CN105593227A - 作为端锚聚合酶抑制剂的吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮化合物 - Google Patents
作为端锚聚合酶抑制剂的吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮化合物 Download PDFInfo
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Abstract
吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮化合物、含有那些化合物的制剂及其用作端锚聚合酶1和2抑制剂的用途。
Description
Wnt信号传导触发三种细胞内信号传导级联，其包括β-联蛋白介导的经典通路、非经典平面细胞极性和Wnt/钙通路。进化上保守的经典Wnt信号传导通路调节许多细胞过程，包括细胞增殖、分化、粘附和维持。当Wnt配体结合至细胞表面Frizzled和脂蛋白受体相关蛋白(LRP)5/6共受体时，起始调节细胞内β-联蛋白水平的经典通路，其进而促进激酶GSK3从APC/轴蛋白/GSK-3 (腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)、轴蛋白、糖原合酶激酶3α/β (GSK3))破坏复合物的置换。在Wnt结合存在的情况下(开启状态)，Dishevelled(Wnt通路中的蛋白)被活化，其进而，招募GSK3远离破坏复合物，导致细胞溶质β-联蛋白的累积，β-联蛋白易位至核，与T-细胞因子/淋巴样增强因子(TCF/LEF)家族转录因子的相互作用和经典Wnt通路应答基因的转录。在Wnt配体不存在的情况下(关闭状态)，细胞溶质β-联蛋白被组成型磷酸化，且被靶向用于泛素化和由蛋白酶体降解。
两种高度同源的人端锚聚合酶同工型，端锚聚合酶1和2(TNKS1和TNKS2)是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)酶家族的成员，其使用β NAD+作为底物催化蛋白的翻译后修饰以便相继将ADP核糖部分添加至目标蛋白上(聚ADP-核糖基化(parylation或parsylation))。端锚聚合酶类的蛋白底物之一为轴蛋白，β-联蛋白破坏复合物的浓度-限制性组分；聚ADP-核糖基化标记轴蛋白用于降解且端锚蛋白酶抑制导致轴蛋白稳定化、Wnt信号传导抑制和β-联蛋白降解。
Wnt信号传导通路活化突变发现于宽范围的癌症中，且据信有助于肿瘤起始、维持和/或进展。因此，端锚聚合酶活性的抑制似乎是治疗癌症中有希望的方法，所述癌症诸如结肠直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、卵巢癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、肺癌(包括非小细胞肺癌)、胰腺癌、前列腺癌、成胶质细胞瘤、T-细胞淋巴瘤、T-淋巴母细胞性淋巴瘤、T-细胞急性淋巴细胞性白血病(T-ALL))、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞白血病和急性粒细胞白血病。
已经进行相当大的努力来鉴定抑制经典Wnt /β-联蛋白信号传导通路的药剂。TNKS1和TNKS2抑制剂诸如WO 2013/117288是已知的。
尽管存在WO 2013/117288，但需要发现具有TNKS1和TNKS2抑制活性的化合物。进一步需要发现相比于其他PARP选择性抑制TNKS1和TNKS2的化合物。
图1是8-甲基-2-[4-(嘧啶-2-基甲基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 4-甲基苯磺酸盐(实施例6的化合物) 的代表性XRPD图。
本发明的一个方面是式I的化合物：
其中：
Y是：
、 、或；
X是–CH2-、-C(CH3)H-或–C(CH2CH3)H-；
R1是氢、羟基或卤素；
R2是氢、卤素、-CN、-CH3、CF3或-OCH3；
或其药学上可接受的盐。
优选地，本发明的一个进一步方面提供式I的化合物，其中：
Y是：
或；
X是–CH2-、-C(CH3)H-或–C(CH2CH3)H-；
R1是氢、羟基或卤素；
R2是氢、卤素、-CN、-CH3、CF3或-OCH3；
或其药学上可接受的盐。
优选地，本发明的另一个方面提供式I的化合物，其中：
Y是
；
X是–CH2-、-C(CH3)H-或–C(CH2CH3)H-；
R2是氢、卤素、-CN、-CH3、CF3或-OCH3；
或其药学上可接受的盐。
本发明的另一个优选方面提供式I的化合物，其中：
Y是：
；
X是–CH2-、-C(CH3)H-或–C(CH2CH3)H-；
R1是氢、羟基或卤素；
R2是氢、卤素、-CN、-CH3、CF3或-OCH3；
或其药学上可接受的盐。
本发明的一个优选方面是以下化合物：
8-甲基-2-[4-(嘧啶-2-基甲基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，或其药学上可接受的盐；
8-甲基-2-[4-(1-嘧啶-2-基乙基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，或其药学上可接受的盐；
2-[4-[(4-氯嘧啶-2-基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，或其药学上可接受的盐；或
2-[4-[(4-甲氧基嘧啶-2-基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，或其药学上可接受的盐。
本发明的另一个优选方面是以下化合物：
2-[4-[(3-溴-2-吡啶基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，或其药学上可接受的盐；
2-[4-[(3-氯-2-吡啶基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，或其药学上可接受的盐；
2-[4-[(3-氟-2-吡啶基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，或其药学上可接受的盐；或
2-[[4-(8-甲基-4-氧代-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌嗪-1-基]甲基]吡啶-3-甲腈，或其药学上可接受的盐。
本发明的一个进一步方面是药物组合物，所述药物组合物包含式I的化合物，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
本发明的又一个进一步方面提供在有需要的癌症患者中抑制端锚聚合酶1和2的方法，其包括将治疗有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐施用于所述患者。
本发明的另一个方面提供治疗患者中的癌症的方法，所述癌症是结肠直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、成胶质细胞瘤、T-细胞淋巴瘤、T-淋巴母细胞性淋巴瘤、T-细胞急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞白血病或急性粒细胞白血病，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的一个又进一步方面提供式I的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗。
本发明的另一个方面提供式I的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗癌症，所述癌症是结肠直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、成胶质细胞瘤、T-细胞淋巴瘤、T-淋巴母细胞性淋巴瘤、T-细胞急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞白血病或急性粒细胞白血病。
本发明的一个进一步方面提供式I的化合物或其药学上可接受的盐用于制备用于治疗癌症的药物的用途，所述癌症是结肠直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、成胶质细胞瘤、T-细胞淋巴瘤、T-淋巴母细胞性淋巴瘤、T-细胞急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞白血病或急性粒细胞白血病。
术语“患者”是指哺乳动物且“哺乳动物”包括但不限于人。
术语“三阴性乳腺癌”是指特征在于肿瘤样品对于雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)和激素表皮生长因子受体2 (HER2/neu)被测试为阴性的乳腺癌。
“治疗有效量”或“有效量”意指抑制癌症患者中的Wnt /β-联蛋白信号传导通路和破坏患者中目标癌细胞或减缓或停滞癌症的进展所必需的化合物或其药学上可接受的盐，或包含所述化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的剂量。化合物或其药学上可接受的盐的预期剂量为0.1至200 mg/患者/天范围内。预期优选剂量为1至175 mg/患者/天范围内。预期最优选剂量为5至150 mg/患者/天范围内。治疗患者所需的精确剂量和治疗时间长度由医生鉴于疾病的阶段和严重性以及个别患者的特定需要和反应来确定。尽管表示为基于每天的剂量，但可调整给药方案以提供对患者更优的治疗益处并且控制和/或减轻不期望的药代动力学效应。除了每天给药之外，每隔一天给药(Q2D)；经五天时段每隔一天给药、随后两天不给药(T.I.W.)；或者每三天(Q3D)可能适当。
术语“治疗/处理(treatment)”、“治疗/处理(treat)”和“治疗/处理(treating)”意指包括患者遭受的癌症的全方位介入，诸如活性化合物的施用以减轻至减缓或逆转一种或多种症状并且延迟癌症的进展，即使实际上没有根除癌症。待治疗的患者为哺乳动物，特别是人。
优选地，使用药学上可接受的载体将本发明的化合物配制为药物组合物并通过多种途径施用。优选地，此类组合物用于口服施用。此类药物组合物和制备它们的方法是本领域众所周知的。参见例如REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A.Gennaro, 等人编辑，第19版，Mack Publishing Co., 1995)。在特定实施方案中，所述药物组合物包含8-甲基-2-[4-(嘧啶-2-基甲基)哌嗪-1-基]-5,6,7,8-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-酮或其药学上可接受的盐连同药学上可接受的载体和任选其他治疗成分，特别用于治疗特定癌症类型。
本发明的化合物能够与许多无机和有机酸反应以形成药学上可接受的酸加成盐。此类药学上可接受的盐和用于制备它们的常规方法是本领域众所周知的。参见例如，P.Stahl, 等人，HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE,(VCHA/Wiley-VCH, 2002)；S.M. Berge, 等人，“Pharmaceutical Salts, “ Journal ofPharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977。
本发明的化合物，诸如实施例1，被命名为：8-甲基-2-[4-(嘧啶-2-基甲基)哌嗪-1-基]-5,6,7,8-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-酮 (IUPAC)；并且也可以被命名为：吡啶并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-酮, 5,6,7,8-四氢-8-甲基-2-[4-(2-嘧啶基甲基)-1-哌嗪基]-(CAS)；且其他名称也可以用来明确标识本发明的化合物。
应当理解，式I的化合物被描述为单一立体异构体。具体定义的取代基可以产生手性中心，其得到外消旋混合物或两种立体异构体。如本文所使用，除非另有指定，否则提及特定化合物意指包括个别立体异构体和外消旋混合物，其包括命名化合物。可以使用对映异构体纯的或富集的起始材料通过立体特异性合成制备特定的立体异构体。可以通过本领域众所周知的技术(诸如Stereochemistry of Organic Compounds，E. I. Eliel和S. H.Wilen(Wiley 1994)和Enantiomers, Racemates, and Resolutions, J., Jacques, A.Collet和S. H. Wilen(Wiley 1991)中找到的那些，包括手性固定相上的层析、酶促拆分或分级结晶或为了该目的形成的非对映异构体(诸如非对映异构体盐)的层析拆分起始材料、中间体或外消旋混合物的特定立体异构体。当手性化合物被分离或拆分成其异构体、但没有确定绝对构象或旋光度时，异构体被任意地指定为异构体1和异构体2，其对应于各自从手性层析洗脱的顺序，且如果手性层析在合成中早期起始，则将相同指定应用于后续中间体和实施例。
本领域普通技术人员将认识到式I的化合物中可以互变异构平衡存在。为了说明的目的，该平衡如下所示：
为了方便起见，在式I中描绘4-氧代形式，且在整个本说明书中使用相应的命名法。然而，此类描绘包括相应的互变异构的羟基形式。
在本发明的化合物的合成中作为最初起始材料采用的化合物是众所周知的，并且在不可商业得到的程度，使用提供的特定参考文献通过本领域普通技术人员通常采用的或在一般参考文献中发现的标准步骤容易合成。
已知程序和方法的实例包括在一般参考文献诸如Comprehensive OrganicTransformations，VCH Publishers Inc，1989；Compendium of Organic SyntheticMethods，第1-10卷，1974-2002，Wiley Interscience；Advanced Organic Chemistry，Reactions Mechanisms, and Structure，第5版，Michael B. Smith和Jerry March，WileyInterscience，2001；Advanced Organic Chemistry，第4版，部分B，Reactions andSynthesis，Francis A. Carey和Richard J. Sundberg，Kluwer Academic / PlenumPublishers，2000等和其中引用的参考文献中描述的那些。
此外，在以下方案中描述的某些中间体可以含有一个或多个氮保护基团。该可变保护基团在每次出现时可以根据特定反应条件和待进行的特定转换而相同或不同。保护和脱保护条件是技术人员众所周知的，并且描述于文献中(参见例如“Greene’s ProtectiveGroups in Organic Synthesis”, 第四版, Peter G.M. Wuts和Theodora W. Greene,John Wiley and Sons, Inc. 2007)。
本文使用的缩写根据Aldrichimica Acta, Vol. 17, No. 1, 1984进行定义。其他缩写定义如下：“APC”是指腺瘤性结肠息肉病蛋白；“BID”是指每日两次给药；“生物素化的NAD+”是指6-生物素-17-烟酰胺-腺嘌呤-二核苷酸；“BOC”是指叔丁基氧基羰基；“DCM”是指二氯甲烷；“DMF”是指二甲基甲酰胺；“DMAP”是指4-二甲基氨基吡啶；“DMEM”是指Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基；“DMSO”是指二甲基亚砜；“DPBS”是指Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水；“DTT”是指二硫苏糖醇；“EDCI”是指1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；“EGFP”是指增强型绿色荧光蛋白；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“FBS”是指胎牛血清；“Flag标签”是指Flag肽DYKDDDDK，N-末端至C-末端(SEQ ID NO:6)；“HEK”是指人胚肾；“HEPES”是指4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸；“HOAc”是指乙酸；“HRP”是指辣根过氧化物酶；“IPAm”是指异丙胺；“MEM”是指最小必需培养基；“MeOH”是指甲醇；“MOI”是指感染复数；“NCBI”是指国家生物技术信息中心；“PBS”是指磷酸盐缓冲盐水；“RPMI”是指Roswell Park Memorial研究所；“SCX”是指结合至二氧化硅的强阳离子交换苯基磺酸的纯化柱；“SCX-2”是指结合至二氧化硅的强阳离子交换丙基磺酸的纯化柱；“SFC”是指超临界流体层析；“TBS”是指Tris缓冲盐水；“THF”是指四氢呋喃；“TBME”是指叔丁基甲基醚；“TMB过氧化物酶”是指3,3’,5,5’-四甲基联苯胺；Tris”是指三(羟基甲基)氨基甲烷；且“X-Phos”是指2-(二环己基膦基)-2’,4’,6’-三异丙基联苯。
本发明的化合物或其盐可以通过本领域已知的各种程序进行制备，其中一些在以下方案、制备例和实施例中进行说明。描述的各途径的特定合成步骤可以不同方式组合，或结合来自不同方案的步骤组合，以制备式I的化合物或其药学上可接受的盐。以下方案中的各步骤的产物可以通过本领域众所周知的常规方法回收，所述常规方法包括萃取、蒸发、沉淀、层析、过滤、研磨和结晶。在以下方案中，除非另外说明，否则所有取代基均如先前定义。试剂和起始材料对于本领域普通技术人员是容易获得的。
方案1
方案1描绘作为TFA盐的8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮(6)、中性物质(7)和(7)的甲基三氟四氢硼酸盐(trifluoroboranate methyl salt)的形成。
在步骤A中，从用2-氯烟酸乙酯 (2)环化受保护的哌嗪-1-甲酰胺盐酸盐(1)获得受保护的2-哌嗪-1-基-3H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 (3)。反应在惰性溶剂诸如DMF中在强碱诸如叔丁醇钾存在的情况下在50- 120℃的温度下进行。优选的保护基团是叔丁基氧基羰基，但也可以使用其他氨基甲酸酯保护基团。
在步骤B中，使用甲基碘将受保护的2-哌嗪-1-基-3H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮(3)甲基化以得到季盐，受保护的8-甲基-2-哌嗪-1-基-3H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-8鎓(ium)-4-酮碘化物 (4)(Z是I，方案1)。反应在高压釜中在惰性溶剂诸如THF或二氧杂环己烷中在50-120℃的温度下进行4至24小时。或者，可以通过在约60-80℃加热的情况下将硫酸二甲酯添加至极性非质子溶剂诸如DMF中的化合物(3)来形成硫酸甲酯盐(methyl sulfatesalt)。将溶液在室温下转移至含有TMBE的容器以沉淀产物(4)(Z为CH3OSO3)。
在方案1，步骤C中，将季盐(4，Z为I)还原以提供受保护的8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 (5)。可以使用还原剂诸如氰基硼氢化钠在约10/1的DMF/TFA的混合物中完成还原。在0 – 5℃的温度下添加TFA和还原剂，其中不使温度升至高于15℃。然后使反应物在室温下继续约12至24小时。可以在冷却的情况下添加额外量的TFA和还原剂以驱动反应完成。
或者，可以通过用还原剂诸如氧化铂还原硫酸甲酯盐(4，Z为CH3OSO3)且在极性溶剂诸如MeOH中在约155 psi下氢化以得到化合物(5)而完成步骤C。
在步骤D中，将哌嗪基环脱保护以提供8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 (6)。用于除去保护基诸如BOC的酸性条件是本领域中众所周知的。优选的条件在室温下使用DCM和TFA的1/1混合物2至24小时的时段以得到作为TFA盐的产物，其中存在2-4当量的TFA。盐形式没有表征，但以重量进行计算。
步骤E显示如上讨论的保护基团的脱保护以得到TFA盐，所述TFA盐可以用离子交换树脂或SCX柱使用氨/MeOH进行中和以得到中性物质(7)。吡嗪环的氮可以在溶剂诸如THF中使用溴甲基三氟硼酸钾转化成甲基三氟四氢硼酸盐(methyl trifluoroboranatesalt)，以得到如步骤F中所示的盐形式，化合物8。
方案2
方案2说明从盐形式(6)、中性物质(7)或甲基三氟四氢硼酸盐(methyltrifluoroboranate salt)(8)形成式I的化合物。
存在许多方式来从中间体(6)、(7)和(8)形成式I的化合物，诸如烷基化、还原性烷基化或Suzuki偶联，这取决于用于还原性烷基化的适当的醛类或酮类的可用性或合成、用于烷基化的适当的卤化物试剂或用于Suzuki偶联的硼酸试剂。TFA胺盐(6)或中性胺(7)可以用于还原性烷基化或烷基化中以得到式I的化合物。还原性烷基化是本领域中是众所周知的，且涉及使用还原剂诸如氰基硼氢化钠在适当溶剂诸如DMF中在室温下或其他还原剂诸如三乙酰氧基硼氢化钠在适当溶剂诸如DMF中在室温下醛和胺的反应。如果需要，催化量的甲醇可以与DMF和氰基硼氢化钠一起使用以更快推动反应向前。适当的芳基甲基卤化物可用于使用适当的有机碱诸如三乙胺或无机碱诸如碳酸钾在溶剂诸如乙腈或DCM中将TFA胺盐(6)或中性物质(7)烷基化。碘化钠可以原位用于将氯甲基底物转化成更具活性的碘甲基底物以完成适当的吡嗪、吡啶或嘧啶的烷基化。反应物可以在室温下搅拌1-3天以得到式I的化合物。
化合物(8)可以在Suzuki钯催化的交叉偶联条件下与芳基卤化物偶联以形成N-甲基杂芳基取代的产物。化合物8甲基三氟四氢硼酸盐(methyl trifluoroboranate salt)提供制备式I的化合物的另一种变型。技术人员将认识到存在许多可用于促进此类交联偶联反应的条件。因此，合适的钯试剂包括乙酸钯(II)和合适的有机磷试剂诸如X-phos与碱诸如碳酸铯、碳酸钠、碳酸钾或磷酸三钾单水合物。其他合适的有机磷和钯试剂包括双(三苯基膦)氯化钯(II)、三(二亚苄基丙酮)二钯 (0)与三环己基膦、(1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁)氯化钯(II)或四三苯基膦钯(palladium tetrakistriphenylphosphine)。
在任选步骤中，式I的化合物的药学上可接受的盐，诸如盐酸盐，可以通过式I的游离碱化合物与适当酸在合适溶剂中在标准条件下反应来形成。此外，此类盐的形成可以在氮保护基团的脱保护时同时发生。
以下制备例和实施例进一步说明本发明。除非相反指出，否则本文所示化合物使用Accelrys® Draw 版本 4.0 (Accelrys, Inc., San Diego, CA)、IUPACNAME ACDLABS或ChemDraw® Ultra 12.0进行命名和编号。
反相纯化的一般方法描述
系统：配备质量选择检测器(MSD)质谱仪和Leap自动进样器/级分收集器的Agilent1200 LCM/MS；
柱：75 × 30 mm Phenomenex Gemini-NX，具有10 × 20 mm护罩的5μ粒径柱；
溶剂系统：A：10 mM碳酸氢铵，pH 10作为水相，B：ACN作为有机相；
流速：85 mL/min；
方法：各方法的梯度在方法名称中被指定为开始％B-结束％B(例如，如高pH 13-48中)。梯度设置如下： 0-1 min (保持在开始%B)，1-8 min (从开始%B至结束%B的梯度)，8-8.1 min (从结束%B至100%B的斜变)，8.1-9 min (保持100% B)。
制备例1
4-甲氧基嘧啶-2-甲醛
将4-甲氧基嘧啶-2-甲醇 (300 mg, 2.14 mmol)和草酰氯 (1 mL, 2.0 M/DCM)合并于DCM (5 mL)中，并冷却至-78℃。添加DMSO (0.33 mL, 4.71 mmol)并搅拌混合物2小时。添加三乙胺 (0.66 mL, 4.71 mmol)，并将混合物温热至室温过夜。添加水(5 mL)，搅拌1小时并用DCM (2 × 50 mL)萃取。经硫酸钠干燥合并的有机萃取物，过滤，并在减压下浓缩滤液以得到浅棕色固体，并不经进一步纯化即使用。1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 醛峰9.94 (s,1H)，剩余峰由于存在多于一种化合物的混合物而不可指定。
制备例2
4-甲基嘧啶-2-甲醛
基本上如制备例1中所述使用(4-甲基嘧啶-2-基)甲醇制备4-甲基嘧啶-2-甲醛以获得标题化合物，并不经进一步纯化即使用。
制备例3
4-(三氟甲基)-2-乙烯基-嘧啶
将2-氯-4-(三氟甲基)嘧啶 (250 mg, 1.37 mmol)、乙烯基三氟硼酸钾 (184 mg,1.37 mmol)、碳酸铯 (1.34 g, 4.11 mmol)、THF (5 mL)和水 (0.5 mL)合并于小瓶中。用氮气流脱气1分钟。添加双(三苯基膦)氯化钯(II) (48 mg, 0.069 mmol)，密封小瓶，并在85℃下加热混合物3天。冷却，用DCM稀释混合物，通过硅藻土过滤，在减压下浓缩滤液以得到标题化合物(0.200 g, 84%)，其不经进一步纯化即使用。
制备例4
5-甲基-2-乙烯基-嘧啶
基本上如制备例3中所述使用2-氯-5-甲基嘧啶制备标题化合物，并不经进一步纯化即使用(220 mg, 94%)。
制备例5
4-(三氟甲基)嘧啶-2-甲醛
将4-(三氟甲基)-2-乙烯基-嘧啶 (200 mg, 0.84 mol)与高碘酸钠 (737 mg, 3.45mmol)和聚合物结合的四氧化锇 (292 mg, 0.057 mmol)合并于二氧杂环己烷 (3 mL)和水(1 mL)中，并在室温下搅拌混合物过夜。用EtOAc (5 mL)和水 (5 mL)稀释混合物。将混合物过滤通过玻璃棉并分离各层。经硫酸镁干燥有机层，过滤，并浓缩滤液以得到标题化合物(40 mg, 20%)。不经进一步纯化即使用粗物质。1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 醛10.16 (s,1H)，剩余峰由于存在多于一种化合物的混合物而不可指定。
制备例6
5-甲基嘧啶-2-甲醛
基本上如制备例5中所述使用2-氯-5-甲基-嘧啶制备5-甲基嘧啶-2-甲醛以得到标题化合物(90 mg, 44%)，并不经进一步纯化即使用。
制备例7
2-(溴甲基)-4-氯-嘧啶
将2-甲基-4-氯嘧啶 (200 mg, 1.55 mmol)、四氯化碳 (5 mL)、 N-溴代琥珀酰亚胺(304 mg, 1.71 mmol)和过氧化苯甲酰 (38 mg, 1.6 mmol)合并于小瓶中，用氮气吹扫2分钟，密封并在80℃下加热过夜。不经进一步纯化即使用粗反应混合物。GC-MS m/e:(79BR/81Br 205/207 (M+)。
制备例8
2-(氯甲基)吡嗪
将2-吡嗪基甲醇 (2.0 g, 18.1 mmol)溶解于DCM (200 mL)中，并冷却至0℃，同时在氮气下搅拌。经10分钟逐滴添加亚硫酰氯(4.63 mL, 63.6 mmol)，并允许温热至25℃。在室温下搅拌16小时。浓缩混合物，然后用DCM稀释。用饱和NaHCO3洗涤粗溶液，经MgSO4干燥，过滤，并浓缩。将粗残余物溶解于DCM中，并通过硅胶快速层析(己烷/EtOAc，95:5至100％EtOAc梯度)纯化以得到作为浅黄色油状物的标题化合物。
制备例9
2-(溴甲基)-3-氯-吡嗪
一起添加2-氯-3-甲基-吡嗪 (5.0 g, 38.9 mmol)、N-溴代琥珀酰亚胺 (6.92 g,38.9 mmol)、过氧化苯甲酰 (0.471 g, 1.94 mmol)和四氯化碳 (50 mL)，并在氮气下回流加热16小时。将反应混合物冷却至25℃，并用己烷稀释。过滤混合物，在减压下浓缩液体，并通过硅胶快速层析(己烷/EtOAc，梯度为95:5至40:60)纯化以得到作为褐色油状物的标题化合物(3.93 g, 49%)。
制备例10
3,5-二氟吡啶-2-甲酸甲酯
一起添加3,5-二氟吡啶-2-甲酸 (1.4 g, 8.8 mmol)和DCM (30 mL)并冷却至0℃。添加MeOH (3 mL)、DMAP (1.32 g, 10.6 mmol)和EDCI (2.1 g, 10.6 mmol)。使混合物温热至室温并搅拌过夜。在减压下浓缩反应混合物，并通过硅胶上的层析(用10/1石油醚/EtOAc洗脱)纯化残余物以得到标题化合物(1.03 g, 72%)。LC-ES/MS m/z 174 (M+H)+。
制备例11
(3,5-二氟-2-吡啶基)甲醇
一起添加3,5-二氟吡啶-2-甲酸甲酯 (1.0 g, 4.6 mmol)、THF (10 mL)和2 M 硼氢化锂/THF (15 mL, 23 mmoL)。在室温下搅拌混合物2天。在减压下浓缩，并通过硅胶层析纯化残余物，用DCM洗脱以得到标题化合物(0.448 g, 60%)。
制备例12
2-(氯甲基)-3,5-二氟吡啶
一起添加(3,5-二氟-2-吡啶基)甲醇 (200 mg, 1.4 mmol)、DCM (4 mL)、DMF (0.1mL)和亚硫酰氯 (1 mL)，并搅拌混合物4小时。用4 M碳酸氢钠水溶液将pH调节至约7.0，并用DCM (3 × 50 mL)萃取混合物。合并有机部分，经无水硫酸钠干燥，过滤，并浓缩以得到作为橙色油状物的标题化合物(182 mg, 81%)。
制备例13
4-氨基亚氨基甲基(carbamimidoyl)哌嗪-1-甲酸叔丁酯盐酸盐
用哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (1500 g, 8.054 mol)和DMF (4.05 L)投入10 L夹套反应器。搅拌，直至获得溶液。经15分钟在22至28℃下添加1H-吡唑-1-甲酰胺 HCl (1180 g, 8.054mol)，随后添加二异丙胺 (1041 g, 8.054 mol)。在55至60℃加热5小时，然后冷却至20℃。将反应混合物经15至20分钟转移至含有TBME (30 L)的50L夹套反应器，并用DMF (400 mL)冲洗转移管线。将悬浮液在20℃下搅拌1小时，然后通过三个独立的26 cm布氏漏斗进行过滤。用TMBE (2 × 1000 mL)洗涤各产物滤饼，并在60℃下在真空箱中干燥过夜以得到作为白色固体的标题化合物(1898 g, 89%)。
制备例14
4-(4-氧代-3H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
用4-氨基亚氨基甲基(carbamimidoyl)哌嗪-1-甲酸叔丁酯盐酸盐(1897 g, 7.165mol)、DMF (10.1 L)和2-氯烟酸乙酯 (1266 g, 6.824 mol)投入22 L圆底烧瓶。经55分钟逐份添加叔丁醇钾 (1293 g, 11.52 mol)，同时使温度从17℃逐渐上升至62℃。在100 ℃下加热反应物2.5小时。将反应混合物冷却至20℃，并使用DMF (350 mL)转移至含有水(15.2 L)的30 L夹套反应器以冲洗反应器和转移管线。引入3 N 盐酸 (1.52 L)，直至获得5至6的pH，并在20℃下搅拌悬浮液2小时。通过三个独立的26 cm布氏漏斗通过过滤收集产物，并用水 (3 × 1.5 L)洗涤各滤饼。合并滤饼，将它们悬浮于水 (15.0 L)中，并在20℃下搅拌60分钟。通过两个独立的26 cm布氏漏斗通过过滤收集产物，并用水 (2 × 1.5 L)洗涤滤饼。在真空箱中在60℃下干燥固体24小时以得到作为黄色固体的标题化合物(1332g, 59%)。
制备例15
4-(8-甲基-4-氧代-3H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-8-鎓-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯，硫酸甲酯盐
用4-(4-氧代-3H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1331 g, 4.017mol)和DMF (6.66 L)投入20 L夹套反应器。经5-10分钟添加硫酸二甲酯 (583 g, 2.83mol)，并观察到轻微放热至38℃。将溶液加热至63至73℃，持续30分钟。然后引入额外的硫酸二甲酯(50.7 g, 0.402 mol)，并在68至73℃下加热30分钟。反应的样品显示剩余2.0％起始物质。添加额外的硫酸二甲酯(50.7 g, 0.402 mol)，并在68至73℃下加热。样品再次显示剩余1.3％起始物质。将反应物冷却至20℃，并使用DMF (300 mL)经20至30分钟转移至含有TBME (26.6 L)、4-(8-甲基-4-氧代-3H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-8-鎓-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯和晶种(1 g)的50L夹套反应器以冲洗反应器和转移管线。将悬浮液在20℃下搅拌过夜，并使用三个独立的26 cm布氏漏斗通过过滤收集产物。用TBME (3 × 1.3 L)冲洗各滤饼，合并三个部分，并将物质悬浮于TMBE (13.3 L)中，在20℃下搅拌1小时，并在两个独立的26 cm布氏漏斗上收集产物。用TBME (3 × 2.0 L)洗涤各滤饼，并在真空箱中在 55至60℃下干燥16小时以得到作为黄色固体的标题化合物(1812 g, 98%)。
制备例15 晶种形成
用4-(4-氧代-3H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(15 g, 45.3 mmol)和二甲基甲酰胺 (75 mL)投入250 L反应器。将硫酸二甲酯(6.28 g, 49.8 mmol)以一份添加至正在搅拌的混合物(观察到轻微放热至34°C)。将所得溶液在68至73℃下加热3小时。添加硫酸二甲酯(0.57 g, 4.5 mmol)，并在68至73℃下搅拌额外1小时。冷却至20℃，并逐滴转移至含有TBME (300 mL)的1 L烧瓶。观察到粘性固体变化为可搅拌的悬浮液，在20℃下搅拌过夜，并在布氏漏斗上过滤。用TBME (3 x 35 mL)洗涤产物滤饼，并悬浮于TBME (100mL)中。将悬浮液在20℃下搅拌1小时，在布氏漏斗上过滤，并用TBME (2 x 35 mL)洗涤滤饼。在真空箱中在55至60℃下干燥固体16小时以得到4-(8-甲基-4-氧代-3H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-8-鎓-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯, 硫酸甲酯盐(18.84 g, 91%产率) (HPLC纯度95%)。
制备例16
4-(8-甲基-4-氧代-3H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-8-鎓-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯碘化物
将4-(4-氧代-3H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(115.43 g)、THF(1.4 L)和甲基碘 (24 mL)合并于具有机械搅拌器的2 L Parr高压釜中。密封高压釜，并在70℃下加热的情况下搅拌反应物22小时。将反应物冷却至室温，并使用MeOH将所得亮黄色浆料转移至圆底烧瓶。浓缩浆料，并在真空箱中在50-60℃下干燥所得固体以得到作为黄色固体的标题化合物(167.44 g, 100%)。LC-ES/MS m/z 346.2 [M+H]+, TR = 1.16 min。
制备例17
4-(8-甲基-4-氧代-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
用4-(8-甲基-4-氧代-3H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-8-鎓-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯, 硫酸甲酯盐(881 g, 1.927 mol)和MeOH (4.9 L)投入2加仑压力容器。添加氧化铂(1% w/w,8.81 g)并用氢气加压至155 psi。在22-28℃下搅拌4小时。通过过滤筒过滤以收集催化剂。留出滤液以便与第二氢化的滤液合并。如过滤之前对4-(8-甲基-4-氧代-3H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-8-鎓-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯, 硫酸甲酯盐(925 g, 2.023 mol)、MeOH (5.0 L)和氧化铂(1% w/w, 9.25g)的另一部分重复反应，并合并两种滤液并浓缩至油状残余物。将残余物溶解于DCM (9.3 L)中并用0.1 N HOAc水溶液(2 × 2.0 L和2 × 1.1L)和0.5 MNaOH (8.0 L)洗涤。添加水(4.0 L)并用0.1 N HOAc水溶液(约1.9 L)调节至pH 6-7。分离各层，并经硫酸镁干燥有机层，过滤，并浓缩至约4.5 L的体积，并添加EtOAc (16.0 L)以使产物结晶。将悬浮液浓缩至约4.5 L的体积，冷却至0至5℃，并通过过滤收集产物。用EtOAc(2 × 2.0 L和2 x 1.1 L)洗涤滤饼，并在真空箱中在55至65℃下干燥16小时以得到作为白色固体的标题化合物(1185 g, 77%)(非常静电)。
制备例17 替代合成
用4-(8-甲基-4-氧代-3H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-8-鎓-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯碘化物(167.44 g, 353.76 mmol)和DMF (815 mL)投入圆底烧瓶，并在冰浴中冷却至0-5℃的内部温度。以维持内部温度低于15℃(45分钟)的速率添加三氟乙酸 (80.25 mL, 1.06 mol)。将反应物冷却至0-5℃的内部温度，并以维持温度低于15℃(约50分钟)的速率添加氰基硼氢化钠 (66.69 g, 1.06 mol)。将反应物搅拌18小时，同时温热至25℃。将反应物向下冷却回0-5℃，并以维持温度低于15℃(10分钟)的速率添加三氟乙酸 (80.25 mL, 1.06 mol)，随后以维持温度低于15℃(10分钟)的速率添加氰基硼氢化钠 (66.69 g, 1.06 mol)。将反应物搅拌过夜，同时温热至25℃。将反应物向下冷却回0-5℃，并以维持温度低于10℃(5分钟)的速率添加三氟乙酸 (26.6 mL, 0.345 mol)，随后经10分钟以两部分添加氰基硼氢化钠(22.3 g, 0.345 mol)。搅拌过夜，同时温热至25℃。安装具有顶置式搅拌器的12 L桶，并用碳酸氢钠 (297.18 g, 3.54 mol)和水 (7.2 L)投入其中。经30分钟的时段使用分液漏斗将粗反应混合物添加至碳酸氢盐溶液，并观察到气体逸出。搅拌混合物2小时，然后让其在25℃下放置过夜。通过过滤收集所得固体，并用水和乙醚冲洗。在真空箱中在约60℃下干燥固体过夜以得到作为米黄色固体的标题化合物(111.34 g, 90%)。LC-ES/MS m/z 350.0 [M+H]+, TR = 1.93 min。
制备例18
8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 双-(2,2,2-三氟乙酸)盐
一起添加4-(8-甲基-4-氧代-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (46.8 g, 133.9 mmol)和DCM (100 mL)。经15分钟添加三氟乙酸 (80 mL, 1.09 摩尔)并在25℃下搅拌过夜。在减压下浓缩，添加DCM (200 mL)，并在减压下重新浓缩四次以得到作为灰白色固体的标题化合物(69.685 g, 100%粗品)。LC-ES/MS m/z 250.0 [M+H]+,TR = 0.53 min。
制备例19
8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮; 三-2,2,2-三氟乙酸
一起添加4-(8-甲基-4-氧代-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯 (196.0 g, 560.8 mmol)和DCM (783 mL)。将混浊悬浮液在冰浴中冷却至4℃的内部温度，并经10分钟添加三氟乙酸(254 mL)，同时搅拌。在室温下搅拌42小时。在减压下除去挥发物，并溶解于DCM中。在减压下除去挥发物，并在真空下在40℃下干燥过夜以得到作为白色固体的标题化合物(431.5 g, 99%)。
制备例20
8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮; 四-2,2,2-三氟乙酸
一起添加4-(8-甲基-4-氧代-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.29 g, 0.83 mmol)、DCM (3 mL)和三氟乙酸 (3 mL)。在室温下搅拌反应物4小时。浓缩混合物，并将残余物溶解于DCM (2×)，并浓缩混合物。在真空下干燥1小时以得到标题化合物(0.556 g, 95%)，其不经纯化或表征即使用。
制备例21
8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮
用4-(8-甲基-4-氧代-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(730 mg, 1.53 mmol)、DCM (15 mL)和三氟乙酸 (15 mL)投入圆底烧瓶，并在室温下搅拌反应物3小时。在减压下浓缩，将残余物溶解于甲醇，添加离子交换树脂Dowex® 50WX4-400(5.5 g)，并在室温下搅拌混合物过夜。过滤混合物并用7M氨/甲醇洗涤离子交换树脂。合并滤液和洗液，并在减压下浓缩以得到作为橙色固体的标题化合物(385 mg, 95%)。LC-ES/MSm/z 250 [M+H]+。
替代制备例21
用DCM (30 mL)预洗涤10 g SCX-2柱，并用8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 双-(2,2,2-三氟乙酸) (0.5 g, 1.05 mmol)于DCM (10 mL)和MeOH (1mL)中的溶液上样。用DCM (30 mL)、随后用MeOH (30 mL)洗涤柱，并用2 M NH3/MeOH (60mL)洗脱。在减压下浓缩含有产物的级分以得到标题化合物(0.26 g, 100%)。
制备例22
三氟-[[4-(8-甲基-4-氧代-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基) 哌嗪-1-基]甲基]硼氢化(boranuide)钾
将8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 (250 mg, 1.00mmol)溶解于THF (4 mL)，并添加溴甲基三氟四氢硼酸钾(potassium bromomethyltrifluoroborate)(208 mg, 1.00 mmol)。在80℃下加热90分钟，然后在氮气流下浓缩。添加丙酮 (30 mL)和碳酸氢钾(100 mg, 1.00 mmol)并在室温下搅拌过夜。通过过滤除去固体，并在减压下浓缩滤液以得到作为灰白色固体的标题化合物(273 mg, 73%)。ES/MS m/z330 [M-K+]-。
实施例1
8-甲基-2-[4-(嘧啶-2-基甲基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮
将8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮; 三-2,2,2-三氟乙酸 (409 g, 531 mmol)溶解于5 L萃取漏斗中的DCM (2.0 L)中。用氮气吹扫漏斗并用顶置式机械搅拌器装备它。添加嘧啶-2-甲醛(66.6 g, 616 mmol)并搅拌40分钟。然后逐份添加三乙酰氧基硼氢化钠 (225.1 g, 1060 mmol)，并在添加之后立即观察到从20℃至36℃的放热。在室温下搅拌反应物过夜。在20℃下将反应物小心倒入10L反应器中的1 M NaOH(2.32 L)，同时用冷却器控制所得放热。用1 N NaOH (2.55 L)将pH调节至8至9。收集有机层并用DCM (2.32 L)萃取水层。合并有机层，浓缩并在氮气流下干燥过夜以得到标题化合物(193 g, 100%粗产物)。
将该批次与4个其他批次合并用于纯化(203 g)。通过硅胶过滤(20 cm直径×8 cm高)纯化，并用90% DCM / 10% 2 M NH3/MeOH洗脱以得到标题化合物(162 g, 84%)。
实施例1 替代合成
合并8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 三-2,2,2-三氟乙酸 (203.23 g, 344 mmol)、嘧啶-2-甲醛 (40 g, 370 mmol)和DMF (343 mL)，并搅拌直至获得均匀溶液(30分钟)。在冰浴中冷却溶液，并以5 g部分、随后5分钟后以10g部分添加氰基硼氢化钠 (25 g, 397 mmol)。搅拌1.5小时，并添加最终10 g氰基硼氢化物。搅拌30分钟，同时维持温度低于25℃。将反应物搅拌过夜并允许25℃温热。将反应混合物倒入含有碳酸氢钠 (115 g, 1.37 mol)和水 (350 mL)的安装顶置式搅拌器的烧杯(4L)。将混合物搅拌20分钟，然后添加EtOAc (1L)并搅拌30分钟。经约30分钟通过硅藻土(700 g)倒入混合物并重力过滤约1小时。然后应用真空并用EtOAc (2 × 1 L)冲洗硅藻土。结合并浓缩有机层以得到具有117 g的粗重量的粘性黄色油状物。通过硅胶快速层析(DCM至90% DCM/MeOH,梯度)纯化油状物。在真空箱中在50℃下干燥所得物质以得到作为白色泡沫状固体的标题化合物(44.22 g, 38%)。LC-ES/MS m/z 342.3 [M+H]+, TR = 0.96 min。
实施例2
2-[4-[(3-氯-2-吡啶基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮
一起添加8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮; 四 2,2,2-三氟乙酸 (0.556 g, 0.788 mmol)、3-氯吡啶甲醛(chloropicolinaldehyde)(557.87 mg,3.94 mmol)于DMF (3 mL)中，随后添加氰基硼氢化钠 (148.6 mg, 2.36 mmol)。将反应物在室温下搅拌5天。用CHCl3 (75 mL)稀释反应物，并用饱和NaHCO3和盐水洗涤。经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩至干燥。将粗产物通过硅胶层析纯化，用DCM至90% DCM/MeOH洗脱以得到标题产物(214 mg, 72%)。LC ES/MS m/z 375.3 (35Cl) (M+H)+。
基本上遵循实施例2中所述的程序，使用适当的醛或酮，在室温下搅拌2小时直至48小时，并监测反应完成，添加更多氰基硼氢化钠(如果需要)和再搅拌24小时，制备以下实施例3、4和5。
a 除了DMF以外添加MeOH (1 mL)作为溶剂。
b 二氯甲烷是溶剂且使用三乙酰氧基硼氢化钠代替硼氢化钠。
c MeOH是溶剂。
实施例6
8-甲基-2-[4-(嘧啶-2-基甲基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮4-甲基苯磺酸盐
将8-甲基-2-[4-(嘧啶-2-基甲基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 (274.5 mg, 0.804 mmol)添加至乙醇 (0.5 mL)，并添加甲苯磺酸单水合物(160 mg)。超声处理以得到暗琥珀红色溶液。添加庚烷 (5 mL)，将混合物加盖，搅拌，并将混合物加热至80℃。混合物固化为褐色-棕色固体。将混合物搅拌30分钟，通过真空过滤收集固体并空气干燥以得到标题化合物(387 mg, 94%)。
实施例6 X-射线粉末衍射
结晶固体的XRPD图案在配备有CuKa源(λ = 1.54060 Å)和Vantec检测器在35 kV和50mA下操作的Bruker D4 Endeavor X-射线粉末衍射仪上获得。在4和40°(以2θ计)之间，用0.0087°的步长(以2θ计)和0.5秒/步的扫描速率，和0.6mm散度，5.28mm固定的反散射和9.5mm检测器狭缝扫描该样品。将干燥粉末填装在石英样品架上，且使用载玻片获得光滑的表面。在结晶学领域中众所周知的是，对于任何给定晶形，衍射峰的相对强度可能随因素诸如结晶形态学和习性引起的优选取向而不同。当存在优选取向的效应时，峰强度改变，但多晶形物的特征峰位置不变。参见，例如美国药典35 – 国家处方集30 第<941>章Characterization of crystalline and partially crystalline solids by X-raypowder diffraction (XRPD) Official 2012年12月1日-2013年5月1日。此外，在结晶学领域中也众所周知的是，对于任何给定晶形，角峰位置可能稍微改变。例如，由于分析样品时的温度或湿度的变化、样品移位或内部标准品的存在或不存在，峰位置可以移动。在本情况下，± 0.2(以2θ计)的峰位置变化将考虑这些潜在变化而不妨碍明确鉴定指定的晶形。可以基于特征峰(通常为较显著的峰)的任何独特的组合(以°2θ为单位)确认晶形。在环境温度和相对湿度下收集的晶形衍射图案基于在8.85和26.77度(2-θ)的NIST 675标准峰进行调整。
制备的实施例6的样品的特征在于具有如下表1中所述的衍射峰(2-θ值)的使用CuKa照射的XRPD图案。具体地，该图案含有在7.68的峰以及一个或多个选自12.02、12.93、15.17、19.24 和23.21的峰，具有0.2度的衍射角容差。
实施例6的X-射线粉末衍射峰
。
实施例7
8-甲基-2-[4-(1-嘧啶-2-基乙基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮
。
实施例8
8-甲基-2-[4-(1-嘧啶-2-基乙基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，异构体1
。
实施例9
8-甲基-2-[4-(1-嘧啶-2-基乙基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，异构体2
合并8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 双-(2,2,2-三氟乙酸)盐(1.0 g, 2.1 mmol)、2-乙酰基嘧啶 (0.38 g, 3.14 mmol)、DMF (3 mL)、MeOH (1mL)、氰基硼氢化钠 (0.20 g, 3.14 mmol)，并在室温下搅拌20小时。添加额外的2-乙酰基嘧啶 (0.38 g, 3.14 mmol)和氰基硼氢化钠 (0.20 g, 3.14 mmol)，并在80℃下加热过夜。在氮气流下蒸发DMF 4天，并通过硅胶快速层析纯化，用DCM至90% DCM/MeOH洗脱以得到标题化合物，实施例7 (330 mg, 44%)作为外消旋体。
使用Phenomene® Lux®纤维素-2柱(2.1 × 25 cm, 5 µm)上的SFC分离8-甲基-2-[4-(1-嘧啶-2-基乙基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮。流动相:40% EtOH (0.2% IPAm)/二氧化碳。流速：70 mL/min。检测：225 nm。获得作为异构体1的第一洗脱峰和作为异构体2的第二洗脱峰。
实施例8，异构体1:135 mg，99.25%纯，以0.75% 异构体2作为杂质(TR = 4.59min; Phenomenex® Lux®纤维素-2柱(2.1 × 25 cm, 5 µm)、流动相:40% EtOH (0.2%IPAm)/二氧化碳，流速：5 mL/min。检测：225 nm)。LC-ES/MS m/z 356.3 (M+H)+。
实施例9，异构体2:121 mg，96.63%纯，以3.36% 异构体1作为杂质 (TR = 5.91min, Phenomenex® Lux®纤维素-2柱(2.1 × 25 cm, 5 µm)、流动相:40% EtOH (0.2%IPAm)/二氧化碳，流速：5 mL/min，检测：225 nm)。LC-ES/MS m/z 356.3 (M+H)+。
实施例10
8-甲基-2-[4-(1-嘧啶-2-基丙基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮
。
实施例11
8-甲基-2-[4-(1-嘧啶-2-基丙基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，异构体1
。
实施例12
8-甲基-2-[4-(1-嘧啶-2-基丙基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，异构体2
基本上遵循如实施例7、8和9中所述的程序使用1-(2-嘧啶基)-1-丙酮和通过硅胶快速层析(用DCM至90% DCM/MeOH的梯度洗脱)纯化而制备实施例10、11和12。通过硅胶层析使用相同条件进行第二次纯化。然后通过高pH制备型HPLC(柱：150 g高分辨率C18 Gold；初始：5%乙腈/95% 10 mM碳酸氢铵w/5% MeOH，以梯度经30分钟至60%乙腈/40%碳酸氢铵w/5%MeOH，检测波长239、254、280和290 nm)进一步纯化以得到标题化合物实施例10 (140 mg,18%)。使用SFC使用对于实施例8和9所述的条件(除了使用Lux®纤维素-4-柱)分离所得对映异构体混合物。
实施例11，异构体1：50 mg，>99.9%纯度(TR = 4.26 min; Phenomenex® Lux®纤维素-4-柱(2.1 × 25 cm, 5 µm)，流动相：40% EtOH (0.2% IPAm)/二氧化碳，流速：5 mL/min，检测：225 nm)。LC-ES/MS m/z 370.2 (M+H)+。
实施例12，异构体2：47 mg，>99.9%纯度(TR = 5.67 min; Phenomenex® Lux®纤维素-4-柱(2.1 × 25 cm, 5 µm)。流动相：40% EtOH (0.2% IPAm)/二氧化碳。流速：5 mL/min。检测：225 nm)，LC-ES/MS m/z 370.2 (M+H)+。
实施例13
2-[4-[(4-甲氧基嘧啶-2-基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮
合并8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 双-(2,2,2-三氟乙酸)盐(0.5 g, 1.0 mmol)、 4-甲氧基嘧啶-2-甲醛 (150 mg, 1.08 mmol)、DMF (10mL)、MeOH (1 mL)和氰基硼氢化钠 (136 mg, 2.17 mmol)，并在室温下搅拌3天。用MeOH稀释并吸附至SCX-2柱上，用MeOH冲洗，然后用2 M NH3/MeOH洗脱，浓缩并通过硅胶快速层析纯化，用DCM至90% DCM/MeOH的梯度洗脱以得到标题化合物(43 mg, 11%)。LC-ES/MS m/z372.1 (M+H)+ TR = 1.519 min。
基本上遵循实施例13的程序使用适当的醛和适当的层析制备以下实施例。
1 搅拌反应物3天。
2 添加额外的醛(1当量)和氰基硼氢化钠 (1.5当量)；然后在80℃下加热6小时。通过反相层析(高pH 5-100)的通用方法进一步纯化。
3 通过反相层析(高pH 9-24)的通用方法进一步纯化。
4 通过反相层析(低pH 0.1% TFA/ACN)、随后SCX-2柱上的层析的通用方法进一步纯化。
5 在室温下搅拌反应物12小时，并通过反相层析(高pH 13-48)的通用方法进一步纯化。
实施例20
2-[4-[(3-氟-2-吡啶基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮
将8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮双-( 2,2,2-三氟乙酸) (20.31 g, 34.34 mmol)悬浮于DCM (114 mL)中，并用氮气吹扫。添加3-氟吡啶-2-甲醛(5.26 g, 41.2 mmol)并搅拌60分钟。然后以一份添加三乙酰氧基硼氢化钠 (14.56 g,68.68 mmol)，并观察到放热至回流。搅拌并使反应物经1小时冷却至室温。倒入0.5 M NaOH(200 mL)并用2 M NaOH调节pH:7-8。收集有机层并用DCM (2 × 200 mL)萃取水层。合并并经硫酸钠干燥有机层，过滤，并浓缩以得到油状物。通过硅胶层析(400 g)纯化，用95% DCM/5% MeOH洗脱8个柱体积并用90% DCM/10% MeOH洗脱8个柱体积，以得到具有>97% HPLC纯度的标题化合物(7.59 g, 61.7%)和还有2.64 g (21.5%)的具有87% HPLC纯度的额外产物。LC ES/MS m/z 359.1 (M+1) +。
实施例21
2-[4-[(2-甲氧基苯基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮
合并8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 双-(2,2,2-三氟乙酸)盐(0.25 g, 0.52 mmol)、2-甲氧基苯甲醛 (0.21 g, 1.57 mmol)、DMF (15 mL)、MeOH (5 mL)和氰基硼氢化钠 (100 mg, 1.57 mmol)，并在室温下搅拌12小时。用甲醇稀释并吸附至SCX-2柱上，用MeOH冲洗，然后用2 M NH3/MeOH洗脱，浓缩并通过反向层析纯化(参见反相层析(高pH 21-55)的通用方法)，以得到标题化合物(223 mg, 59%)。LC-ES/MS m/z370.2 (M+H)+。
基本上如实施例21中所述使用适当的醛制备以下化合物。
a 反向层析(高pH 30-64)。
b 反向层析(高pH 23-57)。
c 反向层析(高pH 13-48)。
d 反向层析(高pH 39-73)。
实施例28
2-[4-[(3-氟-2-吡啶基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮, 二盐酸盐
在2个小瓶中，将4M HCl/二氧杂环己烷 (1 mL, 4 mmol)和2-[4-[(3-氟-2-吡啶基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 (0.117 g, 0.65 mmol)添加至各DCM (5 mL)。摇动小瓶1小时，合并至1个小瓶中，然后在氮气流下蒸发过夜。将物质在真空箱中干燥过夜以得到标题化合物(0.28 g, 99%)。LC-ES/MS m/z 359.2 [M+H]+,TR = 1.04 min。
基本上如实施例28中所述使用实施例21-27的适当化合物制备以下实施例。
实施例37
2-[[4-(8-甲基-4-氧代-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌嗪-1-基]甲基]苯甲腈; 双-2,2,2-三氟乙酸
合并8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 双-( 2,2,2-三氟乙酸) (0.364 g, 0.76 mmol)于DMF (3.2 mL)中的溶液与2-氰基苯甲醛 (0.499 g, 3.18mmol)，并在室温下搅拌1小时。添加氰基硼氢化钠 (0.143 g, 2.28 mmol)并在室温下搅拌过夜。倒入水中并尝试通过过滤收集。观察到过滤器的堵塞，然后添加2 N NaOH和NaCl(水溶液)并将粗产物萃取至乙酸乙酯(3×)中。合并有机层，经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶层析纯化，用以下洗脱：10分钟等度(isocratic)的98% DCM /2%乙醇，逐步梯度至95%DCM /5%乙醇，并保持45分钟。通过制备型反相层析进一步纯化，用5%乙腈(0.1% TFA)/95%水(0.1%TFA)至54%乙腈(0.1% TFA)/46%水(0.1%TFA)的梯度洗脱，以得到标题化合物(48.1mg, 10.7%)。LC-ES/MS m/z 365.2 [M+H]+。
实施例38
2-[4-[(2-氯苯基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮
基本上如实施例37中所述使用2-氯-5-甲基-嘧啶2-氯苯甲醛制备标题化合物。通过硅胶快速层析(5% EtOH/CHCl3至10% EtOH/CHCl3梯度)纯化粗物质。将该物质从DMSO/MeOH重结晶以获得白色固体(83 mg, 29%)。LC-ES/MS m/z 374.3 (35Cl) [M+H]+。
实施例39
2-[4-[(5-氟嘧啶-2-基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮
合并三氟-[[4-(8-甲基-4-氧代-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌嗪-1-基]甲基]硼氢化(boranuide)钾(273 mg, 0.74 mmol)、2-氯-5-氟嘧啶 (98 mg, 0.74 mmol)、碳酸铯 (723 mg, 2.22 mmol)、X-Phos (71 mg, 0.15 mmol)、THF (10 mL)和水 (1 mL)，并用氮气流脱气2分钟。添加乙酸钯(II) (17 mg, 0.074 mmol)并在80℃下加热过夜。在乙酸乙酯和水之间分配混合物并分离有机层。经硫酸镁干燥、过滤并在减压下浓缩滤液。通过硅胶快速层析纯化所得残余物，用DCM至90% DCM/MeOH洗脱以得到标题化合物(20 mg,7.5%)。LC-ES/MS m/z 360.2 [M+H]+。
实施例40
2-[[4-(8-甲基-4-氧代-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌嗪-1-基]甲基]吡啶-3-甲腈
将2-[4-[(3-溴-2-吡啶基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 (167 mg, 0.398 mmol)溶解于DMF (10 mL)，并用氮气流脱气1分钟。添加四(三苯基膦)钯 (92 mg, 0.080 mmol)和氰化锌(187 mg, 1.59 mmol)，并将混合物在120℃下加热过夜。冷却反应物并用MeOH稀释。将混合物转移至10 g SCX-2柱，并用2 M NH3/MeOH洗脱。浓缩并通过反相层析(高pH 9-29)进一步纯化所得残余物以得到标题化合物(35 mg,24%)。LC-ES/MS m/z 366.2 (M+H)+。
实施例41
2-[4-[(4-氯嘧啶-2-基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮
合并作为四氯化碳中的粗溶液的2-(溴甲基)-4-氯-嘧啶 (322 mg, 1.55 mmol)(5mL)、DCM (2 mL)、三乙胺 (0.65 mL, 4.65 mmol)和8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮双-(2,2,2-三氟乙酸) (739 mg, 1.55 mmol)，并在25℃下搅拌3天。在DCM和水之间分配反应混合物，并用DCM萃取水层。合并有机层，经MgSO4干燥，过滤，并浓缩。通过质量指导的SFC(柱：4-硝基苯磺酰胺，Princeton Chromatography，150 × 30mm，流速 = 100 mL/min；方法：30秒等度的95% CO2/14 mM氨/MeOH，然后经330秒梯度至60%CO2/14 mM氨/MeOH梯度，然后经10秒斜变至50% CO2/14 mM氨/MeOH，并保持30秒)纯化所得残余物，以得到71 mg具有氨盐杂质的期望产物。通过硅胶快速层析(CH2Cl2/MeOH, 90:10)进一步纯化产物以得到标题化合物(28 mg, 5%)。LC-ES/MS m/z 376.0 [M+H]+。
实施例42
8-甲基-2-[4-(吡嗪-2-基甲基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮
合并8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 双-(2,2,2-三氟乙酸) (500 mg, 1.05 mmol)、三乙胺 (0.73 mL, 5.2 mmol)、碘化钠 (78.5 mg, 0.52mmol)和乙腈 (7 mL)。添加2-(氯甲基)吡嗪 (201 mg, 1.57 mmol)，并在25℃下搅拌72小时。用DCM和水稀释反应物，并将产物萃取至DCM中。用饱和NaHCO3和盐水洗涤有机部分，经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速层析(DCM / 2M NH3/MeOH, 90:10)纯化所得残余物以得到作为黄色固体的标题化合物(249 mg, 0.72 mmol, 70%)。LC-ES/MS m/z 342.0[M+H]+, TR = 0.99 min。
基本上遵循实施例42中所述的程序使用适当的卤代-甲基吡嗪制备以下实施例。
实施例45
2-[4-[(3,5-二氟-2-吡啶基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮
添加2-(氯甲基)-3,5-二氟吡啶 (182 mg, 1.11 mmol)、8-甲基-2-哌嗪-1-基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 (260 mg, 1.04 mmol)、碳酸钾 (2.2 g, 15 mmol)和乙腈 (5 mL)，并在室温下搅拌混合物过夜。在减压下浓缩反应混合物，并通过硅胶层析(用MeOH/DCM, 1/20洗脱)纯化残余物以得到标题化合物(160 mg, 43%)。LC-ES/MS m/z 377.2(M+H)+, TR = 1.11 min。
癌症越来越被认识到是疾病的异类集合，所述疾病的起始和进展通过一种或多种调节细胞和组织微环境中的DNA修复、基因组稳定性、细胞增殖、细胞死亡、粘附、血管生成、侵入和转移的基因的异常活化或功能来诱导。“癌症”基因的变异或异常功能可由以下导致：天然存在的DNA多态性、基因组拷贝数的变化(通过扩增、缺失、染色体丢失或复制)、基因和染色体结构的变化(通过染色体易位、倒位或其他导致失调的基因表达的重排)和点突变。癌肿瘤可由一种异常基因功能诱导，且由相同的异常基因功能维持，或者其维持和发展由额外的异常基因活化或功能加重。
除了上述遗传染色体畸变之外，各癌症还可包括基因组的表观遗传修饰，包括DNA甲基化，基因组印迹和通过乙酰化、甲基化或磷酸化进行的组蛋白修饰。表观遗传修饰可在恶性肿瘤的诱导和/或维持中发挥作用。
通过活组织检查、免疫表型分型和其他测试诊断癌症恶性肿瘤是已知和常规使用的。除了高分辨率染色体显带和高级染色体成像技术之外，可以通过细胞遗传学分析诸如荧光原位杂交(FISH)、核型分析、光谱核型分析(SKY)、多重FISH(M-FISH)、比较基因组杂交(CGH)、单核苷酸多态性阵列(SNP芯片)和本领域技术人员已知和使用的其他诊断和分析测试确定癌症疑似病例中的染色体畸变。
Wnt/β-联蛋白信号传导通路的一个重要部分是β-联蛋白破坏复合物对下游效应物β-联蛋白的调节的蛋白水解。β-联蛋白破坏复合物的主要成分是腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)、轴蛋白和GSK3α/β。在Wnt通路活化不存在的情况下，细胞溶质β-联蛋白被组成型磷酸化且被靶向降解。Wnt刺激后，β-联蛋白破坏复合物分离，其导致细胞溶质β-联蛋白的积累，易位至核，和Wnt典型通路应答基因的转录。
已经进行相当大的努力来鉴定抑制经典Wnt/β-联蛋白信号传导通路的药剂。TNKS1和TNKS2抑制剂诸如XAV939, Huang等人, Nature, 2009, 461, 614; JW55, Waaler等人, Cancer Res., 2012, 72(11), 2822; G007-LK, Lau等人, Cancer Res., 2013,73(10), 3132; TNKS656, Shultz等人, J. Med. Chem. 2013年7月11日在线公开, DOI:10.1021/jm400807n;和WO 2013/117288是已知的。尽管存在这些努力，但此时还没有临床TNKS1和TNKS2抑制剂治疗药剂出现。
已经在癌症中观察到由Wnt蛋白的过表达或影响β-联蛋白破坏复合物的组分的突变介导的该通路的异常活化，因此导致β-联蛋白的稳定化。值得注意的是，APC的截短突变是结肠直肠癌中最普遍的遗传改变(Miyaki, M. 等人Cancer Res. 1994, 54, 3011-20;Miyoshi, Y. 等人Hum. Mol. Genet. 1992, 1, 229-33; and Powell, S. M. 等人Nature 1992, 359, 235-7)。此外，已经在分别具有肝癌和结肠直肠癌的患者中鉴定了轴蛋白1和轴蛋白2突变，Wnt信号传导通路的负调控剂(Taniguchi, K. 等人 Oncogene2002, 21, 4863-71; Liu, W. 等人 Nat. Genet. 2000, 26, 146-7; Lammi, L. 等人Am. J. Hum. Genet. 2004, 74, 1043-50)。这些体细胞突变导致β-联蛋白的Wnt-依赖的稳定化和β-联蛋白介导的转录的组成型活化。
异常Wnt信号传导通路活性已经牵涉于几种癌症(Waaler 等人Cancer Res.2012, 72, 2822-2832; Busch 等人BMC Cancer 2013, 13, 211; Yang 等人Oncogene2011, 30, 4437-4446;De Robertis 等人Mol. Cancer Ther.2013, 12, 1180-1189;Polakis, P. Curr. Opin. Genet. Dev. 2007, 17, 45-51; and Barker, N. 等人 Nat.Rev. Drug Discov. 2006, 5, 997-1014)，包括结肠直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌和成胶质细胞瘤。异常Wnt/β-联蛋白通路信号传导活性已经牵涉于T-细胞淋巴瘤、T-淋巴母细胞性淋巴瘤、T-细胞急性淋巴细胞性白血病(T-ALL) Groen 等人Cancer Res.2008, 68, 6969-6977；多发性骨髓瘤Qiang 等人Oncogene 2003, 22, 1536-1545，和Chim 等人Leukemia2007, 21, 2527-2536；套细胞淋巴瘤Gelebart 等人Blood 2008, 112, 5171-5179；慢性粒细胞白血病(CML)，Heidel 等人Cell Stem Cell 2012, 10(4):412-424，和急性粒细胞白血病(AML)，Ysebaert 等人Leukemia 2006, 20, 1211-1216。
已经发现，可以通过经由聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)酶端锚聚合酶1和端锚聚合酶2的抑制稳定轴蛋白/APC/GSK3α/β破坏复合物而促进β-联蛋白降解，Huang 等人Nature2009, 461, 614-620。
以下体外和体内研究表明例举和测试的式I的化合物或其药学上可接受的盐在抑制hTNKS1和hTNKS2、稳定化HEK293细胞中的轴蛋白2、针对PARP1抑制的选择性、降低Wnt可诱导的基因表达的表达和体内抗肿瘤活性中的Wnt /β-联蛋白信号传导通路抑制活性和效力。这些测定通常被本领域技术人员认可为表明人临床化学治疗活性。TNKS 1和TNKS 2的抑制据信针对Wnt/β-联蛋白信号传导通路的异常活化是有效的。证明Wnt/β-联蛋白信号传导通路抑制活性和效力的测定可以基本上如下或通过提供类似数据的类似测定来实施。
测定
通常，使用商业可得的材料和本领域技术人员已知且常规使用的程序生成细胞系。
表明hTNKS酶活性的化合物抑制的生物化学测定
hTNKS1和hTNKS2的酶促活性使用酶联免疫吸附测定(ELISA)进行评价，所述酶联免疫吸附测定以384孔形式检测并入板结合的端粒重复结合因子1(TRF1)蛋白(NCBI，登录号NP_059523.2 (SEQ ID NO:1)的聚ADP核糖。使用重组hTNKS1 (NCBI，登录号NP_003738.2 (SEQID NO:2)或hTNKS2 (NCBI，登录号NP_079511.1 (SEQ ID NO:3)酶，该测定使用生物素化的NAD+，且使用生成色度信号的链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物和TMB过氧化物酶底物测量其并入重组hTRF1。通过在大肠杆菌中表达具有N-末端Flag标签的全长人TRF1蛋白而生成重组Flag-标签的hTRF1蛋白。通过根据Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的制造商的方案在杆状病毒中表达具有N-末端Flag标签的全长人TNKS1而生成重组Flag-hTNKS1(具有Q83P的改变)蛋白(Invitrogen™；还参见Invitrogen™用户手册，版本F，日期为2010年9月4日；和日期为2002年2月27日的Invitrogen™说明手册)。hTRF1和hTNK1上的Flag标签仅用于酶的纯化，且不以其他方式参与ELISA测定。
使用TBS包被缓冲液(50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl)将Flag-TRF1稀释至5µg/ml，且将25 μl添加至Corning 3700板(Tewksbury, MA #CLS3700)的各孔。将板在4℃孵育过夜。第二天，用50 µl/孔洗涤缓冲液(含有0.1% Tween-20 (Sigma, St. Louis, MO #7949)的PBS (从10×浓缩物制备，使用Hyclone, Logan, UT #SH30258.01))将板洗涤3次，随后使用50 µl 1%酪蛋白封闭缓冲液(Thermo Scientific, Waltham, MA #37528)/1×PBS (Roche, Indianapolis, IN #11666789001)在室温封闭1.5小时。封闭之后，用50 µl/孔洗涤缓冲液将板洗涤3次。设置酶测定，其使用2 µg/ml Flag-hTNKS1、9.5 µM NAD+(Sigma, St. Louis, MO #N0632)、0.5 µM 生物素-NAD+ (Trevigen, Gaithersburg, MD#4670-500-01)，和在50 mM Tris、pH 8.0 (Invitrogen™, Grand Island, NY #15568-025)、4 mM MgCl2、0.2 mM DTT、0.5% Triton X-100 (Roche, Indianapolis, IN #11332481001)和1.0 % DMSO中从10 µM稀释至4 nM最终浓度的化合物，总体积为25 µl。将反应物在室温孵育120分钟，且通过用50 µl/孔洗涤缓冲液洗涤板3次而停止。生物素-NAD+并入的检测使用25 µl/孔的以洗涤缓冲液1:3000稀释的链霉抗生物素-HRP(GE LifeSciences Pittsburgh, PA #RPN1231V)进行，且在室温孵育60分钟。然后使用50 µl/孔洗涤缓冲液将板洗涤3次。这随后为与25 µl/孔TMB过氧化物酶底物试剂盒(KPL,Gaithersburg, MD #50-76-02和#50-65-02)在室温孵育15分钟，且使用25 µl/孔的2 NH2SO4停止反应。使用Envision型号2103在450 nm阅读吸光度。
通过基本上遵循上面对于hTNKS1描述的方法和使用hTNKS2，准备基本上类似的ELISA测定。
针对两种hTNKS同工型测试的那些化合物的活性显示于表7中。
平均值±SEM；SEM＝平均值的标准误差
表7中的数据提供证据证明测试的化合物针对人端锚聚合酶的两种同工型的体外抑制活性。
表明端锚聚合酶抑制剂的基于细胞的活性的EGFP-轴蛋白2稳定化测定
通过用含有N-末端截短的EGFP标签(氨基酸228-466；SEQ ID NO:7)的轴蛋白2构建体稳定转染HEK293细胞而制备增强型绿色荧光蛋白-轴蛋白2细胞(EGFP-轴蛋白2)。通过定量384-孔形式中各种处理之后稳定细胞系中的EGFP的水平而监测轴蛋白2水平、特别是轴蛋白2稳定化的变化。Acumen激光扫描细胞计数器中监测荧光的增加，其反映作为端锚聚合酶抑制的结果的EGFP-轴蛋白2融合蛋白的稳定化。
将HEK293细胞(ATCC, Manassas, VA #CRL-1573)维持于DMEM:F12的完全培养基(Invitrogen™, Grand Island, NY #93-0152DK)，其含有5% FBS (Invitrogen™, GrandIsland, NY #10082-147)、20 mM HEPES (Hyclone, Logan, UT #SH30237.01)和Glutamax(Invitrogen™, Grand Island, NY #35050-061)。通过用pcDNA3.1+中的含有截短的(氨基酸228-466) EGFP N-末端标签(全长EGFP, NCBI, 登录号ABG78037.1 (SEQ ID NO:5)的全长人轴蛋白2 (NCBI, 登录号NP_004646.3 (SEQ ID NO:4))转染HEK293细胞而生成EGFP-轴蛋白2细胞(根据制造商的方案, Invitrogen™, Grand Island, NY #V79020)。将稳定的EGFP-轴蛋白2细胞维持于添加800 µg/ml G418 (Invitrogen™, Grand Island,NY #10131-035)的上述HEK293完全培养基中。通过将2000个EGFP-轴蛋白2细胞/孔铺板于聚-D-赖氨酸包被的BD 384-孔板(BD Biosciences, San Jose, CA #356663)并在30 µl/孔完全HEK293培养基中孵育而进行EGFP-轴蛋白2稳定化测定，并在37℃、5% CO2下 生长过夜。将100% DMSO中的化合物以100 nl/孔直接添加至细胞培养基。测定中测试的化合物的最终浓度为33 µM -1.7 nM，测定中的DMSO的最终浓度为0.33%。在37℃、5% CO2下将细胞与化合物孵育24小时，并在室温下使用2％最终浓度的甲醛固定细胞15分钟。将固定的细胞各自在40 µl/孔含有0.1% Triton X-100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA #BP151-500)的PBS (Hyclone, Logan, UT #SH30264.01)中洗涤两次，持续20分钟。然后将它们使用30 µl/孔含有10 µg/ml碘化丙啶(Invitrogen™, Grand Island, NY #P3566)和50 µg/ml RNaseA (Sigma, St. Louis, MO #R6513)的PBS进行染色。使用经门控以具有10% EGFP/细胞的Acumen型号eX3 Acumen激光扫描细胞计数器测量EGFP强度。
平均值±SEM；SEM＝平均值的标准误差
表8中的数据提供证据证明测试的化合物在HEK293细胞中稳定化轴蛋白2。
评价端锚聚合酶抑制剂的选择性(相比于PARP1)的人PARP1酶测定
聚ADP-核糖聚合酶1(PARP1)测定是以384孔形式检测并入板结合的组蛋白的聚ADP核糖的ELISA。使用重组hPARP1酶，该测定使用生物素化的NAD+，并使用生成色度信号的链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物和TMB过氧化物酶底物测量并入组蛋白。
将组蛋白在包被缓冲液(50 mM Na2CO3, pH 9.4, Mallinckrodt, St. Louis,MO)中稀释至0.1 mg/ml，并将25 µl添加至Corning 3700板的各孔。将板在4℃下孵育过夜。第二天，用50 µl/孔洗涤缓冲液(含有0.1% Tween-20的PBS (从10×浓缩物制备)将板洗涤3次，随后使用50 µl 1%酪蛋白封闭缓冲液/1× PBS(Roche, Indianapolis, IN #11666789001)在室温下封闭1.5小时。封闭之后，用50 µl/孔洗涤缓冲液将板洗涤3次。通过使用以下设置PARP1酶测定：0.01 U/µl hPARP1 (Trevigen, Gaithersburg, MD #4668-500-01)，0.5X PARP混合物，活化的DNA (Trevigen, Gaithersburg, MD #4671-096-03和#4671-096-06)，和在含有50 mM Tris(pH 8.0)、10 mM MgCl2、1 mM DTT (Invitrogen™,Grand Island, NY #15508-013)、0.5% Triton X-100和1.0 % DMSO的测定缓冲液中从10µM稀释至4 nM最终浓度的化合物。将反应物在室温下孵育60分钟，且通过用50 µl/孔洗涤缓冲液洗涤板3次而停止。生物素-NAD+并入的检测使用25 µl/孔的以洗涤缓冲液1:3000稀释的链霉抗生物素-HRP进行，且在室温下孵育60分钟。然后使用50 µl/孔洗涤缓冲液将板洗涤3次。这随后为与25 µl/孔TMB过氧化物酶底物试剂盒(KPL, Gaithersburg, MD #50-76-02和#50-65-02)在室温孵育15分钟，且使用25 µl/孔的2 N H2SO4停止反应。使用Envision型号2103在450 nm阅读吸光度。
平均值±SEM；SEM＝平均值的标准误差
表9中的数据提供证据证明当与PARP1抑制相比时各测试化合物对端锚聚合酶的选择性抑制。
测定端锚聚合酶抑制剂降低Wnt-可诱导基因的表达的能力的DLD-1 TOPFlash测定
DLD-1细胞含有编码截短的APC蛋白的腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)基因中的突变。该蛋白不能结合破坏复合物，并通过允许β联蛋白易位至核并活化TCF/LEF转录因子而引起组成型活化的Wnt通路 。DLD-1 TOPFlash是通过连接至荧光素酶报道分子的TCF4启动子的稳定转染而衍生自DLD-1(人结肠直肠腺癌)细胞的报道细胞系。通过以96孔形式测量发光而定量细胞裂解物中的荧光素酶的量。
将DLD-1细胞(ATCC, Manassas, VA, #CCL-221)维持于含有10% FBS (Hyclone,Logan, UT #SH30070.03)的RPMI的完全培养基(Invitrogen™, Grand Island, NY #11875-093)中。根据制造商的方案通过Cignal Lenti TCF/LEF报道分子(Luc) (Qiagen,Valencia, CA #CLS-018L-8, lot#BX16)以10的MOI感染DLD-1细胞而生成DLD-1 TOPFlash细胞。将Polybreen (Sigma, St. Louis, MO #H9268)添加至8 µg/ml的最终浓度，并将细胞在37℃、5% CO2下孵育过夜。第二天，将培养基更换为含有10 µg/ml嘌呤霉素(Clontech,Mountain View, CA #631305)的新鲜生长培养基，并将细胞在37℃、5% CO2下孵育额外3天以生成稳定的细胞系。通过将DLD-1 TOPFlash细胞以10,000个细胞/孔铺板于Corning 96孔白色/透明板(Corning Tewksbury, MA #3610)中并在30 µl/孔含有RPMI (Hyclone,Logan, UT #SH30027.01)、10% FBS和10 µg/ml嘌呤霉素的完全培养基中孵育而进行TOPFlash测定，并在37℃、5% CO2下生长过夜。将100% DMSO中的化合物28.5倍稀释于含有0.2% BSA (稀释自7.5% BSA Invitrogen™, Grand Island, NY #15260-037)的OptiMEM® (Invitrogen™, Grand Island, NY #31985-062)中，并将5 µl稀释的化合物添加至30µl细胞培养基化合物/孔。测定中测试的化合物的最终浓度为50 µM -1.5 nM，测定中的DMSO的最终浓度为0.48%。在37℃、5% CO2下将细胞与化合物孵育24小时，并将板从培养箱中取出，并在室温下放置30分钟。通过将2.296g DTT (Sigma, St. Louis, MO #D0632)、1.152g CoA (Sigma, St. Louis, MO #C3019)、0.248g ATP (Sigma, St. Louis, MO #A7699)和0.42g荧光素(Biosynth AG, Itasca, IL #L-8240)溶解于1升含有150 mM Tris(108.15 ml 1M Tris HCl和41.85 ml 1M Tris Base (Sigma, St. Louis, MO #T3253和T-1503))、3 mM MgCl2和3% Triton X-100的Triton-X100裂解缓冲液中而制备BugLite™(3×)试剂。将板平衡至室温之后，将18 µl 3× BugLite试剂添加至各孔，并在振荡下将板在室温下孵育30分钟。使用Envision型号2103测量发光。
。
平均值±SEM；SEM＝平均值的标准误差
表10的数据表明，测试的化合物是Wnt可诱导基因的抑制剂，如TOPFlash Wnt报道分子测定所测量。
端锚聚合酶抑制剂的体内抗肿瘤活性的评价：
C57BL/6J-ApcMin/J品系小鼠在Apc基因的密码子850处携带截短突变，并在3-6个月龄时发展肠息肉和结肠直肠肿瘤。APC基因中的截短导致Wnt信号传导通路的活化，且在这些小鼠中的肿瘤前期/肿瘤性病变中经常检测到升高水平的β联蛋白。
为了评价端锚聚合酶抑制剂的体内抗肿瘤活性，C57BL/6J-ApcMin/J品系小鼠购自Jackson Laboratories (保存编号002020)，并驯化1周。将动物分成2组，并用25 mg/kg(BID)的实施例1或媒介物处理连续60天。在处理期结束时，将动物处死并在解剖显微镜下计数小肠中的息肉数目。如表11中所示，与媒介物处理的动物相比时，用实施例1化合物处理的C57BL/6J-ApcMin/J品系小鼠在小肠中具有统计学显著较低数目的肿瘤。
表11
| 处理 | 动物数/组 | 平均息肉数/动物 | p值 |
| 媒介物 | 13 | 7.3 ± 0.53 | |
| 实施例1 | 9 | 4.3 ± 0.70 | 0.0028 |
表11中的数据提供证据证明，用实施例1体内处理降低C57BL/6J-ApcMin/J品系小鼠中的肠息肉的数目。
集落形成测定
还针对四种不同的人肿瘤细胞系(三种衍生自胰腺肿瘤(Capan-2、HPAF-II和Panc04.03)和一种衍生自非小细胞肺癌(A549))在体外集落形成测定中测试实施例1化合物。使用商业可得的材料通过本领域技术人员已知且常规使用的程序实施该测定。
将A549细胞(ATCC, Manassas, VA # CCL-185)维持于含有10% FBS(Invitrogen, Grand Island, NY #16000-044)的F12K的完全培养基(Hyclone, Logan,UT #SH30526)中。将Capan-2细胞(ATCC, Manassas, VA # HTB-80)维持于含有10% FBS(Invitrogen, Grand Island, NY #16000-044)的McCoys 5A的完全培养基(Hyclone,Logan, UT #SH30200)中。将HPAF-II细胞(ATCC, Manassas, VA #CRL-1997)维持于含有10% FBS (Invitrogen, Grand Island, NY #16000-044)的EMEM的完全培养基(Hyclone,Logan, UT #SH30024)中。将Panc 04.03细胞(ATCC, Manassas, VA #CRL-2555)维持于含有15% FBS (Invitrogen, Grand Island, NY #16000-044)和20 µg/ml胰岛素(Sigma,St. Louis, MO #I9278)的RPMI的完全培养基(Hyclone, Logan, UT #SH30255)中。通过在6-孔板(Corning Life Sciences, Tewksbury, MA #353046)中各自以250细胞/孔铺板A549细胞；以2000细胞/孔铺板Capan-2细胞；以1000细胞/孔铺板HPAF-II细胞或以2000细胞/孔铺板Panc 04.03细胞、在2 ml完全培养基中孵育而进行集落形成测定，并在37℃、5%CO2下生长过夜。第二天，对于各细胞系，除去培养基并用2 ml各新鲜生长培养基替换。将100% DMSO中的测试化合物在100% DMSO中稀释至1000X浓度，并将2 µl添加至孔中的2 ml培养基以达到0.03至3 µM的最终浓度。在37℃、5% CO2下孵育细胞。每三至四天，如前对各细胞系除去培养基并用2 ml新鲜完全培养基替换。培养基更换之后，如上添加新鲜化合物。将细胞在化合物存在的情况下孵育总共11天。在第11天，除去培养基并用5 ml DPBS(Hyclone, Logan, UT #SH30028)洗涤一次。将结晶紫染料(20%甲醇(EMD Millipore,Billerica, MA #MX0490-4)中的0.5%结晶紫(Sigma, St Louis, MO, #C3886))添加至各孔(0.4 ml)，并在室温下孵育15分钟。然后各孔用DPBS洗涤两次，并使用Fuji LAS4000(FujiFilm, Tokyo, Japan)对板拍照。各孔内的集落面积的分析使用FujiFilm Colony版本1.1软件(FujiFilm, Tokyo, Japan)来进行。
表12中的数据证明当与对照相比时实施例1化合物针对测试的各细胞系抑制集落形成。
序列
SEQ ID NO:1 - hTRF1 - 蛋白
SEQ ID NO:2 - hTNKS1 - 蛋白
SEQ ID NO:3 - hTNKS2 - 蛋白
SEQ ID NO:4 - hAxin2 - 蛋白
SEQ ID NO:5 – EGFP – 全长蛋白
SEQ ID NO:6 – Flag肽
SEQ ID NO:7 – EGFP – 截短的蛋白氨基酸228-466
Claims (12)
1.具有下式的化合物：
其中：
Y是：
、 、或；
X是–CH2-、-C(CH3)H-或–C(CH2CH3)H-；
R1是氢、羟基或卤素；
R2是氢、卤素、-CN、-CH3、CF3或-OCH3；
或其药学上可接受的盐。
2.权利要求1的化合物，其中：
Y是：
或；
X是–CH2-、-C(CH3)H-或–C(CH2CH3)H-；
R1是氢、羟基或卤素；
R2是氢、卤素、-CN、-CH3、CF3或-OCH3；
或其药学上可接受的盐。
3.权利要求1或2的化合物，其中：
Y是
；
X是–CH2-、-C(CH3)H-或–C(CH2CH3)H-；
R2是氢、卤素、-CN、-CH3、CF3或-OCH3；
或其药学上可接受的盐。
4.权利要求1或2的化合物，其中：
Y是：
；
X是–CH2-、-C(CH3)H-或–C(CH2CH3)H-；
R1是氢、羟基或卤素；
R2是氢、卤素、-CN、-CH3、CF3或-OCH3；
或其药学上可接受的盐。
5.权利要求1、2或3中任一项的化合物，其为：
8-甲基-2-[4-(嘧啶-2-基甲基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，或其药学上可接受的盐；
8-甲基-2-[4-(1-嘧啶-2-基乙基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，或其药学上可接受的盐；
2-[4-[(4-氯嘧啶-2-基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，或其药学上可接受的盐；或
2-[4-[(4-甲氧基嘧啶-2-基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，或其药学上可接受的盐。
6.权利要求1、2或4中任一项的化合物，其为：
2-[4-[(3-溴-2-吡啶基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮或其药学上可接受的盐；
2-[4-[(3-氯-2-吡啶基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，或其药学上可接受的盐；
2-[4-[(3-氟-2-吡啶基)甲基]哌嗪-1-基]-8-甲基-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮，或其药学上可接受的盐；或
2-[[4-(8-甲基-4-氧代-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)哌嗪-1-基]甲基]吡啶-3-甲腈，或其药学上可接受的盐。
7.权利要求1、2、3或5中任一项的化合物，其为8-甲基-2-[4-(嘧啶-2-基甲基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-酮，或其药学上可接受的盐。
8.权利要求1、2、3、5或7中任一项的化合物，其为8-甲基-2-[4-(嘧啶-2-基甲基)哌嗪-1-基]-3,5,6,7-四氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮 4-甲基苯磺酸盐。
9.药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
10.治疗患者中的癌症的方法，所述癌症是结肠直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、成胶质细胞瘤、T-细胞淋巴瘤、T-淋巴母细胞性淋巴瘤、T-细胞急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞白血病或急性粒细胞白血病，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的权利要求1至8中任一项的化合物或其药学上可接受的盐。
11.权利要求1至8中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗。
12.权利要求1至8中任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗癌症，所述癌症是结肠直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、成胶质细胞瘤、T-细胞淋巴瘤、T-淋巴母细胞性淋巴瘤、T-细胞急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞白血病或急性粒细胞白血病。
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