CN108744047B - 一种钛纳米/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层的制备方法 - Google Patents

一种钛纳米/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种钛纳米/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层的制备方法，包括以下步骤：1）丝素蛋白的提纯；2）钛片的表面处理；3）钛纳米管的制备；4）小分子级抗菌消炎药物的负载；5）丝素蛋白涂层的制备；6）原位沉积法制备羟基磷灰石涂层。本发明以钛作为基底材料对其表面改性，使替换材料在植入人体后，对置换部位不断缓慢释放消炎抗菌的药物，并且有一定的诱导细胞分化的能力。使得植入置换材料的部位能消除炎症还能诱导细胞向骨细胞分化。

Description

一种钛纳米/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层的制备 方法
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种钛纳米/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层的制备方法。
背景技术
目前，由创伤、骨折及骨质疏松症等疾病引起的骨缺损是临床面临的普遍问题，每年全球有数以百计的硬组织植入人体用于骨固定或者功能性组织全置换。钛及钛合金具有优良的力学性能、无毒、良好的生物相容性和抗腐蚀能力，临床上成为为牙科、骨科等硬组织修复和重建的优选材料。目前临床中应用的钛基种植体均经过表面改性，有较高的种植成功率。但在临床中，部分患者因种植体与周围骨整合所需时间过长（超过 3-6月），导致种植失败。究其原因，主要有三：一，钛金属表面的氧化层在植入活体后常形成纤维包囊，不能与周围骨组织形成骨性结合，易导致植入失败；二，金属钛的弹性模量(105-117GPa )与骨组织(3-20GPa )不匹配，植入后易产生磨损颗粒，诱发骨溶解，继而导致假体松动。三，菌斑聚集导致的高发感染。因此，在承接钛金属所具有的性质之余，探索新的表面改性，提高种植体的成骨活性与抗菌性能，仍具有较大的实际的临床价值。针对上述存在的不足之处，近年来国内外学者针对钛基体表面的改性进行了大量的研究，主要集中在钛基体表面生成有机或无机生物活性涂层，如物理改性法、化学改性法以及生物化学改性法，但现有的钛及钛合金植入体仅仅起到支撑结构的作用，并不具备消炎抗菌的功效。
天然骨组织是一种由高度有序的纳米、微米结构构成的分级多孔结构。分级复合微/纳结构的表面形貌被证实可以通过机械锁结的方式促进骨-种植体的接触，并且还够增强成骨细胞的功能，最终形成较好的骨整合。钛纳米管（titania nanotube,TNT）制备简单，有和骨组织相近的弹性模量，能够模拟骨组织中胶原原纤维的尺寸和排列，成为生物医学领域改善传统生物替代材料的绝佳选择。钛纳米管（titania nanotube,TNT）有和骨组织相近的弹性模量，且已被证明能够提供适当的骨细胞附着位点，可用来改善植入物的生物相容性和成骨能力.此外，银作为广谱抗菌剂，由于其尺寸小，活动度较高，极易被周围组织的细胞所摄取，引起多种细胞毒性。故此，控制纳米银的活动性和释放浓度就尤为重要。通过银纳米颗粒修饰钛种植体原有微米级粗化钛表面，能够在一定程度上模拟机体内在的多级微纳结构，实现抑菌的同时增强其骨结合性能。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明设计的目的在于提供一种钛纳米管/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层的制备方法。以研究采用阳极氧化的方法在钛片表面改性，制备出纳米级的微管，在纳米微管中载入小分子级的抗菌消炎药物，并用丝素蛋白溶液作为阻止药物突释的涂层材料涂覆在钛纳米管的表面，形成均匀平整的丝素蛋白膜把药物封锁在纳米管中，使其在相当长的时间内释放。最后在丝素蛋白涂层上面沉积羟基磷灰石涂层，在钛片表面形成复合涂层，作为为细胞的增长和繁殖的基底。这类材料可以用于组织、器官的修复、替换，比如人工置换关节。
本发明采用以下技术方案加以实现：
所述的一种钛纳米管/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）丝素蛋白的提纯
取蚕茧剪碎，置于碳酸钠溶液中煮沸，然后用去离子水清洗，重复煮沸三次，脱去丝胶，将脱去丝胶后的蚕丝置于55℃的烘箱中干燥，将干燥后的蚕丝完全溶于9.3mol/L的LiBr溶液中，将LiBr溶液装入透析袋中，于磁力搅拌机转速100rpm条件下，去离子水透析除去溶液中的LiBr，每八小时换水一次，透析三天，收集获得浓度为4%的丝素蛋白溶液；
2）钛片的表面处理
将金属钛片依次用400目，600目，800目，1000目的砂纸打磨，去除表面氧化层，用蒸馏水清洗表面；再依次用丙酮，无水乙醇，和蒸馏水依次分别超声清洗30min，最后取出钛片自然晾干备用；
3）钛纳米管的制备
将步骤2）打磨过的钛片置于聚四氟乙烯电泳杯中的电解液中，连接电极和电源，铂电极作为负极，钛片作为正极，连接到恒压电源上，接通电源，调节电压保持22V，阳极氧化完成后，取出钛片立即用蒸馏水冲洗三次，然后自然晾干，制得纳米管钛片，干燥保存；
4）小分子级抗菌消炎药物的负载
将步骤3）制备好的纳米管钛片浸没在抗菌消炎药物的溶液中1小时，取出钛片后，于室温条件下自然晾干，用双蒸水轻轻吸取表面残留的抗菌消炎药物溶液，完全晾干后制得负载有小分子级抗菌消炎药物的纳米管钛片；
5）丝素蛋白涂层的制备
取步骤1）制得的丝素蛋白溶液均匀涂布到钛片的表面，然后在室温下自然晾干，钛片表面产生一层致密的丝素蛋白薄膜，如此重复三次，完成丝素蛋白涂层的制备；
6）原位沉积法制备羟基磷灰石涂层
配置四水硝酸钙和磷酸氢二铵混合液，用枪取混合液滴加在丝素蛋白涂层上，静置到混合液浸入，烘箱40-50℃烘干，如此反复均匀滴加三次，然后置于浓氨水中放置24h，使钛片涂层的pH值逐渐升高到10以上，原位沉积出羟基磷灰石涂层，再用去离子水多次洗涤，洗干净没有沉积在表面的混合物，然后放在烘箱中40℃烘干即制得钛纳米管/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层。
所述的一种钛纳米管/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层的制备方法，其特征在于步骤1）中蚕茧与碳酸钠溶液的质量体积比为10 g:1 L，碳酸钙溶液的浓度为8g/L。
所述的一种钛纳米管/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层的制备方法，其特征在于步骤3）中电解液为氢氟酸溶液或氟化铵溶液，电解液的浓度为1%，阳极氧化时间为10min，钛纳米管的孔径为45-55 nm m，钛纳米管的长度在600-800nm。
所述的一种钛纳米管/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层的制备方法，其特征在于步骤4）中小分子级抗菌消炎药物为姜黄素，姜黄素溶液的制备方法为在DMSO体积浓度为10％的乙醇溶液中溶解姜黄素，溶解浓度为5x10-2mg/mL，制得姜黄素溶液。
所述的一种钛纳米管/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层的制备方法，其特征在于步骤6）中四水硝酸钙和磷酸氢二铵混合液中钙离子与磷酸根离子的质量比为Ca/P=1.67；浓氨水的质量体积浓度为25%。
本发明以钛作为基底材料对其表面改性，使替换材料在植入人体后，对置换部位不断缓慢释放消炎抗菌的药物，并且有一定的诱导细胞分化的能力。使得植入置换材料的部位能消除炎症还能诱导细胞向骨细胞分化。
附图说明
图1为钛纳米管SEM图（a）HF为电解液，（b）NH4F为电解液；
图2为钛纳米管SEM图（a）侧面，（b）底部；
图3为丝素蛋白层SEM图；
图4为HA涂层SEM图；
图5为XRD图；
图6为前四小时药物释放曲线；
图7为七天内的药物释放曲线；
图8为七天内全程药物释放曲线；
图9为纳米银释放情况；
图10为不同储藏时间后样品对大肠杆菌OD570变化及抑菌率。
具体实施方式
以下结合说明书附图对本发明做进一步详细的说明，并给出具体实施方式。
如图所示，本发明一种钛纳米/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层的制备方法，利用水热法在医用钛基体表面构筑牢固的纳米钛涂层作为复合涂层的第一层，进而以丝素蛋白为原材料,利用丝素蛋白交联构建三维网络多孔层作为抗炎药物负载的主体层，以姜黄素作为缓释的抑菌药物进行药物的负载，具体包括以下步骤：
1）丝素蛋白的提纯
取蚕茧20g剪碎，取8g/L的碳酸钠溶液2L煮沸30min，然后用去离子水清洗。重复煮沸三次，脱去丝胶，烘箱干燥。在烘箱中，调节温度到55℃，将干燥后的蚕丝完全溶于LiBr溶液。将溶液装入透析袋中，用封口夹封口，在2L的烧杯里加入1.5L的蒸馏水，磁力搅拌机搅拌，转速100rpm/min，每八个小时换水一次，一共透析三天，收集获得浓度为4%的丝素蛋白溶液。
2）钛片的表面处理
将金属钛片依次用400目，600目，800目，1000目的砂纸依次打磨，去除表面氧化层，用蒸馏水清洗表面；再依次用丙酮，无水乙醇，和蒸馏水依次分别超声清洗30min，最后取出钛片自然晾干备用。
3）钛纳米管的制备
将上步已经打磨过的钛片取出三片作为平行试验。将配好的10％的氢氟酸溶液稀释为1％的氢氟酸溶液倒入聚四氟乙烯的电泳杯中作为电解液，连接电极和电源，铂电极作为负极，钛片作为正极，连接到恒压电源上。接通电源，调节电压保持22V，电泳时间为10min。阳极氧化完成后，取出钛片立即用蒸馏水冲洗，冲洗3次，然后自然晾干，干燥保存。同时，我们也采用NH4F为电解液进行测试，钛纳米管的SEM图见图1。
钛片经过阳极氧化处理后，会在钛片表面形成纳米孔管，调价电压，时间，和电解液的浓度产生孔径大小不同的纳米管。在通过一系列的实验后发现，在电压为22V，阳极氧化时间为10min的时候，可以形成孔径大约在50nm的纳米管，而且纳米管的在表面分布是均匀的，这对于后来药物在表面的均匀负载和释放是很重要的。电镜图片显示，纳米管的长度在600-800nm之间，纳米管大多数呈现竖直的状态，而且底部紧凑整齐，扫面电镜图像可以清晰地看到纳米管的全貌，见图2。
4）小分子级抗菌消炎药物的负载
将步骤3）制备好的纳米管钛片浸没在抗菌消炎药物的溶液中1小时，取出钛片后，于室温条件下自然晾干，用双蒸水轻轻吸取表面残留的抗菌消炎药物溶液，完全晾干后制得负载有小分子级抗菌消炎药物的纳米管钛片。
5）丝素蛋白涂层的制备
丝素本身具有良好的机械性能和理化性质，如良好的柔韧性和抗拉伸强度、透气透湿性、缓释性等，而且经过不同处理可以得到不同的形态。将已经透析获得丝素蛋白溶液稀释到4％、3％、2％、1％的浓度，取20μL涂布到钛片的表面，注意要将溶液涂布均匀，然后在室温下自然晾干，表面上会产生一层致密的丝素蛋白薄膜。如此重复三次，一共滴加60μL丝素蛋白溶液。如图3所示，丝素蛋白涂层和钛纳米管结合紧密，在纳米管表面交联形成了致密的丝素蛋白膜。丝素蛋白膜还具有良好的生物相容性，可以用来做细胞培养基体。并且增强涂层材料的功能，使其具有更强的抗菌抑菌性，调控细胞生长速度等，有利于骨髓间充质干细胞向骨细胞分化。
6）原位沉积法制备羟基磷灰石涂层
配置四水硝酸钙和磷酸氢二铵（Ca/P=1.67）混合液，用枪取100μL滴加在丝素蛋白层上，静置到溶液浸入，烘箱℃烘干，反复均匀滴加三次。加入100μL的浓氨水放置24h，让钛片涂层的PH值逐渐升高到10以上，原位沉积出羟基磷灰石涂层。再用去离子水多次洗涤，洗干净没有沉积在表面的混合物，然后放在烘箱中40℃烘干即可。如图4所示，可见不规则结晶。结合图5可知，各涂层的成功覆盖。其中，二氧化钛层为锐钛矿晶形，磷酸钙层为Cap的衍射峰。
试验例
姜黄素药物的释放实验
姜黄素释放试验，将已经载入姜黄素的钛片分别放在24孔板里，分为空白未加涂层的钛片，涂覆丝素蛋白涂层的钛片，涂覆复合涂层的钛片，分为三组，每组有三个平行组。每个孔加500μLPBS，放在摇床中，220rpm/min，37℃。前四个小时，每隔20min取样一次，每次取样80μL，取出之后再加入80μL的PBS，在酶标仪425nm出检测的OD值。然后连续释放7天，每天取80μL的样品，并且加入80μL的PBS，使得体积总是保持不变，连续测其OD值。最后换算为释放的质量。在释放七天后，取出各个样品，放在2mL的烧杯中，加入1mL PBS，超声30min，将还未释放的药物全部释放出来，检测OD值，转换为药物负载总量。
标准曲线的做法，是在DMSO体积浓度为10％的乙醇溶液中溶解0.05g姜黄素，浓度为5x10-2mg/mL，然后依次稀释出-3，-4，-5，-6，-7，-8，-9，-10梯度，测定波长在425nm时相应的OD值，拟合出标准曲线。
利用紫外分光法姜黄素药物的缓释测定,在模拟体液环境中，考察累积释放量。总结其负载与缓释效果。
图6是装载姜黄素释放的前四个小时的情况，可以看出涂覆了丝素蛋白涂层的钛片相比于未加涂层的空白钛片有一定的防止药物突然释放的作用，而且随着丝素蛋白浓度增加，对药物释放的阻止效果越好。1％丝素蛋白涂层，2％丝素蛋白涂层和4％丝素蛋白涂层三组阻止药物突释的效果是有明显的差距，相比于不加涂层的一组，在阻止药物突释方面具有一定效果。滴加了4％丝素蛋白涂层的钛片比低浓度的丝素蛋白涂层的钛片的阻止突释效果更好，是因为形成的丝素蛋白薄膜更加厚和致密，和钛片的交联更牢固。丝素蛋白羟基磷灰石复合涂层防止药物释放分效果是最好的，能药物在较长的周期里都有药物释放的作用。在前四个小时药物的释放结果显示，4％丝素蛋白羟基磷灰石涂层的钛片能使药物的突然释放仅仅在19.1％，而其他组的钛片的药物释放依次是Blank释放45.61％，1％SF释放39.75％，2％SF释放32.93％；4％SF释放28.45％。由此判断，丝素蛋白薄膜的药物阻滞效果良好，而且丝素蛋白溶液浓度决定了阻止药物突释大的情况。复合涂层加强了涂层的阻滞效果，提高了9.35％。可见HA对涂层有加固作用，对药物也有防止突释的效果。
七天内的药物释放，如图7所示，药物的释放都趋于平缓，但是涂覆涂层的钛片仍然保持钛片能缓慢释放药物，而且能够保持一个持续释放的效果，而且释放的第七天，空白钛片的药物释放已经达到83％，涂覆了1％，2％，4％丝素蛋白涂层的钛片释放量分别是73.81％，59.57％和51.63％，涂覆复合涂层组的钛片释放仅仅为34.02％。说明涂层保证了药物释放的持续性，复合涂层的药物释放效果更好。
从药物释放的全过程来看，Blank组释放保持一个快速突释的状态，在释放的前四个小时里，每小时以11.40％的速度释放，释放一天就达到了59.51％，纳米管没有涂层封住管口，突释效果明显。而涂覆了不同浓度的丝素蛋白涂层的钛片，在阻止药物突释方面起到了很好的效果，而且阻滞效果和丝素蛋白的浓度相关，浓度越高，效果越好。而涂覆和复合涂层的一组防止药物突释效果明显，在四小时仅仅释放了19.10％，释放速度是4.775％/h。在后来的七天中，释放也是保持缓慢释放的趋势，最后释放7天百分比为34.02％，释放速度是0.09％/h。HA涂层加强了丝素蛋白涂层防止药物突释的能力，高浓度的丝素蛋白涂层和钛片表面有更多化学交联。七天内全称药物释放曲线见图8和表1。
表1
Time Blank 1％SF 2％SF 4％SF 4％SF+HA
四小时 45.61% 39.75% 32.93% 28.45% 19.10%
四小时释放速度 11.40% 9.94% 8.23% 7.11% 4.78%
七天 83.00% 73.81% 59.57% 51.63% 34.02%
七天释放速度 0.22% 0.20% 0.16% 0.14% 0.09%
纳米银颗粒的释放实验
在制备好的钛片表面滴加100μL10 mM/L的硝酸银溶液，待溶液自然晾干后再次进行滴加。重复三次后，将晾干的钛片放入马弗炉500℃煅烧3h，即在钛片表面制得银涂层。之后分别涂覆上丝素蛋白涂层和羟基磷灰石涂层，为了检验修饰钛表面纳米银的释放，将1cm的样品浸入2mL PBS，样品分别为nTi-Ag，nTi-Ag-SF，nTi-Ag-SF-HA，设纯钛片为空白对照组。每过一段时间（6h，12h,1d,2d,3d, 4d,5d…）将样品取出重新浸泡入2mL PBS，37℃恒温摇床释放。不断重复这个过程，直到总浸泡时间为10天。通过多功能酶标仪在405nm处测定更换液中的纳米银的光密度。在释放10天后，取出各个样品，放在2mL的烧杯中，加入1mLPBS，超声1小时，将还未释放的纳米银全部释放出来，测定OD值。
将大肠杆菌的菌液培养在放置了涂层材料的孔板中，在培养1，2,3,4,5天，通过检测在600nm纳米处OD值得变化作为抑菌实验的依据，计算出抗菌率，从而表征材料的抗菌性能。
1）纳米银缓释实验
图9和表2可以看出纳米银的释放趋势，释放9天，没有涂覆涂层的nTi-Ag样品释放速度很快，10天释放量已经达到89.1%；9天内，nTi-Ag-SF和nTi-Ag-SF-HA释放速度缓慢，10天释放量分别为48.8%和43.2%，说明丝素蛋白涂层可以封锁钛纳米管，在纳米银的释放方面有很好的阻滞效果， 且HA涂层加强了丝素蛋白涂层防止药物突释的能力。
表2
Time nTi-Ag nTi-Ag-SF nTi-Ag-SF-HA
十天释放百分比 89.1％ 48.8％ 43.2％
四小时释放速度 8.91％ 4.88％ 4.32%
2）纳米银释放抑菌实验
从图10中可以看出Blank组中大肠杆菌以较快的速度生长，度过潜伏期的大肠杆菌显示一个快速生长的趋势，明显高于其他两组的的生长情况，随后2-5天我们可以明显观察到大肠杆菌的快速生长。对于经过涂层涂覆处理的材料，大肠杆菌生长曲线趋势缓慢，且从第4天开始，菌体浓度不在变化，纳米银的释放效果导致菌体生长的抑制。第5天抗菌率分别达到60.8 %和61.6 %，纳米银涂层对于大肠杆菌有着较为良好的抑制效果。

Claims (4)

1.一种钛纳米管/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）丝素蛋白的提纯
取蚕茧剪碎，置于碳酸钠溶液中煮沸，然后用去离子水清洗，重复煮沸三次，脱去丝胶，将脱去丝胶后的蚕丝置于55℃的烘箱中干燥，将干燥后的蚕丝完全溶于9.3mol/L的LiBr溶液中，将LiBr溶液装入透析袋中，于磁力搅拌机转速100rpm条件下，去离子水透析除去溶液中的LiBr，每八小时换水一次，透析三天，收集获得浓度为4%的丝素蛋白溶液；
2）钛片的表面处理
将金属钛片依次用400目，600目，800目，1000目的砂纸打磨，去除表面氧化层，用蒸馏水清洗表面；再依次用丙酮，无水乙醇，和蒸馏水依次分别超声清洗30min，最后取出钛片自然晾干备用；
3）钛纳米管的制备
将步骤2）打磨过的钛片置于聚四氟乙烯电泳杯中的电解液中，连接电极和电源，铂电极作为负极，钛片作为正极，连接到恒压电源上，接通电源，调节电压保持22V，阳极氧化完成后，取出钛片立即用蒸馏水冲洗三次，然后自然晾干，制得纳米管钛片，干燥保存；
所述电解液为氢氟酸溶液或氟化铵溶液；
4）小分子级抗菌消炎药物的负载
将步骤3）制备好的纳米管钛片浸没在抗菌消炎药物的溶液中1小时，取出钛片后，于室温条件下自然晾干，用双蒸水轻轻吸取表面残留的抗菌消炎药物溶液，完全晾干后制得负载有小分子级抗菌消炎药物的纳米管钛片；抗菌消炎药物为姜黄素，姜黄素溶液的制备方法为在DMSO体积浓度为10％的乙醇溶液中溶解姜黄素，溶解浓度为5x10-2mg/mL，制得姜黄素溶液；
5）丝素蛋白涂层的制备
取步骤1）制得的丝素蛋白溶液均匀涂布到钛片的表面，然后在室温下自然晾干，钛片表面产生一层致密的丝素蛋白薄膜，如此重复三次，完成丝素蛋白涂层的制备；
6）原位沉积法制备羟基磷灰石涂层
配置四水硝酸钙和磷酸氢二铵混合液，用枪取混合液滴加在丝素蛋白涂层上，静置到混合液浸入，烘箱40-50℃烘干，如此反复均匀滴加三次，然后置于浓氨水中放置24h，使钛片涂层的pH值逐渐升高到10以上，原位沉积出羟基磷灰石涂层，再用去离子水多次洗涤，洗干净没有沉积在表面的混合物，然后放在烘箱中40℃烘干即制得钛纳米管/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层。
2.如权利要求1所述的一种钛纳米管/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层的制备方法，其特征在于步骤1）中蚕茧与碳酸钠溶液的质量体积比为10g:1L，碳酸钠溶液的浓度为8g/L。
3.如权利要求1所述的一种钛纳米管/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层的制备方法，其特征在于步骤3）中电解液的浓度为1%，阳极氧化时间为10min，钛纳米管的孔径为45-55 nm，钛纳米管的长度在600-800nm。
4.如权利要求1所述的一种钛纳米管/丝素蛋白/羟基磷灰石复合医用钛涂层的制备方法，其特征在于步骤6）中四水硝酸钙和磷酸氢二铵混合液中钙离子与磷酸根离子的质量比为Ca/P=1.67；浓氨水的质量体积浓度为25%。
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