CN110923291B - 一种检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法 - Google Patents

一种检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法，属于酶制剂检测技术领域，所述方法包括以下步骤：(1)对待测葡萄糖氧化酶样品进行预处理；(2)配置成葡萄糖浓度为20g/L的葡萄糖磷酸盐缓冲液；(3)用0.1mol/L的氢氧化钠溶液终止反应，用0.020‑0.030mol/L的盐酸溶液滴定剩余的氢氧化钠溶液，利用反应前后消耗的盐酸毫升数计算试验样品中葡萄糖氧化酶活力。本方法通过增加预热时间、改变反应温度和反应体系中盐酸溶液浓度，采用双指标判定反应终点，显著增加了检测方法的准确度和可重复性；用所述方法检测酶活，相对标准偏差RSD小于2％(n＝10)，本发明的准确性和可重复性均超过了河北省地方标准DB13/T 1444‑2011的检测方法，取得了显著的检查效果。

Description

一种检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法
技术领域：
本发明涉及酶制剂检测技术领域，具体涉及一种检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法。
背景技术：
葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOD)，其系统命名为β-D-葡萄糖氧化还原酶：氧1-氧化还原酶(EC1.1.3.4)，广泛分布与动植物体内，主要来源为黑曲霉(Aspergillusniger)和青霉(Penicillium)，属胞内酶，它能高度专一性地催化β-D-葡萄糖与氧反应，使葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和过氧化氢。该酶最早发现于1904年，由于当时没有认识到其商业价值而没有被广泛应用，直到1928年Muller从黑曲霉中发酵得到GOD；1960年Kusai等和1964年Pazur等分别从青霉菌和黑曲霉中提纯得到葡萄糖氧化酶。我国自1986年开始研究葡萄糖氧化酶的制备提纯工艺，1998年正式投入生产。1999年农业部将其定为12种允许使用的饲料酶制剂添加剂之一，但是酶活力定义和检测方法没有国家标准，个别省份有地方标准比如河北省地方标准DB13/T 1444-2011《饲料添加剂葡萄糖氧化酶》(滴定法)、河南省地方标准DB41/T1729-2018(分光光度法)，大多生产企业采用自己的企业标准。
目前葡萄糖氧化酶活力主要的检测方法有滴定法、分光光度法、电化学法、测压法、凝胶电泳法和傅里叶变换红外光谱法；其中电化学法、测压法、凝胶电泳法和傅里叶变换红外光谱法及连续分光光度法由于其操作繁杂、仪器依赖和试剂缺乏等方面存在的问题，未被大量推广使用；滴定法和普通分光光度法则应用较多。普通分光光度法的原理是在有氧的情况下，葡萄糖氧化酶催化β-D-葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢。随后，辣根过氧化物酶(HRP)催化过氧化氢与显色底物发生反应，然后用分光光度计检测生成的有色物质。目前利用此原理进行GOD酶活力检测的方法主要有靛红褪色法、醌亚胺法、邻苯二胺法和邻联茴香胺法等。虽然分光光度法非常灵敏，但是存在显色物质不稳定，数据重复性不好，标准曲线线性范围较窄和检测酶活力较低不适合进行推广和制定标准。滴定法的原理是葡萄糖氧化酶催化β-D-葡萄糖产生葡萄糖酸，再通过酸碱滴定法可以间接测定出葡萄糖酸的产量，然后根据葡萄糖酸的产生量计算出GOD的酶活力；此法简单易行、成本低，采用较多比如河北省地方标准DB13/T 1444-2011就是采用此原理制定；但是存在滴定终点判定难、检测酶活力的温度低酶活低、灵敏度低、误差大。因此，建立一种快速、灵敏、检测成本低的GOD检测方法是一切迫切需求。
为了克服GOD酶活力检测体系的缺点，设计出快速可靠，操作简单，成本低，灵敏准确的检测方法，拓宽检测体系的适用范围，改正不合理的因素，本发明提供一种定性和定量测定葡萄糖氧化酶活力的方法，通过反复验证，建立了较为实用可靠的酶活力检测体系。
发明内容：
本发明的目的是提供一种检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法，包括以下步骤：
(1)将葡萄糖氧化酶稀释至浓度为6.3-7.2U/mL，记录稀释倍数f，作为待测酶液；
(2)配置葡萄糖浓度为20g/L的葡萄糖磷酸盐缓冲液，溶剂为0.06mol/L pH5.6磷酸缓冲溶液；
(3)取所述葡萄糖磷酸盐缓冲液，于37℃预热5.0-10.0min，与所述待测酶液按照体积比25：1混合，于37℃振荡反应57-63min取出；向混合溶液中按照体积比26:20加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液，终止反应；加酚酞指示剂，用0.020-0.030mol/L的盐酸溶液滴定至红色恰好退去并且pH为8.95-9.00为滴定终点，记录所消耗的盐酸体积A；
(4)取与所述步骤(3)相同体积的葡萄糖磷酸盐缓冲液，在与所述步骤(3)相同预热温度和时间下进行预热，并与0.1mol/L的氢氧化钠溶液按照体积比25：20混合，摇匀混合，并向混合液中按照体积比45:1加入所述待测酶液，加酚酞指示剂，用与所述步骤(3)相同浓度的盐酸溶液滴定至红色恰好退去并且pH达到与所述步骤(3)pH相同时为滴定终点，记录所消耗的盐酸毫升数B；
Figure BDA0002316548900000021
式中：
A----滴定样品反应后消耗的盐酸(mL)；B----反应前消耗的盐酸(mL)；N----盐酸摩尔浓度(mol/L)；f----稀释倍数，1000—换算系数，T----反应时间(按min计)。
所述步骤(1)中，葡萄糖氧化酶配置浓度为6.3-7.2U/mL，通过检测数据，同时结合回归分析表明，葡萄糖氧化酶液在6.3-7.2U/mL检测范围内，相对标准偏差RSD＝1.9％，达到检测精度要求。
需要说明的是，在测定酶活之前，稀释之前的待测葡萄糖氧化酶的酶活是根据已知的酶活标注值或估算的最大酶活值为准。
所述待测酶液的浓度可以为6.3U/mL、6.4U/mL、6.5U/mL、6.6U/mL、6.7U/mL、6.8U/mL、6.9U/mL、7.0U/mL、7.1U/mL、7.2U/mL。
优选地，所述步骤(1)中，酶液浓度为6.5-6.9U/mL。
更优选地，所述步骤(1)中，酶液浓度为6.6-6.7U/mL。
更优选地，所述步骤(1)中，酶液浓度为6.68U/mL。通过回归分析表明，葡萄糖氧化酶在6.68U/mL中为更优浓度。
所述步骤(1)中，葡萄糖氧化酶可为固体粉末或为发酵后的发酵酶液。
所述步骤(1)中，葡萄糖氧化酶为发酵后的发酵酶液，则直接加水稀释至酶活浓度为6.3-7.2U/mL。
所述步骤(1)中，葡萄糖氧化酶为固体粉末，加水稀释后经过浸提，过滤，再稀释，使酶液浓度控制在6.3-7.2U/mL，作为待测酶液；所述过滤选用中性快速滤纸进行过滤，所述中性快速滤纸的孔径为20-25μm，滤速＜35S；所述浸提条件为：于4-8℃条件下，浸提15-16小时。
优选地，所述步骤(2)中，磷酸缓冲溶液组成为0.06mol/L的NaH2PO4·2H2O溶液与0.06mol/L的Na2HPO4·12H2O溶液按照体积比20:1混合或0.06mol/L的NaH2PO4·2H2O溶液或0.06mol/L的Na2HPO4·12H2O溶液。
优选地，所述步骤(3)中，振荡反应时间为60min。
优选地，所述步骤(3)中，震荡反应的转速为150-180rpm。
其中，所述步骤(3)和(4)中，葡萄糖磷酸盐缓冲液的预热时间可以为5.0min、5.5min、6.0min、6.5min、7.0min、7.5min、8.0min、8.5min、9.0min、9.5min、10.0min。
优选地，所述步骤(3)和(4)中，葡萄糖磷酸盐缓冲液的预热时间为5.0-6.0min。
更优选地，所述步骤(3)和(4)中，葡萄糖磷酸盐缓冲液的预热时间为5.0min。
优选地，所述步骤(3)和(4)中，酚酞指示剂组成为：酚酞10g/L，余量为浓度为90％的乙醇。
其中，所述步骤(3)和(4)中，盐酸的浓度为0.020mol/L、0.021mol/L、0.022mol/L、0.023mol/L、0.024mol/L、0.025mol/L、0.026mol/L、0.027mol/L、0.028mol/L、0.029mol/L、0.030mol/L。
优选地，所述步骤(3)和(4)中，盐酸的浓度为0.025mol/L。
其中，所述步骤(3)和(4)中，滴定终点的pH值可以为8.95、8.96、8.97、8.98、8.99、9.00。选择滴定终点的pH值在此范围内，测得的酶活的相对标准偏差＜2％。
优选地，所述步骤(3)和(4)中，滴定终点的pH值为8.97-8.99。
优选地，所述步骤(3)和(4)中，滴定终点的pH值为8.98。
优选地，所述步骤(3)(4)中，酚酞指示剂加入量为1滴。
本发明葡萄糖氧化酶活力检测原理为：葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能催化葡萄糖生成葡萄糖酸。用过量的氢氧化钠中和产生的葡萄糖酸，再用盐酸返滴定，即可求得葡萄糖酸的产量，根据产葡萄糖酸量表示酶活力高低。
所述步骤(3)中，葡萄糖磷酸盐缓冲液和待测酶液混合，目的是让酶液在其中反应，添加0.1mol/L的氢氧化钠溶液是终止反应；步骤(4)中，在同样添加相同体积葡萄糖磷酸盐缓冲液、0.1mol/L的氢氧化钠溶液后，再加1毫升待测酶液，通过滴定来测定在不发生酶活反应时，盐酸的消耗总量。
优选地，所述一种检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法，包括以下步骤：
(1)配置浓度为6.3-7.2U/mL的葡萄糖氧化酶液，经浸提，过滤、稀释，使酶液浓度控制在6.3-7.2U/mL，记录稀释倍数f，作为待测酶液；
(2)将葡萄糖与0.06mol/L pH5.6磷酸缓冲溶液混合，配置成葡萄糖浓度为20g/L的葡萄糖磷酸盐缓冲液；
(3)取所述葡萄糖磷酸盐缓冲液25.00mL，于37℃预热5.0-10.0min，向其中加入所述待测酶液1.00mL混合，于37℃振荡反应60min取出；向混合溶液中加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液20.00mL，终止反应；加酚酞指示剂，用0.020-0.030mol/L的盐酸溶液滴定至红色恰好退去并且pH为8.95-9.00为滴定终点，记录所消耗的盐酸体积A；
(4)取与所述步骤(3)相同体积的所述葡萄糖磷酸盐缓冲液，在与所述步骤(3)相同预热温度和时间下进行预热，并与0.1mol/L的氢氧化钠溶液按照体积比25：20混合，摇匀混合，并向混合液中加入所述待测酶液1.00mL，加酚酞指示剂，用与所述步骤(3)相同浓度的盐酸溶液滴定至红色恰好退去并且pH达到与所述步骤(3)pH相同时为滴定终点，记录所消耗的盐酸毫升数B；
Figure BDA0002316548900000051
式中：/>
A----滴定样品反应后消耗的盐酸(mL)；B----反应前消耗的盐酸(mL)；N----盐酸摩尔浓度(mol/L)；f----稀释倍数，1000—换算系数，T----反应时间(按min计)。
需要说明的是，本发明方法测定的葡萄糖氧化酶是在饲料添加剂中应用的酶，因此测定的酶活也应是葡萄糖氧化酶在被饲喂动物的胃肠道中的真实酶活，因此葡萄糖氧化酶的震荡反应温度则控制在30℃以上的温度。
有益效果
本发明克服了GOD酶活力检测体系的缺点，该检测方法具有快速可靠，操作简单，成本低，灵敏准确的优点，在检测范围6.3-7.2U/mL内，相对标准偏差为1.9％。
本发明通过增加预热时间、改变反应温度和反应体系中盐酸溶液浓度，采用双指标判定反应终点：在用肉眼判定红色恰好退去为滴定终点的基础上，增加了判定反应终点的另一指标(pH值)，这样显著增加了检测方法的准确度和可重复性；本发明测定方法的准确性和可重复性均超过了河北省地方标准DB13/T1444-2011《饲料添加剂葡萄糖氧化酶》检测方法，取得比较满意的效果。
所述步骤(3)(4)中，在将葡萄糖磷酸盐缓冲液于37℃预热5.0-10.0min的过程中，其中37℃是本发明的发明点，因为是饲料添加剂，使用对象是畜禽等动物，体温一般是37℃；因此本发明在此测定的是应用于饲料添加剂领域中，测定酶活的温度条件，检测酶活是在动物体内发挥作用的酶活。
其中葡萄糖磷酸盐缓冲液预热5.0-10.0min同样对于酶活的检测性能具有显著的提高，现有技术中，河北省地方标准是预热3min，而在实践中表明预热3min，启动酶活不够，检测数据偏低)
本发明利用浓度为0.020-0.030mol/L的盐酸溶液滴定剩余的氢氧化钠，同时本发明通过控制滴定至红色恰好退去并且pH计显示8.95-9.00为滴定终点，采取颜色观察和pH的双重控制，均可显著提高酶活的检测精准度。同时，该测定方式使得检测数据可重复性好，数据检测数值相对更为准确。
附图说明
图1为本发明实施例1的饲料添加剂葡萄糖氧化酶GOD检测方法流程图；
图2为本发明实施例4的GOD检测范围回归分析图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法
(1)固体葡萄糖氧化酶的预处理，将葡萄糖氧化酶经过蒸馏水稀释，配置浓度为6.68U/mL的葡萄糖氧化酶液，于4℃条件下(搅拌摇匀，冰箱条件下4-8℃)浸提15-16小时，用中性快速滤纸过滤，滤液经蒸馏水稀释，使酶液浓度控制在6.68U/mL(记录两次稀释的总稀释倍数f)，作为待测酶液；
其中，步骤(1)中，所述中性快速滤纸的孔径为20-25μm，滤速＜35S。
(2)配制2％葡萄糖磷酸盐缓冲液(20g/L)：将葡萄糖与0.06mol/L pH5.6磷酸缓冲溶液混合，配置成葡萄糖浓度为20g/L的葡萄糖磷酸盐缓冲液；
其中，所述(2)中磷酸缓冲溶液(0.06mol/L pH5.6)的配制是：第一步NaH2PO4·2H2O 9.36g加水溶解，定容至1000mL，摇匀；第二步Na2HPO4·12H2O 21.48g加水溶解，定容至1000mL，摇匀；第三步是取NaH2PO4·2H2O溶液和Na2HPO4·12H2O溶液按照20：1比例混合，调节pH值至5.6即可。
(3)取所述步骤(2)制备得到的2％葡萄糖磷酸盐缓冲溶液25.00mL置于250mL锥形瓶中，于恒温摇床37℃、150rpm预热5.0min，并与所述步骤(1)的待测酶液按照体积比25：1混合，立即置恒温摇床上，于37℃、150rpm振荡反应60min取出(准确计时)；向混合溶液中按照体积比26:20加入立即准确加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液(即20.00mL)，终止反应；加酚酞指示剂1滴，用0.025mol/L的盐酸溶液滴定剩余的氢氧化钠，滴定至红色恰好退去并且pH计显示8.98为滴定终点，记录所消耗的盐酸毫升数A；
(4)空白对照：取所述步骤(2)制备得到的2％葡萄糖磷酸盐缓冲溶液25.00mL置于250mL锥形瓶中，于恒温摇床37℃、150rpm预热5min，与0.1mol/L的氢氧化钠溶液(即20mL)按照体积比25：20混合，摇匀，并按照体积比45:1准确加入所述待测酶液(即1.00mL)，加酚酞指示剂1滴，用0.025mol/L的盐酸溶液滴定剩余的氢氧化钠，滴定至红色恰好退去并且pH计显示8.98为滴定终点，记录所消耗的盐酸毫升数B。
Figure BDA0002316548900000071
式中：
A----滴定样品反应后消耗的盐酸(mL)；B----反应前消耗的盐酸(mL)；N----盐酸摩尔浓度(mol/L)；f----稀释倍数，1000—换算系数，T----反应时间(按min计)。
其中，步骤(2)和(3)中，酚酞指示剂配置过程为：称取酚酞1g溶于100mL 90％乙醇中。
实施例2不同浓度的饲料添加剂葡萄糖氧化酶活力的检测
(1)固体葡萄糖氧化酶的预处理，将葡萄糖氧化酶用蒸馏水稀释，配置浓度为6.3U/mL的葡萄糖氧化酶液，于4℃条件下(搅拌摇匀，冰箱条件下4℃)浸提15小时，用中性快速滤纸过滤，滤液经蒸馏水稀释，使酶液浓度控制在6.3U/mL(记录两次稀释的总稀释倍数f)，作为待测酶液；
其中，步骤(1)中，所述中性快速滤纸的孔径为20μm，滤速＜35S。
(2)配制2％葡萄糖磷酸盐缓冲液(20g/L)：将葡萄糖与0.06mol/L pH5.6磷酸缓冲溶液混合，配置成葡萄糖浓度为20g/L的葡萄糖磷酸盐缓冲液；
其中，所述(2)中磷酸缓冲溶液(0.06mol/L pH5.6)的配制是：第一步NaH2PO4·2H2O 9.36g加水溶解，定容至1000mL，摇匀；第二步Na2HPO4·12H2O 21.48g加水溶解，定容至1000mL，摇匀；第三步是取NaH2PO4·2H2O溶液和Na2HPO4·12H2O溶液按照20：1比例混合，调节pH值至5.6即可。
(3)取所述步骤(2)制备得到的2％葡萄糖磷酸盐缓冲溶液25.00mL置于250mL锥形瓶中，于恒温摇床37℃、150rpm预热6.0min，并与所述步骤(1)的待测酶液按照体积比25：1混合，立即置恒温摇床上，于37℃、150rpm振荡反应60min取出(准确计时)；向混合溶液中按照体积比26:20加入立即准确加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液(即20.00mL)，终止反应；加酚酞指示剂1滴，用0.020mol/L的盐酸溶液滴定剩余的氢氧化钠，滴定至红色恰好退去并且pH计显示8.95为滴定终点，记录所消耗的盐酸毫升数A；
(4)空白对照：取所述步骤(2)制备得到的2％葡萄糖磷酸盐缓冲溶液25.00mL置于250mL锥形瓶中，于恒温摇床37℃、150rpm预热6.0min，并与0.1mol/L的氢氧化钠溶液(即20mL)按照体积比25：20混合，摇匀，并按照体积比45:1准确加入所述待测酶液(即1.00mL)，加酚酞指示剂1滴，用0.020mol/L的盐酸溶液滴定剩余的氢氧化钠，滴定至红色恰好退去并且pH计显示8.95为滴定终点，记录所消耗的盐酸毫升数B。
计算样品中葡萄糖氧化酶活力，葡萄糖氧化酶活力公式同实施例1。
其中，步骤(2)和(3)中，酚酞指示剂配置过程同实施例1。
实施例3检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法
(1)固体葡萄糖氧化酶的预处理，将葡萄糖氧化酶用蒸馏水稀释，配置浓度为7.2U/mL的葡萄糖氧化酶液，于8℃条件下(搅拌摇匀，冰箱条件下8℃)浸提16小时，用中性快速滤纸过滤，滤液经蒸馏水稀释，使酶液浓度控制在7.2U/mL(记录两次稀释的总稀释倍数f)，作为待测酶液；
其中，步骤(1)中，所述中性快速滤纸的孔径为25μm，滤速＜35S。
(2)配制2％葡萄糖磷酸盐缓冲液(20g/L)：将葡萄糖与0.06mol/L pH5.6磷酸缓冲溶液混合，配置成葡萄糖浓度为20g/L的葡萄糖磷酸盐缓冲液；
其中，所述步骤(2)中，所述磷酸缓冲溶液为浓度为0.06mol/L NaH2PO4·2H2O溶液。
(3)取所述步骤(2)制备得到的2％葡萄糖磷酸盐缓冲溶液25.00mL置于250mL锥形瓶中，于恒温摇床37℃、150rpm预热10.0min，并与所述步骤(1)的待测酶液按照体积比25：1混合，立即置恒温摇床上，于37℃、150rpm振荡反应60min取出(准确计时)；向混合溶液中按照体积比26:20加入立即准确加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液(即20.00mL)，终止反应；加酚酞指示剂1滴，用0.030mol/L的盐酸溶液滴定剩余的氢氧化钠，滴定至红色恰好退去并且pH计显示9.00为滴定终点，记录所消耗的盐酸毫升数A；
(4)空白对照：取所述步骤(2)制备得到的2％葡萄糖磷酸盐缓冲溶液25.00mL置于250mL锥形瓶中，于恒温摇床37℃、150rpm预热10min，与0.1mol/L的氢氧化钠溶液(即20mL)按照体积比25：20混合，摇匀，并按照体积比45:1准确加入所述待测酶液(即1.00mL)，加酚酞指示剂1滴，用0.030mol/L的盐酸溶液滴定剩余的氢氧化钠，滴定至红色恰好退去并且pH计显示9.00为滴定终点，记录所消耗的盐酸毫升数B。
计算样品中葡萄糖氧化酶活力，葡萄糖氧化酶活力公式同实施例1。
其中，步骤(2)和(3)中，酚酞指示剂配置过程同实施例1。
实施例4检测不同浓度的饲料用葡萄糖氧化酶活力
为了探究不同葡萄糖氧化酶浓度对于酶活测定的影响，分别配置不同浓度的葡萄糖氧化酶浓度进行酶活测定，
待测葡萄糖氧化酶，估算酶活为2650U/mL。
分组如下：
实验组：分别配置浓度为6.3U/mL、6.4U/mL、6.5U/mL、6.6U/mL、6.7U/mL、6.8U/mL、6.9U/mL、7.0U/mL、7.1U/mL、7.2U/mL的葡萄糖氧化酶液，同样按照本发明实施例1步骤(1)的处理方式得到待测酶液；
对照组：对照组1，配置浓度为6.0U/mL的葡萄糖氧化酶液；
对照组2，配置浓度为7.5U/mL的葡萄糖氧化酶液，
对照组1、2同样按照本发明实施例1步骤(1)的处理方式得到待测酶液；
实验组分别按照实施例1中步骤(2)、(3)、(4)的过程测定葡萄糖氧化酶的酶活，每个酶活浓度测定1次，酶活计算公式同实施例1。不同浓度葡萄糖氧化酶的酶活测定值、平均值、标准偏差以及相对标准偏差如表1和图1所示。
对照组1、2分别按照实施例1中步骤(2)、(3)、(4)的过程测定葡萄糖氧化酶的酶活，每个对照组各重复测定5次，酶活计算公式同实施例1。酶活测定值、平均值、标准偏差以及相对标准偏差如表3、4。
通过做回归分析表明，实验组在葡萄糖氧化酶的浓度在6.3-7.2U/mL的检测范围内，相对标准偏差RSD＝1.9％，标准偏差为49.53，其测定酶活数值稳定、准确。
在葡萄糖氧化酶的浓度为6.68U/mL时，酶活检测值最大2653U/mL；相关系数R2＝0.9661(表2所示，通过回归分析，得出酶活的最优浓度和对应的检测酶活最大值)。酶活大是酶催化效率高的重要指标，酶活数据大，越能反应测定的精准度高，说明该方法对酶的活性敏感。
而在对照组中，当酶活浓度分别为6.0U/mL以及7.5U/mL时，其在分别重复测定5次获得酶活结果中，其标准偏差高达127.63，相对标准偏差也高达5.83％和5.75％。说明酶活在该浓度下，数值测定并不稳定，酶活测定的重复性较差。
表1实验组不同浓度葡萄糖氧化酶的酶活测定
Figure BDA0002316548900000101
Figure BDA0002316548900000111
表2检测范围内葡萄糖氧化酶回归分析
Figure BDA0002316548900000112
表3浓度为6.0U/mL的葡萄糖氧化酶的酶活测定
稀释到单位U/mL 酶活U/mL
6.0 2049
6.0 2175
6.0 2368
6.0 2260
6.0 2098
平均值 2190
标准偏差 127.63
相对标准偏差(％) 5.83
表4浓度为7.5U/mL的葡萄糖氧化酶的酶活测定
Figure BDA0002316548900000113
Figure BDA0002316548900000121
实验例1预热时间对于酶活测定的影响
为了说明不同葡萄糖磷酸盐缓冲液的预热时间对于葡萄糖氧化酶酶活的影响，分别测定葡萄糖氧化酶在不同葡萄糖磷酸盐缓冲液的预热时间条件下所测定的酶活。
待测葡萄糖氧化酶，估算酶活为2650U/mL。
将实验分为10组，其中实验组1、2、3、4、5、6以及对照组1、2、3、4。
按照实施例1步骤(1)-(4)测定方法的步骤进行，
唯一不同的是步骤(3)(4)中葡萄糖磷酸盐缓冲液的预热时间不同，其中实验组1、2、3、4、5、6分别对应步骤(3)(4)中葡萄糖磷酸盐缓冲液的预热时间分别为5.0min、6.0min、7.0min、8.0min、9.0min、10.0min，对照组1、2、3、4分别对应步骤(3)(4)中葡萄糖磷酸盐缓冲液的预热时间为1.0min、2.0min、3.0min、4.0min(其中实验组，步骤(3)(4)中，葡萄糖磷酸盐缓冲液的预热时间相同，对照组步骤(3)(4)葡萄糖磷酸盐缓冲液的预热时间相同)。
实验组中，通过葡萄糖磷酸盐缓冲液的不同预热时间：5.0min、6.0min、7.0min、8.0min、9.0min、10.0min，测得的酶活测定值、平均值、标准偏差以及相对标准偏差详见表5，对照组中，通过葡萄糖磷酸盐缓冲液的不同预热时间：1.0min、2.0min、3.0min、4.0min测得的酶活测定值、平均值、标准偏差以及相对标准偏差详见表6.
表5实验组不同预热时间对于葡萄糖氧化酶的酶活测定的影响
分组 预热时间min 酶活U/mL
实验组1 5.0 2656
实验组2 6.0 2650
实验组3 7.0 2620
实验组4 8.0 2628
实验组5 9.0 2634
实验组6 10.0 2641
平均值 2638
标准偏差 13.58
相对标准偏差(％) 0.51
误差
(注：表5中标准偏差和相对标准偏差是将实验组所有数值进行拟合之后得到的偏差值)
表6对照组不同预热时间对于葡萄糖氧化酶的酶活测定的影响
分组 预热时间min 酶活U/mL
对照组1 1.0 2470
对照组2 2.0 2510
对照组3 3.0 2540
对照组4 4.0 2570
平均值 2523
标准偏差 42.72
相对标准偏差(％) 1.69
误差％ 2.76
(注：表6中标准偏差和相对标准偏差是将对照组组所有数值进行拟合之后得到的偏差值)
检测数据说明：实验组，葡萄糖磷酸盐缓冲液的预热时间为5.0-10.0分钟，酶活(也就是酶蛋白)启动充分，平均值2638U/mL，标准偏差SD13.58％；相对标准偏差0.51％；而对照组，预热1-4分钟，平均酶活2523U/mL，标准偏差SD 42.72％；相对标准偏差1.69％。误差(％)4.59％。而现有技术如河北省地方标准DB13/T 1444-2011中，在测定葡萄糖氧化酶酶活的过程中，其对于葡萄糖磷酸盐缓冲液的预热时间均为3.0min，现有技术关于葡萄糖氧化酶酶活的测定也以此预热时间为指导，而本发明发现葡萄糖磷酸盐缓冲液对于预热3min，其启动酶活不够，检测数据偏低，而预热5.0-10.0min则对于酶活的检测性能具有显著的提高。
实验例2判定滴定终点指标对于酶活测定的影响
为了说明不同滴定终点的判定指标对于葡萄糖氧化酶酶活测定的影响，特别设置此实验例。
待测葡萄糖氧化酶酶估算酶活为2650U/mL。
分别设置实验组和对照组，均测定不同浓度葡萄糖氧化酶的酶活，即葡萄糖氧化酶的浓度分别为6.3U/mL、6.4U/mL、6.5U/mL、6.6U/mL、6.7U/mL、6.8U/mL、6.9U/mL、7.0U/mL、7.1U/mL、7.2U/mL，记录不同的稀释倍数。
其中，实验组：按照实施例1步骤(1)-(4)方法，测定不同浓度葡萄糖氧化酶的酶活，其中步骤(3)(4)中，判定盐酸溶液滴定终点的指标为：红色恰好退去并且pH计显示8.98为滴定终点；经酶活测定，计算出实验组测定酶活的平均值、标准偏差以及相对标准偏差，详见表7。
对照组：同样按照实施例1步骤(1)-(4)方法，测定不同浓度葡萄糖氧化酶的酶活，与实施例1步骤(3)(4)不同的是，判定盐酸溶液滴定终点的指标仅为：红色恰好退去，并不进行pH的监控；经酶活测定，计算出实验组测定酶活的平均值、标准偏差以及相对标准偏差，详见表8。
(其中实验组的步骤(3)(4)滴定终点pH值相同，对照组步骤(3)(4)滴定终点的方法相同)
表7实验组滴定法对于酶活测定的影响
稀释到单位U/mL 酶活U/mL
6.3 2565
6.4 2602
6.5 2640
6.6 2655
6.7 2656
6.8 2650
6.9 2620
7.0 2588
7.1 2541
7.2 2519
平均值 2604
标准偏差 49.53
相对标准偏差(％) 1.90
表8对照组滴定法对于酶活测定的影响
Figure BDA0002316548900000141
Figure BDA0002316548900000151
试验数据表明：双指标判定终点(红色恰好退去并且pH计显示8.98为滴定终点)酶活平均值为2604U/mL、标准偏差SD为49.53、相对标准偏差RSD为1.90％；单指标判定终点(红色恰好退去)酶活平均值酶活2354U/mL、标准偏差SD为140、相对标准偏差RSD为5.95％；由此可以看出双指标判定终点显著优于单指标判定终点。
需要说明的是，判断pH的滴定终点为8.95、8.96、8.97、8.99以及9.00时，同样具有如上述实验组相近的技术效果。
实验例3处理温度对于酶活测定的影响
为了说明酶的不同处理温度对于葡萄糖氧化酶酶活测定的影响，特别设置此实验例。
待测葡萄糖氧化酶估算酶活为4500U/mL。
分别设置实验组和对照组，其中，实验组为按照实施例1的方法测定葡萄糖氧化酶的酶活，其中步骤(3)(4)中，葡萄糖磷酸盐缓冲溶液预热的温度均为37℃，振荡反应60min过程中的处理温度为37℃；
对照组分为对照组1、2、3、4、5、6、7、8，对照组的测定方法分别为：
对照组1：步骤(1)(2)同实施例1；步骤(3)(4)同实施例1，唯一不同的是葡萄糖磷酸盐缓冲溶液预热的温度均为34℃，振荡反应60min过程中的处理温度为34℃；
对照组2：步骤(1)(2)同实施例1；步骤(3)(4)同实施例1，唯一不同的是葡萄糖磷酸盐缓冲溶液预热的温度均为35℃，振荡反应60min过程中的处理温度为35℃；
对照组3：步骤(1)(2)同实施例1；步骤(3)(4)同实施例1，唯一不同的是葡萄糖磷酸盐缓冲溶液预热的温度均为36℃，振荡反应60min过程中的处理温度为36℃；
对照组4：步骤(1)(2)同实施例1；步骤(3)(4)同实施例1，唯一不同的是葡萄糖磷酸盐缓冲溶液预热的温度均为38℃，振荡反应60min过程中的处理温度为38℃；
对照组5：步骤(1)(2)同实施例1；步骤(3)(4)同实施例1，唯一不同的是葡萄糖磷酸盐缓冲溶液预热的温度均为39℃，振荡反应60min过程中的处理温度为39℃；
对照组6：步骤(1)(2)同实施例1；步骤(3)(4)同实施例1，唯一不同的是葡萄糖磷酸盐缓冲溶液预热的温度均为39℃，振荡反应60min过程中的处理温度为39℃；
对照组7：步骤(1)(2)同实施例1；步骤(3)(4)同实施例1，唯一不同的是葡萄糖磷酸盐缓冲溶液预热的温度均为40℃，振荡反应60min过程中的处理温度为40℃；
对照组8：步骤(1)(2)同实施例1；；步骤(3)(4)同实施例1，唯一不同的是葡萄糖磷酸盐缓冲溶液预热的温度均为45℃，振荡反应60min过程中的处理温度为45℃；
对照组9：步骤(1)(2)同实施例1，步骤(3)(4)同实施例1，唯一不同的是葡萄糖磷酸盐缓冲溶液预热的温度均为50℃，振荡反应60min过程中的处理温度为50℃；
实验组和对照组同时进行葡萄糖氧化酶的酶活测定：
相对酶活力的测定方法：相对酶活力＝37℃下测得酶活/不同分组下测得酶活×100％
表9不同温度下酶活测定的影响
反应温度℃ 34 35 36 37 38 39 40 45 50
酶活力U/mL 2533.236 3415.548 4240.1004 4548 4495.2432 4162.3296 4102.296 3969.9492 3687.9732
相对酶活力％ 55.70 75.10 93.23 100.00 98.84 91.52 90.20 87.29 81.09
实验例4pH滴定终点对于酶活测定的影响
为了说明酶的pH滴定终点对于葡萄糖氧化酶酶活测定的影响，特设置此实验例。将实验分为12组，其中实验组1、2、3、4、5、6以及对照组1、2、3、4、5、6。
待测葡萄糖氧化酶为1000U/mL标准品。
实验组和对照组基本按照实施例1步骤(1)-(4)测定方法的步骤进行，实验组和对照组与实施例1不同的是步骤(3)(4)中葡萄糖氧化酶的pH滴定终点不同，其中实验组1、2、3、4、5、6分别对应步骤(3)(4)中的pH滴定终点为8.95、8.96、8.97、8.98、8.99、9.00，测得的酶活测定值、平均值、标准偏差以及相对标准偏差详见表10。
对照组1、2、3、4、5、6分别对应步骤(3)(4)中的pH滴定终点为8.90、8.91、8.92、8.93、8.94，测得的酶活测定值、平均值、标准偏差以及相对标准偏差详见表11。
(其中，实验组的步骤(3)(4)pH滴定终点相同，对照组的步骤(3)(4)pH滴定终点相同)
表10实验组不同pH滴定终点下的酶活测定
不同滴定pH终点 酶活U/mL
8.97 1009
8.96 1017
8.98 1001
8.99 991
9.00 986
8.95 1021
平均值 1004.17
标准偏差 12.81
相对标准偏差(％) 1.28
通过表10可以看出，当滴定终点的pH值在8.95-9.00范围内，其测定的酶活值接近于标准品1000U/mL的酶活值。且实验组的相对标准偏差小于2％，测定数值较为稳定。
其中，当滴定终点的pH值为8.98；平均酶活是1004U/mL，更接近标准品酶活1000U/mL；8.98为最优值。
表11对照组不同pH滴定终点下的酶活测定
Figure BDA0002316548900000171
Figure BDA0002316548900000181
通过实验组和对照组的比较可以明显的看出，实验组在不同滴定pH终点测定的酶活，其相对标准偏差远小于2％，测定数值较为稳定。
而对照组中：pH滴定终点在pH8.90-pH8.94的范围内，溶液颜色已变为透明无色状态，失去了以颜色判断终点的这一指标；第二溶液是一个缓冲体系，8.94及以下，缓冲能力不敏感了，滴定盐酸溶液用的多，酶活波动大，表现为相对标准偏差变大，酶活测定数据的稳定性较差。
此外，对于滴定终点pH9.0以上的范围，并不能作为判断滴定的终点，因为溶液仍然呈现红色并且颜色很深，并不满足滴定指标其中之一：红色恰好退去的滴定指标。
对比例1标准方法与本发明实施方法测定酶活的比较
分别按照本发明测定方法与现有技术检测方法测定葡萄糖氧化酶酶活，比较酶活测定的准确度和稳定性。
待测葡萄糖氧化酶的酶活为1000U/mL标准品。
将实验分为两组：
实验组：本发明实施例1测定的酶活方法，重复测定5次。
对照组：河北省地方标准DB13/T 1444-2011《饲料添加剂葡萄糖氧化酶》检测方法测定葡萄糖氧化酶酶活，重复测定5次，对照组具体方法如下：
取待测葡萄糖氧化酶，准确加入适量蒸馏水稀释,使酶液浓度控制在3.0U/mL范围(记录稀释倍数f)。搅拌摇匀后于4℃冰箱中浸提15～16小时，用中性快速滤纸或细绸布过滤，滤液作为测定液；准确量取液体产品，用适量蒸馏水稀释，使酶液浓度控制在3.0U/mL范围(记录稀释倍数f)，作为测定液。
取2％葡萄糖磷酸缓冲液25.00mL置250mL锥形瓶中，于恒温摇床上30℃、150rpm预热3.0分钟，准确加入上述测定液1.00mL，立即置恒温摇床上，30℃、150rpm振荡反应60分钟取出(准确计时)；立即准确加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液20.00ml，振摇终止反应；加酚酞指示剂1滴，用0.1mol/L盐酸滴定剩余的氢氧化钠，记录所消耗的盐酸毫升数A。
空白对照，取2％葡萄糖磷酸缓冲液25.00mL置250mL锥形瓶中，准确加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液20.00ml，摇匀，再准确加入酶液1.00mL，酚酞指示剂1滴，用0.1mol/L盐酸滴定剩余的氢氧化钠，
记录所消耗的盐酸毫升数B。
计算：葡萄糖氧化酶活力单位(GOD/g或mL)＝(B-A)×N×f×1000/60(1)
式中：A----反应后消耗的盐酸(mL)；B----反应前消耗的盐酸(mL)；
N----盐酸摩尔浓度(mol/L)；f-----稀释倍数
60----为反应60分钟，按分钟计。
对照组和实验组重复测定五次的酶活测定值、平均值、标准偏差以及相对标准偏差详见表12。
表12不同测定方法下对于葡萄糖氧化酶测定的影响
Figure BDA0002316548900000191
通过表12可以看出，针对于同一葡萄糖氧化酶标准品酶活的测定，利用本发明方法测得的酶活几乎接近于产品实际酶活力数值，且相对标准偏差远远小于2％，由此说明该方法测定误差较小，且多次测定重复性较好，数据稳定性较高。而相比于对照组，利用河北省地方标准DB13/T 1444-2011测定的酶活值仅为30U/mL，且相对标准偏差远远大于2％，测定方法不仅误差偏大，且测定数据稳定性较差。

Claims (9)

1.一种检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将葡萄糖氧化酶稀释至浓度为6.3-7.2U/mL，记录稀释倍数f，作为待测酶液；
(2)配置葡萄糖浓度为20g/L的葡萄糖磷酸盐缓冲液，溶剂为0.06mol/LpH5.6磷酸缓冲溶液；
(3)取所述葡萄糖磷酸盐缓冲液，于37℃预热5.0-10.0min，与所述待测酶液按照体积比25：1混合，于37℃振荡反应57-63min取出；向混合溶液中按照体积比26:20加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液，终止反应；加酚酞指示剂，用0.020-0.030mol/L的盐酸溶液滴定至红色恰好退去并且pH为8.95-9.00为滴定终点，记录所消耗的盐酸体积A；
(4)取与所述步骤(3)相同体积的葡萄糖磷酸盐缓冲液，在与所述步骤(3)相同预热温度和时间下进行预热，并与0.1mol/L的氢氧化钠溶液按照体积比25：20混合，摇匀混合，并向混合液中按照体积比45:1加入所述待测酶液，加酚酞指示剂，用与所述步骤(3)相同浓度的盐酸溶液滴定至红色恰好退去并且pH达到与所述步骤(3)pH相同时为滴定终点，记录所消耗的盐酸毫升数B；
计算每g或每ml样品中葡萄糖氧化酶活力单位
Figure FDA0004042262870000011
式中：
A----滴定样品反应后消耗的盐酸mL；B----反应前消耗的盐酸mL；N----盐酸摩尔浓度mol/L；f----稀释倍数，1000—换算系数，T----反应时间按min计。
2.如权利要求1所述一种检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，酶液浓度为6.5-6.9U/mL。
3.如权利要求1所述一种检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，葡萄糖氧化酶为固体粉末，加水后经过浸提，过滤，再稀释，使酶液浓度控制在6.3-7.2U/mL，作为待测酶液；所述过滤用中性快速滤纸进行过滤，所述中性快速滤纸的孔径为20-25μm，滤速＜35S。
4.如权利要求3所述一种检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，浸提条件为：于4-8℃条件下，浸提15-16小时。
5.如权利要求1所述一种检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，磷酸缓冲溶液组成为0.06mol/L的NaH2PO4·2H2O溶液与0.06mol/L的Na2HPO4·12H2O溶液按照体积比20:1混合或0.06mol/L的NaH2PO4·2H2O溶液或0.06mol/L的Na2HPO4·12H2O溶液。
6.如权利要求1所述一种检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法，其特征在于：所述步骤(3)和(4)中，葡萄糖磷酸盐缓冲液的预热时间为5.0-6.0min。
7.如权利要求1所述一种检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法，其特征在于：所述步骤(3)和(4)中，酚酞指示剂组成为：酚酞10g/L，余量为浓度为90％的乙醇。
8.如权利要求1所述一种检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法，其特征在于：所述步骤(3)和(4)中，盐酸的浓度为0.025mol/L。
9.如权利要求1所述一种检测饲料用葡萄糖氧化酶活力的方法，其特征在于：所述步骤(3)和(4)中，滴定终点的pH值为8.97-8.99。
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