CN105560226A - 含葛根素的药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明含葛根素的药物组合物及其应用，涉及药物组合物，是由以葛根素为活性成分，辅以药学上可接受的载体组成，所述药学上可接受的载体为淀粉、糖粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、甘露醇或其中2～6种的混合物，所述活性成分的葛根素与辅以药学上可接受的载体的质量比为1∶0.5～1.5；该药物组合物是一种用于治疗TMEM16A/CaCCs离子通道相关疾病的药物，在治疗高血压方面效果显著。

Description

含葛根素的药物组合物及其应用
技术领域
本发明的技术方案涉及药物组合物，具体地说是含葛根素的药物组合物及其应用。
背景技术
高血压病是指病因尚未明确，以体循环动脉血压高于正常范围为主要临床表现的一种独立疾病，发病主要原因与高级神经活动障碍有关。高血压病的早期症状为头晕、头痛、心悸、失眠、紧张烦躁、疲乏等，以后可逐渐累及心、脑、肾器官，严重时可并发高血压性心脏病、肾功能衰竭、脑血管意外等病变。高血压病是当今世界引人瞩目的流行病之一，而且越是工业发达的国家患病率越高。我国的高血压患病率已由解放初期的6％上升到10％左右。因此，积极研发治疗高血压的特效药物已成为一个迫在眉睫的问题。
最近有文献报道，钙激活氯通道TMEM16A的过表达是导致高血压发病的主要原因之一，通过降低钙激活氯通道TMEM16A的表达，可以有效地治疗高血压(ZhangXH,ZhengB,YangZ,etal.TMEM16AandMyocardinFormaPositiveFeedbackLoopThatIsDisruptedbyKLF5DuringAngII-InducedVascularRemodeling.[J].Hypertension,2015)。TMEM16A是血管平滑肌上一个重要的离子通道，研究表明在人的主动脉平滑肌细胞中，心肌素可以通过与血清效应因子形成复合物从而促进TMEM16A的表达，而通过抑制TMEM16A的表达可以有效减少心肌素和血清效应因子的分泌，从而对高血压起到调控作用。对于我国中医医药界来说，查找和研发能够治疗高血压的特效中草药是义不容辞的紧迫任务。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供含葛根素的药物组合物及其应用，是一种用于治疗TMEM16A/CaCCs离子通道相关疾病的药物，在治疗高血压方面效果显著。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：含葛根素的药物组合物，是由以葛根素为活性成分，辅以药学上可接受的载体组成。
上述含葛根素的药物组合物，所述药学上可接受的载体为淀粉、糖粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、甘露醇或其中2～6种的混合物，所述活性成分的葛根素与辅以药学上可接受的载体的质量比为1∶0.5～1.5。
上述含葛根素的药物组合物，所述药物组合物的组成方式为口服型给药。
上述含葛根素的药物组合物，所述药物组合物的组成方式为口服型给药的剂型为散剂、颗粒、胶囊、片剂、滴丸或口服液。
上述含葛根素的药物组合物，所述药物组合物的组成方式为非口服型给药。
上述含葛根素的药物组合物，所述药物组合物的组成方式为非口服型给药的剂型为注射剂。
上述含葛根素的药物组合物，其中葛根素购自阿拉丁试剂有限公司，CAS号：3681-99-0，其他所涉及的成分原料均可通过公知途径获得，所述药物组合物的口服型给药和所述药物组合物的非口服型给药的配制方法均使用药学上公知的可接受的形式，其配制方法是本领域的技术人员所能掌握的。
上述含葛根素的药物组合物的应用，作为TMEM16A离子通道抑制剂，用于治疗TMEM16A/CaCCs离子通道相关疾病。
上述含葛根素的药物组合物的应用，所述用于治疗TMEM16A/CaCCs离子通道相关疾病是用于治疗人的高血压疾病。
上述含葛根素的药物组合物的应用，作为TMEM16A离子通道抑制剂是上述含葛根素的药物组合物中的任意一种剂型。
上述含葛根素的药物组合物的应用，所涉及的治疗操作方法是本技术领域的技术人员所能掌握的。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明突出的实质性特点如下：
(1)中草药是中华五千年的瑰宝，其优点甚多。发明人在大量中药典籍中查找能够治疗高血压的中草药,经过大量查阅和仔细分析，发现中药葛根素在调节血压方面效果显著。葛根素是从豆科植物野葛根中提取的一种单一成份，属黄酮苷类化合物。纯净的葛根素是一种白色针状结晶粉末，属于黄酮类，具有活血化瘀、改善微循环、扩张冠状动脉和脑血管、降低心肌耗氧量等作用，对人体副作用小。《中药大辞典》第二版3208页，“葛根素腹腔注射降低大鼠慢性低O2高CO2性肺动脉高压，改善肺血管重建”。
(2)近年来，钙激活氯离子通道TMEM16A通道电流的抑制剂相继被发现，比如CaCCinh-A01，T16Ainh-A01，DIDS，NPPB等，但钙激活氯通道TMEM16A电流的抑制剂基本都是化学合成药物，目前在天然产物小分子药物方面的探索很少，而这些化学合成药物对细胞伤害较大，在高浓度下细胞存活时间较短，对于后期药物研发是一个非常严重的问题，因此开发对细胞伤害较小的天然产物小分子药物具有重要意义。
试验证明，通过本发明的含葛根素的药物组合物与细胞浴液的混合液体对钙激活氯通道TMEM16A的外向电流抑制率达90％，半数有效抑制浓度在100μM以内。这为研制高血压的有效治疗药物打开了一扇大门。
与现有技术相比，本发明的显著进步如下：
(1)本发明的含葛根素的药物组合物能明显抑制TMEM16A通道，抑制率可达到90％，为高血压方面的疾病治疗提供了潜在的应用前景。
(2)本发明的含葛根素的药物组合物对TMEM16A通道的抑制效率与目前所发现的其它抑制剂相比更高，其半数抑制浓度在100μM以内。
(3)葛根素一种是一种天然化合物，是从豆科植物野葛根中提取的一种单一成份黄酮苷，属于常见中草药，来源丰富，提取简单，经济实用。
(4)本发明的含葛根素的药物组合物配置方法简单，成本低廉。
(5)本发明的含葛根素的药物组合物的应用方法简单，容易操作。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为实施例13中，通过激光共聚焦扫描显微镜观察到的转染钙激活氯通道TMEM16A的CHO细胞的荧光效果对比图，其中：
图1A与图1C为不同视野下，未加入Ca2+和葛根素时，转染钙激活氯通道TMEM16A和YFP的CHO细胞荧光图；
图1B为在与图1A相同视野下加入1μMCa2+后，转染钙激活氯通道TMEM16A和YFP的CHO细胞荧光图；
图1D为在1C相同视野下加入100μM葛根素后的转染钙激活氯通道TMEM16A和YFP的CHO细胞再加入1μMCa2+后的荧光图；
图2为实施例14中，转染钙激活氯通道TMEM16A的CHO细胞被1μMCa2+激活后，灌流葛根素的电流变化图；
图3为实施例14中，在加入葛根素前后，转染钙激活氯通道TMEM16A的CHO细胞的电流变化典型电流图，其中：
图3A为未灌流葛根素的转染钙激活氯通道TMEM16A的CHO细胞被1μMCa2+激活的典型电流图；
图3B为转染钙激活氯通道TMEM16A的CHO细胞被1μMCa2+激活，再灌流葛根素后的典型电流图；
图4为实施例14中，在转染钙激活氯通道TMEM16A的CHO细胞被1μMCa2+激活后，用含100μM葛根素的浴液灌流并连续记录电流变化的电流随时间变化图，以及用不含葛根素的浴液冲洗后电流随时间变化图；
图5为葛根素分子结构图。
具体实施方式
图5所示实施例显示本发明所用葛根素分子的结构图。
实施例1
本实施例的含葛根素的药物组合物，以葛根素为活性成分，辅以淀粉载体，葛根素与淀粉载体的质量比为1:0.5，其配制方法使用药学上可接受的形式，本实施例的含葛根素的药物组合物的组成方式为口服型给药的散剂。
实施例2
本实施例的含葛根素的药物组合物，以葛根素为活性成分，辅以糖粉载体，葛根素与糖粉载体的质量比为1:0.5，其配制方法使用药学上可接受的形式，本实施例的含葛根素的药物组合物的组成方式为口服型给药的颗粒。
实施例3
本实施例的含葛根素的药物组合物，以葛根素为活性成分，辅以糊精载体，葛根素与糊精载体的质量比为1:1，其配制方法使用药学上可接受的形式，本实施例的含葛根素的药物组合物的组成方式为口服型给药的胶囊。
实施例4
本实施例的含葛根素的药物组合物，以葛根素为活性成分，辅以乳糖载体，葛根素与乳糖载体的质量比为1:1.5，其配制方法使用药学上可接受的形式，本实施例的含葛根素的药物组合物的组成方式为口服型给药的片剂。
实施例5
本实施例的含葛根素的药物组合物，以葛根素为活性成分，辅以微晶纤维素载体，葛根素与微晶纤维素载体的质量比为1:1，其配制方法使用药学上可接受的形式，本实施例的含葛根素的药物组合物的组成方式为口服型给药的滴丸。
实施例6
本实施例的含葛根素的药物组合物，以葛根素为活性成分，辅以甘露醇载体，葛根素与甘露醇载体的质量比为1:1.5，其配制方法使用药学上可接受的形式，本实施例的含葛根素的药物组合物的组成方式为非口服型给药的注射剂。
实施例7
本实施例的含葛根素的药物组合物，以葛根素为活性成分，辅以任意比例的淀粉加糖粉载体，葛根素与任意比例的淀粉加糖粉的质量比为1:1，其配制方法使用药学上可接受的形式，本实施例的含葛根素的药物组合物的组成方式为口服型给药的散剂。
实施例8
本实施例的含葛根素的药物组合物，以葛根素为活性成分，辅以任意比例的糊精加乳糖加微晶纤维素的载体，葛根素与任意比例的糊精加乳糖加微晶纤维素的质量比为1:1.5，其配制方法使用药学上可接受的形式，本实施例的含葛根素的药物组合物的组成方式为口服型给药的散剂。
实施例9
本实施例的含葛根素的药物组合物，以葛根素为活性成分，辅以任意比例的糊精加乳糖加微晶纤维素加甘露醇的载体，葛根素与任意比例糊精加乳糖加微晶纤维素加甘露醇的质量比为1:1.5，其配制方法使用药学上可接受的形式，本实施例的含葛根素的药物组合物的组成方式为口服型给药的散剂。
实施例10
本实施例的含葛根素的药物组合物，以葛根素为活性成分，辅以任意比例的糊精加乳糖加微晶纤维素加甘露醇加糖粉载体，葛根素与任意比例的糊精加乳糖加微晶纤维素加甘露醇加糖粉的质量比为1∶1，其配制方法使用药学上可接受的形式，本实施例的含葛根素的药物组合物的组成方式为口服型给药的散剂。
实施例11
本实施例的含葛根素的药物组合物，以葛根素为活性成分，辅以任意比例的糊精加乳糖加微晶纤维素加甘露醇加糖粉加淀粉载体，葛根素与任意比例糊糊精加乳糖加微晶纤维素加甘露醇加糖粉加淀粉的质量比为1:0.5，其配制方法使用药学上可接受的形式，本实施例的含葛根素的药物组合物的组成方式为口服型给药的散剂。
实施例12
取蒸馏水500mL，加入聚山梨酯-80制成溶液，再加入葛根素100g，边加热边搅拌使之溶解成含葛根素的溶液，另外将糖粉50g加入公知标准用量的防腐剂并溶于蒸馏水100mL中，制得糖粉溶液，再将该糖粉溶液在搅拌下加入上述含葛根素的溶液中，加蒸馏水至1000mL，混匀，过滤，分装成200支，灭菌，制得本实施例的含葛根素的药物组合物的口服液。
在以下含葛根素的药物组合物的应用的实施例中，所选用的含葛根素的药物组合物为上述实施例1至实施例12中的任意一种含葛根素的药物组合物。
实施例13
将上述实施例1至实施例12中的任意一种含葛根素的药物组合物作为TMEM16A离子通道的一种抑制剂,用于在碘离子黄色荧光蛋白(YFP)荧光淬灭法中，结果使转染有TMEM16A的细胞荧光不会因加入Ca2+而淬灭。
黄色荧光蛋白(YFP)是一种来源于绿色荧光蛋白(GFP)的荧光蛋白，可在波长515nm下被激发发出黄色荧光。碘离子可以与YFP结合使荧光淬灭，而突变YFP的两个位点H148Q和I152L可以使YFP对碘离子的敏感性增强。CaCCs通道不仅是一种氯通道，其对包括碘离子在内的大部分阴离子都有通透作用。本实施例的药物筛选试验用脂质体的方法将外源的双突变YFP基因导入CHO细胞中，使YFP在胞内大量表达；再将备选药物与细胞孵育使其与通道充分作用；最后观察加入含有碘离子的溶液以后YFP荧光的淬灭程度。此种方法中，灌流后使钙离子不能引起YFP淬灭的药物可以被认为是CaCCs通道的抑制剂，该结果与膜片钳实验结果相互印证。
实验前一天在激光共聚焦显微镜专用培养皿中培养稳定转染YFP的CHO细胞；第二天将转染YFP并培养过夜的CHO细胞用D-PBS冲洗3次，最后留下500μl的D-PBS；加入含有150mMI-的溶液500μl，使I-浓度达到75mM；加入100μM葛根素孵育10min，即实施例1至实施例12中的任意一种含葛根素的药物组合物贮液使其终浓度达到100μM，随后加入1μMCa2+浴液，用激光共聚焦显微镜实时记录荧光强度。
图1A与图1C显示，本实施例中未加入葛根素及Ca2+时细胞内黄色荧光蛋白荧光强度的代表性实验结果图。该两幅图表明未加入葛根素及Ca2+时细胞内黄色荧光蛋白的荧光强度，每个细胞内部均为强烈的黄色荧光。如该两幅图显示，未加入葛根素及Ca2+时YFP的荧光强度很高。
图1B显示，本实施例中在1A相同视野下加入1μΜCa2+后细胞内黄色荧光蛋白荧光强度的代表性实验结果图。该图表明加入1μΜCa2+后细胞内黄色荧光蛋白的荧光强度，由于1μΜCa2+激活了TMEM16A离子通道，从该离子通道进入的碘离子使得胞内的黄色荧光蛋白发生荧光淬灭,即在加入I-以后，YFP荧光明显淬灭，5min以后荧光几乎完全消失。
图1D显示，本实施例中在1C相同视野下加入100μΜ葛根素孵育10分钟，随后加入1μΜCa2+后细胞内黄色荧光蛋白荧光强度的代表性实验结果图。该图表明加入100μΜ葛根素可以抑制钙激活氯通道TMEM16A的开放，使得1μΜCa2+并不能激活TMEM16A离子通道，因此即使在加入I-以后，YFP荧光强度无显著变化。
实施例14
将上述实施例1至实施例12中的任意一种含葛根素的药物组合物作为TMEM16A离子通道的一种抑制剂，用于使转染有TMEM16A离子通道的CHO细胞电流得到抑制：
将表达质粒pEGFP-N1-TMEM16A转入哺乳动物细胞CHO中，在细胞转染后24-72h之内，进行电生理检测，具体方法如下：
CHO细胞用含有10％胎牛血清的F12K培养液传代培养,其中加入100UI/ml的青霉素和100μg/ml链霉素。转染过程用Lipofectamine2000(Invitrogen公司)脂质体进行。细胞于37℃,5％CO2饱和湿度培养箱中培养至对数生长期用于实验。电生理检测在22℃的室温下进行，采用全细胞(即WholeCell)记录模式(EPC-10Amplifier，HEKA公司，德国)，所用药物的内液成分为：CsCl130mM、MgCl2·6H2O1mM、HEPES10mM、EGTA10mM和MgATP1mM，用CsOH调至pH7.3；所用药物的外液成分为：NaCl150mM、MgCl2·6H2O1mM、CaCl21mM,HEPES10mM、甘露醇10mM和葡萄糖10mM，用NaOH调至pH7.4；将实施例1至实施例12中的任意一种含葛根素的药物组合物加入到所用药物的外液使其终浓度达到100μM；用10mMEGTA无钙溶液做阴性对照，并与1μM游离钙条件下的电流作比较。通过电压去极化激活膜电流，操作条件是：膜去极化电压从-100mV连续变化至+100mV，维持电压为0mV。检测结果如下：
图2显示了本实施例中电流首先被电极内液中1μΜCa2+激活，随后用含100μM葛根素的浴液灌流并连续记录电流变化的代表性实验结果图，横坐标为时间，纵坐标为电流大小。该图表明，被电极内液中1μΜCa2+激活的电流,其为TMEM16A离子通道被激活时的典型电流，稳态电流大小约为2.1nA，其电流可以被含100μM葛根素的浴液有效抑制至350pA，因此证明葛根素是一种有效的钙激活氯通道TMEM16A抑制剂。
图3A显示了本实施例中电极内液中含1μMCa2+时的激活电流的代表性实验结果图，该图表明，电极内液中含1μMCa2+时的激活电流，其为TMEM16A离子通道被激活时的典型电流，稳态电流大小约为1.7nA。
图3B显示了本实施例中电流被电极内液中含1μMCa2+的激活，随后用含100μM葛根素的浴液灌流，并在其达到稳定后记录到的典型电流图，其电流大小可被抑制至180pA,因此证明葛根素是一种有效的钙激活氯通道TMEM16A抑制剂。
图4显示了本实施例中电流首先被电极内液中1μΜCa2+激活，随后用含100μM葛根素的浴液灌流并连续记录电流变化的电流随时间变化图，横坐标为时间，纵坐标为电流大小。实验结果表明TMEM16A电流可以有效的被葛根素抑制，随后用不含葛根素的浴液冲洗，电流可以恢复到较高水平，因此表明葛根素可有效抑制TMEM16A通道电流。
实施例15
将上述实施例1至实施例12中的任意一种含葛根素的药物组合物作为TMEM16A离子通道的一种抑制剂,用于治疗人的高血压疾病，该药物组合物的临床试验如下：
病例选择：高血压患者52例，临床表现以血压较高、头痛、头晕、注意力不集中、肢体麻木、呕吐、心悸、眩晕等症状，严重时会发生神志不清、抽搐等为主，所有高血压患者无其他病变，无用药史，无严重系统性疾病。52例患者随机分为葛根素治疗组和珍菊降压片治疗对照组，每组各26例，治疗组男性14例，女性12例，年龄41-68岁；对照组男性13例，女性13例，年龄41-69岁。治疗组和对照组的性别、年龄、病程、治疗前临床表现差异均无统计学意义。
用法用量：治疗时嘱患者注意饮食卫生。葛根素治疗组采用口服药剂，每天1次，一次一粒；珍菊降压片治疗组采用哈药集团制药六厂生产的珍菊降压片口服片，每天3次，一次一片。
疗效评价标准：
(1)显效：用药4天后呕吐、心悸、眩晕症状减轻，血压恢复正常。
(2)有效：用药6天后临床症状基本消失，血压升高频率明显减少。
(3)无效：超过7天后血压仍持续较高，仍有呕吐、心悸、眩晕等症状，。
治疗结果：本发明药物组合物所制备而成的葛根素药剂治疗组显效23例，占88.46％；有效1例，无效2例，总有效率为92.31％；珍菊降压片治疗组显效19例，有效3例，无效4例，总有效率为84.62％。葛根素治疗组总有效率明显高于珍菊降压片治疗组。

Claims (9)

1.含葛根素的药物组合物，其特征在于：是由以葛根素为活性成分，辅以药学上可接受的载体组成。
2.根据权利要求1所述含葛根素的药物组合物，其特征在于：所述药学上可接受的载体为淀粉、糖粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、甘露醇或其中2～6种的混合物，所述活性成分的葛根素与辅以药学上可接受的载体的质量比为1∶0.5～1.5。
3.根据权利要求1或权利要求2所述含葛根素的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的组成方式为口服型给药。
4.根据权利要求3所述含葛根素的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的组成方式为口服型给药的剂型为散剂、颗粒、胶囊、片剂、滴丸或口服液。
5.根据权利要求1或权利要求2所述含葛根素的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的组成方式为非口服型给药。
6.根据权利要求5所述含葛根素的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的组成方式为非口服型给药的剂型为注射剂。
7.权利要求1所述含葛根素的药物组合物的应用，其特征在于：作为TMEM16A离子通道抑制剂，用于治疗TMEM16A/CaCCs离子通道相关疾病。
8.根据权利要求7所述含葛根素的药物组合物的应用，其特征在于：作为TMEM16A离子通道抑制剂是上述权利要求1～6中含葛根素的药物组合物中的任意一种剂型。
9.根据权利要求7所述含葛根素的药物组合物的应用，其特征在于：所述用于治疗TMEM16A/CaCCs离子通道相关疾病是用于治疗人的高血压疾病。
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