CN105586388A - 一种葡萄糖氧化酶酶活性的测量方法 - Google Patents

一种葡萄糖氧化酶酶活性的测量方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种葡萄糖氧化酶酶活性的测量方法，具体为：1）配置pH值为5.8的磷酸盐缓冲液，然后室温下依次加入辣根过氧化物酶液、葡萄糖氧化酶液、愈创木酚和葡萄糖溶液；2）采用紫外可见光分光光度计进行时间扫描，获得产物四邻甲氧基连酚的吸光值随时间的变化数据；3）根据朗伯比尔定律将四邻甲氧基连酚的吸光值换算为浓度，然后以时间为横坐标，浓度为纵坐标，在excel中作散点图，添加趋势线，趋势线斜率即为四邻甲氧基连酚的生成速率，该生成速率乘以系数4即得到葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的反应速率，再根据酶活力单位定义进行换算即得到葡萄糖氧化酶酶活性。该方法具有操作简便，反应现象明显，灵敏度高，重复性好等优点。

Description

一种葡萄糖氧化酶酶活性的测量方法
技术领域
本发明属于酶活性测量技术领域，具体涉及一种葡萄糖氧化酶酶活性的测量方法。
背景技术
葡萄糖氧化酶是一种具有高效催化效率的糖蛋白，在有氧气的情况下催化葡萄糖转化为葡萄糖酸和过氧化氢，葡萄糖氧化酶活力的测量是研究其性能的基础，目前有一些方法来测量，如盐酸滴定法中，当向葡萄糖氧化酶催化β-D-葡萄糖反应体系中加入氢氧化钠时，反应会被其终止，然后再用一定量的盐酸溶液滴定，计算出盐酸溶液的消耗量，从而得出葡萄糖氧化酶的活性。
但是大多数研究者还是更倾向于利用其催化β-D-葡萄糖时产生的过氧化氢，在过氧化物酶存在的情况下，催化显色剂，测定有色产物的生成速率，以此测定酶的活性。苯酚和邻联茴香胺是两种常见的发色体。但是，苯酚易挥发，对人体有害，邻联茴香胺在水溶液中的溶解度很低，而且生成的有色产物的最大吸收峰在400nm处，该吸收峰处不稳定的，容易被样本中的一些背景材料所干扰。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种葡萄糖氧化酶酶活性的测量方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种葡萄糖氧化酶酶活性的测量方法，其包括如下步骤：
1）配置pH值为5.8的磷酸盐缓冲液，然后室温下依次加入辣根过氧化物酶液、葡萄糖氧化酶液、愈创木酚溶液和葡萄糖溶液；
2）当加入葡萄糖后酶促反应开始，此时开始计时，在吸收波长为470nm条件下采用紫外可见光分光光度计进行时间扫描，获得产物四邻甲氧基连酚的吸光值随时间的变化数据；
3）根据朗伯比尔定律将四邻甲氧基连酚的吸光值换算为浓度，然后以时间为横坐标，浓度为纵坐标，在excel中作散点图，添加趋势线，趋势线斜率即为四邻甲氧基连酚的生成速率，该生成速率乘以系数4即得到葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的反应速率，再根据酶活力单位定义进行换算即得到葡萄糖氧化酶酶活性。
依据朗伯比尔定律，采用公式c=A/εb将四邻甲氧基连酚的吸光值换算为浓度；式中，c为四邻甲氧基连酚的浓度；A为吸光值；ε为四邻甲氧基连酚470nm处的摩尔吸收系数；b为比色皿光程，1cm。
其中，四邻甲氧基连酚的生成速率的计算原理如下所示：
；
式中，v为四邻甲氧基连酚的生成速率；
A2、A1分别为t2、t1时四邻甲氧基连酚470nm处的吸光值，t2、t1单位s；
b为比色皿光程，1cm；
ε为四邻甲氧基连酚470nm处的摩尔吸光系数。
具体的，酶促反应中，辣根过氧化物酶的浓度为2.5×10-5mmol/L；葡萄糖氧化酶的初始浓度为9×10-6mmol/L，愈创木酚的初始浓度为3mmol/L；葡萄糖的初始浓度为50mmol/L。
和现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明方法利用光谱学仪器-紫外可见光分光光度计进行测量，使用的体系是葡萄糖氧化酶（GOD）-辣根过氧化物酶（HRP）-愈创木酚（Guaiacol）耦联体系，利用愈创木酚和葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生的过氧化氢在HRP催化下生成的有色产物四邻甲氧基连酚，该有色产物在470nm波长光照射时有光吸收，而且随着有色产物的增加，光的吸收越强，吸光值越大。根据470nm处四邻甲氧基连酚的摩尔吸光系数，利用朗伯比尔定律换算为四邻甲氧基连酚的浓度，做出时间-浓度散点图，其斜率便是该四邻甲氧基连酚的生成速率。然后根据反应比例乘以相应系数4得到GOD催化葡萄糖的反应速率，再根据酶活力单位定义进行换算即可。
此外，本发明试验过程中还使用邻联茴香胺方法测量，对比吸光度的变化。总体来说，葡萄糖氧化酶（GOD）-辣根过氧化物酶（HRP）-愈创木酚（Guaiacol）耦联体系测量葡萄糖氧化酶酶活性的新方法具有操作简便，便于控制，反应现象明显，灵敏度高，重复性好等优点。
附图说明
图1为四邻甲氧基连酚的时间浓度变化图；
图2为本发明葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶-愈创木酚耦联体系的光谱扫瞄图；
图3为溶液pH值对葡萄糖氧化酶酶活性的影响；
图4为采用本发明耦联体系（图中a）和采用现有邻联二茴香胺体系（图中b）测量葡萄糖氧化酶酶活性的对比；
图5为葡萄糖氧化酶动力学参数的测定，图中，（A）：随葡萄糖浓度变化反应速率变化图；（B）：双倒数作图；
图6为采用本发明葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶-愈创木酚耦联体系测量葡萄糖氧化酶酶活性的可重复性检测。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
原理及方法
1.1试剂：
磷酸盐缓冲液（Na2HPO4-NaH2PO4,Sigma公司）、辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP,Sigma公司）、葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,GOD,Sigma公司）、葡萄糖(Glucose,Sigma公司)、愈创木酚溶液（Guaiacol，Sigma公司）、邻联二茴香胺（o-Dianisidine，Sigma公司）、双蒸水（H2O）。
1.2试剂配制：
①磷酸盐缓冲液（Na2HPO4-NaH2PO4）的配制：
取89.5gNa2HPO4和39.0gNaH2PO4分别用双蒸水定溶于500mL容量瓶，摩尔浓度为500mmol/L。实验所需缓冲液浓度为50mmol/L，分别将Na2HPO4和NaH2PO4母液稀释10倍后，将二者按一定体积比调制pH值为5.8。配制好后，4℃低温储存。
②愈创木酚（Guaiacol）溶液的配制：
取1mL浓度为9mol/L的愈创木酚溶液，加入99mL温热（<60℃）双蒸水中，摇晃，使愈创木酚充分溶解于双蒸水中，稀释后的摩尔浓度为90mmol/L。配制好后，避光常温储存。
③辣根过氧化物酶（HRP）溶液的配制：
取5mg辣根过氧化物酶于2mL的EP管中，加入1mL双蒸水溶解，摩尔浓度为1.25×10- 4mol/L作为母液，-20℃冷冻储存。实验前解冻母液，取30μL加入4970μL配好的磷酸盐缓冲液中，摩尔浓度为7.5×10-4mmol/L，待用。
④葡萄糖氧化酶(GOD)溶液的配制：
取14.4mg辣根过氧化物酶于2mL的EP管中，加入1mL双蒸水溶解，摩尔浓度为9×10- 2mmol/L作为母液，-20℃冷冻储存。实验前解冻母液，取15μL加入4985μL配好的磷酸盐缓冲液中，摩尔浓度为2.7×10-4mmol/L，待用。
⑤葡萄糖（Glucose）溶液的配制:
取1.44g葡萄糖溶于8ml配好的磷酸盐缓冲液中作为母液，葡萄糖的摩尔浓度为1000mmol/L。用磷酸盐缓冲液对其稀释梯度，以备实验所需浓度。配制好后，常温储存。
⑥邻联二茴香胺（o-Dianisidine）溶液的配制：
取1.173mg邻联二茴香胺溶于1mL配好的磷酸盐缓冲液中，邻联二茴香胺的摩尔浓度为4.8mmol/L。配制好后，封口膜封口通风橱常温储存。
1.3实验内容
采用光谱学仪器-紫外可见光分光光度计进行测量，使用的体系是葡萄糖氧化酶（GOD）-辣根过氧化物酶（HRP）-愈创木酚（Guaiacol）耦联体系，利用愈创木酚和GOD催化葡萄糖产生的过氧化氢在HRP催化下生成的有色产物四邻甲氧基连酚，该有色产物在470nm波长光照射时有光吸收，而且随着有色产物的增加，光的吸收越强，吸光值越大。具体测量步骤如下：
1）取89.5gNa2HPO4和39.0gNaH2PO4分别用双蒸水定溶于500mL容量瓶，摩尔浓度为500mmol/L，作为Na2HPO4、NaH2PO4母液。将Na2HPO4、NaH2PO4母液稀释10倍后浓度为50mmol/L，将二者按不同量混合利用pH计调节至pH为5.8，取2400μL加入反应皿中；
2）接着向反应皿中依次加入100μL浓度为7.5×10-4mmol/L的辣根过氧化物酶液、100μL浓度为2.7×10-4mmol/L的葡萄糖氧化酶液、100μL浓度为90mmol/L的愈创木酚、300μL浓度为500mmol/L的葡萄糖溶液；
3）当加入葡萄糖后，酶促反应于25℃下开始进行，此时开始计时。在吸收波长为470nm条件下采用紫外可见光分光光度计进行时间扫描，获得产物四邻甲氧基连酚的吸光值随时间的变化数据，再根据朗伯比尔定律将四邻甲氧基连酚的吸光值转化为浓度，如下表所示（下表中给出了部分数据）；
；
4）然后以时间为横坐标，浓度为纵坐标，在Excel中作散点图，添加趋势线，由趋势线斜率得到四邻甲氧基连酚的生成速率，见图1。由图1可知：四邻甲氧基连酚的生成速率为0.6841μM/S。
5）葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的反应速率可由四邻甲氧基连酚的生成速率乘以相应系数换算得到，涉及的反应式如下所示：
；
；
四邻甲氧基连酚的生成速率乘以系数4即得到葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的反应速率；再根据酶活力单位定义换算为葡萄糖氧化酶酶活性，具体计算过程如下：
；
即得到葡萄糖氧化酶酶活性为：
。
主要结果与结论
2.1葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶-愈创木酚耦联体系的可行性
为了证明葡萄糖氧化酶（GOD）-辣根过氧化物酶（HRP）-愈创木酚（Guaiacol）耦联体系的可行性，在步骤3）加入葡萄糖后酶促反应开始，进行光谱扫描，结果见图2（实验条件：25℃，pH5.8、50mM磷酸盐缓冲液）。从图2中可以看出：在470nm处有色产物随时间的推移逐渐增加，表明葡萄糖氧化酶在有氧气存在的条件下催化葡萄糖产生过氧化氢，愈创木酚在辣根过氧化物酶作用下与产生的过氧化氢反应生成有色产物。
结论1：运用本发明方法测定葡萄糖氧化酶的活性的方法是可行的。
2.2溶液pH值对葡萄糖氧化酶酶活性测量的影响
图3中给出了不同溶液pH值对葡萄糖氧化酶酶活性的影响（实验条件：25℃,50mM磷酸盐缓冲液）。从图3中可以看出：在pH2.0-10范围内，葡萄糖氧化酶的催化活性在5.8时达到最高，与天然的葡萄糖氧化酶的最适pH值5.5十分接近。
结论2：运用本发明方法测定葡萄糖氧化酶活性条件温和，对葡萄糖氧化酶的最大活性环境无影响。
2.3与邻联二茴香胺方法测量对比
图4给出了采用本发明耦联体系（图中a）和采用现有邻联二茴香胺体系（图中b）测量葡萄糖氧化酶酶活性的对比（实验条件：25℃,pH5.8、50mM磷酸盐缓冲液，邻联二茴香胺终浓度为0.16mM，愈创木酚终浓度3mM，葡萄糖氧化酶终浓度9×10-6mM，辣根过氧化物酶终浓度2.5×10-5mM，葡萄糖终浓度50mM）。
结论3：由图4可以看出，采用本发明耦联体系的吸光度变化比邻联二茴香胺体系高出许多，因此本发明方法具有更高的灵敏度。
2.4葡萄糖氧化酶动力学参数测定
本发明测量了愈创木酚体系中葡萄糖氧化酶的动力学参数（实验条件：25℃,pH5.8、50mM磷酸盐缓冲液，葡萄糖浓度为0.05-100mM）。
米氏方程中的常数Km和最大反应速率可以通过下面公式根据双倒数作图法得到：，
见图5。根据线性回归方程得到Km值为30.0±1.0mM，数值比Sigma公司提供的数值33mM稍小。
结论4：试验结果表明葡萄糖氧化酶在本发明耦联体系中与底物的亲和能力很好。
2.5测量葡萄糖氧化酶酶活性的稳定性检测
本发明对愈创木酚体系测量葡萄糖氧化酶酶活性的稳定性进行检测（实验条件：25℃,pH5.8、50mM磷酸盐缓冲液），结果见图6。
结论5：如图6所示，使用愈创木酚体系重复测量31次，相对标准偏差为2.8%，测定酶的活力为114±3U/mg，与Sigma公司提供的数值（酶活性≥100U/mg）相符，证明了本发明方法具有可行性并且可重复性良好。
综上可看出：本发明葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶-愈创木酚耦联体系可以被应用于测量葡萄糖氧化酶酶活性。该方法操作简便，便于控制，反应现象明显，具有良好的的可重复性和高灵敏度。

Claims (2)

1.一种葡萄糖氧化酶酶活性的测量方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）配置pH值为5.8的磷酸盐缓冲液，然后室温下依次加入辣根过氧化物酶液、葡萄糖氧化酶液、愈创木酚溶液和葡萄糖溶液；
2）当加入葡萄糖后酶促反应开始，此时开始计时，在吸收波长为470nm条件下采用紫外可见光分光光度计进行时间扫描，获得产物四邻甲氧基连酚的吸光值随时间的变化数据；
3）根据朗伯比尔定律将四邻甲氧基连酚的吸光值换算为浓度，然后以时间为横坐标，浓度为纵坐标，在excel中作散点图，添加趋势线，趋势线斜率即为四邻甲氧基连酚的生成速率，该生成速率乘以系数4即得到葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的反应速率，再根据酶活力单位定义进行换算即得到葡萄糖氧化酶酶活性。
2.如权利要求1所述葡萄糖氧化酶酶活性的测量方法，其特征在于，酶促反应中，辣根过氧化物酶的浓度为2.5×10-5mmol/L；葡萄糖氧化酶的初始浓度为9×10-6mmol/L，愈创木酚的初始浓度为3mmol/L；葡萄糖的初始浓度为50mmol/L。
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