CN105580732A - 一种根为外植体的文冠果组织培养快繁方法及其培养的文冠果不定芽 - Google Patents

一种根为外植体的文冠果组织培养快繁方法及其培养的文冠果不定芽 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种根为外植体的文冠果组织培养快繁方法及其培养的文冠果不定芽，属于木本植物组培与消毒技术领域，本方法主要包括不定芽诱导培养基的制备，外植体的选取、灭菌，外植体的培养三个步骤，经本发明提供的快繁方法培养得到的文冠果根污染率明显下降，尤其是真菌的感染率；经本发明提供的组培方法得到的文冠果不定芽生长快且能保持亲本的优良性状。

Description

一种根为外植体的文冠果组织培养快繁方法及其培养的文冠果不定芽
技术领域
本发明涉及木本植物组培与消毒技术领域，具体为一种根为外植体的文冠果组织培养快繁方法及其培养的文冠果不定芽。
背景技术
文冠果是一种经济价值高、发展前途广的木本油科树种，文冠果种子含油量35-40％、种仁含油率高达60％，是一种中国特有的木本油料植物，有北方油茶之称；其种子油经转脂化反应可生产生物柴油，是国家林业局推荐的四种木本生物能源植物之一。文冠果还具有重要的药用和食用价值，由于花色品种多，作为观花木本植物，也具有很大的发展前景。但目前由于缺乏对文冠果林保护的投入，致使文冠果的品种资源林在日趋缩小，品种资源严重减少。文冠果组织培养是解决其种源不足、发展速度缓慢的一个很好的途径。通常其种苗以茎、叶、种胚、花药等做为外植体进行组织培养，但是存在以下问题：以种胚为外植体，母本的优良性状遗传不稳定，繁殖后代变异大，以茎、叶、花药等为外植体试管植株长势弱、增殖率不高且生根困难。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种根为外植体的文冠果组织培养快繁方法及其培养的文冠果不定芽。
本发明的技术方案如下：一种根为外植体的文冠果组织培养快繁方法，该方法包括如下步骤：
1)不定芽诱导培养基的制备：以WPM培养基为基本培养基，每升WPM培养基中添加0.5mL-2mL的植物组培抗菌剂，0.5mg-2.0mg的6-BA，0.5mg-2.0mg的NAA混合均匀后,即得不定芽诱导培养基；
2)外植体的选取、灭菌：取一年生文冠果根，清洗干净后，取侧根，即为外植体，将外植体消毒；
3)外植体的培养：将消毒后的外植体接种到不定芽诱导培养基中，在28-30℃，光照25-30天，进行文冠果不定芽的培养。
进一步的，所述的不定芽诱导培养基具体为：以WPM培养基为基本培养基，每升WPM培养基中添加2.0mL的植物组培抗菌剂，1.0mg的6-BA，1.0mg的NAA混合均匀后,即得不定芽诱导培养基。
进一步的，所述步骤2)清洗具体为：取一年生文冠果根，用自来水冲洗，然后在含有洗洁精的水中清洗干净，再用自来水冲洗3h。
所述含洗洁精的水，是为了将文冠果根外部的污渍清洗干净，洗洁精的主要成分为直链烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、烯烃磺酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、烷基醇酰胺、烷基糖苷等，本方法对洗洁精的浓度不作限定，可根据文冠果根外部的污渍的多少适当调整。
进一步的，所述步骤2)消毒包括如下步骤：将外植体使用60-80vt％酒精冲洗1分钟，无菌水冲洗3次，0.05-0.1wt％升汞冲洗10分钟，无菌水冲洗5次，然后将外植体放入添加了4-5vt％植物组培抗菌剂的完全MS培养基中，搅拌4-12h；更好的，所述的消毒为：将外植体使用75vt％酒精冲洗1分钟，无菌水冲洗3次，0.1wt％升汞冲洗10分钟，无菌水冲洗5次，然后将外植体放入添加了4vt％植物组培抗菌剂的完全MS培养基中，搅拌9h。
本发明同时要求保护按照上述方法得到的文冠果不定芽。
本发明的有益效果如下：
1、经本发明提供的消毒方法处理后的文冠果根污染率明显下降，尤其是真菌的感染率；
2、经本发明提供的组织培养快繁方法得到的文冠果不定芽生长快且能保持亲本的优良性状；
3、本发明的文冠果组织培养快繁方法组培过程，操作简单，且培养周期短。
附图说明
图1为本发明的文冠果不定芽生长30天的示意图；
图2为本发明的文冠果不定芽生长31天的示意图；
图3为本发明的文冠果不定芽使用传统消毒方法感染细菌的示意图；
图4为本发明的文冠果不定芽使用传统消毒方法感染真菌的示意图。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明做进一步说明，所述原料及试剂若无特殊说明，均市售可得，作为优选，植物组培抗菌剂41009ES25购于上海翊圣生物科技有限公司；文冠果来源于内蒙古赤峰市阿鲁科尔沁旗；WPM培养基与完全MS培养基按照本领域公知的配方制备。
实施例1
1)不定芽诱导培养基的制备：以WPM培养基为基本培养基，向1LWPM培养基中添加2mL的植物组培抗菌剂，1mg6-BA和1mgNAA，混合均匀后,即得不定芽诱导培养基；
2)外植体的选取、灭菌：取长势较好的一年生文冠果根，所述的长势较好的文冠果根按以下标准选择：选择地上部分叶子较嫩的文冠果侧根，立即用自来水冲洗，然后在含有5g/L洗洁精的水中清洗干净，再用自来水冲洗3h；取2-3cm长的侧根部分，即为外植体；
3)外植体的消毒：将外植体使用75vt％酒精冲洗1分钟，无菌水冲洗3次，0.1wt％升汞冲洗10分钟，无菌水冲洗5次，消毒后将外植体放入添加了4vt％植物组培抗菌剂的完全MS培养基中，搅拌9h；
4)外植体的培养：将消毒后的外植体接种到不定芽诱导培养基中，在28-30℃，光照培养30天即可得到文冠果不定芽。
实施例2
1)不定芽诱导培养基的制备：以WPM培养基为基本培养基，向1LWPM培养基中添加0.5mL的植物组培抗菌剂，0.5mg6-BA和0.5mgNAA，混合均匀后,即得不定芽诱导培养基；
2)外植体的选取、灭菌：取长势较好的一年生文冠果根，所述的长势较好的文冠果根按以下标准选择：选择地上部分叶子较嫩的文冠果侧根，立即用自来水冲洗，然后在含有10g/L洗洁精的水中清洗干净，再用自来水冲洗3h；取2-3cm长的侧根部分，即为外植体；
3)外植体的消毒：将外植体使用60vt％酒精冲洗1分钟，无菌水冲洗3次，0.05wt％升汞冲洗10分钟，无菌水冲洗5次，消毒后将外植体放入添加了5vt％植物组培抗菌剂的完全MS培养基中，搅拌4h；
4)外植体的培养：将消毒后的外植体接种到不定芽诱导培养基中，在28-30℃，光照培养30天即可得到文冠果不定芽。
实施例3
1)不定芽诱导培养基的制备：以WPM培养基为基本培养基，向1LWPM培养基中1mL的植物组培抗菌剂，2mg6-BA和2mgNAA，混合均匀后,即得不定芽诱导培养基；
2)外植体的选取、灭菌：取长势较好的一年生文冠果根，所述的长势较好的文冠果根按以下标准选择：选择地上部分叶子较嫩的文冠果侧根，立即用自来水冲洗，然后在含有8g/L洗洁精的水中清洗干净，再用自来水冲洗3h；取2-3cm长的侧根部分，即为外植体；
3)外植体的消毒：将外植体使用80vt％酒精冲洗1分钟，无菌水冲洗3次，0.08wt％升汞冲洗10分钟，无菌水冲洗5次，消毒后将外植体放入添加了4.5vt％植物组培抗菌剂的完全MS培养基中，搅拌12h；
4)外植体的培养：将消毒后的外植体接种到不定芽诱导培养基中，在28-30℃，光照培养30天即可得到文冠果不定芽。
经本发明提供的以根为外植体的文冠果组织培养快繁方法，克服了根冠果根内部容易滋生细菌带来的消毒难以及不定芽培养难等问题，得到的不定芽长势良好，组培过程，操作简单，能够保持母本的优良特性；且培养周期短，传统培养周期35-40天，本发明提供的方法培养周期约为30天。
经本发明提供的消毒方法相对传统的消毒方法可使文冠果的染菌率由100％降低到71.6％，真菌的感染率由95.0％下降为13.0％。
从图1-2可观察到文冠果不定芽长势良好，无感染细菌和真菌；从图3-4可观察到文冠果按照传统消毒方法会感染细菌、真菌，无法继续培养。
上面结合附图1-4对本发明具体实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。
上述具体实施方式仅用于解释说明本发明的构思，而非对本发明权利保护的限定，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均落入本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种根为外植体的文冠果组织培养快繁方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)不定芽诱导培养基的制备：以WPM培养基为基本培养基，每升WPM培养基中添加0.5mL-2mL的植物组培抗菌剂，0.5mg-2.0mg的6-BA，0.5mg-2.0mg的NAA混合均匀后,即得不定芽诱导培养基；
2)外植体的选取、灭菌：取一年生文冠果根，清洗干净后，取侧根，即为外植体，将外植体消毒；
3)外植体的培养：将消毒后的外植体接种到不定芽诱导培养基中，在28-30℃，光照25-30天，进行文冠果不定芽的培养。
2.如权利要求1所述的根为外植体的文冠果组织培养快繁方法，其特征在于，所述的不定芽诱导培养基具体为：以WPM培养基为基本培养基，每升WPM培养基中添加2.0mL的植物组培抗菌剂，1.0mg的6-BA，1.0mg的NAA混合均匀后,即得不定芽诱导培养基。
3.如权利要求1所述的根为外植体的文冠果组织培养快繁方法，其特征在于，所述步骤2)清洗具体为：取一年生文冠果根，用自来水冲洗，然后在含有洗洁精的水中清洗干净，再用自来水冲洗3h。
4.如权利要求1所述的根为外植体的文冠果组织培养快繁方法，其特征在于，所述的消毒包括如下步骤：将外植体使用60-80vt％酒精冲洗1分钟，无菌水冲洗3次，0.05-0.1wt％升汞冲洗10分钟，无菌水冲洗5次，然后将外植体放入添加了4-5vt％植物组培抗菌剂的完全MS培养基中，搅拌4-12h。
5.如权利要求4所述的根为外植体的文冠果组织培养快繁方法，其特征在于，所述的消毒为：将外植体使用75vt％酒精冲洗1分钟，无菌水冲洗3次，0.1wt％升汞冲洗10分钟，无菌水冲洗5次，然后将外植体放入添加了4vt％植物组培抗菌剂的完全MS培养基中，搅拌9h。
6.一种根据权利要求1所述的根为外植体的文冠果组织培养快繁方法得到的文冠果不定芽。
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