KR20160063395A - 탄키라제 억제제로서의 피리도[2,3-d]피리미딘-4-온 화합물 - Google Patents

Abstract

피리도[2,3-d]피리미딘-4-온 화합물, 이 화합물을 함유하는 제제, 및 탄키라제 1 및 2 억제제 화학식 I로서 그의 용도.
<화학식 I>

Description

탄키라제 억제제로서의 피리도[2,3-d]피리미딘-4-온 화합물{PYRIDO[2,3-d]PYRIMIDIN-4-ONE COMPOUNDS AS TANKYRASE INHIBITORS}

Wnt 신호전달은 β-카테닌-매개의 정규(canonical) 경로, 비-정규 평면 세포 극성 및 Wnt/칼슘 경로를 포함하는 세 가지 세포내 신호전달 캐스케이드를 촉발한다. 진화적으로 보존된 정규 Wnt 신호전달 경로는 세포 증식, 분화, 부착 및 유지를 포함하는 많은 세포 과정을 조절한다. 세포 내 β-카테닌 단백질 수준을 조절하는 정규 경로는 Wnt 리간드가 세포 표면 프리즐드(Frizzled) 및 리포단백질 수용체-연관 단백질(LRP)5/6 보조-수용체와 결합할 때 개시되고, 이는 APC/액신(Axin)/GSK-3(선종성 결장 폴립증(adenomatous polyposis coli; APC), 액신, 글리코겐 신타제 키나제 3α/β(GSK3)) 해체 복합체(destruction complex)로부터 키나제 GSK3의 변위를 촉진한다. Wnt 결합이 존재할 경우(온-상태), 디쉐블드(Dishevelled)(Wnt 경로 내 단백질)는 활성화되어 해체 복합체로부터 멀리 GSK3를 동원해 시토졸 β-카테닌의 축적, 핵으로의 β-카테닌의 전위, T-세포 인자/림프성 인핸서 인자(TCF/LEF) 패밀리 전사 인자와의 상호작용 및 정규 Wnt 경로 반응성 유전자의 전사를 유발한다. Wnt 리간드의 부재시(오프-상태), 시토졸 β-카테닌은 구성적으로 인산화되고 프로테아좀에 의한 유비퀴틴화 및 분해의 표적이 된다.

두 개의 매우 상동의 인간 탄키라제 동형(isoform)인 탄키라제 1 및 2(TNKS1 및 TNKS2)는 기질로서 β NAD+를 사용해 표적 단백질에 계속적으로 ADP 리보스 모이어티를 부가하는 단백질의 번역후 변형을 촉매하는(파릴레이션 또는 파실레이션) 폴리(ADP-리보스)중합효소(PARP) 효소 패밀리의 구성원이다. 탄키라제의 단백질 기질 중 하나는 β-카테닌 해체 복합체의 농도-제한 요소인 액신이고, 파실레이션은 액신에 분해를 위한 표시를 하며, 탄키라제 억제는 액신 안정화, Wnt 신호전달 억제 및 β 카테닌 분해로 이어진다.

Wnt 신호전달 경로 활성화 돌연변이는 광범위한 암에서 발견되며 종양 발병, 유지, 및/또는 진행에 기여하는 것으로 여겨진다. 따라서, 탄키라제 활성의 억제는 암 예컨대 결장직장암, 위암, 간암, 유방암(삼중 음성 유방암을 포함), 난소암, 수모세포종, 흑색종, 폐암(비-소세포 폐암을 포함), 췌장암, 전립선암, 교모세포종, T-세포 림프종, T-림프모구성 림프종, T-세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL), 외투 세포 림프종, 다발성 골수종, 만성 골수성 백혈병, 또는 급성 골수성 백혈병의 치료에 있어서 유망되는 접근법으로 관측된다.

정규 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로를 억제하는 약제를 확인하기 위한 상당한 노력이 투입되었다. TNKS1 및 TNKS2 억제제 예컨대 제WO 2013/117288호가 공지되어 있다.

제WO 2013/117288호에도 불구하고, TNKS1 및 TNKS2 억제제 활성을 갖는 화합물을 찾을 필요성이 있다. 다른 PARP보다 TNKS1 및 TNKS2에 대해 선택적 억제성을 갖는 화합물을 찾을 추가적인 필요성도 있다.

도 1은 실시예 6의 화합물인 8-메틸-2-[4-(피리미딘-2-일메틸)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온 4-메틸벤젠술폰산 염에 대한 대표적 XRPD 패턴이다.

본 발명의 일 측면은 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이고,

<화학식 I>

여기서, Y는

이고;

X는 -CH₂-, -C(CH₃)H-, 또는 -C(CH₂CH₃)H-이고;

R¹은 수소, 히드록시, 또는 할로이고;

R²는 수소, 할로, -CN, -CH₃, CF₃, 또는 -OCH₃이다.

바람직하게는, 본 발명의 추가적 측면은 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공하며, 여기서, Y는

이고;

X는 -CH₂-, -C(CH₃)H-, 또는 -C(CH₂CH₃)H-이고;

R¹은 수소, 히드록시, 또는 할로이고;

R²는 수소, 할로, -CN, -CH₃, CF₃, 또는 -OCH₃이다.

바람직하게는, 본 발명의 또다른 측면은 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공하며, 여기서 Y는

이고,

X는 -CH₂-, -C(CH₃)H-, 또는 -C(CH₂CH₃)H-이고;

R²는 수소, 할로, -CN, -CH₃, CF₃, 또는 -OCH₃이다.

본 발명의 또다른 바람직한 측면은 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공하고, 여기서 Y는

이고,

X는 -CH₂-, -C(CH₃)H-, 또는 -C(CH₂CH₃)H-이고;

R¹은 수소, 히드록시, 또는 할로이고;

R²는 수소, 할로, -CN, -CH₃, CF₃, 또는 -OCH₃이다.

본 발명의 바람직한 측면은 화합물:

8-메틸-2-[4-(피리미딘-2-일메틸)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 또는 그의 제약상 허용되는 염;

8-메틸-2-[4-(1-피리미딘-2-일에틸)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 또는 그의 제약상 허용되는 염;

2-[4-[(4-클로로피리미딘-2-일)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 또는 그의 제약상 허용되는 염; 또는

2-[4-[(4-메톡시피리미딘-2-일)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.

본 발명의 또다른 바람직한 측면은 화합물:

2-[4-[(3-브로모-2-피리딜)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 또는 그의 제약상 허용되는 염;

2-[4-[(3-클로로-2-피리딜)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 또는 그의 제약상 허용되는 염;

2-[4-[(3-플루오로-2-피리딜)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 또는 그의 제약상 허용되는 염; 또는

2-[[4-(8-메틸-4-옥소-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)피페라진-1-일]메틸]피리딘-3-카보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.

본 발명의 추가적 측면은 제약상 허용되는 담체와 함께, 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물이다.

본 발명의 다른 추가적 측면은 치료적 유효량의 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 그를 필요로 하는 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 탄키라제 1 및 2를 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 측면은 치료적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 결장직장암, 위암, 간암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 난소암, 수모세포종, 흑색종, 폐암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 전립선암, 교모세포종, T-세포 림프종, T-림프모구성 림프종, T-세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL), 외투 세포 림프종, 다발성 골수종, 만성 골수성 백혈병, 또는 급성 골수성 백혈병인 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 추가적 측면은 치료에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 또다른 측면은 결장직장암, 위암, 간암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 난소암, 수모세포종, 흑색종, 폐암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 전립선암, 교모세포종, T-세포 림프종, T-림프모구성 림프종, T-세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL), 외투 세포 림프종, 다발성 골수종, 만성 골수성 백혈병, 또는 급성 골수성 백혈병인 암의 치료에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가적 측면은 결장직장암, 위암, 간암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 난소암, 수모세포종, 흑색종, 폐암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 전립선암, 교모세포종, T-세포 림프종, T-림프모구성 림프종, T-세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL), 외투 세포 림프종, 다발성 골수종, 만성 골수성 백혈병, 또는 급성 골수성 백혈병인 암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.

용어 "환자"는 포유류를 의미하고 "포유류"는 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

용어 "삼중 음성 유방암"은 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR), 및 호르몬 표피 성장 인자 수용체 2(HER2/neu)에 대해 음성으로 테스트된 종양 샘플을 특징으로 하는 유방암을 의미한다.

"치료적 유효량" 또는 "유효량"은 암 환자에서 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로를 억제하고, 환자에서 표적 암 세포를 파괴하거나 또는 암의 진행을 감속시키거나 저지하기 위해 필요한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 함유하는 제약 조성물의 용량을 의미한다. 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 예측 용량은 0.1 내지 200 mg/환자/일의 범위에 있다. 바람직한 용량은 1 내지 175 mg/환자/일의 범위에 있다. 가장 바람직한 용량은 5 내지 150 mg/환자/일의 범위에 있다. 환자를 치료하기 위해 요구되는 정확한 용량 및 치료 시간의 길이는 질병의 단계 및 중증도 뿐만 아니라 개별 환자의 특정 필요 및 반응의 관점에서 내과의에 의해 결정될 것이다. 일일 기준의 용량으로 표현되었지만, 투약 처방은 환자에게 보다 최적의 치료적 이점을 제공하고 원치 않는 약역학적 효과를 관리하고 및/또는 개선하기 위해 조정될 수 있다. 일일 투약에 더해, 격일 투약(Q2D); 5일 동안 격일 투여 후 투여 없는 이틀(T.I.W); 또는 매 셋째 날(Q3D)이 적절할 수 있다.

용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 환자가 고통받는 암에 대한 모든 스펙트럼의 개입, 예컨대, 암이 실제로 제거되지 않는다 할지라도 하나 이상의 증상을 감속시키거나 반전시키기도록 완화시키고 암의 진행을 지연시키기 위한 활성 화합물의 투여를 포함하는 의미이다. 치료되는 환자는 포유류, 특히 인간이다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 제약상 허용되는 담체를 사용하여 제약 조성물로 제제화되어 다양한 경로로 투여된다. 바람직하게는, 이러한 조성물은 경구 투여용이다. 이러한 제약 조성물 및 이를 제조하기 위한 공정은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 [REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al., eds., 19^th ed., Mack Publishing Co., 1995)]을 참조하라. 구체적 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 및 임의적으로 특히 특정 암 유형의 치료를 위한 다른 치료적 성분과 함께 8-메틸-2-[4-(피리미딘-2-일메틸)피페라진-1-일]-5,6,7,8-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4(3H)-온 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.

본 발명의 화합물은 많은 무기 및 유기산과 반응하여 제약상 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 이러한 제약상 허용되는 염 및 이를 제조하기 위한 통상적인 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 [P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts, " Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977]을 참조하라.

본 발명의 화합물, 예컨대 실시예 1은 8-메틸-2-[4-(피리미딘-2-일메틸)피페라진-1-일]-5,6,7,8-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4(3H)-온(IUPAC)으로 명명되고; 피리도[2,3-d]피리미딘-4(3H)-온, 5,6,7,8-테트라히드로-8-메틸-2-[4-(2-피리미디닐메틸)-1-피페라지닐]-(CAS)으로도 또한 명명될 수 있으며; 다른 이름이 본 발명의 화합물을 명료하게 식별하기 위해 사용될 수 있다.

화학식 I의 화합물은 단일한 입체이성질체로 도시된다는 것을 이해할 것이다. 특정한 정의된 치환기는 라세미 혼합물 또는 두 가지 입체이성질체를 가질 수 있는 키랄 중심을 발생시킬 수 있다. 달리 지칭되지 않는 한, 본원에 사용되는, 특정 화합물에 대한 언급은 개별 입체이성질체들 및 명명된 화합물을 포함하는 라세미 혼합물을 포함하는 의미이다. 특정 입체이성질체는 거울이성질체적으로 순수하거나 우세한 출발 물질을 사용한 입체특이적 합성법으로 제조될 수 있다. 출발 물질, 중간체, 또는 라세미 혼합물의 특정 입체이성질체는 키랄 고정상에서의 크로마토그래피, 효소적 분해, 또는 부분입체이성질체 염과 같이 이러한 목적을 위해 형성된 부분입체이성질체의 분별 결정 또는 크로마토그래피를 포함해 예컨대, 문헌[Stereochemistry of Organic Compounds, E. I. Eliel and S. H. Wilen (Wiley 1994)] 및 문헌[Enantiomers , Racemates , and Resolutions, J., Jacques, A. Collet, and S. H. Wilen (Wiley 1991)]에서 찾을 수 있는 것과 같은 관련 기술분야에 널리 알려진 기법으로 분리될 수 있다. 키랄 화합물이 그의 이성질체로 단리되거나 또는 분리되지만 절대 배위 또는 선광성이 결정되지 않는 경우, 이성질체는 키랄 크로마토그래피로부터의 각 용출물 순서에 대응되도록 이성질체 1 및 이성질체 2로 임의로 지칭되고, 만약 키랄 크로마토그래피가 합성에서 초기에 개시되면, 동일한 지칭이 후속 중간체 및 실시예에 적용된다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 화학식 I의 화합물이 토토머 평형으로 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 예시적인 목적상, 평형을 하기에 나타낸다:

편의상, 4-옥소 형이 화학식 I에 도시되고, 상응하는 명명법이 본 명세서를 통틀어 사용된다. 그러나, 이러한 도시는 상응하는 토토머 히드록시 형을 포함한다.

본 발명의 화합물의 합성에서 초기 출발 물질로 이용되는 화합물은 널리 공지되어 있고, 시판되지는 않는 정도에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 흔히 이용되는 표준 절차에 의해, 제공된 특정 참조문헌을 사용해 용이하게 합성되거나, 또는 일반 참조 텍스트에서 발견된다.

공지된 절차 및 방법의 예시는 일반 참조 텍스트 예컨대 문헌 [Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Inc, 1989; Compendium of Organic Synthetic Methods, Volumes 1-10, 1974-2002, Wiley Interscience; Advanced Organic Chemistry, Reactions Mechanisms, and Structure, 5^th Edition, Michael B. Smith and Jerry March, Wiley Interscience, 2001; Advanced Organic Chemistry, 4^th Edition, Part B, Reactions and Synthesis, Francis A. Carey and Richard J. Sundberg, Kluwer Academic / Plenum Publishers, 2000] 등 및 그 안에 인용된 참조문헌에 기재된 것들을 포함한다.

추가로, 하기 반응식에 기재된 특정 중간체는 하나 이상의 질소 보호기를 함유할 수 있다. 가변 보호기는 수행되는 특정 반응 조건 및 특정 변형에 따라 각각의 경우 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 보호 및 탈보호 조건은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 문헌에 기재되어 있다(예컨대, "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007 참조).

본원에 사용된 약어는 문헌[Aldrichimica Acta, Vol. 17, No. 1, 1984]에 따라 정의된다. 다른 약어는 하기와 같이 정의된다: "APC"는 선종성 결장 폴립증을 의미하고; "BID"는 1일 2회 투여를 의미하고; "비오티닐화된 NAD+"는 6-비오틴-17-니코틴아미드-아데닌-디뉴클레오티드를 의미하고; "BOC"는 tert-부틸옥시카보닐을 의미하고; "DCM"은 디클로로메탄을 의미하고; "DMF"는 디메틸포름아미드를 의미하고; "DMAP"는 4-디메틸아미노피리딘을 의미하고; "DMEM"은 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)를 의미하고; "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 의미하고; "DPBS"는 둘베코의 포스페이트 완충 염수를 의미하고; "DTT"는 디티오트레이톨을 의미하고; "EDCI"는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보이미드를 의미하고; "EGFP"는 강화된 녹색 형광 단백질을 의미하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 의미하고; "FBS"는 소 태아 혈청을 의미하고; "플래그 태그"는 플래그 펩티드 DYKDDDDK, N-말단부터 C-말단까지(서열 6)를 의미하고; "HEK"은 인간 배아 신장을 의미하고; "HEPES"는 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산을 의미하고; "HOAc"는 아세트산을 의미하고; "HRP"는 홀스래디쉬 과산화효소를 의미하고; "IPAm"은 이소프로필아민을 의미하고; "MEM"은 최소 필수 배지를 의미하고; "MeOH"는 메탄올을 의미하고; "MOI"는 감염 다중도(multiplicity of infection)를 의미하고; "NCBI"는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 의미하고; "PBS"는 포스페이트 완충 염수를 의미하고; "RPMI"는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute)를 의미하고; "SCX"는 실리카에 결합된 강한 양이온 교환 페닐 술폰산의 정제 컬럼을 의미하고; "SCX-2"는 실리카에 결합된 강한 양이온 교환 프로필술폰산의 정제 컬럼을 의미하고; "SFC"는 초임계 유체 크로마토그래피를 의미하고; "TBS"는 트리스 완충 염수를 의미하고; "THF"는 테트라히드로퓨란을 의미하고; "TBME"는 tert-부틸 메틸 에테르를 의미하고; "TMB 과산화효소"는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 의미하고; "Tris"는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 의미하고; "X-Phos"는 2-(디시클로헥실포스피노)-2',4',6'-트리이소프로필비페닐을 의미한다.

본 발명의 화합물 또는 그의 염은 관련 기술분야에 공지된 다양한 절차에 의해 제조될 수 있고, 그의 일부는 하기 반응식, 제조법, 실시예에 나타난다. 기재된 각각의 루트의 특정 합성 단계는 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제조하기 위해 상이한 방식으로 또는 상이한 반응식의 단계들과 함께 결합될 수 있다. 하기 반응식의 각각의 단계의 생성물은 추출, 증발, 침전, 크로마토그래피, 여과, 분쇄, 및 결정화를 포함하는 관련 기술분야에 널리 공지된 종래의 방법에 의해 회수될 수 있다. 하기 반응식에서, 모든 치환기는 달리 표시되지 않는 한 사전에 정의된 것과 같다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 이용할 수 있다.

반응식 1

반응식 1은 TFA 염으로서 8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온(6), 중성 물질(7) 및 (7)의 트리플루오로보라네이트 메틸 염의 형성을 도시한다.

단계 A에서, 보호된 2-피페라진-1-일-3H-피리도[2,3-d]피리미딘-4-온(3)은 보호된 피페라진-1-카복사미드 염산염(1)과 에틸 2-클로로니코티네이트(2)의 고리화로부터 얻어진다. 반응은 50 - 120 ℃의 온도에서 강 염기, 예컨대 포타슘 tert-부톡시드의 존재 하에서 비활성 용매, 예컨대 DMF에서 진행된다. 바람직한 보호기는 tert-부틸옥시카보닐이지만 다른 카바메이트 보호기가 사용될 수 있다.

단계 B에서, 보호된 2-피페라진-1-일-3H-피리도[2,3-d]피리미딘-4-온(3)은 메틸 아이오다이드를 사용해 메틸화되어 4차 염, 보호된 8-메틸-2-피페라진-1-일-3H-피리도[2,3-d]피리미딘-8이움-4-온 아이오다이드(4)를 제공한다(Z는 I, 반응식 1). 반응은 50-120 ℃에서 4 내지 24 h 동안 비활성 용매, 예컨대 THF 또는 디옥산에서 오토클레이브 내에서 진행된다. 대안으로 메틸 술페이트 염은 약 60-80 ℃에서 가열하면서 극성 반양자성 용매 예컨대 DMF에서 화합물(3)에 디메틸술페이트를 첨가함으로써 형성될 수 있다. 용액은 Z가 CH₃OSO₃이면 생성물(4)를 침전시키기 위해 TMBE를 함유한 용기로 상온에서 옮겨진다.

반응식 1, 반응 C에서, 4차 염(4, Z는 I)은 환원되어 보호된 8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온(5)을 제공한다. 환원은 환원제, 예컨대 약 10/1의 DMF/TFA의 혼합물 내 소듐 시아노보로히드라이드를 사용해 달성될 수 있다. TFA 및 환원제는 온도가 15 ℃를 초과하지 않게 하면서 0 - 5 ℃의 온도에서 첨가된다. 반응은 그 다음 RT에서 약 12 내지 24 h를 거치게 한다. 추가적인 양의 TFA 및 환원제가 반응이 완결되게 하기 위해 냉각하면서 첨가될 수 있다.

대안으로, 단계 C는 환원제 예컨대 산화백금으로 메틸 술페이트 염(4, Z는 CH₃OSO₃)을 환원시키고 극성 용매 예컨대 MeOH에서 약 155 psi에서 수소화시켜 화합물(5)를 제공함으로써 달성될 수 있다.

단계 D에서, 피페라지닐 고리는 탈보호화되어 8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온(6)을 제공한다. 보호기 예컨대 BOC의 제거를 위한 산성 조건은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 조건은 RT에서 2 내지 24 h의 기간 동안 DCM 및 TFA의 1/1 혼합물을 사용해 2-4 당량의 TFA의 존재 하에서 TFA 염으로서의 생성물을 제공한다. 염 형태는 특성 분석되지 않지만 중량 계산된다.

단계 E는 상기에서 논의된 것과 같이, 암모니아/MeOH를 사용해 이온 교환 수지 또는 SCX 컬럼으로 중성화될 수 있는 TFA 염을 제공해 중성 물질(7)을 제공하기 위한, 보호기의 탈보호화를 보여준다. 피라진 고리의 질소는 용매 예컨대 THF 내 포타슘 브로모메틸 트리플루오로보레이트를 사용해 메틸 트리플루오로보라네이트 염으로 전환되어 단계 F에 나타난 것과 같이 염 형태, 화합물 8을 제공할 수 있다.

반응식 2

반응식 2는 염 형태(6), 중성 물질(7), 또는 메틸 트리플루오로 보라네이트 염(8)으로부터 화학식 I의 화합물의 형성을 나타낸다. 중간체(6), (7), 및 (8)로부터 화학식 I의 화합물을 형성하는 많은 방법, 예컨대 환원적 알킬화를 위한 적절한 알데히드 또는 케톤, 알킬화를 위한 적절한 할라이드 시약, 스즈키(Suzuki) 커플링을 위한 보론산 시약의 이용가능성 또는 합성에 따라 알킬화, 환원적 알킬화, 또는 스즈키 커플링이 존재한다. TFA 아민 염(6) 또는 중성 아민(7)은 환원적 알킬화들 또는 알킬화에 사용되어 화학식 I의 화합물을 제공한다. 환원적 알킬화는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 상온에서 적절한 용매 예컨대 DMF 내 환원제 예컨대 소듐 시아노보로히드라이드 또는 상온에서 적절한 용매 예컨대 DCM 내 다른 환원제 예컨대 소듐 트리아세톡시보로히드라이드를 사용해 아민에 의한 알데히드의 환원을 수반한다. 촉매량의 메탄올은 만약 원한다면 반응을 더 빠르게 진행시키기 위해 DMF 및 소듐 시아노보로히드라이드와 함께 사용될 수 있다. 적절한 아릴 메틸 할라이드는 용매 예컨대 아세토니트릴 또는 DCM 내 적절한 유기 염기 예컨대 트리에틸아민 또는 무기 염기 예컨대 포타슘 카보네이트를 사용해 TFA 아민 염(6) 또는 중성 물질(7)을 알킬화하는 데 사용될 수 있다. 소듐 아이오다이드는 계내에서 클로로메틸 기질을 보다 반응성의 아이오도 메틸 기질로 전환해 적절한 피라진, 피리딘, 또는 피리미딘의 알킬화를 완결하는 데 사용될 수 있다. 반응은 상온에서 1-3 일 동안 교반되어 화학식 I의 화합물을 제공할 수 있다.

화합물(8)은 스즈키 팔라듐 촉매된 교차 커플링 조건 하에서 아릴 할라이드와 함께 커플링되어 N-메틸 헤테로아릴 치환된 생성물을 형성할 수 있다. 화합물(8) 메틸 트리플루오로보라네이트 염은 화학식 I의 화합물을 제조하기 위한 또다른 변형을 제공한다. 숙련된 기술자는 이러한 교차-커플링 반응을 촉진하기 위해 유용한 다양한 조건이 존재함을 인식할 것이다. 이에 따라, 적합한 팔라듐 시약은 팔라듐(II) 아세테이트 및 적합한 유기인 시약 예컨대 염기 예컨대 세슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 포타슘 카보네이트, 또는 포타슘 포스페이트 3염기 일수화물을 갖는 X-phos를 포함한다. 다른 적합한 유기인 및 팔라듐 시약은 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드, 트리시클로헥실포스핀을 갖는 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0), (1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센)팔라듐(II) 클로라이드, 또는 팔라듐 테트라키스트리페닐포스핀을 포함한다.

임의적 단계에서, 화학식 I의 화합물의 제약상 허용되는 염, 예컨대 염산염은 표준 조건 하에서 적합한 용매에서 화학식 I의 유리 염기 화합물과 적절한 산과의 반응에 의해 형성될 수 있다. 추가로, 이러한 염의 형성은 질소 보호기의 탈보호와 동시에 일어날 수 있다.

하기 제조법 및 실시예는 발명을 추가로 나타낸다. 반대로 언급되지 않는 한, 본원에 예시된 화합물은 [Accelrys® Draw version 4.0 (Accelrys, Inc., San Diego, CA), IUPACNAME ACDLABS, or ChemDraw® Ultra 12.0]을 사용해 명명되고 넘버링된다.

역상 정제의 일반적 방법 기재

시스템: 매스 셀렉티브 디텍터(Mass Selective Detector; MSD) 질량 분석기 및 리프(Leap) 오토샘플러/분획 콜렉터가 구비된 애길런트(Agilent) 1200 LCM/MS; 컬럼: 75 × 30 mm 페노메넥스 제미니(Phenomenex Gemini)-NX, 10 × 20 mm 가드의 5μ 입자 크기 컬럼; 용매 시스템: A: 10 mM 암모늄 비카보네이트, 수성상으로 pH 10, B: 유기상으로 ACN; 유속: 85 mL/min; 방법: 각 방법에 대한 구배는 시작 %B-종료 %B의 방법명으로 지칭된다(예컨대, 높은 pH 13-48에서와 같이). 구배는 다음과 같이 설정된다: 0-1 min(시작 %B에서 유지됨), 1-8 min(시작 %B에서 종료 %B까지의 구배), 8-8.1 min(종료 %B에서 100%B까지의 램핑), 8.1-9 min(100% B 유지).

제조법 1

4-메톡시피리미딘-2-카브알데히드

DCM(5 mL)에서 4-메톡시피리미딘-2-메탄올(300 mg, 2.14 mmol) 및 옥살릴 클로라이드(DCM 내 1 mL, 2.0 M)을 합치고 -78 ℃로 냉각했다. DMSO(0.33 mL, 4.71 mmol)을 첨가하고 2 h 동안 혼합물을 교반했다. 트리에틸아민(0.66 mL, 4.71 mmol)을 첨가하고 상온에서 밤새 혼합물을 데웠다. 물(5 mL)을 첨가하고, 1 h 교반하고 DCM(2 × 50 mL)으로 추출했다. 소듐 술페이트로 합쳐진 유기 추출물을 건조하고, 여과하고, 감압 하에서 여과물을 농축해 연갈색 고체를 제공하고 추가 정제 없이 사용했다. ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 알데히드 피크 9.94 (s, 1H), 나머지 피크는 하나 초과의 화합물의 혼합물 때문에 배정 불가능함.

제조법 2

4-메틸피리미딘-2-카브알데히드

(4-메틸피리미딘-2-일)메탄올을 사용해 본질적으로 제조법 1에 기재된 것과 같이 4-메틸피리미딘-2-카복스알데히드를 제조해 표제 화합물을 얻고 추가 정제 없이 사용했다. ¹H NMR, 400 MHz, CDCl₃) δ 10.06 (s, 1H), 8.79 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.33 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 2.65 (s, 3H)

제조법 3

4-(트리플루오로메틸)-2-비닐-피리미딘

바이알에서 2-클로로-4-(트리플루오로메틸)피리미딘(250 mg, 1.37 mmol), 포타슘 비닐트리플루오로보레이트(184 mg, 1.37 mmol), 세슘 카보네이트(1.34 g, 4.11 mmol), THF(5 mL) 및 물(0.5 mL)을 합쳤다. 1 분 동안 질소의 스트림으로 가스를 제거했다. 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드(48 mg, 0.069 mmol)를 첨가하고, 바이알을 밀봉하고, 85 ℃에서 3 일 동안 혼합물을 가열했다. DCM과 함께 혼합물을 냉각하고, 희석하고, 규조토를 통해 여과하고, 감압 하에서 여과물을 농축하여 추가 정제 없이 사용되는 표제 화합물을 제공했다(0.200 g, 84%). ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.93 (d, 1H, J = 5.0 Hz), 7.43 (d, 1H, J = 5.0 Hz), 6.94 (ABX, 1H, J_AX = 17.3, J_BX = 10.47), 6.74 (ABX, 1H, J_AB = 1.54, J_AX = 17.3), 5.84 (ABX, 1H, J_AB = 1.54, J_BX = 10.47).

제조법 4

5-메틸-2-비닐-피리미딘

2-클로로-5-메틸피리미딘을 사용해 본질적으로 제조법 3에 기재된 것과 같이 표제 화합물을 제조하고 추가 정제 없이 사용했다(220 mg, 94%). ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.38 (s, 2H), 6.73 (ABX, 1H, J_AX = 17.4, J_BX = 10.7), 6.41 (ABX, 1H, J_AB = 1.8, J_AX = 17.4), 5.54 (ABX, 1H, J_AB = 1.8, J_BX = 10.7), 2.16 (s, 3H).

제조법 5

4-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-카브알데히드

디옥산(3 mL) 및 물(1 mL)에서 소듐 퍼아이오데이트(737 mg, 3.45 mmol) 및 중합체에 결합된 오스뮴 테트록시드(292 mg, 0.057 mmol)와 4-(트리플루오로메틸)-2-비닐-피리미딘(200 mg, 0.84 mol)을 합치고 상온에서 밤새 혼합물을 교반했다. EtOAc(5 mL) 및 물(5 mL)로 혼합물을 희석했다. 글라스 울을 통해 혼합물을 여과하고 층을 분리했다. 마그네슘 술페이트로 유기 층을 건조하고, 여과하고, 여과물을 농축해 표제 화합물을 제공했다(40 mg, 20%). 추가 정제 없이 조 물질을 사용했다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 알데히드 10.16 (s, 1H), 나머지 피크는 하나 초과의 화합물의 혼합물 때문에 배정 불가능함.

제조법 6

5-메틸피리미딘-2-카브알데히드

2-클로로-5-메틸-피리미딘을 사용해 본질적으로 제조법 5에 기재된 것과 같이 5-메틸피리미딘-2-카브알데히드를 제조해 표제 화합물을 제공하고(90 mg, 44%), 추가 정제 없이 사용했다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 10.06 (s, 1H), 8.79 (s, 2H), 2.42 (s, 3H).

제조법 7

2-(브로모메틸)-4-클로로-피리미딘

바이알에서 2-메틸-4-클로로피리미딘(200 mg, 1.55 mmol), 카본 테트라클로라이드(5 mL), N-브로모숙신이미드(304 mg, 1.71 mmol), 및 벤조일 퍼옥시드(38 mg, 1.6 mmol)를 합치고, 2 min 동안 질소로 플러싱하고, 밀봉하여 80 ℃에서 밤새 가열했다. 추가 정제 없이 조 반응 혼합물을 사용했다. GC-MS m/ e: (⁷⁹BR/⁸¹Br 205/207 (M⁺).

제조법 8

2-(클로로메틸)피라진

DCM(200 mL)에서 2-피라지닐메탄올(2.0 g, 18.1 mmol)을 용해하고 질소 하에서 교반하면서 0 ℃로 냉각했다. 티오닐 클로라이드(4.63 mL, 63.6 mmol)를 10 min 동안 적가하고, 25 ℃로 데워지게 했다. 상온에서 16 h 동안 교반했다. 혼합물을 농축하고 그 다음 DCM으로 희석했다. 포화 NaHCO₃로 조 용액을 세척하고, MgSO₄로 건조하고, 여과하고, 농축했다. DCM에서 조 잔여물을 용해하고 실리카 겔 플래시 크로마토그래피(헥산/EtOAc, 95:5에서 100% EtOAc 구배)로 정제해 연노란색 오일로서 표제 화합물을 제공했다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.67 (s = 2H), 8.50-8.55 (m, 2H), 8.73 (s, 1H).

제조법 9

2-(브로모메틸)-3-클로로-피라진

2-클로로-3-메틸-피라진(5.0 g, 38.9 mmol), N-브로모숙신이미드(6.92 g, 38.9 mmol), 벤조일 퍼옥시드(0.471 g, 1.94 mmol), 및 카본 테트라클로라이드(50 mL)를 함께 첨가하고, 16 h 동안 질소 하에서 환류로 가열했다. 25 ℃에서 반응 혼합물을 냉각하고 헥산으로 희석했다. 혼합물을 여과하고, 감압 하에서 액체를 농축하고, 실리카 겔 플러시 크로마토그래피(헥산/EtOAc, 95:5 → 40:60 구배)로 정제해 갈색 오일로서 표제 화합물을 제공했다(3.93 g, 49%). ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.66 (s = 2H), 8.32 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.47 (d, J = 2.4 Hz, 1H).

제조법 10

메틸 3,5-디플루오로피리딘-2-카복실레이트

3,5-디플루오로피리딘-2-카복실산(1.4 g, 8.8 mmol) 및 DCM(30 mL)을 함께 첨가하고 0 ℃로 냉각했다. MeOH(3 mL), DMAP (1.32 g, 10.6 mmol) 및 EDCI(2.1 g, 10.6 mmol)를 첨가했다. 혼합물이 상온으로 데워지게 하고 밤새 교반했다. 감압 하에서 반응 혼합물을 농축하고 실리카 겔에서 크로마토그래피(10/1 석유 에테르/EtOAc로 용출)로 잔여물을 정제해 표제 화합물을 제공했다(1.03 g, 72%). LC-ES/MS m/z 174 (M+H)⁺.

제조법 11

(3,5-디플루오로-2-피리딜)메탄올

메틸 3,5-디플루오로피리딘-2-카복실레이트(1.0 g, 4.6 mmol), THF(10 mL) 및 THF 내 2 M 리튬 보로히드라이드(15 mL, 23 mmoL)를 첨가했다. 상온에서 2 일 동안 혼합물을 교반했다. 감압 하에서 농축하고 DCM으로 용출되는 실리카 겔 크로마토그래피로 잔여물을 정제해 표제 화합물을 제공했다(0.448 g, 60%).

제조법 12

2-(클로로메틸)-3,5-디플루오로피리딘

(3,5-디플루오로-2-피리딜)메탄올(200 mg, 1.4 mmol), DCM(4 mL), DMF(0.1 mL) 및 티오닐 클로라이드(1 mL)를 함께 첨가하고 4 시간 동안 혼합물을 교반했다. 4 M 수성 소듐 비카보네이트로 pH를 약 7.0으로 조정하고 DCM(3 × 50 mL)으로 혼합물을 추출했다. 유기 부분을 합치고, 무수 소듐 술페이트로 건조하고, 여과하고, 농축해 오렌지색 오일로서 표제 화합물을 제공했다(182 mg, 81%).

제조법 13

tert-부틸 4-카밤이미도일피페라진-1-카복실레이트 히드로클로라이드

10 L 재킷형 반응기를 tert-부틸 피페라진-1-카복실레이트(1500 g, 8.054 mol) 및 DMF(4.05 L)로 충전했다. 용액이 얻어질 때까지 교반했다. 22 내지 28 ℃에서 15 분 동안 1H-피라졸-1-카복사미드 HCl(1180 g, 8.054 mol)에 이어 디이소프로필아민(1041 g, 8.054 mol)을 첨가했다. 55 내지 60 ℃에서 5 h 동안 가열하고 20 ℃로 냉각했다. 반응 혼합물을 15 내지 20 분 동안 TBME(30 L)를 함유하는 50 L 재킷형 반응기에 옮기고 DMF(400 mL)로 트랜스퍼 라인을 세척했다. 현탁액을 20 ℃에서 1 시간 동안 교반하고 그 다음 세 분별 26 cm 부흐너(Buchner) 깔때기를 통해 여과했다. 각각의 생성물 케이크를 TMBE(2 × 1000 mL)로 세척하고 60 ℃에서 밤새 진공 오븐에서 건조해 흰색 고체로서 표제 화합물을 제공했다(1898 g, 89%). ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 1.41 (s, 9H), 3.42-3.50 (m, 4H), 3.33-3.42 (m, 4H), 7.77 (s, 4H).

제조법 14

tert-부틸 4-(4-옥소-3H-피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)피페라진-1-카복실레이트

tert-부틸 4-카밤이미도일피페라진-1-카복실레이트 히드로클로라이드(1897 g, 7.165 mol), DMF (10.1 L), 및 에틸 2-클로로니코티네이트(1266 g, 6.824 mol)로 22 L 둥근 바닥 플라스크를 충전했다. 온도가 17에서 62 ℃로 점진적으로 상승하게 하면서 포타슘 tert-부톡시드(1293 g, 11.52 mol)를 55 분 동안 조금씩 첨가했다. 100 ℃에서 2.5 h 동안 반응물을 가열했다. 반응 혼합물을 20 ℃로 냉각하고, 반응기 및 트랜스퍼 라인을 세척하기 위해 DMF(350 mL)를 사용해 물(15.2 L)을 함유하는 30 L 재킷형 반응기로 옮겼다. 5 내지 6의 pH가 얻어질 때까지 3 N 염산(1.52 L)을 도입하고 20 ℃에서 2 시간 동안 현탁액을 교반했다. 세 분별 26 cm 부흐너 깔때기를 통한 여과에 의해 생성물을 수집하고 각각의 케이크를 물로 세척했다(3 × 1.5 L). 케이크를 합치고, 이를 물(15.0 L)에서 현탁하고, 20 ℃에서 60 분 동안 교반했다. 두 분별 26 cm 부흐너 깔때기를 통한 여과에 의해 생성물을 수집하고 케이크를 물로 세척했다(2 × 1.5 L). 60 ℃에서 24 시간 동안 진공 오븐에서 고체를 건조해 노란색 고체로서 표제 화합물을 제공했다(1332 g, 59%). ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 1.43 (s, 9H), 3.36-3.49 (m, 4H), 3.62-3.76 (m, 4H), 7.13-7.20 (m, 1H), 8.22-8.27 (m, 1H), 8.62-8.70 (m, 1H).

제조법 15

tert-부틸 4-(8-메틸-4-옥소-3H-피리도[2,3-d]피리미딘-8-이움-2-일)피페라진-1-카복실레이트, 메틸 술페이트

tert-부틸 4-(4-옥소-3H-피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)피페라진-1-카복실레이트(1331 g, 4.017 mol) 및 DMF (6.66 L)로 20 L 재킷형 반응기를 충전했다. 5-10 분 동안 디메틸술페이트(583 g, 2.83 mol)를 첨가하고 38 ℃로의 경미한 발열을 관측했다. 용액을 63 내지 73 ℃로 30 분 동안 가열했다. 그 다음 추가적 디메틸술페이트(50.7 g, 0.402 mol)를 도입하고 68 내지 73 ℃에서 30 min 동안 가열했다. 반응물의 샘플은 잔여 2.0% 출발 물질을 보여줬다. 추가적 디메틸술페이트(50.7 g, 0.402 mol)를 첨가하고 68 내지 73 ℃에서 가열했다. 샘플은 다시 잔여 1.3% 출발 물질을 보여줬다. 반응물을 20 ℃로 냉각하고, 반응기 및 트랜스퍼 라인을 세척하기 위해 DMF(300 mL)를 사용해, 20 내지 30 분 동안 TBME(26.6 L), tert-부틸 4-(8-메틸-4-옥소-3H-피리도[2,3-d]피리미딘-8-이움-2-일)피페라진-1-카복실레이트 및 시드(1 g)을 함유하는 50 L 재킷형 반응기에 옮겼다. 현탁액을 20 ℃에서 밤새 교반하고 세 분별 26 cm 부흐너 깔때기를 사용한 여과에 의해 생성물을 수집했다. 각각의 케이크를 TBME(3 × 1.3 L)로 세척했다. 세 가지 부분을 합치고 TMBE(13.3 L)에서 물질을 현탁하고, 20 ℃에서 1 h 동안 교반하고, 두 분별 26 cm 부흐너 깔때기에서 생성물을 수집했다. 각각의 케이크를 TBME(3 × 2.0 L)로 세척하고 진공 오븐에서 55 내지 60 ℃에서 16 시간 동안 건조해 노란색 고체로서 표제 화합물을 제공했다(1812 g, 98%). ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 1.44 (s, 9H), 3.37 (s, 3H), 3.45-3.55 (m, 4H), 3.80-3.95 (m, 4H), 4.08 (s, 3H), 7.40-7.45 (m, 1H), 8.72-8.76 (m, 1H), 8.86-8.91 (m, 1H)

제조법 15 시드 결정 형성

tert-부틸 4-(4-옥소-3H-피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)피페라진-1-카복실레이트(15 g, 45.3 mmol) 및 디메틸포름아미드(75 mL)로 250 mL 반응기를 충전했다. 교반 혼합물의 일 부분에 디메틸술페이트(6.28 g, 49.8 mmol)를 첨가했다(34 ℃로의 경미한 발열을 관측함). 68 내지 73 ℃에서 3 시간 동안 생성된 용액을 가열했다. 디메틸술페이트(0.57 g, 4.5 mmol)를 첨가하고 68 내지 73 ℃에서 추가로 1 시간 동안 교반했다. 20 ℃로 냉각하고 TBME(300 mL)을 함유하는 1 L 플라스크에 적가식으로 옮겼다. 교반가능한 현탁액에 점착성 고체 변화를 관측했고, 20 ℃에서 밤새 교반하고 부흐너 깔때기에서 여과했다. 생성물 케이크를 TBME(3 x 35 mL)로 세척하고 TBME(100 mL)에서 현탁했다. 현탁액을 20 ℃에서 1 시간 동안 교반하고, 부흐너 깔때기에 여과하고 케이크를 TBME(2 x 35 mL)로 세척했다. 진공 오븐에서 55 내지 60 ℃에서 16 시간 동안 고체를 건조해 tert-부틸 4-(8-메틸-4-옥소-3H-피리도[2,3-d]피리미딘-8-이움-2-일)피페라진-1-카복실레이트, 메틸 술페이트를 제공했다(18.84 g, 91% 수율) (HPLC 순도 95%).

제조법 16

tert-부틸 4-(8-메틸-4-옥소-3H-피리도[2,3-d]피리미딘-8-이움-2-일)피페라진-1-카복실레이트 아이오다이드

기계적 교반기로 2 L 파르(Parr) 오토클레이브에서 tert-부틸 4-(4-옥소-3H-피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)피페라진-1-카복실레이트(115.43 g), THF (1.4 L), 및 메틸 아이오다이드(24 mL)를 합쳤다. 오토클레이브를 밀봉하고 70 ℃에서 22 시간 동안 가열하면서 반응물을 교반했다. 상온에서 반응물을 냉각하고 MeOH를 사용해 생성된 밝은 노란색 슬러리를 둥근 바닥 플라스크에 옮겼다. 슬러리를 농축하고 생성된 고체를 진공 오븐에서 50-60 ℃에서 건조해 노란색 고체로서 표제 화합물을 제공했다(167.44 g, 100%). LC-ES/MS m/z 346.2 [M+H]⁺, T_R = 1.16 min.

제조법 17

tert-부틸 4-(8-메틸-4-옥소-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)피페라진-1-카복실레이트

2 갤론 압력 용기를 tert-부틸 4-(8-메틸-4-옥소-3H-피리도[2,3-d]피리미딘-8-이움-2-일)피페라진-1-카복실레이트, 메틸 술페이트(881 g, 1.927 mol) 및 MeOH (4.9 L)로 충전했다. 산화백금(1% w/w, 8.81 g)을 첨가하고 155 psi로 수소로 가압했다. 22-28 ℃에서 4 시간 동안 교반했다. 여과 카트리지를 통해 여과해 촉매를 수집했다. 제2 수소화의 여과물과 합하기 위해 이 여과물을 확보했다. 앞서와 같이 tert-부틸 4-(8-메틸-4-옥소-3H-피리도[2,3-d]피리미딘-8-이움-2-일)피페라진-1-카복실레이트, 메틸 술페이트(925 g, 2.023 mol), MeOH (5.0 L) 및 산화백금(1% w/w, 9.25g)의 또다른 부분에서 반응을 반복하고 여과하고 두 여과물을 합치고 오일성 잔여물로 농축했다. 잔여물을 DCM(9.3 L)에 용해시키고 0.1 N 수성 HOAc(2 × 2.0 L 및 2 × 1.1L) 및 0.5 M NaOH (8.0 L)로 세척했다. 물(4.0 L)을 첨가하고 0.1 N 수성 HOAc(약 1.9 L)로 pH 6-7로 조정했다. 층을 분리하고 마그네슘 술페이트로 유기 층을 건조하고 여과하고, 약 4.5 L의 부피로 농축하고 EtOAc(16.0 L)을 첨가해 생성물을 결정화했다. 현탁액을 약 4.5 L의 부피로 농축하고, 0 내지 5 ℃로 냉각하고 여과에 의해 생성물을 수집했다. 케이크를 EtOAc(2 × 2.0 L 및 2 x 1.1 L)로 세척하고 진공 오븐에서 55 내지 65 ℃에서 16 h 동안 건조해 흰색 고체로서 표제 화합물을 제공했다(1185 g, 77%)(매우 정전기적). ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1.45 (s, 9H), 1.76-1.88 (m, 2H), 2.53 (t, J = 6.3 Hz, 2h), 3.04 (s, 3H), 3.20-3.26 (m, 2H), 3.40-3.52 (m, 4 H), 3.60-3.70 (m, 4H), 5.01 (s, 1H), 12.1-12.3 (br s, 1H). ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 20.00, 21.63, 28.81, 36.55, 44.99, 50.20, 80.38, 85.85, 152.38, 155.15, 160.14, 164.03. ESI/ MS m/z 350.0 [M+H]⁺.

제조법 17 대안적 합성법

둥근 바닥 플라스크를 tert-부틸 4-(8-메틸-4-옥소-3H-피리도[2,3-d]피리미딘-8-이움-2-일)피페라진-1-카복실레이트 아이오다이드(167.44 g, 353.76 mmol) 및 DMF(815 mL)로 충전하고 0-5 ℃의 내부 온도로 얼음조에서 냉각했다. 15 ℃ 미만의 내부 온도를 유지하기 위한 속도에서 트리플루오로아세트산(80.25 mL, 1.06 mol)을 첨가했다(45 min). 반응물을 0-5 ℃의 내부 온도로 냉각하고 15 ℃ 미만의 온도를 유지하기 위한 속도에서 소듐 시아노보로히드라이드(66.69 g, 1.06 mol)를 첨가했다(약 50 min). 반응물을 25 ℃로 데우면서 18 h 동안 교반했다. 반응물을 0-5 ℃로 다시 냉각하고 15 ℃ 미만의 온도를 유지하기 위한 속도에서 트리플루오로아세트산(80.25 mL, 1.06 mol)(10 min)에 이어 15 ℃ 미만의 온도를 유지하기 위한 속도에서 소듐 시아노보로히드라이드(66.69 g, 1.06 mol)를 첨가했다(10 min). 반응물을 25 ℃로 데우면서 밤새 교반했다. 반응물을 다시 0-5 ℃로 냉각하고 10 ℃ 미만의 온도를 유지하기 위한 속도에서 트리플루오로아세트산(26.6 mL, 0.345 mol)(5 min)에 이어 10 분 동안 두 부분에서 소듐 시아노보로히드라이드(22.3 g, 0.345 mol)를 첨가했다. 25 ℃로 데우면서 밤새 교반했다. 오버헤드 교반기를 12 L 버켓에 장착하고 이를 소듐 비카보네이트(297.18 g, 3.54 mol) 및 물(7.2 L)로 충전했다. 조 반응 혼합물을 30 min의 기간 동안 분별 깔때기를 사용해 비카보네이트 용액에 첨가하고 가스 방출을 관측했다. 혼합물을 2 시간 동안 교반하고 그 다음 25 ℃에서 밤새 놓아뒀다. 여과에 의해 생성된 고체를 수집하고 물 및 디에틸 에테르로 세척했다. 고체를 약 60 ℃에서 밤새 진공 오븐에서 건조시켜 베이지색 고체로서 표제 화합물을 제공했다(111.34 g, 90%). LC-ES/MS m/z 350.0 [M+H]⁺, T_R = 1.93 min.

제조법 18

8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온 비스-(2,2,2-트리플루오로아세트산) 염

tert-부틸 4-(8-메틸-4-옥소-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)피페라진-1-카복실레이트(46.8 g, 133.9 mmol) 및 DCM(100 mL)을 함께 첨가했다. 15 min 동안 트리플루오로아세트산(80 mL, 1.09 몰)을 첨가하고 25 ℃에서 밤새 교반했다. 감압 하에서 농축하고, DCM(200 mL)을 첨가하고, 감압 하에서 4 회 재농축해 황백색 고체로서 표제 화합물을 제공했다(69.685 g, 100% 조 물질). LC-ES/MS m/z 250.0 [M+H]⁺, T_R = 0.53 min.

제조법 19

8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온; 트리-2,2,2-트리플루오로아세트산

tert-부틸 4-(8-메틸-4-옥소-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)피페라진-1-카복실레이트(196.0 g, 560.8 mmol) 및 DCM(783 mL)을 함께 첨가했다. 얼음 조에서 4 ℃의 내부 온도로 탁한 현탁액을 냉각하고, 교반하면서 10 min 동안 트리플루오로아세트산(254 mL)을 첨가했다. 상온에서 42 시간 동안 교반했다. 감압 하에서 휘발 성분을 제거하고 DCM에 용해시켰다. 감압 하에서 휘발 성분을 제거하고 진공 하에서 40 ℃에서 밤새 건조해 흰색 고체로서 표제 화합물을 제공했다(431.5 g, 99%). ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.96 (br s, 2H), 7.49 (br s, TFA/물, 9H), 3.78 (t, 4H, J = 5 Hz), 3.29 (t, 2H, J = 5 Hz), 3.15 (br s, 4H), 3.04 (s, 3H), 2.37 (t, 2H , J = 6.3 Hz), 1.76 (pt, 2H, J = 5.8 Hz

제조법 20

8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온; 테트라-2,2,2-트리플루오로아세트산

tert-부틸 4-(8-메틸-4-옥소-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)피페라진-1-카복실레이트(0.29 g, 0.83 mmol), DCM(3 mL), 및 트리플루오로아세트산(3 mL)을 함께 첨가했다. 반응물을 상온에서 4 시간 동안 교반했다. 혼합물을 농축하고 잔여물을 DCM(2×)에 용해시키고 혼합물을 농축했다. 진공 하에서 1 시간 동안 건조시켜 정제 또는 특성 분석 없이 사용되는 표제 화합물을 제공했다(0.556 g, 95%).

제조법 21

8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온

tert-부틸 4-(8-메틸-4-옥소-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)피페라진-1-카복실레이트(730 mg, 1.53 mmol), DCM(15 mL), 및 트리플루오로아세트산(15 mL)으로 둥근 바닥 플라스크를 충전하고 상온에서 3 시간 동안 반응물을 교반했다. 감압 하에서 농축하고, 메탄올에 잔여물을 용해시키고, 이온-교환 수지 도웩스(Dowex)® 50WX4-400(5.5 g)를 첨가하고, 혼합물을 상온에서 밤새 교반했다. 혼합물을 여과하고 이온 교환 수지를 메탄올 내 7 M 암모니아로 세척했다. 여과물 및 세척물을 합치고, 감압 하에서 농축해 오렌지색 고체로서 표제 화합물을 제공했다(385 mg, 95%). LC-ES/MS m/z 250 [M+H]⁺.

대안적 제조법 21

10 g SCX-2 컬럼을 DCM(30 mL)으로 예비 세척하고 DCM(10 mL) 및 MeOH(1 mL) 내 8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온 비스-(2,2,2-트리플루오로아세트산)(0.5 g, 1.05 mmol)의 용액으로 로딩했다. 컬럼을 DCM(30 mL)에 이어 MeOH(30 mL)으로 세척하고, 2 M NH₃/MeOH(60 mL)으로 용출했다. 감압 하에서 생성물을 함유하는 분획을 농축해 표제 화합물을 제공했다(0.26 g, 100%).

제조법 22

포타슘 트리플루오로-[[4-(8-메틸-4-옥소-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일) 피페라진-1-일]메틸]보라누이드

THF(4 mL) 내 8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온(250 mg, 1.00 mmol)을 용해시키고 포타슘 브로모메틸 트리플루오로보레이트(208 mg, 1.00 mmol)를 첨가했다. 80 ℃에서 90 min 동안 가열하고 그 다음 질소의 스트림 하에서 농축했다. 아세톤(30 mL) 및 포타슘 비카보네이트(100 mg, 1.00 mmol)를 첨가하고 상온에서 밤새 교반했다. 여과에 의해 고체를 제거하고 감압 하에서 여과물을 농축해 황백색 고체로서 표제 화합물을 제공했다(273 mg, 73%). ES/MS m/z 330 [M-K⁺]^-.

실시예 1

8-메틸-2-[4-(피리미딘-2-일메틸)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온

5 L 추출 깔때기에서 8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온; DCM(2.0 L) 내 트리-2,2,2-트리플루오로아세트산(409 g, 531 mmol)을 용해시켰다. 깔때기를 질소로 퍼징하고 오버헤드 기계적 교반기를 장착했다. 피리미딘-2-카복스알데히드(66.6 g, 616 mmol)를 첨가하고 40 min 동안 교반했다. 그 다음 조금씩 소듐 트리아세톡시보로히드라이드(225.1 g, 1060 mmol)를 첨가했고 첨가 직후 20 내지 36 ℃의 발열을 관측했다. 상온에서 밤새 반응물을 교반했다. 칠러로 생성된 발열을 제어하면서 10 L 반응기에서 20 ℃에서 반응물을 1 M NaOH(2.32 L)로 조심스럽게 부었다. 1 N NaOH(2.55 L)로 pH를 8 에서 9까지 조정했다. 유기층을 수집하고 DCM(2.32 L)으로 수성층을 추출했다. 유기층을 합치고, 농축하고 질소의 스트림 하에서 밤새 건조해 표제 화합물을 제공했다(193 g, 100% 조 생성물). ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (br s, 1H), 8.78 (d, 2H, J = 5.5 Hz), 7.41 (t, 1H, J = 4.9 Hz), 3.76 (s, 2H), 3.52 (br s, 4H), 3.187 (t, 2H , J = 5.2 Hz), 2.96 (s, 3H), 2.54 (m, 2H), 2.28 (t, 2H, J = 6Hz), 1.72(pt, 2H, J = 5.2 Hz). 이 로트를 정제를 위해 4 개의 다른 로트와 함께 합했다(203 g). 실리카 여과(20 cm 지름에 8 cm 높이)에 의해 정제하고 MeOH 내 90% DCM/ 10% 2 M NH₃로 용출해 표제 화합물을 제공했다(162 g, 84%). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 8.74 (d, J = 5.1 Hz, 2H), 7.20 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 3.85 (s, 2H), 3.78-3.69 (m, 4H), 3.27-3.19 (m, 2H), 3.03 (2, 3H), 2.68-2.59 (m, 4H), 2.47-2.38 (m, 2H), 1.88-1.76 (m, 2H).

실시예 1 대안적 합성법

8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온 트리-2,2,2-트리플루오로아세트산(203.23 g, 344 mmol), 피리미딘-2-카브알데히드(40 g, 370 mmol) 및 DMF(343 mL)를 합치고 균질 용액이 얻어질 때까지 교반했다(30 min). 얼음 조에서 용액을 냉각하고 5 g 부분에 소듐 시아노보로히드라이드(25 g, 397 mmol)에 이어 5 분 뒤 10 g 부분을 첨가했다. 1.5 hr 동안 교반하고 최종 10 g의 시아노보로히드라이드를 첨가했다. 25 ℃ 미만의 온도를 유지하면서 30 분 교반했다. 반응물을 밤새 교반하고 25 ℃로 데워지게 했다. 반응 혼합물을 소듐 비카보네이트(115 g, 1.37 mol) 및 물(350 mL)을 함유하는, 오버헤드 교반기가 장착된 비커(4L)에 부었다. 혼합물을 20 min 동안 교반하고 그 다음 EtOAc(1L)를 첨가하고 30 min 동안 교반했다. 혼합물을 약 30 min 동안 규조토(700 g)에, 그리고 약 1 시간 동안 중력 필터에 부었다. 그 다음 진공을 적용하고 EtOAc(2 × 1 L)로 규조토를 세척했다. 유기층을 합치고 농축해 117g의 조 중량을 갖는 점성의 노란색 오일을 제공했다. 오일을 실리카 겔 플래시 크로마토그래피로 정제했다(DCM→90% DCM/MeOH, 구배). 생성된 물질을 진공 오븐에서 50 ℃에서 건조시켜 흰 거품형 고체로서 표제 화합물을 제공했다(44.22 g, 38%). LC-ES/MS m/z 342.3 [M+H]⁺, T_R = 0.96 min.

실시예 2

2-[4-[(3-클로로-2-피리딜)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온

8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온; DMF(3 mL) 내 테트라 2,2,2-트리플루오로아세트산(0.556 g, 0.788 mmol), 3-클로로피콜린알데히드(557.87 mg, 3.94 mmol)에 이어서 소듐 시아노보로히드라이드(148.6 mg, 2.36 mmol)를 함께 첨가했다. 반응물을 5 일 동안 상온에서 교반했다. 반응물을 CHCl₃(75 mL)로 희석하고 포화 NaHCO₃및 염수(brine)로 세척했다. Na₂SO₄로 건조하고, 여과하고, 건조 상태로 농축했다. 조 생성물을 DCM에서 90% DCM/MeOH로 용출되는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제해 표제 생성물을 제공했다(214 mg, 72%). LC ES/MS m/z 375.3 (³⁵Cl) (M+H)⁺.

하기 실시예 3, 4 및 5는 적절한 알데히드 또는 케톤을 사용하고, 상온에서 2 hr 내지 48 hr 동안 교반하고, 완결을 위해 반응물을 모니터링하고, 만약 필요하다면 더 많은 소듐 시아노보로히드라이드를 첨가하고 추가 24 시간 동안 교반하면서, 본질적으로 실시예 2에 기재된 절차에 따라 제조된다.

<표 1>

^a용매로서 DMF에 더해 MeOH(1 mL)가 첨가됨

^b디클로로메탄은 용매이며 소듐 트리아세톡시보로히드라이드는 소듐 보로히드라이드 대신 사용된다.

^cMeOH는 용매이다.

실시예 6

8-메틸-2-[4-(피리미딘-2-일메틸)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온 4-메틸벤젠술폰산 염

8-메틸-2-[4-(피리미딘-2-일메틸)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온(274.5 mg, 0.804 mmol)을 에탄올(0.5 mL)에 첨가하고 톨루엔술폰산 일수화물(160 mg)을 첨가했다. 초음파 처리해 어두운 앰버 레드 용액을 제공했다. 헵탄(5 mL)을 첨가하고, 혼합물을 캡핑하고, 교반하고, 혼합물을 80 ℃로 가열했다. 혼합물은 황갈색 고체로 고형화했다. 혼합물을 30 분 동안 교반하고, 고체를 진공 여과에 의해 수집하고 공기 건조해 표제 화합물을 제공했다(387 mg, 94%).

실시예 6 X-선 분말 회절

결정질 고체의 XRPD 패턴을 35 kV 및 50 mA에서 동작하는 CuKa 광원(λ = 1.54060 Å) 및 반텍(Vantec) 검출기가 구비된 브루커 D4 인디버(Bruker D4 Endeavor) X-선 회절계에서 얻었다. 샘플을 2θ에서 0.0087°의 스텝 사이즈 및 0.5 초/스텝의 스캔 속도로 2θ에서 4 내지 40°로 및 0.6 mm 디버전스, 5.28mm 고정된 안티-스캐터, 및 9.5 mm 검출기 슬릿으로 스캐닝했다. 건조 분말을 쿼츠 샘플 홀더에 패킹했고 활면을 유리 슬라이드를 사용해 얻었다. 임의의 주어진 결정형에 대해, 회절 피크의 상대적 세기는 결정 형태 및 특성과 같은 요소로부터 생성되는 바람직한 배향에 때문에 달라질 수 있다는 것이 결정학 분야에서 널리 공지되어 있다. 바람직한 배향의 효과가 존재할 경우, 피크 세기는 변경되지만, 그러나 다형체의 특징적 피크 위치는 불변한다. 예컨대, The U. S. Pharmacopeia 35 - National Formulary 30 Chapter <941> Characterization of crystalline and partially crystalline solids by X-ray powder diffraction (XRPD) Official December 1, 2012-May 1, 2013을 참조하라. 또한, 임의의 주어진 결정형에 대해 각 피크 위치는 경미하게 변할 수 있다는 것이 결정학에서 또한 널리 공지되어 있다. 예컨대, 피크 위치는 샘플이 분석되는 온도 및 습도의 변화, 샘플 변위, 또는 내부 표준의 존재 또는 부재 때문에 이동할 수 있다. 본 경우, 2θ에서 ± 0.2의 피크 위치 가변성은 지정된 결정형의 명백한 확인을 방해하지 않으면서 가능한 변화로 고려될 것이다. 결정형의 확인은 구별되는 피크(° 2θ의 단위에서), 전형적으로 보다 우세한 피크의 임의의 고유한 조합에 기반하여 만들어질 수 있다. 주위 온도 및 상대 습도에서 수집된 결정형 회절 패턴은 8.85 및 26.77 도 2-세타에서 NIST 675 표준 피크에 기반하여 조정되었다.

실시예 6의 제조된 샘플은 CuKa 방사를 사용한 XRPD 패턴에 의해 하기 표 1에 기재된 것과 같은 회절 피크(2-세타 값)를 갖는 것으로 특성 분석되었다. 구체적으로 패턴은 0.2 도의 회절 각도 허용오차 하에 12.02, 12.93, 15.17, 19.24 및 23.21으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 피크와 함께 7.68에서의 피크를 포함한다.

<표 2> 실시예 6의 X-선 분말 회절 피크

실시예 7

8-메틸-2-[4-(1-피리미딘-2-일에틸)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온

실시예 8

8-메틸-2-[4-(1-피리미딘-2-일에틸)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 이성질체 1

실시예 9

8-메틸-2-[4-(1-피리미딘-2-일에틸)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 이성질체 2

8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온 비스-(2,2,2-트리플루오로아세트산) 염(1.0 g, 2.1 mmol), 2-아세틸피리미딘(0.38 g, 3.14 mmol), DMF(3 mL), MeOH(1 mL), 소듐 시아노보로히드라이드(0.20 g, 3.14 mmol)를 합하고 상온에서 20 시간 동안 교반했다. 추가의 2-아세틸피리미딘(0.38 g, 3.14 mmol) 및 소듐 시아노보로히드라이드 (0.20 g, 3.14 mmol)를 첨가하고 80 ℃에서 밤새 가열했다. DMF를 질소의 스트림 하에서 4 일 동안 증발시키고 DCM에서 90% DCM/MeOH로 용출되는 실리카 겔 플래시 크로마토그래피로 정제해 라세미체로서 표제 화합물, 실시예 7을 제공했다(330 mg, 44%).

페노멘(Phenomene)® 룩스(Lux)® 셀룰로스-2 컬럼 (2.1 × 25 cm, 5 ㎛) 상의 SFC를 사용해 8-메틸-2-[4-(1-피리미딘-2-일에틸)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온을 분리했다. 이동상: 40% EtOH(0.2% IPAm)/이산화탄소. 유속: 70 mL/min. 검출: 225 nm. 이성질체 1로서 제1 용출 피크 및 이성질체 2로서 제2 용출 피크를 얻었다.

실시예 8, 이성질체 1: 135 mg, 불순물로서 0.75%의 이성질체 2를 갖는 99.25% 순도(T_R = 4.59 min; 페노메넥스(Phenomenex)® 룩스® 셀룰로스-2 컬럼(2.1 × 25 cm, 5 ㎛), 이동상: 40% EtOH (0.2% IPAm)/이산화탄소, 유속: 5 mL/min. 검출: 225 nm). LC-ES/MS m/z 356.3 (M+H)⁺.

실시예 9, 이성질체 2: 121 mg, 불순물로서 3.36%의 이성질체 1을 갖는 96.63% 순도(T_R = 5.91 min, 페노메넥스® 룩스® 셀룰로스-2 컬럼(2.1 × 25 cm, 5 ㎛), 이동상: 40% EtOH (0.2% IPAm)/이산화탄소, 유속: 5 mL/min, 검출: 225 nm). LC-ES/MS m/z 356.3 (M+H)⁺.

실시예 10

8-메틸-2-[4-(1-피리미딘-2-일프로필)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온

실시예 11

8-메틸-2-[4-(1-피리미딘-2-일프로필)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 이성질체 1

실시예 12

8-메틸-2-[4-(1-피리미딘-2-일프로필)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 이성질체 2

1-(2-피리미디닐)-1-프로파논을 사용해 본질적으로 실시예 7, 8, 및 9에 기재된 것과 같은 절차에 따르고, DCM에서 90% DCM/MeOH의 구배로 용출되는 실리카 겔 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 실시예 10, 11, 및 12를 제조했다. 동일한 조건을 사용해 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 두 번째로 정제했다. 그 다음 높은 pH 프렙 HPLC(컬럼: 150 g 고해상도 C18 골드; 초기: 30 분 동안 60% 아세토니트릴/40% 암모늄 비카보네이트 w/5% MeOH의 구배로 5% 아세토니트릴/95% 10 mM 암모늄 비카보네이트 w/5% MeOH, 검출 파장 239, 254, 280 및 290 nm)에 의해 추가로 정제해 표제 화합물, 실시예 10을 제공했다(140 mg, 18%). 룩스® 셀룰로스-4 컬럼이 사용되었다는 예외가 있는 실시예 8 및 9에 기재된 조건을 사용해 SFC를 사용하여 생성된 거울상 이성질체 혼합물을 분리했다.

실시예 11, 이성질체 1: 50 mg, >99.9% 순도(T_R = 4.26 min; 페노메넥스® 룩스® 셀룰로스-4 컬럼(2.1 × 25 cm, 5 ㎛), 이동상: 40% EtOH (0.2% IPAm)/이산화탄소, 유속: 5 mL/min, 검출: 225 nm). LC-ES/MS m/z 370.2 (M+H)⁺.

실시예 12, 이성질체 2: 47 mg, >99.9% 순도 (T_R = 5.67 min; 페노메넥스® 룩스® 셀룰로스-4 컬럼 (2.1 × 25 cm, 5 ㎛). 이동상: 40% EtOH (0.2% IPAm)/이산화탄소. 유속: 5 mL/min. 검출: 225 nm), LC-ES/MS m/z 370.2 (M+H)⁺.

실시예 13

2-[4-[(4-메톡시피리미딘-2-일)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온

8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온 비스-(2,2,2-트리플루오로아세트산) 염(0.5 g, 1.0 mmol), 4-메톡시피리미딘-2-카브알데히드(150 mg, 1.08 mmol), DMF(10 mL), MeOH(1 mL) 및 소듐 시아노보로히드라이드(136 mg, 2.17 mmol)를 합하고 상온에서 3 일 동안 교반했다. MeOH로 희석하고 SCX-2 컬럼에 흡착시키고, MeOH로 세척하고 그 다음 MeOH 내 2 M NH₃로 용출하고, DCM에서 90% DCM/MeOH의 구배로 용출되는 실리카 겔 플래시 크로마토그래피에 의해 정제해 표제 화합물을 제공했다(43 mg, 11%). LC-ES/MS m/z 372.1 (M+H)⁺ T_R = 1.519 min.

하기 실시예는 적절한 알데히드 및 적절한 크로마토그래피를 사용해 본질적으로 실시예 13의 절차에 따라 제조됐다.

<표 3>

¹3 일 동안 반응물을 교반했다.

²추가적 알데히드(1 eq) 및 소듐 시아노보로히드라이드(1.5 eq)를 첨가하고; 그 다음 80 ℃에서 6 h 동안 가열했다. 역상 크로마토그래피(높은 pH 5-100)의 일반적 방법에 의해 추가 정제했다.

³역상 크로마토그래피(높은 pH 9-24)의 일반적 방법에 의해 추가 정제했다.

⁴역상 크로마토그래피(낮은 pH 0.1% TFA/ACN)에 이어서 SCX-2 컬럼 상의 크로마토그래피의 일반적 방법에 의해 추가 정제했다.

⁵상온에서 12 시간 동안 반응물을 교반하고 역상 크로마토그래피(높은 pH 13-48)의 일반적 방법에 의해 추가 정제한다.

실시예 20

2-[4-[(3-플루오로-2-피리딜)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온

DCM(114 mL)에 8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온 비스-(2,2,2-트리플루오로아세트산)(20.31 g, 34.34 mmol)을 현탁하고 질소로 퍼징했다. 3-플루오로피리딘-2-카브알데히드(5.26 g, 41.2 mmol)을 첨가하고 60 분 동안 교반했다. 그 다음 일 부분에 소듐 트리아세톡시보로히드라이드(14.56 g, 68.68 mmol)를 첨가하고 환류로의 발열을 관측했다. 반응물을 교반하고 상온으로 1 시간 동안 냉각되게 했다. 0.5 M NaOH(200 mL)에 붓고 2 M NaOH로 pH : 7-8로 조정했다. 유기층을 수집하고 DCM(2 × 200 mL)으로 수성층을 추출했다. 소듐 술페이트로 유기층을 합해 건조하고, 여과하고, 농축해 오일을 제공했다. 8 컬럼 부피에 대해 95% DCM/ 5% MeOH로, 그리고 8 컬럼 부피에 대해 90% DCM/10% MeOH로 용출되는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제해(400 g), >97% HPLC 순도를 갖는 표제 화합물(7.59 g, 61.7%)을 제공하고, 87% HPLC 순도를 갖는 2.64 g (21.5%)의 추가 생성물을 또한 제공했다. LC ES/MS m/z 359.1 (M+1) ⁺.

실시예 21

2-[4-[(2-메톡시페닐)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온

8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온 비스-(2,2,2-트리플루오로아세트산) 염(0.25 g, 0.52 mmol), 2-메톡시벤즈알데히드(0.21 g, 1.57 mmol), DMF(15 mL), MeOH(5 mL) 및 소듐 시아노보로히드라이드(100 mg, 1.57 mmol)를 합치고 상온에서 12 시간 동안 교반했다. 메탄올로 희석하고 SCX-2 컬럼에 흡착시키고, MeOH로 세척하고 그 다음 MeOH 내 2 M NH₃로 용출하고, 농축하고 역상 크로마토그래피(역상 크로마토그래피(높은 pH 21-55)에 대한 일반적 방법 참조)에 의해 정제해 표제 화합물을 제공했다(223 mg, 59%). LC-ES/MS m/z 370.2 (M+H)⁺.

하기 화합물은 적절한 알데히드를 사용해 본질적으로 실시예 21에 기재된 것과 같이 제조됐다.

<표 4>

^a역상 크로마토그래피(높은 pH 30-64)

^b역상 크로마토그래피(높은 pH 23-57)

^c역상 크로마토그래피(높은 pH 13-48)

^d역상 크로마토그래피(높은 pH 39-73)

실시예 28

2-[4-[(3-플루오로-2-피리딜)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 디히드로클로라이드

2 바이알에 각각의 DCM(5 mL)에 디옥산 내 4M HCl(1 mL, 4 mmol), 및 2-[4-[(3-플루오로-2-피리딜)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온(0.117 g, 0.65 mmol)을 첨가했다. 바이알을 1 시간 동안 흔들고, 1 바이알로 합치고 그 다음 질소의 스트림 하에서 밤새 증발시켰다. 물질을 진공 오븐에서 밤새 건조시켜 표제 화합물을 제공했다(0.28 g, 99%). LC-ES/MS m/z 359.2 [M+H]⁺, T_R = 1.04 min.

하기 실시예는 실시예 21-27의 적절한 화합물을 사용해 본질적으로 실시예 28에 기재된 것과 같이 제조됐다.

<표 5>

실시예 37

2-[[4-(8-메틸-4-옥소-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)피페라진-1-일]메틸]벤조니트릴; 비스-2,2,2-트리플루오로아세트산

DMF(3.2 mL) 내 8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온 비스-(2,2,2-트리플루오로아세트산)(0.364 g, 0.76 mmol)의 용액과 2-시아노벤즈알데히드(0.499 g, 3.18 mmol)를 합치고 상온에서 1 시간 동안 교반했다. 소듐 시아노보로히드라이드(0.143 g, 2.28 mmol)를 첨가하고 상온에서 밤새 교반했다. 물에 붓고 여과에 의한 수집을 시도했다. 필터의 클로깅을 관측했고 그 다음 2 N NaOH 및 NaCl(수성)을 첨가하고 조 생성물을 에틸 아세테이트(3×)로 추출했다. 유기층을 합하고, 소듐 술페이트로 건조하고, 여과하고, 농축했다. 10 분 동안 등용매로 98% DCM /2% 에탄올 및 95% DCM /5% 에탄올의 단계 구배로 용출되는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하고 45 분 동안 유지했다. 5% 아세토니트릴(0.1% TFA)/95% 물(0.1% TFA)→54% 아세토니트릴(0.1% TFA)/46% 물(0.1% TFA)로 구배 용출되는 정제용 역상 크로마토그래피에 의해 추가로 정제해 표제 화합물을 제공했다(48.1 mg, 10.7%). LC-ES/MS m/z 365.2 [M+H]⁺

실시예 38

2-[4-[(2-클로로페닐)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온

2-클로로-5-메틸-피리미딘 2-클로로벤즈알데히드를 사용해 본질적으로 실시예 37에 기재된 것과 같이 표제 화합물을 제조했다. 실리카 겔 플래시 크로마토그래피로 조 물질을 정제했다(5% EtOH/CHCl₃→10% EtOH/CHCl₃ 구배). DMSO/MeOH로부터 물질을 재결정화해 흰색 고체를 얻었다(83 mg, 29%). LC-ES/MS m/z 374.3 (³⁵Cl) [M+H]⁺.

실시예 39

2-[4-[(5-플루오로피리미딘-2-일)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온

포타슘 트리플루오로-[[4-(8-메틸-4-옥소-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)피페라진-1-일]메틸]보라누이드(273 mg, 0.74 mmol), 2-클로로-5-플루오로피리미딘(98 mg, 0.74 mmol), 세슘 카보네이트(723 mg, 2.22 mmol), X-Phos(71 mg, 0.15 mmol), THF (10 mL) 및 물(1 mL)을 합하고, 질소의 스트림으로 2 min 동안 가스를 제거했다. 팔라듐(II) 아세테이트(17 mg, 0.074 mmol)를 첨가하고 80 ℃에서 밤새 가열했다. 혼합물을 에틸 아세테이트 및 물 간에 분할하고 유기층을 분리했다. 마그네슘 술페이트로 건조하고, 여과하고, 여과물을 감압 하에서 농축했다. DCM→90% DCM/MeOH로 용출되는 실리카 겔 플래시 크로마토그래피에 의해 생성된 잔여물을 정제해 표제 화합물을 제공했다(20 mg, 7.5%). LC-ES/MS m/z 360.2 [M+H]⁺.

실시예 40

2-[[4-(8-메틸-4-옥소-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)피페라진-1-일]메틸]피리딘-3-카보니트릴

DMF(10 mL)에 2-[4-[(3-브로모-2-피리딜)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온(167 mg, 0.398 mmol)을 용해시키고 질소의 스트림으로 1 min 동안 가스를 제거했다. 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(92 mg, 0.080 mmol) 및 시안화아연(187 mg, 1.59 mmol)을 첨가하고 120 ℃에서 밤새 혼합물을 가열했다. 반응물을 냉각하고 MeOH로 희석했다. 혼합물을 10 g SCX-2 컬럼에 옮기고 MeOH 내 2 M NH₃로 용출했다. 농축하고 생성된 잔여물을 역상 크로마토그래피(높은 pH 9-29)로 추가 정제해 표제 화합물을 제공했다(35 mg, 24%). LC-ES/MS m/z 366.2 (M+H)⁺

실시예 41

2-[4-[(4-클로로피리미딘-2-일)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온

카본 테트라클로라이드(5 mL) 내 조 용액으로서 2-(브로모메틸)-4-클로로-피리미딘 (322 mg, 1.55 mmol), DCM(2 mL), 트리에틸아민(0.65 mL, 4.65 mmol), 및 8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온 비스-(2,2,2-트리플루오로아세트산)(739 mg, 1.55 mmol)을 합치고 25 ℃에서 3 일 동안 교반했다. 반응 혼합물을 DCM 및 물 간에 분할하고 수성 층을 DCM으로 추출했다. 유기층을 합치고, MgSO₄로 건조하고, 여과하고, 농축했다. 생성된 잔여물을 질량 가이드된 SFC(컬럼: 4-니트로벤젠 술폰아미드, 프린스톤(Princeton) 크로마토그래피, 150 × 30 mm, 유속 = 100 mL/min; 방법: 30 sec 동안 등용매로 MeOH 내 95% CO₂/14 mM 암모니아, 그 다음 330 sec 동안 MeOH 구배에서 60% CO₂/14 mM 암모니아로 구배, 그 다음 10 sec 동안 MeOH 내 50% CO₂/14 mM 암모니아로 램핑 및 30 초 동안 유지)에 의해 정제해 71 mg의 원하는 생성물을 암모니아 염 불순물과 함께 제공했다. 생성물을 실리카 겔 플래시 크로마토그래피(CH₂Cl₂/MeOH, 90:10)에 의해 추가로 정제해 표제 화합물을 제공했다(28 mg, 5%). LC-ES/MS m/z 376.0 [M+H]⁺

실시예 42

8-메틸-2-[4-(피라진-2-일메틸)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온

8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온 비스-(2,2,2-트리플루오로아세트산)(500 mg, 1.05 mmol), 트리에틸아민(0.73 mL, 5.2 mmol), 소듐 아이오다이드(78.5 mg, 0.52 mmol) 및 아세토니트릴(7 mL)을 합쳤다. 2-(클로로메틸)피라진 (201 mg, 1.57 mmol)을 첨가하고 25 ℃에서 72 h 동안 교반했다. 반응물을 DCM 및 물로 희석하고 생성물을 DCM으로 추출했다. 유기 부분을 포화 NaHCO₃ 및 브라인으로 세척하고, Na₂SO₄로 건조하고, 여과하고, 농축했다. 생성된 잔여물을 실리카 겔 플래시 크로마토그래피(DCM / MeOH 내 2M NH₃, 90:10)에 의해 정제해 노란색 고체로서 표제 화합물을 제공했다(249 mg, 0.72 mmol,70%). LC-ES/MS m/z 342.0 [M+H]⁺, T_R = 0.99 min.

하기 실시예는 적절한 할로-메틸피라진을 사용해 본질적으로 실시예 42에 기재된 절차에 따라 제조됐다.

<표 6>

실시예 45

2-[4-[(3,5-디플루오로-2-피리딜)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온

2-(클로로메틸)-3,5-디플루오로피리딘(182 mg, 1.11 mmol), 8-메틸-2-피페라진-1-일-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온(260 mg, 1.04 mmol), 포타슘 카보네이트(2.2 g, 15 mmol) 및 아세토니트릴(5 mL)을 첨가하고 혼합물을 상온에서 밤새 교반했다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하고 실리카 겔 크로마토그래피(MeOH/DCM, 1/20으로 용출됨)에 의해 잔여물을 정제해 표제 화합물을 제공했다(160 mg, 43%). LC-ES/MS m/z 377.2 (M+H)⁺, T_R = 1.11 min.

암은 그의 발병 및 진행이 세포 및 조직 미세환경 내 DNA 복구, 게놈 안정성, 세포 증식, 세포 사멸, 부착, 혈관 신생, 침습, 및 전이를 조절하는 하나 이상의 유전자의 비정상적 활성화 또는 기능에 의해 유도되는 질병의 이질적인 집합으로 점점 인식되고 있다. "암" 유전자의 변이 또는 비정상적 기능은 자연 발생되는 DNA 다형성, 게놈 카피수의 변화(증폭, 결실, 염색체 결실, 또는 중복에 의해), 유전자 및 염색체 구조의 변화(염색체 전위, 역전, 또는 탈조절된 유전자 발현으로 이어지는 다른 재배치에 의해), 및 점 돌연변이로부터 발생할 수 있다. 암성 신생물 형성은 하나의 비정상적 유전자 기능에 의해 유도되거나, 동일한 비정상적 유전자 기능, 또는 추가의 비정상적 유전자 활성화 또는 기능에 의해 악화되는 유지 및 진행에 의해 유도될 수 있다.

상기에 언급된 유전적 염색체 이상 외에, 각각의 암은 또한 DNA 메틸화, 게놈 각인, 및 아세틸화, 메틸화, 또는 인산화에 의한 히스톤 변형을 포함하는 게놈의 후성적 변형을 또한 포함할 수 있다. 후성적 변형은 악성 종양 형성의 유도 및/또는 유지에서 역할을 담당할 수 있다.

생검, 면역표현형 분석 및 다른 테스트에 의한 암성 악성 종양의 진단법은 공지되어 있고 상용된다. 고해상도 염색체 밴딩 및 고급 염색체 이미징 기술에 더해, 암이 의심되는 경우에서 염색체 이상이 세포유전 분석 예컨대 형광 계내 혼성화(FISH), 핵형 분석, 스펙트럼 핵형 분석(SKY), 멀티플렉스 FISH(M-FISH), 비교 게놈 혼성화(CGH), 단일 뉴클레오티드 다형성 어레이(SNP Chips) 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지되고 사용되는 다른 진단적 및 분석 테스트를 통해 결정될 수 있다.

Wnt/β-카테닌 신호전달 경로의 중요한 부분은 β-카테닌 해체 복합체에 의한 하류 이펙터 β-카테닌의 조절된 단백질 분해 과정이다. β-카테닌 해체 복합체의 주요한 구성요소는 선종성 결장 폴립증(APC), 액신, 및 GSK3α/β이다. Wnt 경로 활성화가 없으면, 시토졸 β-카테닌은 구성적으로 인산화되어 분해의 표적이 된다. Wnt 자극 후, β-카테닌 해체 복합체는 해리되어, 시토졸 β-카테닌의 축적, 핵으로의 전위, 및 Wnt 정규 경로 반응성 유전자의 전사를 유발한다.

상당한 노력이 정규 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로를 억제하는 약제를 식별하기 위해 이루어졌다. TNKS1 및 TNKS2 억제제 예컨대 XAV939 (Huang et al., Nature, 2009, 461, 614; JW55, Waaler et al., Cancer Res., 2012, 72(11), 2822; G007-LK, Lau et al., Cancer Res., 2013, 73(10), 3132; TNKS656, Shultz et al., J. Med . Chem . published online July 11, 2013, DOI: 10.1021/jm400807n); 및 제WO 2013/117288호가 공지되어 있다. 이들 노력에도 불구하고, 어떠한 임상적 TNKS1 및 TNKS2 억제제 치료제도 현재 등장하지 않았다.

Wnt 단백질의 과다발현 또는 β-카테닌 해체 복합체의 구성요소에 영향을 미치는 돌연변이에 의해 매개되어 β-카테닌의 안정화를 유도하는 경로의 비정상적 활성화가 암에서 관측되었다. 특히, APC의 말단절단 돌연변이는 결장직장암종에서 가장 우세한 유전적 변화이다(Miyaki, M. et al. Cancer Res. 1994, 54, 3011-20; Miyoshi, Y. et al. Hum. Mol . Genet. 1992, 1, 229-33; 및 Powell, S. M. et al. Nature 1992, 359, 235-7). 또한, 액신1 및 액신2 돌연변이, Wnt 신호전달 경로의 음성 조절자가 각각 간암종 및 결장직장암을 갖는 환자에서 확인되었다(Taniguchi, K. et al. Oncogene 2002, 21, 4863-71; Liu, W. et al. Nat. Genet. 2000, 26, 146-7; Lammi, L. et al. Am. J. Hum. Genet. 2004, 74, 1043-50). 이들 체세포 돌연변이는 β-카테닌의 Wnt-비의존적 안정화 및 β-카테닌-매개된 전사의 구성적 활성화를 야기한다.

비정상적 Wnt 신호전달 경로 활성화는 결장직장암, 위암, 간암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 난소암, 수모세포종, 흑색종, 폐암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 전립선암 및 교모세포종을 포함한 몇몇 암에서 나타났다(Waaler et al. Cancer Res. 2012, 72, 2822-2832; Busch et al. BMC Cancer 2013, 13, 211; Yang et al. Oncogene 2011, 30, 4437-4446; De Robertis et al. Mol. Cancer Ther . 2013, 12, 1180-1189; Polakis, P. Curr . Opin . Genet. Dev. 2007, 17, 45-51; 및 Barker, N. et al. Nat. Rev. Drug Discov . 2006, 5, 997-1014). 비정상적 Wnt/β-카테닌 경로 신호전달 활성은 T-세포 림프종, T-림프모구성 림프종, T-세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL), Groen et al. Cancer Res. 2008, 68, 6969-6977; 다발성 골수종, Qiang et al. Oncogene 2003, 22, 1536-1545, 및 Chim et al. Leukemia 2007, 21, 2527-2536; 외투 세포 림프종, Gelebart et al. Blood 2008, 112, 5171-5179; 만성 골수성 백혈병(CML), Heidel et al. Cell Stem Cell 2012, 10(4):412-424, 및 급성 골수성 백혈병(AML), Ysebaert et al. Leukemia 2006, 20, 1211-1216에서 나타났다.

β-카테닌 분해는 폴리-ADP-리보스 중합효소(PARP) 효소 탄키라제 1 및 탄키라제 2의 억제를 통해 액신/APC/GSK3α/β 해체 복합체를 안정화함으로써 촉진될 수 있음이 발견됐다(Huang et al. Nature 2009, 461, 614-620).

하기 시험관내 및 생체내 연구는 HEK293 세포 내 hTNKS1 및 hTNKS2의 억제, 액신2의 안정화, PARP1 억제에 대한 선택성에 있어서, 예시되고 테스트된 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로 억제 활성 및 효능이 Wnt-유도성 유전자 발현 및 체내 항종양성 활성을 감소시킨다는 것을 입증한다. 이들 분석은 인간 임상 화학요법 활성의 지표인 것으로 관련 기술분야의 숙련자에 의해 일반적으로 인식되어 있다. TNKS 1 및 TNKS 2의 억제는 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로의 비정상적 활성화에 대항하기에 효과적인 것으로 여겨진다. Wnt/β-카테닌 신호전달 경로 억제 활성 및 효능을 증거하는 분석법은 실질적으로 하기와 같이 또는 유사한 데이터를 다루는 유사한 분석에 의해 수행될 수 있다.

분석

일반적으로, 세포주는 시판되는 물질을 사용하고 관련 기술분야의 숙련자에게 공지되고 상용되는 절차에 의해 제조되었다.

hTNKS 효소 활성의 화합물 억제를 입증하기 위한 생화학적 분석

hTNKS1 및 hTNKS2의 효소 활성은 384-웰 포맷에서 플레이트-결합된 텔로미어 반복 결합 인자 1(TRF1) 단백질(NCBI, 수탁 번호 NP_059523.2(서열 1))로 도입된 폴리 ADP 리보스를 검출하는 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA)를 사용해 평가됐다. 재조합 hTNKS1(NCBI, 수탁 번호 NP_003738.2(서열 2)) 또는 hTNKS2(NCBI, 수탁 번호 NP_079511.1(서열 3)) 효소를 사용해, 이 분석은 비오티닐화된 NAD+를 사용하고 재조합 hTRF1로의 그의 도입을 비색 신호를 생성하기 위한 스트렙타비딘-홀스래디쉬 과산화효소(HRP) 접합체 및 TMB 과산화효소 기질을 사용해 측정했다. 재조합 플래그-태그부착된 hTRF1 단백질은 E. 콜라이(coli)에서 N-말단 플래그 태그를 갖는 전장 인간 TRF1 단백질을 발현함으로써 생성된다. 재조합 플래그-hTNKS1(Q83P의 변화를 갖음) 단백질은 Bac-대-Bac 바쿨로바이러스(Baculovirus) 발현 시스템(인비트로젠(Invitrogen)™; Invitrogen™ User Manual, Version F, dated 04 September 2010; 및 Invitrogen™ Instruction Manual dated 27 February 2002을 또한 참조)의 제조자의 프로토콜에 따라 바쿨로바이러스에서 N-말단 플래그 태그를 갖는 전장 인간 TNKS1을 발현함으로써 생성된다. hTRF1 및 hTNK1의 플래그 태그는 오직 효소의 정제를 위해 사용되고 ELISA 분석법에 달리 연관되지 않는다.

플래그-TRF1을 TBS 코팅 완충액(50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl)을 사용해 5 ㎍/ml로 희석하고, 25 ㎕를 코닝(Corning) 3700 플레이트(메사추세츠주 턱스베리(Tewksbury, MA) #CLS3700)의 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 4 ℃에서 밤새 인큐베이션했다. 다음날 플레이트를 50 ㎕/웰 세척 완충액(0.1% 트윈(Tween)-20(미주리주 세인트 루이스 시그마(Sigma, St. Louis, MO) #7949)을 갖는 PBS(유타주 로건 하이클론(Hyclone, Logan, UT) #SH30258.01을 사용한 10× 농축액으로부터 제조됨))으로 3 회 세척한 후 1× PBS(인디애나주 인디애나폴리스 로슈(Roche, Indianapolis, IN) #11666789001)에서 50 ㎕ 1% 카세인 블록 완충액(메사추세츠주 월섬 써모 사이언티픽(Thermo Scientific, Waltham, MA) #37528)을 사용해 상온에서 1.5 시간 동안 블로킹했다. 블로킹 이후, 플레이트를 50 ㎕/웰 세척 완충액으로 3 회 세척했다. 효소 분석을 25 ㎕의 총 부피 내 2 ㎍/ml의 플래그-hTNKS1, 9.5 μM NAD+(미주리주 세인트루이스 시그마 #N0632), 0.5 μM 비오틴-NAD+(메릴랜드주 게이더스버그 트레비젠(Trevigen, Gaithersburg, MD), #4670-500-01), 및 50 mM 트리스, pH 8.0(뉴욕주 그랜드 아일랜드(Grand Island) 인비트로젠™ #15568-025), 4 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT, 0.5% 트리톤(Triton) X-100 (인디애나주 인디애나폴리스 로슈 #11332481001) 및 1.0 % DMSO 에서 10 μM 내지 4 nM의 최종 농도로 희석된 화합물을 사용해 셋업했다. 반응물을 상온에서 120 분 동안 인큐베이션하고 플레이트를 50 ㎕/웰 세척 완충액으로 3 회 세척함으로써 정지시켰다. 비오틴-NAD+ 도입의 검출을 세척 완충액으로 1:3000으로 희석되고 상온에서 60 분 동안 인큐베이션된 25 ㎕/웰의 스트렙타비딘-HRP(펜실베니아주 피츠버그 GE 라이프 사이언시스(GE Life Sciences Pittsburgh, PA) #RPN1231V)를 사용해 수행했다. 플레이트를 그 다음 50 ㎕/웰 세척 완충액을 사용해 3 회 세척했다. 이것을 그 다음 상온에서 15 분 동안 25 ㎕/웰 TMB 과산화효소 기질 키트(메릴랜드주 게이더스버그 KPL #50-76-02 및 #50-65-02)와 함께 인큐베이션하고 25 ㎕/웰의 2 N H₂SO₄를 사용해 반응을 정지시켰다. 흡광도를 인비젼(Envision) 모델 2103을 사용해 450 nm에서 판독했다.

실질적으로 hTNKS1에 대해 상기된 절차를 따르고 hTNKS2를 사용함으로써, 본질적으로 유사한 ELISA 분석을 준비했다.

hTNKS 동형 둘 다에 대해 테스트된 이들 화합물의 활성이 표 7에 나타난다.

<표 7>

평균±SEM; SEM = 평균의 표준 오차

표 7의 데이터는 테스트된 화합물이 인간 탄키라제의 동형 둘 다에 대해 시험관 내에서 억제 활성을 갖는다는 증거를 제공한다.

탄키라제 억제제의 세포-기반 활성을 입증하기 위한 EGFP - 액신2 안정화 분석

강화된 녹색 형광 단백질-액신2 세포(EGFP-액신2)를 N-말단 말단절단된 EGFP 태그(아미노산 228-466; 서열 7)를 함유하는 액신2 구축물에 의한 HEK293 세포의 안정적 트랜스펙션에 의해 제조했다. 액신2 수치의 변화, 특히 액신2 안정화를 384-웰 포맷에서 다양한 처리 후 안정적 세포주에서의 EGFP의 수치의 정량화에 의해 모니터링했다. 탄키라제 억제의 결과로서 EGFP-액신2 융합 단백질의 안정화를 반영하는 형광의 증가를 어큐멘(Acumen) 레이저 스캐닝 사이토미터에서 모니터링했다.

HEK293 세포(버지니아주 매너서스(Manassas, VA) ATCC #CRL-1573)를 5% FBS(뉴욕주 그랜드 아일랜드 인비트로젠™ #10082-147), 20 mM HEPES(유타주 로건 하이클론 #SH30237.01), 및 글루타맥스(Glutamax)(뉴욕주 그랜드 아일랜드 인비트로젠™ #35050-061)를 함유하는 DMEM:F12(뉴욕주 그랜드 아일랜드 인비트로젠™ #93-0152DK)의 완전 배지에서 유지했다. EGFP-액신2 세포를 pcDNA3.1+에서(제조자의 프로토콜, 뉴욕주 그랜드 아일랜드 인비트로젠™ #V79020에 따라) 말단절단된(아미노산 228-466) EGFP N-말단 태그(전장 EGFP, NCBI, 수탁 번호 ABG78037.1(서열 5))를 함유하는 전장 인간 액신2(NCBI, 수탁 번호 NP_004646.3(서열 4))로 HEK293 세포를 트랜스펙션함으로써 생성했다. 안정적 EGFP-액신2 세포를 800 ㎍/ml G418(뉴욕주 그랜드 아일랜드 인비트로젠™, #10131-035)을 첨가한 상기의 HEK293 완전 배지에서 유지했다. EGFP-액신2 안정화 분석을 폴리-D-리신 코팅된 BD 384-웰 플레이트(캘리포니아주 산 호세 BD 바이오사이언시스(BD Biosciences, San Jose, CA) #356663)에 2000 EGFP-액신2 세포/웰을 플레이팅하고 30 ㎕/웰 완전 HEK293 배지에서 인큐베이션함으로써 수행했고 37 ℃, 5% CO₂에서 밤새 성장시켰다. 100% DMSO 내 화합물을 100 nl/웰로 직접 세포 배지에 첨가했다. 분석에서 테스트된 화합물의 최종 농도는 33 μM - 1.7 nM이고 DMSO의 최종 농도는 0.33%였다. 세포를 37 ℃, 5% CO₂에서 24 시간 동안 화합물과 함께 인큐베이션하고, 세포를 상온에서 15 분 동안 2% 최종 농도의 포름알데히드를 사용해 고정시켰다. 고정된 세포를 0.1% 트리톤 X-100(메사추세츠주 월섬 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific) #BP151-500)을 함유한 40 ㎕/웰 PBS(유타주 로건 하이클론 #SH30264.01)에서 각각 20 분 동안 2 회 세척했다. 이들을 그 다음 10 ㎍/ml 프로피듐 아이오다이드(뉴욕주 그랜드 아일랜드 인비트로젠™ #P3566) 및 50 ㎍/ml RNaseA(미주리주 세인트 루이스 시그마 #R6513)를 함유하는 30 ㎕/웰 PBS를 사용해 염색했다. EGFP 세기를 10% EGFP/세포를 갖도록 게이팅된 어큐멘 모델 eX3 어큐멘 레이저 스캐닝 사이토미터를 사용해 측정했다.

<표 8>

평균±SEM; SEM = 평균의 표준 오차

표 8의 데이터는 테스트된 화합물이 HEK293 세포에서 액신2를 안정화시킨다는 증거를 제공한다.

탄키라제 억제제(대 PARP1 )의 선택성을 평가하기 위한 인간 PARP1 효소 분석

폴리 ADP-리보스 중합효소 1(PARP1) 분석은 384-웰 포맷에서 플레이트-결합된 히스톤 단백질로 도입된 폴리 ADP 리보스를 검출하는 ELISA이다. 재조합 hPARP1 효소를 사용해, 이 분석은 비오티닐화된 NAD+를 사용하고 히스톤으로의 도입을 비색 신호를 생성하는 스트렙타비딘-홀스래디쉬 과산화효소(HRP) 접합체 및 TMB 과산화효소 기질을 사용해 측정했다.

히스톤을 코팅 완충액(50 mM Na₂CO₃, pH 9.4, 미주리주 세인트 루이스 몰린크로트(Mallinckrodt))에서 0.1 mg/ml로 희석하고 25 ㎕를 코닝 3700 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 4 ℃에서 밤새 인큐베이션했다. 다음날 플레이트를 50 ㎕/웰 세척 완충액(0.1% 트윈-20을 갖는 PBS(10× 농축액으로부터 제조됨))으로 3× 세척한 후 1× PBS(인디애나주 인디애나폴리스 로슈 #11666789001) 내 50 ㎕ 1% 카세인 블록 완충액을 사용해 상온에서 1.5 시간 동안 블로킹했다. 블로킹 후, 플레이트를 50 ㎕/웰 세척 완충액으로 3 회 세척했다. PARP1 효소 분석을 0.01 U/㎕ hPARP1(메릴랜드주 게이더스버그 트레비젠 #4668-500-01), 0.5X PARP 칵테일, 활성화된 DNA(메릴랜드주 게이더스버그 트레비젠 #4671-096-03 및 #4671-096-06) 및 50 mM 트리스, pH 8.0, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT(뉴욕주 그랜드 아일랜드 인비트로젠™ #15508-013), 0.5% 트리톤 X-100 및 1.0 % DMSO를 함유하는 분석 완충액 내 10 μM 내지 4 nM의 최종 농도로 희석된 화합물을 사용함으로써 셋업했다. 반응물을 상온에서 60 분 동안 인큐베이션하고 50 ㎕/웰 세척 용액으로 플레이트를 3 회 세척함으로써 정지시켰다. 비오틴-NAD+ 도입의 검출을 세척 완충액으로 1:3000 희석된 25 ㎕/웰의 스트렙타비딘-HRP을 사용하고 상온에서 60 분 동안 인큐베이션하여 수행했다. 플레이트를 그 다음 50 ㎕/웰 세척 용액을 사용해 3 회 세척했다. 그 다음 상온에서 15 분 동안 25 ㎕/웰 TMB 과산화효소 기질 키트(메릴랜드주 게이더스버그 KPL #50-76-02 및 #50-65-02)로 인큐베이션하고 25 ㎕/웰의 2 N H₂SO₄을 사용해 반응을 정지시켰다. 흡광도를 인비젼 모델 2103을 사용해 450 nm에서 판독했다.

<표 9>

평균±SEM; SEM = 평균의 표준 오차

표 9의 데이터는 PARP1 억제와 비교하여 탄키라제의 각각의 테스트된 화합물에 대한 선택적 억제에 대한 증거를 제공한다.

Wnt -유도성 유전자의 발현을 감소시키는 탄키라제 억제제의 능력을 결정하기 위한 DLD -1 TOPFlash 분석

DLD-1 세포는 말단절단된 APC 단백질을 코딩하는 선종성 결장 폴립증(APC) 유전자 내 돌연변이를 함유한다. 이 단백질은 해체 복합체에 결합할 수 없고 β 카테닌이 핵으로 전위되고 TCF/LEF 전사 인자를 활성화되게 함으로써 구성적으로 활성화된 Wnt 경로를 야기한다. DLD-1 TOPFlash는 루시페라제 리포터에 연결된 TCF4 프로모터의 안정적 트랜스펙션에 의해 DLD-1(인간 결장직장 선암종)로부터 유래된 리포터 세포주이다. 세포 용해물 내 루시페라제의 양을 96 웰 포맷에서 발광을 측정함으로써 정량화했다.

DLD-1 세포(버지니아주 매너서스 ATCC #CCL-221)를 10% FBS(유타주 로건 하이클론 #SH30070.03)를 함유하는 RPMI(뉴욕주 그랜드 아일랜드 인비트로젠™ #11875-093)의 완전 배지에서 유지했다. DLD-1 TOPFlash 세포를 10의 MOI로 시그날 렌티(Cignal Lenti) TCF/LEF 리포터(Luc)(캘리포니아주 발렌시아 퀴아젠(Qiagen, Valencia) #CLS-018L-8, lot#BX16)로 DLD-1 세포를 감염시킴으로써 제조자의 프로토콜에 따라 생성했다. 폴리브린(polybreen)(미주리주 세인트 루이스 시그마 #H9268)을 8 ㎍/ml의 최종 농도로 첨가하고 세포를 37 ℃, 5% CO₂에서 밤새 인큐베이션했다. 다음날 배지를 10 ㎍/ml 푸로마이신(캘리포니아주 마운틴 뷰 클론텍(Clontech, Mountain View) #631305)을 함유하는 신선한 성장 배지로 바꾸고 세포를 37 ℃, 5% CO₂에서 추가 3 일 동안 인큐베이션해 안정적 세포주를 생성했다. TOPFlash 분석을 코닝 96 웰 화이트/투명 플레이트(메사추세츠주 턱스베리 코닝 #3610)에서 10,000 세포/웰로 DLD-1 TOPFlash 세포를 플레이팅하고 RPMI(유타주 로건 하이클론 #SH30027.01), 10% FBS, 및 10 ㎍/ml 푸로마이신을 함유하는 30 ㎕/웰 완전 배지에서 인큐베이션하고 37 ℃, 5% CO₂에서 밤새 성장시킴으로써 수행했다. 100% DMSO 내 화합물을 0.2% BSA(7.5% BSA, 뉴욕주 그랜드 아일랜드 인비트로젠™ #15260-037으로부터 희석됨)를 함유하는 OptiMEM®(뉴욕주 그랜드 아일랜드 인비트로젠™ #31985-062)에서 28.5 배 희석하고, 5 ㎕ 희석된 화합물을 30 ㎕ 세포 배양 배지/웰에 첨가했다. 분석에서 테스트된 화합물의 최종 농도는 50 μM - 1.5 nM이고 분석에서 DMSO의 최종 농도는 0.48%였다. 세포를 화합물과 함께 37 ℃, 5% CO₂에서 24 시간 동안 인큐베이션하고 플레이트를 인큐베이터에서 빼내어 상온에서 30 분 동안 놓아두었다. 버그라이트(BugLite)™(3×) 시약을 150 mM 트리스(108.15 ml 1M 트리스 HCl 및 41.85 ml 1M 트리스 베이스(미주리주 세인트 루이스 시그마, #T3253 및 T-1503)), 3 mM MgCl₂ 및 3% 트리톤 X-100를 함유하는 1 리터의 트리톤-X100 용해 완충액에 2.296g DTT(미주리주 세인트 루이스 시그마 #D0632), 1.152g CoA(미주리주 세인트 루이스 시그마 #C3019), 0.248g ATP(미주리주 세인트 루이스 시그마 #A7699), 및 0.42g 루시페린(일리노이주 이타스카 바이오신쓰 AG(Biosynth AG, Itasca, IL) #L-8240)을 용해시킴으로써 제조했다. 플레이트가 상온에서 평형에 도달한 후, 18 ㎕의 3× 버그라이트 시약을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 상온에서 30 분 동안 흔들면서 인큐베이션했다. 발광을 인비젼 모델 2103을 사용해 측정했다.

<표 10>

평균±SEM; SEM = 평균의 표준 오차

표 10의 데이터는 테스트된 화합물이 TOPFlash Wnt 리포터 분석에 의해 측정된 것과 같이 Wnt 유도성 유전자의 억제제임을 입증한다.

탄키라제 억제제의 생체 내 항종양 활성의 평가

C57BL/6J-Apc ^Min /J계 마우스는 Apc 유전자의 코돈 850에서 말단절단 돌연변이를 갖고 3-6 개월의 연령에서 장 폴립 및 결장직장 신생물이 발생한다. APC 유전자 내 말단절단은 Wnt 신호전달 경로의 활성화로 이어지고 β 카테닌의 상승된 수준은 이들 마우스에서 전신생물/신생물성 병변에서 흔히 검출된다.

탄키라제 억제제의 생체 내 항종양 활성을 평가하기 위해, C57BL/6J-Apc ^Min /J계 마우스를 잭슨 래버러토리스(Jackson Laboratories)(스톡 넘버 002020)에서 구매했고 1 주 동안 적응시켰다. 동물을 2 그룹으로 나누고 연속 60 일 동안 25 mg/kg(BID)의 실시예 1 또는 비히클로 처리했다. 처리 기간의 종반에 동물을 희생시키고 소장 내 폴립의 수를 해부 현미경으로 카운팅했다. 표 11에 나타나는 것처럼, 실시예 1의 화합물로 처리된 C57BL/6J-Apc ^Min /J계 마우스는 비히클-처리된 동물에 비해 소장 내에 통계적으로 보다 유의하게 낮은 수의 종양을 가졌다.

<표 11>

표 11의 데이터는 실시예 1로의 생체 내 처리가 C57BL/6J-Apc ^Min /J계 마우스 내 장 폴립의 수를 감소시킨다는 증거를 제공한다.

콜로니 형성 분석

실시예 1의 화합물을 췌장 종양으로부터 유래된 세 개(카판-2, HPAF-II, 및 Panc 04.03) 및 비-소세포 폐암에서 유래한 한 개(A549)의 네 개의 상이한 인간 종양 세포주에 대해 시험관 내 콜로니 형성 분석으로 또한 테스트했다. 이 분석을 관련 기술분야의 숙련자에게 공지되고 상용되는 절차에 의해 시판되는 물질을 사용해 수행했다.

A549 세포(버니지아주 매너서스 ATCC # CCL-185)를 10% FBS(뉴욕주 그랜드 아일랜드 인비트로젠 #16000-044)를 함유하는 F12K(유타주 로건 하이클론 #SH30526)의 완전 배지에서 유지했다. 카판-2 세포(버지니아주 매너서스 ATCC # HTB-80)를 10% FBS(뉴욕주 그랜드 아일랜드 인비트로젠 #16000-044)를 함유하는 McCoys 5A(유타주 로건 하이클론 #SH30200)의 완전 배지에서 유지했다. HPAF-II 세포(버니지아주 매너서스 ATCC #CRL-1997)를 10% FBS(뉴욕주 그랜드 아일랜드 인비트로젠#16000-044)를 함유하는 EMEM(유타주 로건 하이클론 #SH30024)의 완전 배지에서 유지했다. Panc 04.03 세포(버지니아주 매너서스 ATCC #CRL-2555)를 15% FBS(뉴욕주 그랜드 아일랜드 인비트로젠 #16000-044) 및 20 ㎍/ml 인슐린(미주리주 세인트 루이스 시그마 #I9278)를 함유하는 RPMI(유타주 로건 하이클론 #SH30255)의 완전 배지에서 유지했다. 콜로니 형성 분석을 6-웰 플레이트(메사추세츠주 턱스베리 코닝 라이프 사이언시스 #353046)에 각각 A549 세포를 250 세포/웰로; 카판-2 세포를 2000 세포/웰로; HPAF-II 세포를 1000 세포/웰로 또는 Panc 04.03 세포를 2000 세포/웰로 플레이팅하고, 2 ml 완전 배지에서 인큐베이션하고 37 ℃, 5% CO₂에서 밤새 성장시킴으로써 수행했다. 다음날 배지를 제거하고 각 세포주에 대해 2 ml 신선한 각각의 성장 배지로 교체했다. 100% DMSO 내 테스트 화합물을 1000X 농도로 100% DMSO에서 희석하고 2 ㎕를 웰 내 2 ml의 배지에 첨가해 0.03 내지 3 μM의 최종 농도를 달성했다. 세포를 37 ℃, 5% CO₂에서 인큐베이션했다. 매 3 내지 4 일 마다 배지를 제거하고 앞서와 같이 각 세포주에 대해 2 ml 신선한 완전 배지로 교체했다. 배지 교체 후, 신선한 화합물을 상기와 같이 첨가했다. 세포를 화합물의 존재 하에서 총 11 일 인큐베이션했다. 11일째, 배지를 제거하고 세포를 5 ml DPBS(유타주 로건 하이클론 #SH30028)으로 1 회 세척했다. 크리스탈 바이올렛 염색액(20% 메탄올(메사추세츠주 빌레리카 EMD 밀리포어(EMD Millipore, Billerica, MA) #MX0490-4) 내 0.5% 크리스탈 바이올렛(미주리주 세인트루이스 시그마 #C3886))을 각 웰(0.4 ml)에 첨가하고 상온에서 15 min 동안 인큐베이션했다. 웰을 그 다음 DPBS로 2 회 세척하고 플레이트를 후지(Fuji) LAS4000(일본 도쿄 후지필름(FujiFilm))을 사용해 촬영했다. 각 웰 내 콜로니 면적의 분석을 후지필름 콜로니 버전 1.1 소프트웨어(일본 도쿄 후지필름)를 사용해 수행했다.

<표 12> 실시예 1의 화합물의 콜로니 형성에 대한 효과

표 12의 데이터는 실시예 1의 화합물이 테스트된 각각의 세포주에서 대조군에 비해 콜로니 형성을 억제한다는 점을 증거한다.

<표 13>

서열

SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> PYRIDO[2,3-d]PYRIMIDIN-4-ONE COMPOUNDS AS TANKYRASE INHIBITORS <130> X20068 <150> 61/901,023 <151> 2013-11-07 <150> PCT/US2014/062832 <151> 2014-10-29 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 439 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Glu Asp Val Ser Ser Ala Ala Pro Ser Pro Arg Gly Cys Ala 1 5 10 15 Asp Gly Arg Asp Ala Asp Pro Thr Glu Glu Gln Met Ala Glu Thr Glu 20 25 30 Arg Asn Asp Glu Glu Gln Phe Glu Cys Gln Glu Leu Leu Glu Cys Gln 35 40 45 Val Gln Val Gly Ala Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Ala 50 55 60 Gly Leu Val Ala Glu Ala Glu Ala Val Ala Ala Gly Trp Met Leu Asp 65 70 75 80 Phe Leu Cys Leu Ser Leu Cys Arg Ala Phe Arg Asp Gly Arg Ser Glu 85 90 95 Asp Phe Arg Arg Thr Arg Asn Ser Ala Glu Ala Ile Ile His Gly Leu 100 105 110 Ser Ser Leu Thr Ala Cys Gln Leu Arg Thr Ile Tyr Ile Cys Gln Phe 115 120 125 Leu Thr Arg Ile Ala Ala Gly Lys Thr Leu Asp Ala Gln Phe Glu Asn 130 135 140 Asp Glu Arg Ile Thr Pro Leu Glu Ser Ala Leu Met Ile Trp Gly Ser 145 150 155 160 Ile Glu Lys Glu His Asp Lys Leu His Glu Glu Ile Gln Asn Leu Ile 165 170 175 Lys Ile Gln Ala Ile Ala Val Cys Met Glu Asn Gly Asn Phe Lys Glu 180 185 190 Ala Glu Glu Val Phe Glu Arg Ile Phe Gly Asp Pro Asn Ser His Met 195 200 205 Pro Phe Lys Ser Lys Leu Leu Met Ile Ile Ser Gln Lys Asp Thr Phe 210 215 220 His Ser Phe Phe Gln His Phe Ser Tyr Asn His Met Met Glu Lys Ile 225 230 235 240 Lys Ser Tyr Val Asn Tyr Val Leu Ser Glu Lys Ser Ser Thr Phe Leu 245 250 255 Met Lys Ala Ala Ala Lys Val Val Glu Ser Lys Arg Thr Arg Thr Ile 260 265 270 Thr Ser Gln Asp Lys Pro Ser Gly Asn Asp Val Glu Met Glu Thr Glu 275 280 285 Ala Asn Leu Asp Thr Arg Lys Ser Val Ser Asp Lys Gln Ser Ala Val 290 295 300 Thr Glu Ser Ser Glu Gly Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser His Lys Asn 305 310 315 320 Leu Phe Leu Ser Lys Leu Gln His Gly Thr Gln Gln Gln Asp Leu Asn 325 330 335 Lys Lys Glu Arg Arg Val Gly Thr Pro Gln Ser Thr Lys Lys Lys Lys 340 345 350 Glu Ser Arg Arg Ala Thr Glu Ser Arg Ile Pro Val Ser Lys Ser Gln 355 360 365 Pro Val Thr Pro Glu Lys His Arg Ala Arg Lys Arg Gln Ala Trp Leu 370 375 380 Trp Glu Glu Asp Lys Asn Leu Arg Ser Gly Val Arg Lys Tyr Gly Glu 385 390 395 400 Gly Asn Trp Ser Lys Ile Leu Leu His Tyr Lys Phe Asn Asn Arg Thr 405 410 415 Ser Val Met Leu Lys Asp Arg Trp Arg Thr Met Lys Lys Leu Lys Leu 420 425 430 Ile Ser Ser Asp Ser Glu Asp 435 <210> 2 <211> 1327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ala Ser Arg Arg Ser Gln His His His His His His Gln Gln 1 5 10 15 Gln Leu Gln Pro Ala Pro Gly Ala Ser Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Pro Pro Leu Ser Pro Gly Leu Ala Pro Gly Thr Thr Pro Ala Ser Pro 35 40 45 Thr Ala Ser Gly Leu Ala Pro Phe Ala Ser Pro Arg His Gly Leu Ala 50 55 60 Leu Pro Glu Gly Asp Gly Ser Arg Asp Pro Pro Asp Arg Pro Arg Ser 65 70 75 80 Pro Asp Pro Val Asp Gly Thr Ser Cys Cys Ser Thr Thr Ser Thr Ile 85 90 95 Cys Thr Val Ala Ala Ala Pro Val Val Pro Ala Val Ser Thr Ser Ser 100 105 110 Ala Ala Gly Val Ala Pro Asn Pro Ala Gly Ser Gly Ser Asn Asn Ser 115 120 125 Pro Ser Ser Ser Ser Ser Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser 130 135 140 Ser Pro Gly Ser Ser Leu Ala Glu Ser Pro Glu Ala Ala Gly Val Ser 145 150 155 160 Ser Thr Ala Pro Leu Gly Pro Gly Ala Ala Gly Pro Gly Thr Gly Val 165 170 175 Pro Ala Val Ser Gly Ala Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala Cys Arg Asn 180 185 190 Gly Asp Val Ser Arg Val Lys Arg Leu Val Asp Ala Ala Asn Val Asn 195 200 205 Ala Lys Asp Met Ala Gly Arg Lys Ser Ser Pro Leu His Phe Ala Ala 210 215 220 Gly Phe Gly Arg Lys Asp Val Val Glu His Leu Leu Gln Met Gly Ala 225 230 235 240 Asn Val His Ala Arg Asp Asp Gly Gly Leu Ile Pro Leu His Asn Ala 245 250 255 Cys Ser Phe Gly His Ala Glu Val Val Ser Leu Leu Leu Cys Gln Gly 260 265 270 Ala Asp Pro Asn Ala Arg Asp Asn Trp Asn Tyr Thr Pro Leu His Glu 275 280 285 Ala Ala Ile Lys Gly Lys Ile Asp Val Cys Ile Val Leu Leu Gln His 290 295 300 Gly Ala Asp Pro Asn Ile Arg Asn Thr Asp Gly Lys Ser Ala Leu Asp 305 310 315 320 Leu Ala Asp Pro Ser Ala Lys Ala Val Leu Thr Gly Glu Tyr Lys Lys 325 330 335 Asp Glu Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ser Gly Asn Glu Glu Lys Leu Met 340 345 350 Ala Leu Leu Thr Pro Leu Asn Val Asn Cys His Ala Ser Asp Gly Arg 355 360 365 Lys Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gly Tyr Asn Arg Val Arg Ile 370 375 380 Val Gln Leu Leu Leu Gln His Gly Ala Asp Val His Ala Lys Asp Lys 385 390 395 400 Gly Gly Leu Val Pro Leu His Asn Ala Cys Ser Tyr Gly His Tyr Glu 405 410 415 Val Thr Glu Leu Leu Leu Lys His Gly Ala Cys Val Asn Ala Met Asp 420 425 430 Leu Trp Gln Phe Thr Pro Leu His Glu Ala Ala Ser Lys Asn Arg Val 435 440 445 Glu Val Cys Ser Leu Leu Leu Ser His Gly Ala Asp Pro Thr Leu Val 450 455 460 Asn Cys His Gly Lys Ser Ala Val Asp Met Ala Pro Thr Pro Glu Leu 465 470 475 480 Arg Glu Arg Leu Thr Tyr Glu Phe Lys Gly His Ser Leu Leu Gln Ala 485 490 495 Ala Arg Glu Ala Asp Leu Ala Lys Val Lys Lys Thr Leu Ala Leu Glu 500 505 510 Ile Ile Asn Phe Lys Gln Pro Gln Ser His Glu Thr Ala Leu His Cys 515 520 525 Ala Val Ala Ser Leu His Pro Lys Arg Lys Gln Val Thr Glu Leu Leu 530 535 540 Leu Arg Lys Gly Ala Asn Val Asn Glu Lys Asn Lys Asp Phe Met Thr 545 550 555 560 Pro Leu His Val Ala Ala Glu Arg Ala His Asn Asp Val Met Glu Val 565 570 575 Leu His Lys His Gly Ala Lys Met Asn Ala Leu Asp Thr Leu Gly Gln 580 585 590 Thr Ala Leu His Arg Ala Ala Leu Ala Gly His Leu Gln Thr Cys Arg 595 600 605 Leu Leu Leu Ser Tyr Gly Ser Asp Pro Ser Ile Ile Ser Leu Gln Gly 610 615 620 Phe Thr Ala Ala Gln Met Gly Asn Glu Ala Val Gln Gln Ile Leu Ser 625 630 635 640 Glu Ser Thr Pro Ile Arg Thr Ser Asp Val Asp Tyr Arg Leu Leu Glu 645 650 655 Ala Ser Lys Ala Gly Asp Leu Glu Thr Val Lys Gln Leu Cys Ser Ser 660 665 670 Gln Asn Val Asn Cys Arg Asp Leu Glu Gly Arg His Ser Thr Pro Leu 675 680 685 His Phe Ala Ala Gly Tyr Asn Arg Val Ser Val Val Glu Tyr Leu Leu 690 695 700 His His Gly Ala Asp Val His Ala Lys Asp Lys Gly Gly Leu Val Pro 705 710 715 720 Leu His Asn Ala Cys Ser Tyr Gly His Tyr Glu Val Ala Glu Leu Leu 725 730 735 Val Arg His Gly Ala Ser Val Asn Val Ala Asp Leu Trp Lys Phe Thr 740 745 750 Pro Leu His Glu Ala Ala Ala Lys Gly Lys Tyr Glu Ile Cys Lys Leu 755 760 765 Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Pro Thr Lys Lys Asn Arg Asp Gly Asn 770 775 780 Thr Pro Leu Asp Leu Val Lys Glu Gly Asp Thr Asp Ile Gln Asp Leu 785 790 795 800 Leu Arg Gly Asp Ala Ala Leu Leu Asp Ala Ala Lys Lys Gly Cys Leu 805 810 815 Ala Arg Val Gln Lys Leu Cys Thr Pro Glu Asn Ile Asn Cys Arg Asp 820 825 830 Thr Gln Gly Arg Asn Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gly Tyr Asn 835 840 845 Asn Leu Glu Val Ala Glu Tyr Leu Leu Glu His Gly Ala Asp Val Asn 850 855 860 Ala Gln Asp Lys Gly Gly Leu Ile Pro Leu His Asn Ala Ala Ser Tyr 865 870 875 880 Gly His Val Asp Ile Ala Ala Leu Leu Ile Lys Tyr Asn Thr Cys Val 885 890 895 Asn Ala Thr Asp Lys Trp Ala Phe Thr Pro Leu His Glu Ala Ala Gln 900 905 910 Lys Gly Arg Thr Gln Leu Cys Ala Leu Leu Leu Ala His Gly Ala Asp 915 920 925 Pro Thr Met Lys Asn Gln Glu Gly Gln Thr Pro Leu Asp Leu Ala Thr 930 935 940 Ala Asp Asp Ile Arg Ala Leu Leu Ile Asp Ala Met Pro Pro Glu Ala 945 950 955 960 Leu Pro Thr Cys Phe Lys Pro Gln Ala Thr Val Val Ser Ala Ser Leu 965 970 975 Ile Ser Pro Ala Ser Thr Pro Ser Cys Leu Ser Ala Ala Ser Ser Ile 980 985 990 Asp Asn Leu Thr Gly Pro Leu Ala Glu Leu Ala Val Gly Gly Ala Ser 995 1000 1005 Asn Ala Gly Asp Gly Ala Ala Gly Thr Glu Arg Lys Glu Gly Glu 1010 1015 1020 Val Ala Gly Leu Asp Met Asn Ile Ser Gln Phe Leu Lys Ser Leu 1025 1030 1035 Gly Leu Glu His Leu Arg Asp Ile Phe Glu Thr Glu Gln Ile Thr 1040 1045 1050 Leu Asp Val Leu Ala Asp Met Gly His Glu Glu Leu Lys Glu Ile 1055 1060 1065 Gly Ile Asn Ala Tyr Gly His Arg His Lys Leu Ile Lys Gly Val 1070 1075 1080 Glu Arg Leu Leu Gly Gly Gln Gln Gly Thr Asn Pro Tyr Leu Thr 1085 1090 1095 Phe His Cys Val Asn Gln Gly Thr Ile Leu Leu Asp Leu Ala Pro 1100 1105 1110 Glu Asp Lys Glu Tyr Gln Ser Val Glu Glu Glu Met Gln Ser Thr 1115 1120 1125 Ile Arg Glu His Arg Asp Gly Gly Asn Ala Gly Gly Ile Phe Asn 1130 1135 1140 Arg Tyr Asn Val Ile Arg Ile Gln Lys Val Val Asn Lys Lys Leu 1145 1150 1155 Arg Glu Arg Phe Cys His Arg Gln Lys Glu Val Ser Glu Glu Asn 1160 1165 1170 His Asn His His Asn Glu Arg Met Leu Phe His Gly Ser Pro Phe 1175 1180 1185 Ile Asn Ala Ile Ile His Lys Gly Phe Asp Glu Arg His Ala Tyr 1190 1195 1200 Ile Gly Gly Met Phe Gly Ala Gly Ile Tyr Phe Ala Glu Asn Ser 1205 1210 1215 Ser Lys Ser Asn Gln Tyr Val Tyr Gly Ile Gly Gly Gly Thr Gly 1220 1225 1230 Cys Pro Thr His Lys Asp Arg Ser Cys Tyr Ile Cys His Arg Gln 1235 1240 1245 Met Leu Phe Cys Arg Val Thr Leu Gly Lys Ser Phe Leu Gln Phe 1250 1255 1260 Ser Thr Met Lys Met Ala His Ala Pro Pro Gly His His Ser Val 1265 1270 1275 Ile Gly Arg Pro Ser Val Asn Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Tyr Val 1280 1285 1290 Ile Tyr Arg Gly Glu Gln Ala Tyr Pro Glu Tyr Leu Ile Thr Tyr 1295 1300 1305 Gln Ile Met Lys Pro Glu Ala Pro Ser Gln Thr Ala Thr Ala Ala 1310 1315 1320 Glu Gln Lys Thr 1325 <210> 3 <211> 1166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ser Gly Arg Arg Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ser Ala 1 5 10 15 Ala Ala Glu Ala Val Glu Pro Ala Ala Arg Glu Leu Phe Glu Ala Cys 20 25 30 Arg Asn Gly Asp Val Glu Arg Val Lys Arg Leu Val Thr Pro Glu Lys 35 40 45 Val Asn Ser Arg Asp Thr Ala Gly Arg Lys Ser Thr Pro Leu His Phe 50 55 60 Ala Ala Gly Phe Gly Arg Lys Asp Val Val Glu Tyr Leu Leu Gln Asn 65 70 75 80 Gly Ala Asn Val Gln Ala Arg Asp Asp Gly Gly Leu Ile Pro Leu His 85 90 95 Asn Ala Cys Ser Phe Gly His Ala Glu Val Val Asn Leu Leu Leu Arg 100 105 110 His Gly Ala Asp Pro Asn Ala Arg Asp Asn Trp Asn Tyr Thr Pro Leu 115 120 125 His Glu Ala Ala Ile Lys Gly Lys Ile Asp Val Cys Ile Val Leu Leu 130 135 140 Gln His Gly Ala Glu Pro Thr Ile Arg Asn Thr Asp Gly Arg Thr Ala 145 150 155 160 Leu Asp Leu Ala Asp Pro Ser Ala Lys Ala Val Leu Thr Gly Glu Tyr 165 170 175 Lys Lys Asp Glu Leu Leu Glu Ser Ala Arg Ser Gly Asn Glu Glu Lys 180 185 190 Met Met Ala Leu Leu Thr Pro Leu Asn Val Asn Cys His Ala Ser Asp 195 200 205 Gly Arg Lys Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gly Tyr Asn Arg Val 210 215 220 Lys Ile Val Gln Leu Leu Leu Gln His Gly Ala Asp Val His Ala Lys 225 230 235 240 Asp Lys Gly Asp Leu Val Pro Leu His Asn Ala Cys Ser Tyr Gly His 245 250 255 Tyr Glu Val Thr Glu Leu Leu Val Lys His Gly Ala Cys Val Asn Ala 260 265 270 Met Asp Leu Trp Gln Phe Thr Pro Leu His Glu Ala Ala Ser Lys Asn 275 280 285 Arg Val Glu Val Cys Ser Leu Leu Leu Ser Tyr Gly Ala Asp Pro Thr 290 295 300 Leu Leu Asn Cys His Asn Lys Ser Ala Ile Asp Leu Ala Pro Thr Pro 305 310 315 320 Gln Leu Lys Glu Arg Leu Ala Tyr Glu Phe Lys Gly His Ser Leu Leu 325 330 335 Gln Ala Ala Arg Glu Ala Asp Val Thr Arg Ile Lys Lys His Leu Ser 340 345 350 Leu Glu Met Val Asn Phe Lys His Pro Gln Thr His Glu Thr Ala Leu 355 360 365 His Cys Ala Ala Ala Ser Pro Tyr Pro Lys Arg Lys Gln Ile Cys Glu 370 375 380 Leu Leu Leu Arg Lys Gly Ala Asn Ile Asn Glu Lys Thr Lys Glu Phe 385 390 395 400 Leu Thr Pro Leu His Val Ala Ser Glu Lys Ala His Asn Asp Val Val 405 410 415 Glu Val Val Val Lys His Glu Ala Lys Val Asn Ala Leu Asp Asn Leu 420 425 430 Gly Gln Thr Ser Leu His Arg Ala Ala Tyr Cys Gly His Leu Gln Thr 435 440 445 Cys Arg Leu Leu Leu Ser Tyr Gly Cys Asp Pro Asn Ile Ile Ser Leu 450 455 460 Gln Gly Phe Thr Ala Leu Gln Met Gly Asn Glu Asn Val Gln Gln Leu 465 470 475 480 Leu Gln Glu Gly Ile Ser Leu Gly Asn Ser Glu Ala Asp Arg Gln Leu 485 490 495 Leu Glu Ala Ala Lys Ala Gly Asp Val Glu Thr Val Lys Lys Leu Cys 500 505 510 Thr Val Gln Ser Val Asn Cys Arg Asp Ile Glu Gly Arg Gln Ser Thr 515 520 525 Pro Leu His Phe Ala Ala Gly Tyr Asn Arg Val Ser Val Val Glu Tyr 530 535 540 Leu Leu Gln His Gly Ala Asp Val His Ala Lys Asp Lys Gly Gly Leu 545 550 555 560 Val Pro Leu His Asn Ala Cys Ser Tyr Gly His Tyr Glu Val Ala Glu 565 570 575 Leu Leu Val Lys His Gly Ala Val Val Asn Val Ala Asp Leu Trp Lys 580 585 590 Phe Thr Pro Leu His Glu Ala Ala Ala Lys Gly Lys Tyr Glu Ile Cys 595 600 605 Lys Leu Leu Leu Gln His Gly Ala Asp Pro Thr Lys Lys Asn Arg Asp 610 615 620 Gly Asn Thr Pro Leu Asp Leu Val Lys Asp Gly Asp Thr Asp Ile Gln 625 630 635 640 Asp Leu Leu Arg Gly Asp Ala Ala Leu Leu Asp Ala Ala Lys Lys Gly 645 650 655 Cys Leu Ala Arg Val Lys Lys Leu Ser Ser Pro Asp Asn Val Asn Cys 660 665 670 Arg Asp Thr Gln Gly Arg His Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gly 675 680 685 Tyr Asn Asn Leu Glu Val Ala Glu Tyr Leu Leu Gln His Gly Ala Asp 690 695 700 Val Asn Ala Gln Asp Lys Gly Gly Leu Ile Pro Leu His Asn Ala Ala 705 710 715 720 Ser Tyr Gly His Val Asp Val Ala Ala Leu Leu Ile Lys Tyr Asn Ala 725 730 735 Cys Val Asn Ala Thr Asp Lys Trp Ala Phe Thr Pro Leu His Glu Ala 740 745 750 Ala Gln Lys Gly Arg Thr Gln Leu Cys Ala Leu Leu Leu Ala His Gly 755 760 765 Ala Asp Pro Thr Leu Lys Asn Gln Glu Gly Gln Thr Pro Leu Asp Leu 770 775 780 Val Ser Ala Asp Asp Val Ser Ala Leu Leu Thr Ala Ala Met Pro Pro 785 790 795 800 Ser Ala Leu Pro Ser Cys Tyr Lys Pro Gln Val Leu Asn Gly Val Arg 805 810 815 Ser Pro Gly Ala Thr Ala Asp Ala Leu Ser Ser Gly Pro Ser Ser Pro 820 825 830 Ser Ser Leu Ser Ala Ala Ser Ser Leu Asp Asn Leu Ser Gly Ser Phe 835 840 845 Ser Glu Leu Ser Ser Val Val Ser Ser Ser Gly Thr Glu Gly Ala Ser 850 855 860 Ser Leu Glu Lys Lys Glu Val Pro Gly Val Asp Phe Ser Ile Thr Gln 865 870 875 880 Phe Val Arg Asn Leu Gly Leu Glu His Leu Met Asp Ile Phe Glu Arg 885 890 895 Glu Gln Ile Thr Leu Asp Val Leu Val Glu Met Gly His Lys Glu Leu 900 905 910 Lys Glu Ile Gly Ile Asn Ala Tyr Gly His Arg His Lys Leu Ile Lys 915 920 925 Gly Val Glu Arg Leu Ile Ser Gly Gln Gln Gly Leu Asn Pro Tyr Leu 930 935 940 Thr Leu Asn Thr Ser Gly Ser Gly Thr Ile Leu Ile Asp Leu Ser Pro 945 950 955 960 Asp Asp Lys Glu Phe Gln Ser Val Glu Glu Glu Met Gln Ser Thr Val 965 970 975 Arg Glu His Arg Asp Gly Gly His Ala Gly Gly Ile Phe Asn Arg Tyr 980 985 990 Asn Ile Leu Lys Ile Gln Lys Val Cys Asn Lys Lys Leu Trp Glu Arg 995 1000 1005 Tyr Thr His Arg Arg Lys Glu Val Ser Glu Glu Asn His Asn His 1010 1015 1020 Ala Asn Glu Arg Met Leu Phe His Gly Ser Pro Phe Val Asn Ala 1025 1030 1035 Ile Ile His Lys Gly Phe Asp Glu Arg His Ala Tyr Ile Gly Gly 1040 1045 1050 Met Phe Gly Ala Gly Ile Tyr Phe Ala Glu Asn Ser Ser Lys Ser 1055 1060 1065 Asn Gln Tyr Val Tyr Gly Ile Gly Gly Gly Thr Gly Cys Pro Val 1070 1075 1080 His Lys Asp Arg Ser Cys Tyr Ile Cys His Arg Gln Leu Leu Phe 1085 1090 1095 Cys Arg Val Thr Leu Gly Lys Ser Phe Leu Gln Phe Ser Ala Met 1100 1105 1110 Lys Met Ala His Ser Pro Pro Gly His His Ser Val Thr Gly Arg 1115 1120 1125 Pro Ser Val Asn Gly Leu Ala Leu Ala Glu Tyr Val Ile Tyr Arg 1130 1135 1140 Gly Glu Gln Ala Tyr Pro Glu Tyr Leu Ile Thr Tyr Gln Ile Met 1145 1150 1155 Arg Pro Glu Gly Met Val Asp Gly 1160 1165 <210> 4 <211> 843 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ser Ser Ala Met Leu Val Thr Cys Leu Pro Asp Pro Ser Ser Ser 1 5 10 15 Phe Arg Glu Asp Ala Pro Arg Pro Pro Val Pro Gly Glu Glu Gly Glu 20 25 30 Thr Pro Pro Cys Gln Pro Gly Val Gly Lys Gly Gln Val Thr Lys Pro 35 40 45 Met Pro Val Ser Ser Asn Thr Arg Arg Asn Glu Asp Gly Leu Gly Glu 50 55 60 Pro Glu Gly Arg Ala Ser Pro Asp Ser Pro Leu Thr Arg Trp Thr Lys 65 70 75 80 Ser Leu His Ser Leu Leu Gly Asp Gln Asp Gly Ala Tyr Leu Phe Arg 85 90 95 Thr Phe Leu Glu Arg Glu Lys Cys Val Asp Thr Leu Asp Phe Trp Phe 100 105 110 Ala Cys Asn Gly Phe Arg Gln Met Asn Leu Lys Asp Thr Lys Thr Leu 115 120 125 Arg Val Ala Lys Ala Ile Tyr Lys Arg Tyr Ile Glu Asn Asn Ser Ile 130 135 140 Val Ser Lys Gln Leu Lys Pro Ala Thr Lys Thr Tyr Ile Arg Asp Gly 145 150 155 160 Ile Lys Lys Gln Gln Ile Asp Ser Ile Met Phe Asp Gln Ala Gln Thr 165 170 175 Glu Ile Gln Ser Val Met Glu Glu Asn Ala Tyr Gln Met Phe Leu Thr 180 185 190 Ser Asp Ile Tyr Leu Glu Tyr Val Arg Ser Gly Gly Glu Asn Thr Ala 195 200 205 Tyr Met Ser Asn Gly Gly Leu Gly Ser Leu Lys Val Val Cys Gly Tyr 210 215 220 Leu Pro Thr Leu Asn Glu Glu Glu Glu Trp Thr Cys Ala Asp Phe Lys 225 230 235 240 Cys Lys Leu Ser Pro Thr Val Val Gly Leu Ser Ser Lys Thr Leu Arg 245 250 255 Ala Thr Ala Ser Val Arg Ser Thr Glu Thr Val Asp Ser Gly Tyr Arg 260 265 270 Ser Phe Lys Arg Ser Asp Pro Val Asn Pro Tyr His Ile Gly Ser Gly 275 280 285 Tyr Val Phe Ala Pro Ala Thr Ser Ala Asn Asp Ser Glu Ile Ser Ser 290 295 300 Asp Ala Leu Thr Asp Asp Ser Met Ser Met Thr Asp Ser Ser Val Asp 305 310 315 320 Gly Ile Pro Pro Tyr Arg Val Gly Ser Lys Lys Gln Leu Gln Arg Glu 325 330 335 Met His Arg Ser Val Lys Ala Asn Gly Gln Val Ser Leu Pro His Phe 340 345 350 Pro Arg Thr His Arg Leu Pro Lys Glu Met Thr Pro Val Glu Pro Ala 355 360 365 Thr Phe Ala Ala Glu Leu Ile Ser Arg Leu Glu Lys Leu Lys Leu Glu 370 375 380 Leu Glu Ser Arg His Ser Leu Glu Glu Arg Leu Gln Gln Ile Arg Glu 385 390 395 400 Asp Glu Glu Arg Glu Gly Ser Glu Leu Thr Leu Asn Ser Arg Glu Gly 405 410 415 Ala Pro Thr Gln His Pro Leu Ser Leu Leu Pro Ser Gly Ser Tyr Glu 420 425 430 Glu Asp Pro Gln Thr Ile Leu Asp Asp His Leu Ser Arg Val Leu Lys 435 440 445 Thr Pro Gly Cys Gln Ser Pro Gly Val Gly Arg Tyr Ser Pro Arg Ser 450 455 460 Arg Ser Pro Asp His His His His His His Ser Gln Tyr His Ser Leu 465 470 475 480 Leu Pro Pro Gly Gly Lys Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ser Pro Gly Ala 485 490 495 Cys Pro Leu Leu Gly Gly Lys Gly Phe Val Thr Lys Gln Thr Thr Lys 500 505 510 His Val His His His Tyr Ile His His His Ala Val Pro Lys Thr Lys 515 520 525 Glu Glu Ile Glu Ala Glu Ala Thr Gln Arg Val His Cys Phe Cys Pro 530 535 540 Gly Gly Ser Glu Tyr Tyr Cys Tyr Ser Lys Cys Lys Ser His Ser Lys 545 550 555 560 Ala Pro Glu Thr Met Pro Ser Glu Gln Phe Gly Gly Ser Arg Gly Ser 565 570 575 Thr Leu Pro Lys Arg Asn Gly Lys Gly Thr Glu Pro Gly Leu Ala Leu 580 585 590 Pro Ala Arg Glu Gly Gly Ala Pro Gly Gly Ala Gly Ala Leu Gln Leu 595 600 605 Pro Arg Glu Glu Gly Asp Arg Ser Gln Asp Val Trp Gln Trp Met Leu 610 615 620 Glu Ser Glu Arg Gln Ser Lys Pro Lys Pro His Ser Ala Gln Ser Thr 625 630 635 640 Lys Lys Ala Tyr Pro Leu Glu Ser Ala Arg Ser Ser Pro Gly Glu Arg 645 650 655 Ala Ser Arg His His Leu Trp Gly Gly Asn Ser Gly His Pro Arg Thr 660 665 670 Thr Pro Arg Ala His Leu Phe Thr Gln Asp Pro Ala Met Pro Pro Leu 675 680 685 Thr Pro Pro Asn Thr Leu Ala Gln Leu Glu Glu Ala Cys Arg Arg Leu 690 695 700 Ala Glu Val Ser Lys Pro Pro Lys Gln Arg Cys Cys Val Ala Ser Gln 705 710 715 720 Gln Arg Asp Arg Asn His Ser Ala Thr Val Gln Thr Gly Ala Thr Pro 725 730 735 Phe Ser Asn Pro Ser Leu Ala Pro Glu Asp His Lys Glu Pro Lys Lys 740 745 750 Leu Ala Gly Val His Ala Leu Gln Ala Ser Glu Leu Val Val Thr Tyr 755 760 765 Phe Phe Cys Gly Glu Glu Ile Pro Tyr Arg Arg Met Leu Lys Ala Gln 770 775 780 Ser Leu Thr Leu Gly His Phe Lys Glu Gln Leu Ser Lys Lys Gly Asn 785 790 795 800 Tyr Arg Tyr Tyr Phe Lys Lys Ala Ser Asp Glu Phe Ala Cys Gly Ala 805 810 815 Val Phe Glu Glu Ile Trp Glu Asp Glu Thr Val Leu Pro Met Tyr Glu 820 825 830 Gly Arg Ile Leu Gly Lys Val Glu Arg Ile Asp 835 840 <210> 5 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 5 Met Asp Arg Lys Phe Val Phe Leu Val Ser Ile Leu Ser Ile Val Val 1 5 10 15 Ala Ser Val Thr Gly Glu Thr Thr Arg Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr 20 25 30 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr 35 40 45 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr 50 55 60 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr 65 70 75 80 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr 85 90 95 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr 100 105 110 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr 145 150 155 160 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr 165 170 175 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr 180 185 190 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr 195 200 205 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr 210 215 220 Pro Thr Ser Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val 225 230 235 240 Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser 245 250 255 Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu 260 265 270 Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu 275 280 285 Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp 290 295 300 His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr 305 310 315 320 Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr 325 330 335 Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu 340 345 350 Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys 355 360 365 Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys 370 375 380 Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu 385 390 395 400 Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile 405 410 415 Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln 420 425 430 Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu 435 440 445 Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu 450 455 460 Tyr Lys 465 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 6 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 7 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 7 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235

Claims (12)

1. 하기 화학식을 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
   <화학식>
   

   

   
   여기서, Y는
   

   

   
   이고;
   X는 -CH₂-, -C(CH₃)H-, 또는 -C(CH₂CH₃)H-이고;
   R¹은 수소, 히드록시, 또는 할로이고;
   R²는 수소, 할로, -CN, -CH₃, CF₃, 또는 -OCH₃이다.
2. 제1항에 있어서, Y가
   

   

   
   이고;
   X가 -CH₂-, -C(CH₃)H-, 또는 -C(CH₂CH₃)H-이고;
   R¹이 수소, 히드록시, 또는 할로이고;
   R²가 수소, 할로, -CN, -CH₃, CF₃, 또는 -OCH₃
   인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Y가
   

   

   
   이고;
   X가 -CH₂-, -C(CH₃)H-, 또는 -C(CH₂CH₃)H-이고;
   R²가 수소, 할로, -CN, -CH₃, CF₃, 또는 -OCH₃
   인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, Y가
   

   

   
   이고;
   X가 -CH₂-, -C(CH₃)H-, 또는 -C(CH₂CH₃)H-이고;
   R¹이 수소, 히드록시, 또는 할로이고;
   R²가 수소, 할로, -CN, -CH₃, CF₃, 또는 -OCH₃
   인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   8-메틸-2-[4-(피리미딘-2-일메틸)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 또는 그의 제약상 허용되는 염;
   8-메틸-2-[4-(1-피리미딘-2-일에틸)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 또는 그의 제약상 허용되는 염;
   2-[4-[(4-클로로피리미딘-2-일)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 또는 그의 제약상 허용되는 염; 또는
   2-[4-[(4-메톡시피리미딘-2-일)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 또는 그의 제약상 허용되는 염
   인 화합물.
6. 제1항, 제2항, 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   2-[4-[(3-브로모-2-피리딜)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 또는 그의 제약상 허용되는 염;
   2-[4-[(3-클로로-2-피리딜)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 또는 그의 제약상 허용되는 염;
   2-[4-[(3-플루오로-2-피리딜)메틸]피페라진-1-일]-8-메틸-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온, 또는 그의 제약상 허용되는 염; 또는
   2-[[4-(8-메틸-4-옥소-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-2-일)피페라진-1-일]메틸]피리딘-3-카보니트릴, 또는 그의 제약상 허용되는 염
   인 화합물.
7. 제1항 내지 제3항, 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 8-메틸-2-[4-(피리미딘-2-일메틸)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4(3H)-온인 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염.
8. 제1항 내지 제3항, 제5항, 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 8-메틸-2-[4-(피리미딘-2-일메틸)피페라진-1-일]-3,5,6,7-테트라히드로피리도[2,3-d]피리미딘-4-온 4-메틸벤젠술폰산 염인 화합물.
9. 제약상 허용되는 담체와 함께, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물.
10. 결장직장암, 위암, 간암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 난소암, 수모세포종, 흑색종, 폐암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 전립선암, 교모세포종, T-세포 림프종, T-림프모구성 림프종, T-세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL), 외투 세포 림프종, 다발성 골수종, 만성 골수성 백혈병, 또는 급성 골수성 백혈병인 암의 치료를 필요로 하는 환자에게, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 상기 암을 치료하는 방법.
11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염.
12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 결장직장암, 위암, 간암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 난소암, 수모세포종, 흑색종, 폐암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 전립선암, 교모세포종, T-세포 림프종, T-림프모구성 림프종, T-세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL), 외투 세포 림프종, 다발성 골수종, 만성 골수성 백혈병, 또는 급성 골수성 백혈병인 암의 치료에 사용하기 위한 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염.

Images