CN105566466A - 一种互花米草耐盐蛋白hkt及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种互花米草耐盐蛋白HKT及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质的氨基酸序列如SEQ？ID？NO，1所示，或将SEQ？ID？NO，1序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的氨基酸序列。本发明的培育耐盐植物的方法具有操作简单、周期短的特点，适于推广应用。该方法将对植物耐盐分子机制的研究，植物耐盐品种的选育及植物耐盐性分子育种具有重要的理论及实际意义，为提高植物的耐盐性提供了一条经济、快速、有效的途径，本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。

Description

一种互花米草耐盐蛋白HKT及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种互花米草耐盐蛋白HKT，具体涉及一种互花米草耐盐蛋白HKT及其编码基因和应用，属于生物技术领域。

背景技术

自然界诸多环境因子如盐渍、重金属、干旱等都会限制或影响植物的正常生长发育，其中盐渍是影响最普遍的胁迫因子。盐渍胁迫可造成植物细胞脱水，膜系统损伤，膜上酶活性紊乱，各种代谢活动无序进行；还会使光合速率下降，呼吸速率发生变化，诱导糖类和蛋白质转变成可溶性化合物等。

互花米草(SpartinaalternifloraLoisel，)为禾本科米草属多年生草本植物，原产于北美大西洋沿岸，生长于海岸滩涂，可耐受周期性潮汐引起的全海水(约含3％NaCl)的淹没，是高度耐盐的泌盐盐生植物。互花米草的抗胁迫能力和繁殖能力较强，生长迅速，1979年从美国引入我国南方地区，在保滩护岸、加速淤积、控制污染等方面取得了一定的生态和经济效益。从互花米草中发掘、定位、克隆耐盐相关基因，将对探究植物耐盐机制具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种互花米草耐盐重要蛋白HKT及其编码基因和应用，该蛋白及其编码基因可以提高植物的耐盐性。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种互花米草耐盐蛋白HKT，来源于互花米草(SpartinaalternifloraLoisel，)，是如下(a)或(b)：

(a)序列如SEQIDNO，1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQIDNO，1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的由序列SEQIDNO，1衍生的蛋白质。

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明所述的蛋白HKT的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述的编码基因为(1)至(4)中任一所述的DNA分子：

1)序列如SEQIDNO，2所示的DNA分子；

2)如SEQIDNO，2所示序列中自5’末端第80至1756位核苷酸所示的DNA分子；

3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码植物耐盐相关蛋白的DNA分子；

4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码植物耐盐相关蛋白的DNA分子。

所述的严格条件为在0，1×SSPE或0，1×SSC和0，1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

本发明还要求保护含有上述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等；所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体为将所述基因插入植物表达载体Super1300的多克隆位点得到的重组质粒。

本发明还提供了所述编码基因或含有该基因的重组载体在培育耐盐转基因植物中的应用，具体为通过将所述的基因或重组载体导入目的植物中，得到耐盐性高于所述目的植物的转基因植物。

所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

同时，扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明所达到的有益效果是：一种互花米草耐盐蛋白HKT及其编码基因和应用，将对植物耐盐分子机制的研究，植物耐盐品种的选育及植物耐旱性分子育种具有重要的理论及实际意义，为提高植物的耐盐性提供了一条经济、快速、有效的途径，本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中第一次RACE后的琼脂糖凝胶电泳图，其中M：Marker2000；1：SaHKT3’-RACE产物；2：SaHKT5’-RACE产物。

图2为本发明中第二次RACE后的琼脂糖凝胶电泳图，其中M：Marker2000；1：SaHKT3’-RACE产物；2：SaHKT5’-RACE产物。

图3为本发明中盐胁迫处理下互花米草HKT8基因的表达差异。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：互花米草耐盐蛋白HKT及其编码基因的克隆与鉴定互花米草：公众可以从山东莱州海滨获得；参考文献：韩会玲，张侠，尹海波，陈世华，郭善利，盐胁迫和镉胁迫下互花米草生理特性的变化，江苏农业科学,2013，41(2)：361-363。

以互花米草为材料提取总RNA，反转录获得cDNA，以该DNA为模板，以3’-RACE引物、5’-RACE引物进行PCR扩增。

一、Bizol试剂法提取互花米草的总RNA

(1)称取不同处理的新鲜互花米草叶片约0.2g，在液氮中研磨成粉末状，将粉末转移到1.5ml的Eppendorf管中。

(2)预先在1.5ml的Eppendorf管中加入1ml的trizol，用力震荡15min。

(3)室温下静置5min。

(4)4℃，10000rpm离心10min。

(5)取上清，加200μl氯仿，混匀，室温下静置2～5min。

(6)4℃，10000rpm离心10min。

(7)取上清加入另一1.5ml的Eppendorf管中，加入500μl预冷的异丙醇，-20℃沉淀20min。

(8)4℃，12000rpm离心15min。

(9)弃上清，加1ml75％的乙醇，清洗沉淀。

(10)倒掉乙醇，4℃，12000rpm，离心1min。

(11)在超净工作台内用灭过菌的枪头将剩余液体吸干，同时在超净工作台内风吹5～10min。

(12)用不含RNase的DEPC水溶解RNA(加DEPC水量视沉淀多少而定)，轻弹管底溶解。

(13)用1.8％左右的琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA。

(14)在-20℃的冰箱中可暂时保存备用。

二、两步法反转录PCR利用Promega试剂盒进行反转录，按照说明书配置反转录的反应体系，如下：

互花米草总RNA(1μg)2μl

OligodT1μl

RNaseFreeH2O(DEPC水)7μl

充分混匀后，在PCR仪上72℃变性3min，取出放冰上，然后在每管中依次加入如下试剂：

充分混匀后，在PCR仪上42℃反应90min，结束后，将反应产物稀释4倍，-20℃保存。

三、克隆互花米草HKT8基因所用的引物序列

5’-RACE引物

SaHKT8-52：5'-AGTTTTCCGGAGTCGCTCCAC-3'

SaHKT8-51：5'-CTAACTAAGCTTCCAGGCTTTGCC-3'

3’-RACE引物

SaHKT8-31：5'-AAGGTCGTGAACGCGGTGTTC-3'

SaHKT8-32：5'-GAGAGCCAGGGAATCAGATTGC-3'

四、PCR反应体系

按以下组成成分配制25μl的PCR反应体系，如下：

混合均匀后，进行PCR反应，反应条件为：94℃5min预变性；94℃30sec变性，58℃30sec退火，68℃45sec延伸，30～35个循环；68℃10min充分延伸；最后4℃保温。反应结束后取出产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

五、RACE结果

将提取的高质量的RNA用反转录试剂盒反转录后得到cDNA模板，分别进行3’和5’-RACE，第一次RACE后的电泳结果如图1，可以看到有弥散现象，条带不清晰。然后用第一次的产物做模板进行第二次RACE，结果如图2，可以看到清晰的单一条带。

如图1和图2所示，把该产物送到测序公司进行测序，并将3’和5’RACE的测序结果拼接，即可得到芦苇和互花米草HKT8基因的完整序列。

实施例2

互花米草种子萌发后播种，室温下(约25℃)培养14天左右，然后选取生活力强且长势均一的幼苗移栽到装有培养基的小方盆中，培养基成分为营养土:蛭石:珍珠岩＝1:1:1，于温室中培养，温度为25℃，光照时间10～12h/d。待到幼苗长至4～5片真叶时，选择生活力强且大小均一的植株移栽到装有培养基的小盆中，每盆5株，继续培养，至株高约20cm时处理使用。采用600mmol/LNaCl溶液进行处理，处理时间分别为：0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h。每个处理重复三次。

Real-timePCR所使用的引物

总RNA提取和反转录同上。

按以下成分配制实时荧光定量PCR反应体系，如下:

PCR反应条件:预变性94℃，5min；变性94℃，10s；退火58℃，10s，延伸72℃，20s，循环次数40cycles；溶解曲线为:from72℃to95℃。在QiageneRotorGeneQ仪上对不同胁迫处理的互花米草材料进行HKT基因的实时荧光定量检测。

如图3所示：随着盐胁迫处理时间的延长，互花米草HKT8基因的相对表达量基本呈现出先升高后下降的趋势，最高表达量则出现在处理后的24h。

需要说明的是，本发明为一种互花米草耐盐蛋白HKT及其编码基因和应用，将对植物耐盐分子机制的研究，植物耐盐品种的选育及植物耐旱性分子育种具有重要的理论及实际意义，为提高植物的耐盐性提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种互花米草耐盐蛋白HKT，其特征在于：如下(a)或(b)：

(a)序列如SEQIDNO，1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQIDNO，1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的由序列SEQIDNO，1衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述互花米草耐盐蛋白HKT的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述的编码基因为(1)至(4)中任一所述的DNA分子：

1)序列如SEQIDNO，2所示的DNA分子；

2)如SEQIDNO，2所示序列中自5’末端第80至1756位核苷酸所示的DNA分子；

3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码植物耐盐相关蛋白的DNA分子；

4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码植物耐盐相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体具体为将权利要求2或3所述基因插入植物表达载体Super1300的多克隆位点得到的重组质粒。

6.权利要求2或5所述的基因或重组载体在培育耐盐转基因植物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：通过将所述的基因或重组载体导入目的植物中，得到耐盐性高于所述目的植物的转基因植物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。