CN105560438B - 一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法，包括如下步骤：步骤1、枣花蜜水溶液的制备；步骤2、初步纯化；步骤3、粗提物的萃取处理；步骤4、硅胶柱层析纯化。本发明通过选用大孔吸附树脂XAD‑2作为提取枣花蜜中酚类物质的吸附剂，以乙酸乙酯作为粗提液的萃取剂，同时以硅胶ZCX‑2作为分离纯化酚类化合物的吸附剂，以不同比例的二氯甲烷和甲醇混合液作为洗脱剂，确定出了从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的最佳方案，本发明能够有效的从枣花蜜中分离出高纯度的酚类化合物，分离出的三种物质的纯度可分别达到82.3％、67.7％和92.7％。
Description
技术领域
本发明涉及一种酚类化合物的提取、纯化方法，具体涉及一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法。
背景技术
枣树具有丰富的花蜜，深受蜜蜂喜爱。枣花蜜是由蜜蜂采集枣树花儿生产的蜂蜜。枣花蜜有一种特殊的味道，具有良好的口感和甜味。枣花蜜中的酚类化合物主要来自枣花儿的花蜜和花粉，是一类含有氧杂环的有机化合物，包括单体和多聚体酚类化合物。酚类化合物主要包括酚酸、黄酮及其衍生物，是作为抗氧化活性的评价指标之一。
酚类化合物的生物活性主要表现为具有DPPH抗氧化活性，三价铁离子的还原能力，对DNA损伤的保护作用。研究表明蜂蜜的抗氧化性能主要是由于酚类化合物的作用，酚类化合物可以生成活性氧(如超氧阴离子(O)、过氧化氢(H2O2)和羟基自由基(OHC)等)，可以清除DPPH自由基，有显著的抑制血清脂蛋白氧化，增加细胞膜的通透性、提高抗氧化血浆和血清的活性和降低酒精中毒作用。
枣花蜜是我国最宝贵的市场蜂蜜的类型，深受消费者喜爱和赞赏。我国的枣花蜜主要产于陕西、山西和河南等省份，它符合欧盟的质量标准，在欧洲市场非常受欢迎。由于枣花蜜的发展和市场的需要，我国对于枣花蜜的研究日益深入，最近几年更是成为研究的热点。
目前，我国枣花蜜的研究主要集中在对枣花蜜理化和生理等方面的研究。程妮等人研究和比较了中国不同地区的枣花蜜样品的的理化性质、酚酸、总酚酸含量和其抗氧化性。安萨里等人研究了枣花蜜的抗真菌特性。而在对枣花蜜中酚类化合物的提取方法缺乏系统的研究，这成为制约枣花蜜中酚类化合物应用开发的瓶颈。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法，包括如下步骤：
步骤1、枣花蜜水溶液的制备：向枣花蜜中加入1-10倍体积蒸馏水，搅拌均匀；
步骤2、初步纯化：大孔吸附树脂湿法装柱，加入步骤1制备得到的枣花蜜水溶液，然后依次用酸水、蒸馏水、无水甲醇进行洗脱，洗脱流速均为0.7ml/min，收集无水甲醇的洗脱溶液，旋转蒸干，即得粗提物；
步骤3、粗提物的萃取处理：将得到的酚类化合物的粗提物用蒸馏水溶解，然后用1倍体积的乙酸乙酯进行充分萃取，收集萃取相液体，旋转蒸干，收集所得干物质，即得乙酸乙酯萃取相的酚类物质；
步骤4、硅胶柱层析纯化：将所得乙酸乙酯萃取相的酚类物质上样，再分别用不同比例的二氯甲烷和甲醇混合液作为洗脱剂进行洗脱，流速为0.6ml/min，收集洗脱液，得纯化液，将纯化液旋转蒸干，得到纯化后的枣花蜜酚类化合物。
本发明的特点还在于，在步骤1中，向枣花蜜中加入蒸馏水时，枣花蜜与蒸馏水的体积比为1∶6。
本发明的特点还在于，在步骤4中，洗脱分三步进行，依次用体积比为25∶1、15∶1和13∶1的二氯甲烷和甲醇混合液作为洗脱剂进行洗脱。
本发明的特点还在于，在步骤4中，收集洗脱液时，对三次洗脱得到的洗脱液分别进行收集，并分别旋转蒸干。
本发明的特点还在于，步骤2的大孔吸附树脂为XAD-2型。
本发明的特点还在于，步骤4中，硅胶柱层析纯化所用的柱层析硅胶为ZCX-2型。
本发明的特点还在于，步骤2-4中旋转蒸干利用旋转式蒸发器进行。
本发明的特点还在于，步骤2中，酸水洗脱所用酸水为盐酸，pH＝2。
本发明的特点还在于，步骤3中，酚类化合物的粗提物按照质量体积比1∶5～20溶解在蒸馏水中。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法，通过选用大孔吸附树脂XAD-2作为提取枣花蜜中酚类物质的吸附剂，以乙酸乙酯作为粗提液的萃取剂，同时以硅胶ZCX-2作为分离纯化酚类化合物的吸附剂，以不同比例的二氯甲烷和甲醇混合液作为洗脱剂，确定出了从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的最佳方案，为充分开发枣花蜜中酚类化合物提供了理论基础，为我国蜂蜜行业的发展和酚类化合物分离的研究做出贡献。本发明能够有效的从枣花蜜中分离出高纯度的酚类化合物，分离出的三种物质的纯度可分别达到82.3％、67.7％和92.7％。
附图说明
图1为本发明实施例一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法的流程图；
图2为本发明实施例经初步纯化所得粗提物的高效液相色谱图；
图3为本发明实施例中利用不同萃取相和水相的定容液所得的高效液相色谱图；
图4为本发明实施例分离纯化得到的3种酚类化合物的高效液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1示出了本发明实施例提供的一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法的实现流程。如图1所示，本发明实施例给出的一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法，具体按照如下步骤进行：
步骤S101、枣花蜜水溶液的制备：向枣花蜜中加入1-10倍体积蒸馏水，优选的，枣花蜜与蒸馏水按照体积比1∶6搅拌均匀；
步骤S102、初步纯化：大孔吸附树脂湿法装柱，大孔吸附树脂为XAD-2型，加入步骤S101制备得到的枣花蜜水溶液，然后依次用酸水、蒸馏水、无水甲醇进行洗脱，洗脱流速均为0.7ml/min，收集无水甲醇的洗脱溶液，利用旋转式蒸发器于40℃旋转蒸干，即得粗提物；其中的酸水洗脱所用酸水为盐酸，pH＝2；在此步骤中，枣花蜜水溶液利用酸水进行洗脱，枣花蜜中的酚类化合物经酸水洗涤后仍然留在层析柱内，而糖和其他极性化合物则被洗脱掉，这使得酚类物质的吸附率非常高。
步骤S103、粗提物的萃取处理：将得到的酚类化合物的粗提物用蒸馏水溶解，然后用1倍体积的乙酸乙酯进行充分萃取，收集萃取相液体，利用旋转式蒸发器于40℃旋转蒸干，收集所得干物质，即得乙酸乙酯萃取相的酚类物质；在本实施例中，酚类化合物的粗提物可按照质量体积比1∶5～20溶解在蒸馏水中。
步骤S104、硅胶柱层析纯化：将所得乙酸乙酯萃取相的酚类物质上样，硅胶柱层析纯化所用柱层析硅胶为ZCX-2型，洗脱分三步进行，依次用体积比为25∶1、15∶1和13∶1的二氯甲烷和甲醇混合液作为洗脱剂进行洗脱，流速为0.6ml/min，对不同比例的洗脱剂洗脱得到的洗脱液分别进行收集，得到纯化液，然后将所得纯化液分别利用旋转式蒸发器于40℃旋转蒸干，得到纯化后的三种枣花蜜酚类化合物。
本发明选择大孔吸附树脂做吸附剂，主要是依靠大孔吸附树脂和吸附质的分子之间的范德华引力，通过树脂的比表面进行物理吸附。通过试验发现，大孔吸附树脂XAD-2对枣花蜜中的酚类化合物的吸附效果最好，而对其他物质的吸附作用较弱。根据吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱，可以将酚类化合物从枣花蜜中分离开，从而达到分离、纯化的目的。
将步骤S102收集到的粗提物称取一定量后用色谱纯甲醇溶解，超声波洗脱干净后定容，采用高效液相色谱法(HPLC-ECD)进行分析后的结果如图2所示。枣花蜜中酚类化合物的提取、纯化，受萃取剂种类、洗脱剂的极性影响较大。在进行本发明最佳方案的确定试验时，在进行步骤S103时，除了使用乙酸乙酯作为萃取剂进行萃取外，还分别使用了石油醚、正丁醇作为萃取剂进行萃取进行比较，并将每个萃取相和水相的定容液采用高效液相色谱仪进行分析，所得结果如图3所示，其中图3的a-d分别为石油醚样色谱图、乙酸乙酯样色谱图、正丁醇样色谱图、水样色谱图。通过对所得的色谱图分别与图2进行比较，可以看出，需要提取的酚类化合物主要存在于乙酸乙酯的萃取相中，无论是物质种类还是物质含量都较多，所以确定本发明以乙酸乙酯作为萃取剂进行步骤S103的萃取，并只需要将乙酸乙酯的萃取相中的物质进行柱层析分离和高效液相色谱分析就可以了。而其他萃取相的物质种类和含量都较少，没有进行柱层析分离和高效液相色谱分析的必要。
在本发明实施例方法的步骤S104中，采用了不同比例组成的二氯甲烷和甲醇混合液作为洗脱剂，为了确定方法步骤4中所用洗脱剂中二氯甲烷和甲醇的比例，进行实验。该实验的原理主要利用具有酚羟基的黄酮类物质在经过1％的三氯化铝溶液喷淋后会发生显色反应，在紫外灯下观察斑点的颜色会发生变化。
首先准备试验所需不同比例的二氯甲烷和甲醇混合液，二氯甲烷和甲醇的体积比分别是40∶1、25∶1、16∶1、15∶1、14∶1、13∶1、9∶1、6∶1、3∶1，将步骤S103利用乙酸乙酯萃取所得的干物质(即乙酸乙酯萃取相的酚类物质)称取一定量后用色谱纯甲醇溶解、定容，得到乙酸乙酯萃取相的定容液，然后将此乙酸乙酯萃取相的定容液取出少许作为试样，采用薄层层析法将点有萃取相试样的层析板放入上述不同比例的二氯甲烷和甲醇混合液中展开，用铅笔记录液体上层边缘，自然风干后用1％的三氯化铝溶液进行喷洒染色，再经自然风干后采用暗箱式自动紫外分析仪进行观察，记录试样的位置。然后采用公式(1)计算确定洗脱剂的比例。
其中，L：表示物质的总位移；Li：表示物质i的位移；：表示物质i的洗脱比例。
按照上述方法，对于不同配比的二氯甲烷和无水甲醇混合液可以分别得到紫外下的薄层层析板图，根据薄层层析板的效果来确定柱层析时洗脱剂的比例为13∶1、25∶1和15∶1。从而有利于酚类物质中不同成分的分离。
酚类化合物最有用的分析技术是高效液相色谱法。本发明试验利用高效液相色谱法(HPLC-ECD)，通过电化学检测器对分离的提取物进行分析，以色谱图中的波峰作为判断提取物中的单个物质是否被分离开纯化的依据。将本发明实施例三次收集得到的分离物，用色谱纯甲醇溶解，超声波洗脱干净后定容至2ml，然后用高效液相色谱法(HPLC-ECD)进行分析鉴定。图4为3种酚类化合物分离纯化的色谱图，其中图4的a、b、c分别表示洗脱剂比例为13∶1、25∶1和15∶1下洗脱得到的酚类化合物a、b、c的色谱图。表1为三种分离纯化的物质的色谱图参数。
表1分离物的色谱图参数
其中，Si：表示物质i的峰面积；∑S：表示物质的总峰面积；Ri：表示物质i的纯度。
由图4可以看出，根据公式2计算的三种物质的纯度依次为82.3％、67.7％和92.7％；图4中c所示的物质c纯度相对较高，达到了92.7％，实验结果较好。这三种物质分别是使用洗脱剂在二氯甲烷和无水甲醇的比例为13∶1、25∶1和15∶1时收集到的。结果表明，二氯甲烷和无水甲醇当比例在13∶1、25∶1和15∶1下的洗脱剂极性与酚类化合物中分离纯化出的三种物质的极性相近，所以才会在这三种比例下分离出来了三种物质。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、枣花蜜水溶液的制备：向枣花蜜中加入1-10倍体积蒸馏水，搅拌均匀；
步骤2、初步纯化：大孔吸附树脂湿法装柱，加入步骤1制备得到的枣花蜜水溶液，然后依次用酸水、蒸馏水、无水甲醇进行洗脱，洗脱流速均为0.7ml/min，收集无水甲醇的洗脱溶液，旋转蒸干，即得粗提物；
步骤3、粗提物的萃取处理：将得到的酚类化合物的粗提物用蒸馏水溶解，然后用1倍体积的乙酸乙酯进行充分萃取，收集萃取相液体，旋转蒸干，收集所得干物质，即得乙酸乙酯萃取相的酚类物质；
步骤4、硅胶柱层析纯化：将所得乙酸乙酯萃取相的酚类物质上样，再分别用不同比例的二氯甲烷和甲醇混合液作为洗脱剂进行洗脱，流速为0.6ml/min，收集洗脱液，得纯化液，将纯化液旋转蒸干，得到纯化后的枣花蜜酚类化合物；洗脱分三步进行，依次用体积比为25∶1、15∶1和13∶1的二氯甲烷和甲醇混合液作为洗脱剂进行洗脱。
2.根据权利要求1所述的一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法，其特征在于，在步骤1中，向枣花蜜中加入蒸馏水时，枣花蜜与蒸馏水的体积比为1∶6。
3.根据权利要求2所述的一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法，其特征在于，在步骤4中，收集洗脱液时，对三次洗脱得到的洗脱液分别进行收集，并分别旋转蒸干。
4.根据权利要求1所述的一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法，其特征在于，所述步骤2的大孔吸附树脂为XAD-2型。
5.根据权利要求1所述的一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法，其特征在于，所述步骤4中，硅胶柱层析纯化所用的柱层析硅胶为ZCX-2型。
6.根据权利要求1所述的一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法，其特征在于，所述步骤2-4中旋转蒸干利用旋转式蒸发器进行。
7.根据权利要求1所述的一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法，其特征在于，所述步骤2中，酸水洗脱所用酸水为盐酸，pH＝2。
8.根据权利要求1所述的一种从枣花蜜中提取、纯化酚类化合物的方法，其特征在于，所述步骤3中，酚类化合物的粗提物按照质量体积比1∶5～20溶解在蒸馏水中。
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