CN105530931B - 用于治疗黑素瘤的药物组合 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其包含由式I化合物(如本文所述的)或其药学上可接受的盐代表的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂；和至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂。本发明还涉及用于治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的CDK抑制剂和治疗有效量的至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂。

Description

用于治疗黑素瘤的药物组合
技术领域
本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，该组合包含由式I化合物(如本文所述的)或其药学上可接受的盐代表的CDK(细胞周期蛋白依赖性激酶)抑制剂和至少一种选自BRAF(丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B-raf)抑制剂或MEK(促分裂原活化蛋白激酶)抑制剂的抗癌剂。本发明还涉及使用该药物组合治疗黑素瘤的方法。
背景技术
黑素瘤是皮肤癌的最严重的类型。事实上，黑素瘤是一种起源于被称为黑素细胞(其为色素生产细胞)的细胞的恶性肿瘤。它最常在皮肤中发生，但也可在眼中或在鼻、口或生殖器的内衬中发展。随后，黑素瘤可扩散至内脏。当黑素瘤在皮肤中发生时，它被称为皮肤黑素瘤。在眼中发生的黑素瘤被称为眼或眼内黑素瘤。黑素瘤的发病率在世界范围内逐渐增加，据报道，恶性黑素瘤是80％的皮肤癌死亡的原因(N.Engl.J.Med.,2010,363,8,711-723)。
当黑素瘤扩散时，通常在淋巴结中发现癌细胞。当癌到达淋巴结时，这意味着癌细胞可能已经扩散到身体的其他部位如肝、肺或脑，从而导致转移性黑素瘤。实际上，黑素瘤转移是高度侵袭性的，转移性黑素瘤患者的存活时间平均只有3-15个月。不幸的是，转移性黑素瘤不存在有效的治疗方法。早期诊断和及时手术切除是患者可能得到治愈的可能的选项。针对转移性黑素瘤的治疗方案最初包括诸如白介素-2、达卡巴嗪、替莫唑胺、福莫司汀和卡铂的药物，但每种药物均与较差的反应率和较差的总存活期有关。例如，在治疗开始后，发现达卡巴嗪具有7-12％的反应率和5-8个月的总存活期中值(N.Engl.J.Med.,2011,364,26,2507-2516)。
在对大量常见癌症中的促分裂原活化蛋白(MAP)激酶途径的研究中，已经发现40-60％的黑素瘤在编码丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B-raf(BRAF)的基因中携带激活突变。在黑素瘤中观察到的BRAF突变中，超过90％在密码子600处，并且在这些之中，超过90％的为导致谷氨酸置换缬氨酸的单核苷酸突变(BRAFV600E)。第二大常见的突变是赖氨酸置换缬氨酸的BRAFV600K，其占到黑素瘤的5-6％，随后是BRAFV600R(精氨酸置换缬氨酸)以及BRAFV600D(天冬氨酸置换缬氨酸)(Journal of Translational Medicine,2012,10,85,1-9)。
已经发现，BRAF抑制剂在低纳摩尔浓度下有效地使多数BRAF突变型黑素瘤患者中的肿瘤缩小。功效的限制因素是抗药性和被限制为5-7个月的无进展存活期。强效的BRAFV600抑制剂的几个实例包括BAY43-9006(索拉非尼(sorafenib)，Bayer)、维罗非尼(vemurafenib)(PLX4032，Plexxikon；RG7204，RO5185426，Hofmann-LaRoche)、GDC-0879(GlaxoSmithKline)、达拉非尼(dabrafenib)(GSK2118436，GlaxoSmithKline)、PLX4720(Hofmann-LaRoche)、BMS-908662(XL281，Bristol-Myers Squibb)、LGX818(Novartis)、PLX3603(RO5212054,Hofmann-LaRoche)、ARQ-736(ArQule)、DP-4978(Deciphera)以及RAF265(Novartis)。
维罗非尼是突变型BRAF的，特别是BRAFV600E突变型的强效抑制剂。在81％的患有具有BRAFV600E突变的黑素瘤的患者中，维罗非尼诱导完全或部分的肿瘤消退。在包括骨、肝和小肠在内的所有病变部位，均观察到应答。然而，在对维罗非尼的可靠的早期应答之后，发现应答性肿瘤发展出对治疗的抗性。在一些带有BRAFV600E突变的患者中，肿瘤显示出抗性，没有早期应答的迹象(N.Engl.J.Med.,2010,363,9,809-819)。达拉非尼是人野生型BRAF和CRAF酶以及突变形式BRAFV600E、BRAFV600K和BRAFV600D的强效且选择性的RAF激酶抑制剂。
MEK1和MEK2是催化靶蛋白中酪氨酸和苏氨酸的磷酸化的双特异性激酶；双特异性激酶被包括在蛋白质-丝氨酸/苏氨酸激酶家族内。蛋白质磷酸化是信号转导中使用的最普遍的一类翻译后修饰(Biochemical and Biophysical Research Communications,2012,417,5–10)。MEK1和MEK2是遍在表达的、参与RAS-RAF-MEK-ERK信号转导级联(其有时被表示为促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联)的亲水性非受体蛋白质。Ras介导的Raf活化触发MEK1和MEK2(MAP/ERK激酶1和2)的活化，而这又使ERK1和ERK2(胞外信号调节激酶1和2)在酪氨酸-185和苏氨酸-183上磷酸化。激活的ERK1和ERK2易位并在细胞核中积累，在那里它们可以使包括控制细胞生长和存活的转录因子在内的多种底物磷酸化。这些级联的受控调节与细胞增殖和分化有关，而这些激酶的未调节的活化可导致肿瘤形成。RAS/RAF/MEK途径的调节异常已经在超过30％的人类肿瘤中检测到，然而，在MEK1和MEK2基因中的突变很少，因此MEK1/2的超活化通常由RAS和/或BRAF中的功能获得型突变导致。鉴于Ras/Raf/MEK/ERK途径在人类癌症的发展中的重要性，该信号转导级联的激酶组分是用于调节癌症和其他增殖性疾病中的疾病进展的潜在重要靶标。
强效MEK抑制剂的几个实例包括曲美替尼(trametinib)(MekinistTM)、司美替尼(selumetinib)(AstraZeneca)、binimetinib(Array Biopharma)、PD-0325901(Pfizer)、cobimetinib(Exelixis)、refametinib(Valeant Pharmaceutical Int.)、pimasertib(Santhera Pharmaceuticals)、TAK-733(Takeda)以及WX-554(UCB Pharma S A)。
曲美替尼是MEK1和MEK2的强效选择性抑制剂。与化疗(达卡巴嗪或紫杉醇)相比，曲美替尼的显著临床活性在先前没有用BRAF抑制剂治疗的、患有具有BRAFV600E或BRAFV600K突变的转移性恶性黑素瘤的患者中得到证明。
因此，从上述讨论明显看出，转移性黑素瘤和抗性BRAF突变型黑素瘤仍然难以用现有疗法来治疗；因此，对新的、有效的、针对这些病况的治疗方法存在持续需要，以同时防止其进展和治疗该病况。
发明内容
在一个方面，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，该组合包含由式I化合物(如本文所述的)或其药学上可接受的盐代表的CDK(细胞周期蛋白依赖性激酶)抑制剂和至少一种选自BRAF(丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B-raf)抑制剂或MEK(促分裂原活化蛋白激酶)抑制剂的抗癌剂。
在另一方面，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的由式I化合物(如本文所述的)或其药学上可接受的盐代表的CDK抑制剂；联用治疗有效量的至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂。
在另一方面，本发明涉及本发明的药物组合物，其包含选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂和至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在又一方面，本发明涉及包含由式I化合物或其药学上可接受的盐代表的CDK抑制剂和至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂的药物组合在黑素瘤治疗中的用途。
在又一方面，本发明涉及由式I化合物或其药学上可接受的盐代表的CDK抑制剂和至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂在制备用于治疗黑素瘤的药物中的用途。
在又一方面，本发明涉及一种药剂盒，其包含选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂和至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂。
基于下文的详细说明，本发明的适用性的其他方面和进一步的范围将变得显而易见。
附图说明
图1示出了采用流式细胞术，化合物A(voruciclib)和维罗非尼单独和联用在5天后对G361黑素瘤细胞中的细胞周期和凋亡的影响。
图2示出了采用膜联蛋白(Annexin)染色方法，化合物A(voruciclib)和维罗非尼单独和联用对处理24h后的G361黑素瘤细胞中的早期凋亡的影响。
图3示出了采用流式细胞术，化合物A(voruciclib)和维罗非尼单独和联用在5天后对SK-MEL3黑素瘤细胞中的细胞周期和凋亡的影响。
图4示出了在A375细胞系中，化合物A(voruciclib)和维罗非尼单独和联用(48h)的效果。
图5示出了在G361细胞系中，化合物A(voruciclib)和维罗非尼单独和联用(48h)的效果。
图6示出了在MDA-MB435S细胞系中，化合物A(voruciclib)和维罗非尼单独和联用(48h)的效果。
图7a和7b示出了化合物A(voruciclib)和维罗非尼单独(48h)在A375亲代细胞系和A375R抗性细胞系上的剂量响应曲线。
图8a和8b示出了在A375抗性细胞系中，化合物A(voruciclib)和维罗非尼单独和联用(48h)的效果。
图9a和9b示出了在A375R抗性细胞系中，化合物A(voruciclib)和维罗非尼单独和联用(48h)的效果。
图10a和10b示出了在A375抗性细胞系中，化合物A(voruciclib)和曲美替尼单独和联用(48h)的效果。
图11a和11b示出了在A375R抗性细胞系中，化合物A(voruciclib)和曲美替尼单独和联用(48h)的效果。
图12a和12b示出了在A375抗性细胞系中，化合物A(voruciclib)和达拉非尼单独和联用(48h)的效果。
图13a和13b示出了在A375R抗性细胞系中，化合物A(voruciclib)和达拉非尼单独和联用(48h)的效果。
具体实施方式
除非另有说明，在上文或下文中使用的一般术语在本公开内容的语境中优选地具有如下的含义。因此，在本公开内容的语境中所使用的一般术语的定义在下文中提供：
除非上下文另外明确指出，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的参考物。
作为术语的部分使用“(多个)”包括提及该术语的单数或多数形式，例如，术语(多个)药剂可以指单个药剂或多个药剂。
如本文所用的，术语“至少一种”是指一种或多种。例如，术语“至少一种抗癌剂”意味着该组合包括单种抗癌剂或多种抗癌剂。
应当理解，“取代”或“被…取代”包括隐含条件—这样的取代遵循被取代的原子和取代基的允许化合价，以及代表不容易经历转变如重排、环化、消除等的稳定化合物。
如本文所用的，术语“药学上可接受的”意味着载体、稀释剂、赋形剂和/或盐必须与制剂的其他成分相容，并且对其接受者是无害的。“药学上可接受的”还意味着组合物或剂型在合理的医学判断的范围内，适合用于动物或人类而没有过度的毒性、刺激、变态反应或其他问题或并发症，具有合理的利益/风险比。
如本文所用的，术语“组合”或“药物组合”是指在本发明背景下的抗癌剂、CDK抑制剂(式I的化合物)和至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂的联合施用；该抗癌剂可同时独立地施用或在时间间隔内分开施用，从而特别地使得组合配偶体表现出协同效应。
细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)是在细胞周期的特定阶段变为活化的酶的家族。CDK由催化性亚基(实际的细胞周期蛋白依赖性激酶或CDK)和调节性亚基(细胞周期蛋白)组成。存在至少九种CDK(CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK8、CDK9等)和至少15种不同类型的细胞周期蛋白(细胞周期蛋白A、B1、B2、D1、D2、D3、E、H等)。细胞周期的每个步骤均由这类CDK复合物调节：G1/S过渡(transition)(CDK2/细胞周期蛋白A、CDK4/细胞周期蛋白D1-D3、CDK6/细胞周期蛋白D3)、S期(CDK2/细胞周期蛋白A)、G2期30(CDK1/细胞周期蛋白A)、G2/M过渡期(CDK1/细胞周期蛋白B)。
如本文所用的，术语“CDK抑制剂”是指能够抑制一种或多种细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的药剂。这些激酶的异常表达和过表达在许多疾病状况如癌症中得到证实。在本发明的背景下，包含在本发明的药物组合中的CDK抑制剂是指式I化合物或其药学上可接受的盐。本发明的化合物特异性地抑制CDK1/细胞周期蛋白B、CDK2/细胞周期蛋白E、CDK4/细胞周期蛋白D、CDK4/细胞周期蛋白D1和/或CDK9/细胞周期蛋白T1。
如本文所用的，术语“BRAF抑制剂”是指能够抑制BRAF激酶或突变的BRAF激酶活性(丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B-RAF(BRAF)的一种或多种突变形式)的药剂。百分之九十的报道的BRAF突变导致氨基酸600处谷氨酸置换缬氨酸(V600E突变)。因此，术语“BRAF抑制剂”在其范围内包括能够抑制BRAF或其突变形式的化合物；或能够抑制BRAF的V600突变形式的化合物；或能够在非难治性和难治性黑素瘤中均抑制BRAF的V600E突变形式的化合物。
如本文所用的，术语“MEK抑制剂”指能够与促分裂原活化蛋白激酶(MEK)相互作用并抑制其酶活性的药剂。抑制MEK酶活性又使MEK对底物肽或蛋白质进行磷酸化的能力降低。MEK1和MEK2是参与RAS–RAF–MEK–ERK信号转导级联的蛋白激酶。该级联参与对包括凋亡、细胞周期进展、细胞迁移、分化、代谢和增殖在内的众多过程的调节。因此，术语“MEK抑制剂”在其范围内包括能够抑制MEK的化合物。
如本文所用的，术语“协同性的”或“协同效应”或“协同作用”是指化合物(BRAF抑制剂和CDK抑制剂，即式I化合物)的组合的治疗效果，该效果高于该药物组合中使用的化合物的累加效果。有利的是，组合时活性成分(治疗活性的化合物)之间的这种协同作用允许使用较小剂量的一种或两种活性成分，在相同剂量下提供更强的功效，和/或预防或延缓多药抗药性的积聚。Chou和Talalay的联合指数(CI)方法可用于确定联合使用的化合物的协同、累加或拮抗作用。当CI值小于1时，在联合使用的化合物之间存在协同作用；当CI值等于1时，在联合使用的化合物之间存在累加作用，当CI值大于1时，存在拮抗作用。可通过共配制包含在本发明的药物组合或组合物中的化合物，并通过单位剂量形式同时施用或作为同时或依次施用的单独制剂施用所述化合物来实现协同效应。
如本文所用的，“黑素瘤”是指一种病况，其特征在于由皮肤和其他器官的黑素细胞系统引起的肿瘤的生长。大多数黑素细胞出现于皮肤中，但也在脑膜、消化道、淋巴结和眼中发现。当黑素瘤在皮肤中发生时，它被称为皮肤黑素瘤。黑素瘤也可在眼中发生并被称为眼或眼内黑素瘤。黑素瘤很少在脑膜、消化道、淋巴结或其他发现黑素细胞的区域中发生。
可互换使用的术语“突变型黑素瘤”或“恶性黑素瘤”是指包含具有缺陷(也称为“突变”)的黑素瘤细胞的黑素细胞赘生物。恶性黑素瘤通常从由大量具有明显转移倾向的细胞组成的痣或在其附近发展而来。40-60％的黑素瘤在编码丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B-RAF(BRAF)的基因中携带激活突变。在黑素瘤中观察到的BRAF突变中，超过90％在密码子600处，并且在这些之中，超过90％的为导致谷氨酸置换缬氨酸的单核苷酸突变(BRAFV600E)。第二大常见的突变是赖氨酸置换缬氨酸的BRAFV600K，其占到黑素瘤的5-6％，随后是BRAFV600R和BRAFV600D。(Journal of Translational Medicine,2012,10,85,1-9)。
术语“转移性黑素瘤”是指已通过淋巴系统和/或血管扩散到身体的其他部位(包括存在于皮肤下面的皮下组织、淋巴结)以及其他器官(如肺、肝)、骨或者脑的黑素瘤。III期黑素瘤的特征在于淋巴结转移的水平。不存在远端转移的迹象。IV期黑素瘤的特征在于远端转移的位置和血清乳酸脱氢酶(LDH)的水平。该期也被称为转移性黑素瘤。
除非另有说明，术语“黑素瘤”还可包括复发性或抗性黑素瘤。术语“复发性”或“抗性”是指黑素瘤的反复发作，或黑素瘤的进展，而与在所述发作或进展之前疾病是否得到治愈无关。
因此，为其提供(如本文所述的)药物组合的黑素瘤的治疗是指非难治性、转移性或难治性(抗性)的BRAF突变型黑素瘤的治疗，特别是BRAF V600突变型黑素瘤的治疗，更特别的是BRAFV600E突变型黑素瘤的治疗。
如关于黑素瘤所使用的术语“无应答性/难治性”在本文中用来指已经通过目前可用的癌症疗法如化疗、放疗、手术、激素疗法和/或生物疗法/免疫疗法治疗的患有黑素瘤的受试者或患者；为了黑素瘤的治疗；其中该疗法在临床上不足以治疗患者，使得这些患者需要其他有效的疗法，即对疗法仍不敏感。该短语还可描述对疗法发生应答但遭受副作用、复发、发展出抗性或未体验到黑素瘤的一种或多种症状有任何缓解的受试者或患者。在多个实施方案中，“无应答性/难治性”意味着至少一些显著部分的癌细胞没有被杀死或使其细胞分裂停滞。可通过任何本领域已知的用于测定治疗对癌细胞的有效性的方法，使用这一情况下“难治性”的本领域公认的含义，在体内或体外确定癌细胞是否为“无应答性/难治性的”。
如本文所用的，术语“治疗周期”是指一个时间段，在其间进行了一系列循环施用CDK抑制剂即式I化合物或其药学上可接受的盐以及至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂。
术语“凋亡”是指程序性细胞死亡的自然过程。它是自我毁灭的过程，在其中细胞使用专门的细胞机制来杀死自己。细胞瓦解成膜结合的颗粒，这些颗粒随后通过吞噬作用消除。凋亡是一种使得后生动物能够控制细胞数并消除威胁动物生存的细胞的机制。
如本文所用的术语“受试者”是指已作为治疗、观察或实验的对象的动物，优选为哺乳动物，最优选为人类，更具体地为患有黑素瘤的人。术语“受试者”可与术语患者可互换地使用。在本发明的背景下，短语“有需要的受试者”意指需要针对突变型或恶性黑素瘤的治疗的受试者。或者，短语“有需要的受试者”意指诊断出突变型或恶性黑素瘤的受试者(患者)。
如本文所用的术语“哺乳动物”意在包括人类，以及非人类哺乳动物。非人哺乳动物包括但不限于家养动物，如牛、猪、马、狗、猫、兔、大鼠和小鼠，以及非家养动物。
如本文所用的术语“治疗有效量”是指CDK抑制剂即式I化合物或其药学上可接受的盐以及至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂的量，当施用于需要这种治疗的受试者时，该量足以提供治疗益处，该治疗益处包括：(i)预防或延缓黑素瘤的一种或多种症状；(ii)改善或消除黑素瘤的一种或多种症状；或(iii)治疗黑素瘤。
与受试者(优选哺乳动物，更优选人)中的黑素瘤有关的术语“治疗”或“处理”包括：(i)黑素瘤的抑制，即阻止黑素瘤的发展；(ii)黑素瘤复原的减少；(iii)肿瘤细胞向外周器官浸润的抑制；(iv)转移的抑制(即减少、减慢或完全停止)；(v)黑素瘤的改善，即减轻与黑素瘤相关的症状的严重性；以及(vi)一种或多种与黑素瘤相关的症状在一定程度上的缓解。
根据本发明的一个方面，提供了一种药物组合，其包含选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；
其中Ar是被选自氯和三氟甲基的1个或2个不同的取代基取代的苯基基团；和至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂；其用于治疗黑素瘤。
根据另一实施方案，包含在本发明的药物组合中的CDK抑制剂选自式I化合物或其药学上可接受的盐；其中Ar是被选自氯和三氟甲基的2个不同基团取代的苯基基团。
根据又一实施方案，包含在本发明的药物组合中的CDK抑制剂选自式I化合物或其药学上可接受的盐，其中Ar是被氯取代的苯基基团。
式I化合物或其药学上可接受的盐的制备以及含有该化合物的药物组合物的制备在PCT专利公开号WO2004004632(对应于美国专利7,271,193)和PCT专利公开号WO2007148158中公开。这些PCT专利公开披露，由式I代表的化合物可在增殖性疾病的治疗中使用。如上文指出的，式I化合物可以以其盐的形式使用。优选的式I化合物的盐包括乙酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、肉桂酸盐、柠檬酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡糖醛酸盐、谷氨酸盐、乙醇酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、酮戊二酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、草酸盐、帕莫酸盐(palmoates)、高氯酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、氨基磺酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐以及本领域技术人员已知的其他酸加成盐。
在一个实施方案中，包含在药物组合中的CDK抑制剂(式I的化合物)为(+)-反式-2-(2-氯-4-三氟甲基苯基)-5,7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基-吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮；或其药学上可接受的盐。
在另一实施方案中，包含在药物组合中的CDK抑制剂(式I的化合物)为(+)-反式-2-(2-氯-4-三氟甲基苯基)-5,7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮盐酸盐(本文中称为“化合物A”。本文中化合物A还被称为“voruciclib”)。
在一个实施方案中，包含在药物组合中的CDK抑制剂(式I的化合物)为(+)-反式-2-(2-氯-苯基)-5,7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基-吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮或其药学上可接受的盐。
在另一实施方案中，包含在药物组合中的CDK抑制剂(式I的化合物)为(+)-反式-2-(2-氯-苯基)-5,7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基-吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮盐酸盐(本文中称为“化合物B”。本文中化合物B还被称为“riviciclib”)。
在一个实施方案中，包含在药物组合中的BRAF抑制剂为BRAF的V600突变形式的抑制剂。
在一个实施方案中，包含在药物组合中的BRAF抑制剂为BRAF的V600E突变形式的抑制剂。
在一个实施方案中，包含在药物组合中的BRAF抑制剂选自BAY43-9006(索拉非尼，Bayer)、维罗非尼(PLX4032，Plexxikon；RG7204，RO5185426，Hofmann-LaRoche)、GDC-0879(GlaxoSmithKline)、达拉非尼(GSK2118436，GlaxoSmithKline)、PLX4720(Hofmann-LaRoche)、BMS-908662(XL281，Bristol-Myers Squibb)、LGX818(Novartis)、PLX3603(RO5212054,Hofmann-LaRoche)、ARQ-736(ArQule)、DP-4978(Deciphera)或RAF265(Novartis)。
在一个实施方案中，包含在药物组合中的BRAF抑制剂为维罗非尼。
在一个实施方案中，包含在药物组合中的BRAF抑制剂为达拉非尼。
在一个实施方案中，包含在药物组合中的MEK抑制剂为BRAF的V600突变形式的抑制剂。
在一个实施方案中，包含在药物组合中的MEK抑制剂为BRAF的V600E或V600K突变形式的抑制剂。
在一个实施方案中，包含在药物组合中的MEK抑制剂选自司美替尼(AstraZeneca)、binimetinib(Array Biopharma)、PD-0325901(Pfizer)、曲美替尼(MekinistTM)、cobimetinib(Exelixis)、refametinib(Valeant)、pimasertib(SantheraPharmaceuticals)、TAK-733(Takeda)或WX-554(UCB Pharma S A)。
在一个实施方案中，包含在药物组合中的MEK抑制剂为曲美替尼。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的至少一种选自BRAF抑制剂和MEK抑制剂的抗癌剂，其中所述CDK抑制剂和至少一种所述抗癌剂同时施用。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂和治疗有效量的至少一种选自BRAF抑制剂和MEK抑制剂的抗癌剂，其中所述CDK抑制剂和至少一种所述抗癌剂依次施用。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂，其中所述抗癌剂在CDK抑制剂的施用之前施用。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂，其中CDK抑制剂在所述抗癌剂的施用之前施用。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂，其中CDK抑制剂和所述抗癌剂均每日施用一次。
在另一实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂，其中CDK抑制剂每日施用一次，而所述抗癌剂每日施用两次。
在又一实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂，其中CDK抑制剂和所述抗癌剂均每日施用两次。
在一方面，本发明涉及用于治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物(如本文所述的)或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂，其中CDK抑制剂和所述抗癌剂同时施用。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂，其中CDK抑制剂和所述抗癌剂依次施用。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂，其中所述抗癌剂在所述CDK抑制剂的施用之前施用。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂，其中所述CDK抑制剂在所述抗癌剂的施用之前施用。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂，其中所述CDK抑制剂和所述抗癌剂均每日施用一次。
在另一实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂和治疗有效量的BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种，其中所述CDK抑制剂每日施用一次而所述抗癌剂每日施用两次。
在又一实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂和治疗有效量的BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种，其中所述CDK抑制剂和所述抗癌剂均每日施用两次。
在一个实施方案中，治疗黑素瘤的方法包括在本文所述的剂量范围内向有需要的受试者施用选自式I化合物的CDK抑制剂和至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的BRAF抑制剂，其中所述BRAF抑制剂和所述CDK抑制剂同时施用。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的BRAF抑制剂，其中所述BRAF抑制剂和所述CDK抑制剂依次施用。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的BRAF抑制剂，其中所述BRAF抑制剂在所述CDK抑制剂的施用之前施用。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的BRAF抑制剂，其中所述CDK抑制剂在所述BRAF抑制剂的施用之前施用。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的BRAF抑制剂，其中所述CDK抑制剂和所述BRAF抑制剂均每日施用一次。
在另一实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的BRAF抑制剂，其中所述CDK抑制剂每日施用一次而所述BRAF抑制剂每日施用两次。
在又一实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的BRAF抑制剂，其中所述CDK抑制剂和所述BRAF抑制剂均每日施用两次。
在一方面，本发明涉及用于治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物(如本文所述的)或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂和BRAF抑制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂和治疗有效量的BRAF抑制剂，其中所述BRAF抑制剂和所述CDK抑制剂同时施用。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂和治疗有效量的BRAF抑制剂，其中所述BRAF抑制剂和所述CDK抑制剂依次施用。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的BRAF抑制剂，其中所述BRAF抑制剂在所述CDK抑制剂的施用之前施用。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的BRAF抑制剂，其中所述CDK抑制剂在所述BRAF抑制剂的施用之前施用。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的BRAF抑制剂，其中所述CDK抑制剂和所述BRAF抑制剂均每日施用一次。
在另一实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的BRAF抑制剂，其中所述CDK抑制剂每日施用一次，而所述BRAF抑制剂每日施用两次。
在又一实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的BRAF抑制剂，其中所述CDK抑制剂和所述BRAF抑制剂均每日施用两次。
在一个实施方案中，治疗黑素瘤的方法包括在本文所述的剂量范围内向有需要的受试者施用BRAF抑制剂和选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂和所述CDK抑制剂同时施用。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的MEK抑制剂，其中MEK抑制剂和CDK抑制剂依次施用。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂在所述CDK抑制剂的施用之前施用。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的MEK抑制剂，其中所述CDK抑制剂在所述MEK抑制剂的施用之前施用。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的MEK抑制剂，其中所述CDK抑制剂和所述MEK抑制剂均每日施用一次。
在另一实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的MEK抑制剂，其中所述CDK抑制剂每日施用一次，而所述MEK抑制剂每日施用两次。
在又一实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂和治疗有效量的MEK抑制剂，其中所述CDK抑制剂和所述MEK抑制剂均每日施用两次。
在一方面，本发明涉及用于治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物(如本文所述的)或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂和MEK抑制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂和治疗有效量的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂和所述CDK抑制剂同时施用。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂和所述CDK抑制剂依次施用。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂在所述CDK抑制剂的施用之前施用。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的MEK抑制剂，其中所述CDK抑制剂在所述MEK抑制剂的施用之前施用。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的MEK抑制剂，其中所述CDK抑制剂和所述MEK抑制剂均每日施用一次。
在另一实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的MEK抑制剂，其中所述CDK抑制剂每日施用一次，而所述MEK抑制剂每日施用两次。
在又一实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和治疗有效量的MEK抑制剂，其中所述CDK抑制剂和所述MEK抑制剂均每日施用两次。
在一个实施方案中，治疗黑素瘤的方法包括在本文所述的剂量范围内向有需要的受试者施用MEK抑制剂和选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合，其中所述药物组合包含治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；治疗有效量的BRAF抑制剂以及治疗有效量的MEK抑制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗黑素瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；治疗有效量的BRAF抑制剂以及治疗有效量的MEK抑制剂。
在本发明的一个实施方案中，所治疗的黑素瘤是非难治性黑素瘤。
在本发明的另一个实施方案中，所治疗的黑素瘤是非难治性BRAF突变型黑素瘤。
在本发明的又一个实施方案中，所治疗的黑素瘤是非难治性BRAF V600突变型黑素瘤。
在本发明的进一步实施方案中，所治疗的黑素瘤是非难治性BRAF V600E或BRAFV600K突变型黑素瘤。
在本发明的一个实施方案中，所治疗的黑素瘤是复发性或难治性黑素瘤。
在本发明的另一个实施方案中，所治疗的黑素瘤是抗性BRAF突变型黑素瘤。
在本发明的又一个实施方案中，所治疗的黑素瘤是抗性BRAF V600突变型黑素瘤。
在本发明的进一步实施方案中，所治疗的黑素瘤是抗性BRAF V600E或BRAF V600K突变型黑素瘤。
在本发明的一个实施方案中，所治疗的黑素瘤是转移性黑素瘤。
在本发明的另一个实施方案中，所治疗的黑素瘤是转移性BRAF突变型黑素瘤。
在本发明的又一个实施方案中，所治疗的黑素瘤是转移性BRAFV600突变型黑素瘤。
在本发明的进一步实施方案中，所治疗的黑素瘤是转移性BRAFV600E或BRAFV600K突变型黑素瘤。
根据本发明，CDK抑制剂(式I的化合物)和/或选自BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂的抗癌剂的施用可通过任何合适的途径进行，包括但不限于肠胃外、口服、舌下、经皮、局部、鼻内、气雾剂、眼内、气管内或直肠内。
在一个实施方案中，CDK抑制剂可口服施用以产生并维持其良好的血液水平，而选自BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂的抗癌剂可通过静脉内、皮下、肌肉内、血管内或输注途径肠胃外施用。
在另一实施方案中，CDK抑制剂可通过静脉内、皮下、肌肉内、血管内或输注途径肠胃外施用，而选自BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂的抗癌剂可口服施用。
在进一步的实施方案中，CDK抑制剂和选自BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂的抗癌剂均可口服施用以产生并维持其良好的血液水平。
在更进一步的实施方案中，式I的CDK抑制剂和选自BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂的抗癌剂均可通过静脉内、皮下、肌肉内、血管内或输注途径肠胃外施用，以产生并维持其良好的血液水平。
在一方面，本发明涉及用于治疗黑素瘤的药物组合物，其中所述组合物包含选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂；和至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。对于丸剂、片剂、包衣片剂和硬明胶胶囊的生产，可以使用的药物活性赋形剂包括但不限于乳糖、玉米淀粉或其衍生物、阿拉伯胶、氧化镁或葡萄糖等。对于软明胶胶囊和栓剂，可以使用的载体包括但不限于脂肪、蜡、天然或硬化油等。用于生产溶液(例如注射液)或用于乳剂或糖浆的合适载体为例如水、生理氯化钠溶液或醇(例如，乙醇、丙醇或甘油)、糖溶液(如葡萄糖溶液或甘露醇溶液)或多种已被提到的溶剂的混合物。
可采用本领域技术人员熟悉的传统制药技术，如通过混合、造粒、溶解或冻干的方法，将CDK抑制剂(式I的化合物)和选自BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂的抗癌剂单独地或组合地配制成药物剂型。
通常，旨在用于药物用途的组合物可根据任何本领域已知的、用于制备药物组合物的方法来制备，例如，Remington–The Science and Practice of Pharmacy(21stEdition)(2005),Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics(11thEdition)(2006)和Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(9th Edition)，以及Solid-State Chemistry of Drugs(2nd Edition)(1999)。
本文所述的组合物可以为适合于口服给药的形式，例如，固体剂型如片剂、胶囊、锭剂或颗粒剂；液体剂型如乳剂、溶液、悬浮液；适合于肠胃外注射(包括静脉内、皮下、肌肉内、血管内或输注)的形式，例如作为无菌溶液、悬浮液或乳剂；适合于局部给药的形式，例如作为软膏、乳膏、凝胶或洗剂。
用于口服给药的组合物可为片剂、锭剂、水性或油性悬浮液、颗粒剂、粉剂、扁囊剂、乳剂、胶囊、糖浆或酏剂的形式。口服施用的组合物可含有一种或多种任选的药剂，例如，甜味剂如果糖、阿斯巴甜或糖精；调味剂如薄荷、冬青油或樱桃；着色剂；以及防腐剂，以提供药学上可口的制剂。包围渗透活性驱动的化合物的选择性渗透膜也适用于包含在根据本发明的药物组合中的化合物(CDK抑制剂，和/或选自BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂的抗癌剂)的口服给药。适用于口服给药的组合物可包含标准的媒介物如甘露醇、乳糖、淀粉、玉米淀粉、硬脂酸镁、滑石、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这类媒介物优选是药物级的。
对于软膏、乳膏，活性成分(CDK抑制剂和/或选自BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂的抗癌剂)在水包油或油包水基质中配制。
对于肌肉内、腹膜内、皮下和静脉内使用，通常采用活性成分(CDK抑制剂和/或选自BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂的抗癌剂)的无菌溶液，并且该溶液的pH应该适当地调整和缓冲。
而且，包含在药物组合物中的化合物，即CDK抑制剂和/或选自BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂的抗癌剂的效果可以通过合适的制剂来延迟或延长。例如，可制备化合物的缓慢溶解的药丸并且将其引入片剂或胶囊中。该技术可以通过制备具有几种不同溶解速率的药丸并向胶囊中填充该药丸的混合物而得到改善。可以用在可预测的时间段内抵抗溶解的膜包覆片剂或胶囊。通过将化合物溶解或悬浮在使其仅在血清中缓慢分散的油性或乳化的媒介物中，甚至肠胃外制剂也可被制成长效的。
然而，用于施用的选自式I化合物的CDK抑制剂和选自BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂的抗癌剂的有效剂量根据疾病(黑素瘤)的严重性、症状的严重性、患者的年龄、性别、体重及敏感性差异、给药的模式、间隔和持续时间、制剂的性质和类型等而变化。在某些实施方案中，包含在根据本发明的药物组合中的治疗剂在两种药剂仍然具有活性的时间范围内施用。本领域技术人员将能够通过确定所施用的所述治疗剂的半衰期来确定这一时间范围。如本文之前指出的，包含在药物组合物中的抗癌剂可同时或依次施用。本领域技术人员将认识到，在本发明的范围和精神之内若干种变化都是可能的。
应选择待施用的治疗剂的剂量以产生期望的效果。CDK抑制剂的合适的剂量可以为约5mg到约500mg。待施用的CDK抑制剂的剂量可覆盖较宽的范围，取决于待治疗的黑素瘤的严重性。可以选择每日将要施用的剂量以获得期望的效果。CDK抑制剂的合适的剂量可为约50mg/天到350mg/天。如需要，也可施用更高或更低的每日剂量。
在一个实施方案中，可以施用约1mg/天到约2500mg/天的BRAF抑制剂，并且该量可以在每天或每剂量或每个治疗周期以单次或多次剂量给予。
在一个实施方案中，可以施用约0.01mg/天到2000mg/天的MEK抑制剂，并且该量可以在每天或每剂量或每个治疗周期以单次或多次剂量给予。
在一个实施方案中，CDK抑制剂和选自BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂的抗癌剂均每日施用一次。在另一个实施方案中，CDK抑制剂和选自BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂的抗癌剂均每日施用两次。在进一步的实施方案中，CDK抑制剂每日施用一次，而选自BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂的抗癌剂每日施用两次。然而，包含在根据本发明的药物组合中的每种治疗剂的量在联合使用时通常将低于单独施用时将产生治疗效果的量。为了方便起见，如需要，可将总每日剂量分开并在当天内分批施用。
由本发明提供的组合已在某些测定系统中并按照若干不同的给药时间表进行了体外评估。实验细节在本文下文中提供。本文中所示的数据清楚地表明，BRAF抑制剂或MEK抑制剂在与选自式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK抑制剂联用时表现出协同效应。已清楚地表明，相比于仅用CDK抑制剂(即单独的式I化合物或其药学上可接受的盐)或仅用BRAF抑制剂或仅用MEK抑制剂处理细胞，治疗剂在联用用于黑素瘤的治疗时增加了增殖细胞的凋亡或细胞毒性。
在一方面，本发明涉及一种药剂盒，其包含CDK抑制剂(式I化合物或其药学上可接受的盐)和至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂。该药剂盒可包含容器，该容器含有式I化合物或其药学上可接受的盐以及至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂作为固定的剂量制剂；或者该药剂盒可包含两个或更多个单独的用于式I化合物或其药学上可接受的盐以及至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂的容器。该药剂盒还可包含包装插页，其包括关于适应证、用法、剂量、施用说明、禁忌症、注意事项和警告的信息。可使用的合适的容器包括瓶子、小瓶、安瓿、注射器或泡罩包装。该药剂盒可任选地包含另外的容器，该容器包含药学上可接受的缓冲液、注射用水、磷酸盐缓冲盐水、林格液和右旋糖溶液。
包含在本发明的药物组合中的CDK抑制剂，即式I化合物，可根据PCT专利公开号WO2004004632和PCT专利公开号WO2007148158中公开的方法制备。
式I化合物或其药学上可接受的盐的一般制备过程包括以下步骤：(a)在路易斯酸催化剂的存在下用乙酸酐处理式VIA中间体化合物的拆分的对映纯的(-)-反式对映体
以获得拆分的式VIIA的乙酰化化合物，
(b)在碱和溶剂的存在下，使拆分的式VIIA的乙酰化化合物与式ArCOOH的酸或式ArCOCl的酰基氯或式(ArCO)2O的酸酐或式ArCOOCH3的酯反应(其中Ar如上文对于式I化合物所定义)，以获得拆分的式VIIIA化合物；
(c)在合适的溶剂中用碱处理拆分的式VIIIA化合物，以获得相应的拆分的式IXA的β-二酮化合物；
其中Ar如上文所定义；
(d)用酸如盐酸处理拆分的式IXA的β-二酮化合物，以获得相应的环化的式XA化合物，
(e)通过将式XA的化合物与脱烷基剂一起在120-180℃温度下加热来使其经历脱烷基化，以获得式I化合物的(+)-反式对映体，并任选地将该化合物转化为其药学上可接受的盐。
在以上步骤(a)中使用的路易斯酸催化剂可选自：BF3、Et2O、氯化锌、氯化铝和氯化钛。
在过程步骤(b)中使用的碱可选自三乙胺、吡啶以及DCC-DMAP组合(N,N'-二环己基碳二亚胺和4-二甲基氨基吡啶的组合)。
对本领域技术人员显而易见的是，式VIIIA化合物到相应的式IXA的β-二酮化合物的重排被称为Baker-Venkataraman重排(J.Chem.Soc.,1933,1381和Curr.Sci.,1933,4,214)。
在过程步骤(c)中使用的碱可选自：六甲基二硅氮化锂、六甲基二硅氮化钠、六甲基二硅氮化钾、氢化钠和氢化钾。优选的碱为六甲基二硅氮化锂。
在式IXA化合物脱烷基化的过程步骤(e)中使用的脱烷基剂可选自：吡啶盐酸盐、三溴化硼、三氟化硼醚络合物和三氯化铝。优选的脱烷基剂为吡啶盐酸盐。
式VIA的起始化合物的制备包括使1-甲基-4-哌啶酮与1,3,5-三甲氧基苯在冰醋酸中的溶液反应，以产生1-甲基-4-(2,4,6-三甲氧基苯基)-1,2,3,6-四氢吡啶，后者与三氟化硼二乙醚络合物、硼氢化钠和四氢呋喃反应，以产生1-甲基-4-(2,4,6-三甲氧基苯基)哌啶-3-醇。1-甲基-4-(2,4,6-三甲氧基苯基)哌啶-3-醇到式VIA化合物的转化包括：通过在氧亲核试剂如三乙胺、吡啶、碳酸钾或碳酸钠的存在下，用合适的试剂如对甲苯磺酰氯、甲磺酰氯、三氟甲磺酸酐或五氯化磷处理，来将化合物1-甲基-4-(2,4,6-三甲氧基苯基)哌啶-3-醇的哌啶环上存在的羟基基团转化成离去基团如甲苯磺酰基、甲磺酰基、三氟甲磺酸或卤素基团，随后在醇溶剂如异丙醇、乙醇或丙醇中在氧亲核试剂如乙酸钠或乙酸钾的存在下进行环缩。
在药理学试验中使用的代表性化合物，即化合物A(也称为voruciclib)，是指(+)-反式-2-(2-氯-4-三氟苯基)-5,7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基-吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮盐酸盐，并且是公开的PCT公开号WO2007148158中披露的一种化合物。
在药理学试验中使用的另一种代表性化合物，即化合物B(也称为riviciclib)，是指(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基-吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮盐酸盐，并且是公开的PCT公开号WO2004004632中披露的一种化合物。
根据本发明的组合(包含CDK抑制剂和至少一种选自BRAF抑制剂或MEK抑制剂的抗癌剂)的协同效应现将参照其优选实施方案进行更加详细的解释。应指出，这些仅作为实例提供，而并非意在限制本发明。
应理解，除非有相反的明确规定，本发明可采取多种替代变化和步骤顺序。此外，除了任何操作实施例外或者另有说明，表示例如在说明书和权利要求书中使用的成分的量的所有数字应理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，在以下的说明书和所附权利要求书中列出的数值参数可根据本发明要获得的期望性质而变化。
本领域技术人员将认识到，在本发明的范围和精神内若干种变化都是可能的。现在通过参考以下非限制性实施例，将更加详细地描述本发明。以下实施例进一步阐述了本发明，但当然不应理解为以任何方式限制其范围。
实施例：
本文中使用了下列缩写或术语：
BF3:三氟化硼
BF3.Et2O:三氟化硼二乙醚络合物
CaCl2:氯化钙
CHCl3:氯仿
CDCl3:氘代氯仿
CO2:二氧化碳
DCC:N,N'-二环己基碳二亚胺
DMAP:4-二甲基氨基吡啶
DMF:N,N-二甲基甲酰胺
DMSO:二甲基亚砜
Et2O:二乙醚
EtOAc:乙酸乙酯
g:克
h:小时
HCl:盐酸
IPA:异丙醇
KBr:溴化钾
Kg:千克
L:升
MeOH:甲醇
min:分钟
mg:毫克
mL:毫升
μL:微升
μM:微摩尔浓度
mmol:毫摩尔浓度
mol:摩尔
NaCl:氯化钠
Na2CO3:碳酸钠
NaHCO3:碳酸氢钠
Na2SO4:硫酸钠
n-BuLi:正丁基锂
PEL:Piramal Enterprises Limited
℃:摄氏度
THF:四氢呋喃
实施例
化合物A(voruciclib)和化合物B(riviciclib)的制备，代表性的式1化合物在此处作为参考实施例示出：
参考实施例1：
(a)(+)-反式-2-(2-氯-4-三氟甲基苯基)-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-5,7-二甲氧基-苯并吡喃-4-酮的制备
向在氮气气氛下保持在0℃的n-BuLi(在己烷中的15％溶液，2.2mL，5mmol)的THF(10mL)溶液中逐滴添加六甲基二硅氮烷(1.08mL，5.1mmol)，并搅拌15min。向其中逐滴添加(+)-反式-2-氯-4-三氟甲基苯甲酸2-(2-乙酰氧基甲基-1-甲基-吡咯烷-3-基)-6-乙酰基-3,5-二甲氧基苯基酯(1.44g，2.5mmol)在THF(10mL)中的溶液，保持温度在0℃。添加后，使反应升温至室温并搅拌2.5h。将反应混合物用稀HCl酸化，并用10％碳酸氢钠碱化至pH 8到9。将水层用氯仿(3x 25mL)萃取。将有机层用水(25mL)、盐水(25mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。将有机层减压浓缩并真空干燥，以产生作为油的乙酸3-{3-[3-(2-氯-4-三氟甲基-苯基)-3-氧代-丙酰基]-2-羟基-4,6-二甲氧基-苯基}-1-甲基-吡咯烷-2-基甲基酯(1.3g，90.2％)。将该酯溶解于浓HCl(10mL)中并搅拌3小时以实现环化。在3h结束时，将反应混合物用固体NaHCO3碱化至pH 8到9。将水层用氯仿(25x 3mL)萃取并用水(25mL)和盐水(25mL)洗涤。将有机层用无水Na2SO4干燥、减压浓缩并真空干燥。将残余物通过用含3％甲醇的氯仿和0.1％氨作为洗脱剂的柱色谱法进行纯化，以产生呈黄色固体的化合物(+)-反式-2-(2-氯-4-三氟甲基苯基)-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-5,7-二甲氧基-苯并吡喃-4-酮。
产量：0.56g(48.2％)；1H NMR(CDCl3,300MHz):δ7.95(d,1H),7.78(s,1H),7.69(d,1H),6.61(s,1H),6.46(s,1H),4.21(m,1H),4.01(s,3H),3.93(s,3H),3.71(dd,1H),3.41(d,1H),3.26(m,1H),2.84(m,1H),2.70(m,1H),2.44(s,3H),2.10(m,2H)；MS(ES+):m/z 497(M+1)。
(b)(+)-反式-2-(2-氯-4-三氟甲基-苯基)-5,7-二羟基-8-(2-羟基-甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮的制备
将(a)部分中获得的化合物(0.25g，0.5mmol)、吡啶盐酸盐(0.25g，2.16mmol)和催化量的喹啉的混合物在180℃下加热2.5h。将反应混合物用甲醇(25mL)稀释并用固体Na2CO3碱化至pH 10。将反应混合物过滤并用甲醇洗涤。将有机层浓缩，并将残余物通过使用0.1％氨和含4.5％甲醇的氯仿作为洗脱剂的柱色谱法进行纯化，以产生呈黄色固体的化合物(+)-反式-2-(2-氯-4-三氟甲基苯基)-5,7-二羟基-8-(2-羟基-甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮。
产量：0.15g(63.7％)；1H NMR(CDCl3,300MHz):δ7.99(m,2H),7.83(d,1H),6.65(s,1H),6.41(s,1H),4.24(m,1H),3.90(m,2H),3.70(m,1H),3.60(m,1H),3.41(m,1H),2.99(s,3H),2.54(m,1H),2.28(m,1H)；MS(ES+):m/z 470(M+1)。
(c)(+)-反式-2-(2-氯-4-三氟甲基苯基)-5,7-二羟基-8-(2-羟基-甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮盐酸盐(化合物A或voruciclib)的制备
将(b)中获得的化合物(0.1g，0.2mmol)悬浮于甲醇(2mL)中并用含醚的HCl处理，并蒸发有机溶剂，以产生化合物(+)-反式-2-(2-氯-4-三氟甲基-苯基)-5,7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基-吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮盐酸盐。
产量：0.1g(92.8％)；1H NMR(CDCl3,300MHz):δ8.02(d,2H),7.83(d,1H),6.64(s,1H),6.41(s,1H),4.23(m,1H),3.73(m,2H),3.68(m,1H),3.51(m,1H),3.39(m,1H),2.99(s,3H),2.54(m,1H),2.31(m,1H)。
参考实施例2：
(a)(+)-反式-2-(2-氯苯基)-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-5,7-二甲氧基-
苯并吡喃-4-酮的制备
在0℃、氮气气氛以及搅拌下，将氢化钠(50％，0.54g，11.25mmol)分批添加至(-)-反式-1-[2-羟基-3-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-4,6-二甲氧基苯基)-乙酮(0.7g，2.2mmol)在无水DMF(15mL)中的溶液中。10min后，添加2-氯苯甲酸甲酯(1.15g，6.75mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌2h。在低于20℃下小心地添加甲醇。将反应混合物倒在碎冰(300g)上，用1:1HCl(pH 2)酸化，并采用EtOAc(2x 100mL)萃取。将水层用饱和Na2CO3(pH10)碱化并采用CHCl3(3x 200mL)萃取。将有机层干燥(无水Na2SO4)并浓缩。向残余物中添加浓盐酸(25mL)并在室温下搅拌2h。将反应混合物倒在碎冰(300g)上并用饱和Na2CO3水溶液使其呈碱性。采用CHCl3(3x 200mL)萃取混合物。将有机萃取物用水洗涤，干燥(无水Na2SO4)并浓缩，以获得化合物(+)-反式-2-(2-氯-苯基)-8-(2-羟甲基-1-甲基-吡咯烷-3-基)-5,7-二甲氧基-苯并吡喃-4-酮。
产量：0.67g(64％)；mp:91-93℃；[α]D 25＝+5.8°(c＝0.7,甲醇)；IR(KBr):3431,1648,1598,1571cm-1；1H NMR(CDCl3,300MHz):δ7.70(dd,1H),7.52(m,1H),7.45(m,2H),6.50(s,1H),6.44(s,1H),4.17(m,1H),4.00(s,3H),3.97(s,3H),3.64(dd,1H),3.40(d,1H),3.15(m,1H),2.74(d,1H),2.52(m,1H),2.32(s,3H),2.00(m,2H)；MS(ES+):m/z 430(M+1)。
(b)(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基-吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮的制备
将熔融的吡啶盐酸盐(4.1g，35.6mmol)添加至(a)部分中获得的化合物(0.4g,0.9mmol)中并在180℃下加热1.5h。将反应混合物冷却至25℃，用MeOH(10mL)稀释并用Na2CO3碱化至pH 10。将混合物过滤并将有机层浓缩。将残余物悬浮于水(5mL)中，搅拌30min，过滤并干燥，以获得化合物(+)-反式-2-(2-氯-苯基)-5,7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基-吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮。
产量：0.25g(70％)；IR(KBr):3422,3135,1664,1623,1559cm-1；1H NMR(CDCl3,300MHz):δ7.56(d,1H),7.36(m,3H),6.36(s,1H),6.20(s,1H),4.02(m,1H),3.70(m,2H),3.15(m,2H),2.88(m,1H),2.58(s,3H),2.35(m,1H),1.88(m,1H)；MS(ES+):m/z 402(M+1)；分析:C21H20ClNO5C,62.24(62.71)；H,5.07(4.97)；N,3.60(3.48)；Cl,9.01(8.83)。
(c)(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基-吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮盐酸盐(化合物B或riviciclib)的制备
将在(b)部分中获得的化合物(0.2g，0.48mmol)悬浮于IPA(5mL)中并添加3.5％HCl(25mL)。将悬浮液加热以得到澄清溶液。将该溶液冷却并过滤出固体，以获得化合物(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基-吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮盐酸盐。
产量：0.21g(97％)；mp:188–192℃；[α]D 25＝+21.3°(c＝0.2,甲醇)；1H NMR(CD3OD,300MHz):δ7.80(d,1H),7.60(m,3H),6.53(s,1H),6.37(s,1H),4.23(m,1H),3.89(m,2H),3.63(m,1H),3.59(dd,1H),3.38(m,1H),2.90(s,3H),2.45(m,1H),2.35(m,1H)；MS(ES+):m/z 402(M+1)(游离碱)。
生物学数据：
药理学试验：
实施例1：
I.涉及在BRAFV600E突变的黑素瘤细胞系中使用化合物A(CDK抑制剂，也称为voruciclib)和维罗非尼(BRAFV600E抑制剂)的组合的体外研究
目的:
研究化合物A(CDK抑制剂，也称为voruciclib)和维罗非尼(BRAFV600E抑制剂)的组合对BRAFV600E突变的黑素瘤细胞系的细胞周期和凋亡的影响。
材料与方法:
细胞系
在本研究中使用从ATCC(美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection))(USA)获得的G361和SK-MEL3黑素瘤细胞系。G361是维罗非尼敏感的细胞系，而SK-MEL3是维罗非尼抗性细胞系。这两种细胞系均是BRAFV600E突变的。
A.使用流式细胞术对细胞周期分布的分析
将G361/SK-MEL3黑素瘤细胞接种到25mm3组织培养瓶中。24h后，用以下物质处理G361细胞：i)化合物A(1μM)；ii)维罗非尼(1μM)；以及iii)化合物A(1μM)和维罗非尼(1μM)一起，持续5天。
对于SK-MEL3黑素瘤细胞，用以下物质处理该细胞：i)化合物A(1μM)；ii)维罗非尼(10μM)；以及iii)化合物A(1μM)和维罗非尼(10μM)一起，持续5天。
对照细胞不予处理保持5天。在5天结束时收获脱壁的细胞和贴壁的细胞。通过在1000rpm下离心10min，将细胞用约5mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次。将细胞重悬于500μL的PBS中并在500μL冰冷的70％乙醇中固定。将固定的细胞在室温下温育30min，在1000rpm下旋转10min。向细胞沉淀物中添加1mL冷冻的70％乙醇，并在0℃以下保存直到进一步分析。将细胞用PBS洗涤两次以去除固定剂，并重悬于250μL PBS中。向其中添加12.5μL碘化丙啶(在PBS中1mg/mL)和12.5μL核糖核酸酶A(Rnase A)(1mg/mL)。在37o C温育30min后，用流式细胞术对细胞进行分析。
根据制造商的建议将流式细胞仪(Becton Dickinson FACS Calibur,USA)用于这些研究。设定在488nm的氩离子激光器用作激发源。如通过红色荧光水平所定义的，将具有2n到4n的DNA含量的细胞指定为正处于细胞周期的G1、S和G2/M期。将表现出低于2n DNA含量的细胞指定为亚-G1(sub-G1)细胞。将在每个细胞周期阶段的细胞数表示为占存在的细胞总数的百分比。
B.膜联蛋白V-FITC染色(用于早期凋亡的检测)
膜联蛋白V-FITC是用于识别凋亡细胞的灵敏探针。在早期凋亡过程中，膜磷脂磷脂酰丝氨酸(PS)从质膜的内部易位到外部小叶，从而将PS暴露于外部细胞环境。膜联蛋白V是35-36kDa的钙依赖性磷脂结合蛋白，其对PS具有高亲和性并与具有暴露的PS的细胞结合。
碘化丙啶是极性染料，其通过渗漏的膜进入细胞，因此与异硫氰酸荧光素(FITC)一起用于后期凋亡的检测。
将黑素瘤细胞G361接种到25mm3组织培养瓶中。24h后，用以下物质处理细胞：i)化合物A(1μM)；ii)维罗非尼(1μM)；以及iii)化合物A(1μM)和维罗非尼(1μM)一起；持续24h。对照细胞不予处理保持24小时。在不同的时间点用胰蛋白酶收获后，收集含有漂浮细胞的培养基并将其与贴壁细胞合并。通过在1000rpm下离心10分钟，将细胞用冷PBS洗涤两次。将细胞沉淀物以1x 106个细胞/mL的浓度重悬于1X结合缓冲液(10mm HEPES pH 7.4，140mMNaCl，2.5mM CaCl2)中。将100μL溶液(1x 105个细胞)用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶染色。将细胞在暗处在室温(25-30℃)下温育15min，并通过流式细胞术分析样品。
结果:
这些研究的结果在图1-3中示出。
结论：
图1表明，维罗非尼处理的G361细胞相对于对照细胞(72.36％)显示出显著的G1阻滞(91.94％)。从亚G1期看出，用单独的化合物A和维罗非尼处理的细胞分别显示了仅9.48％和2.3％的凋亡，而用化合物A和维罗非尼的组合处理细胞时，显示53.67％的细胞正经历凋亡，表明该组合是协同性的。
在图2中，右上方象限表示处于早期凋亡中的G361细胞。随后这些细胞经历凋亡，从而导致细胞死亡。用化合物A和维罗非尼的组合处理的细胞显示27％的细胞处于早期凋亡(膜联蛋白染色的细胞)，与之相比，仅用化合物A和维罗非尼处理的细胞分别显示8％和20％。该数据表明，该组合表现出协同作用。
在图3中，仅用维罗非尼处理的SK-MEL3细胞相对于对照细胞(67.38％)显示出显著的G1阻滞(76.78％)。从亚G1期看出，在29.75％的用化合物A和维罗非尼的组合处理的细胞中观察到凋亡，而单独用化合物A和维罗非尼处理的细胞仅分别显示19.63％和15.12％的凋亡，表明该组合是协同性的。
如图1-3所示以及如上文所解释的结果清楚地证明，化合物A和维罗非尼的组合在维罗非尼敏感性和抗性BRAFV600E突变的黑素瘤细胞系中是协同性的，并且与化合物A和维罗非尼单独使用时相比，联合使用时诱导了更多的凋亡。
II.化合物A与维罗非尼(BRAFV600E抑制剂)在人BRAF突变的黑素瘤细胞中的体外双重组合研究
目的:本研究的目的在于评估化合物A(CDK抑制剂)和维罗非尼(BRAFV600E抑制剂)的组合在BRAF突变的黑素瘤细胞中的功效。
A.材料
测试化合物：化合物A(在PEL的实验室中制备)；维罗非尼(南京康满林化工实业有限公司(Nanjing Chemlin Chemical Industry Co.,Ltd),中国)
媒介物：DMSO(Sigma-Aldrich-Chemie Gmbh,德国)
剂量制品：将化合物A和维罗非尼称重，并溶解于所需量的DMSO中以产生需要的储备溶液。
测试系统：测试系统包括G361、A375和MDAMB-435S(BRAFV600E突变的)细胞系，其购自ATCC(美国模式培养物保藏所),USA。
B.方法
使用不同组合的化合物A和维罗非尼的细胞毒性研究采用CCK8活细胞脱氢酶试验进行。
i)细胞计数试剂盒-8(CCK8)活细胞脱氢酶试验
将人BRAFV600E突变的黑素瘤癌细胞系G361、A375和MDAMB-435S以3000个细胞/孔的密度接种到96孔板中的199μL RPMI1640培养基中，并温育过夜以使细胞粘附。然后用各自的测试化合物对细胞进行处理。总共10组；
i)单独的1μM维罗非尼，持续48h；
ii)单独的0.3μM/0.1μM化合物A，持续48h；
iii)单独的1μM/0.3μM化合物A，持续48h；
iv)单独的3μM/1μM化合物A，持续48h；
v)单独的10μM/3μM化合物A，持续48h；
vi)0.3μM/0.1μM化合物A和1μM维罗非尼的组合，持续48h；
vii)1μM/0.3μM化合物A和1μM维罗非尼的组合，持续48h；
viii)3μM/1μM化合物A和1μM维罗非尼的组合，持续48h；
ix)10μM/3μM化合物A和1μM维罗非尼的组合，持续48h；
x)对照孔用DMSO媒介物处理48h。
将板在37°±1℃下在加湿的5％CO2培养箱中温育。对于全部三种不同的细胞系，使用1.0μM浓度的维罗非尼，而在A375黑素瘤细胞的情况下使用0.3μM、1μM、3μM和10μM浓度的化合物A，并且在G361和MDA MB435S黑素瘤细胞的情况下使用0.1μM、0.3μM、1.0μM、3.0μM浓度的化合物A。在温育期结束时，采用CCK8细胞毒性测定方案对该板进行测定。通过采用Chou和Talalay(4)的Compusyn软件计算的联合指数(CI)来确定协同作用。CI<1为协同性的，CI＝1为累加性的，而CI>1为拮抗性的。
统计学分析：
采用Student t检验进行统计学分析，并且认为<0.05的p值是显著性的。数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。平均值从至少两次独立实验(均一式三份进行)获得。
ii)细胞毒性测定方案
将对数生长的细胞以3x 103个细胞/孔的密度接种并使其恢复16-18h。将细胞用不同浓度的两种化合物(化合物A和维罗非尼)攻击48h。48h后，通过CCK-8试剂(DojindoMolecular Technologies,Inc,Maryland和日本)确定细胞毒性。根据制造商的说明，添加5μL/孔的CCK-8试剂并将板温育2h。通过在Tecan Sapphire多荧光微板读取仪上测量450nm波长处(相对于650nm进行校正)的吸光度来确定毒性，并将其相对于对照进行归一化。所有实验均一式三份进行两次。
化合物A和维罗非尼的处理方案：
表1和表2分别说明了化合物A和维罗非尼在A375细胞中和在G361和MDA-MB435S细胞中的处理时间表。
表1：化合物A和维罗非尼在A375细胞中的处理时间表
表2：化合物A和维罗非尼在G361和MDA-MB435S细胞中的处理时间表
结果:
表3中示出了化合物A和维罗非尼及其组合在不同细胞系中的细胞毒性的IC50值。图4-6和表4-6示出了化合物A和维罗非尼的组合在不同黑素瘤细胞系中的效果。
表3：化合物A和维罗非尼在G361、A375和MDAMB-435S(BRAFV600E突变的)细胞系中的IC50确定
在图4-6中，X轴示出了单独的化合物A和维罗非尼以及化合物组合的浓度，左侧Y轴示出了％细胞毒性而右侧Y轴示出了联合指数值。
在图4中，用1μM的维罗非尼处理的细胞显示了23％的抑制，而用3μM化合物A处理的细胞显示了46％的细胞抑制。然而，当用该次优浓度的维罗非尼联用化合物A处理细胞时，观察到具有83％细胞抑制、联合指数(CI)为0.70的协同效应。所显示的协同作用数据代表两次独立实验(均一式三份进行)的平均值。
表4：化合物A和维罗非尼的组合在A375细胞中的平均联合指数值
在图5中，用1μM的维罗非尼处理的细胞显示了30％的抑制，而用0.3μM的化合物A处理的细胞仅显示了2％的细胞抑制。然而，当用该次优浓度的维罗非尼联用化合物A处理细胞时，观察到具有52％细胞抑制、联合指数值为0.77的显著的协同效应。当用化合物A(3μM)联用维罗非尼(1μM)处理细胞时，显示了91％的细胞抑制，联合指数为0.9。所显示的协同作用数据代表两次独立实验(均一式三份进行)的平均值。
表5：化合物A和维罗非尼的组合在G361细胞中的平均联合指数值
在图6中，用1μM的维罗非尼处理的细胞显示了31％的细胞抑制，而用1μM的化合物A处理的细胞显示了32％的细胞抑制。当用该次优浓度的维罗非尼联用化合物A处理细胞时，注意到具有90％的细胞抑制、联合指数为0.74的协同效应。所显示的协同作用数据代表两次独立实验(均一式三份进行)的平均值。
表6：化合物A和维罗非尼的组合在MDA MB-435S细胞中的平均联合指数值
结论：
维罗非尼和化合物A的组合在BRAF突变的黑素瘤细胞中显示出显著的协同效应。
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实施例2：
A.化合物A(CKD抑制剂，也称为voruciclib)与一种选自BRAF抑制剂(维罗非尼或达拉非尼)或MEK抑制剂(曲美替尼)的抗癌剂在人BRAF-V600E突变的黑素瘤细胞系(A375)及其维罗非尼抗性衍生物(A375R)中的体外组合研究
目的:
本研究的目的在于评估CKD抑制剂(voruciclib)与BRAF抑制剂(维罗非尼或达拉非尼)或MEK抑制剂(曲美替尼)的组合在BRAF突变的黑素瘤细胞中的功效。
B.材料：
测试化合物：化合物A(在PEL的实验室中制备)；维罗非尼(Selleckchem USA,S1267)；达拉非尼(Selleckchem USA,S2807)和曲美替尼(Selleckchem USA,S2673)
媒介物：DMSO(Sigma-Aldrich-Chemie Gmbh,德国)
剂量制品：将测试化合物称重，并溶解于所需量的DMSO中以产生需要的贮备溶液。
测试系统：测试系统包括购自ATCC(美国模式培养物保藏所(USA)的A375(BRAFV600E突变的)细胞系和A375R细胞系(维罗非尼抗性的—在PEL的实验室中开发的)
C.方法
使用作为单一药剂和组合形式的所有测试化合物的细胞毒性研究采用CCK8活细胞脱氢酶试验进行。
细胞计数试剂盒-8(CCK8)活细胞脱氢酶试验：
采用Tecan自动化平台(FreedomEvo液体处理系统)将对数生长的人BRAFV600E突变的黑素瘤细胞以1500个细胞/孔的密度接种到384孔板(Corning，USA)中的30μLDulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中，并温育约12-16h以使细胞粘附。然后用不同剂量的作为单一疗法(单独使用)和组合形式的化合物A和抗癌剂(维罗非尼或达拉非尼或曲美替尼)将细胞处理48h。对于每一种组合(例如，化合物A和维罗非尼的组合)均进行使用不同剂量的研究。表7A-7C中示出了测试化合物在A375和A375R细胞中单独和联合使用时的处理比(即，化合物A和维罗非尼的组合；化合物A和达拉非尼的组合；以及化合物A和曲美替尼的组合)。使用以下剂量的化合物A(μM)：1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.015；维罗非尼(μM)30、15、7.5、3.75、1.875、0.9、0.4、0.2、0.1、0.05；达拉非尼(μM)3、1.5、0.75、0.37、0.18、0.09、0.04、0.02、0.01、0.005；曲美替尼(μM)1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.031、0.015、0.007、0.003、0.001。如表7A-7C所示，上述剂量的抗癌剂(维罗非尼或达拉非尼或曲美替尼)以多种比例与化合物A混合。所用的对照为只有细胞或连同媒介物(DMSO)一起的细胞。
将板在37°±1℃下在加湿的5％CO2培养箱中温育48h。温育后，使用CCK8试剂(Dojindo Molecular Technologies,Inc,Maryland和日本)对该板进行测定。根据制造商的说明，向384孔板的每个孔中添加3μL CCK-8试剂并将该板温育2h。通过在TecanSapphire多荧光微板读取仪上测量在450nm波长处的吸光度来确定毒性，并将其相对于对照进行归一化。所有实验均一式四份进行。
组合的效力采用Calcusyn软件(Biosoft，Ferguson，MO，USA)进行定量，该软件基于计算联合指数(CI)的Chou Talalay方法，其中CI值小于1表示协同作用。
表7A-7C：在A375和A375R细胞中作为单一疗法(单独使用)和组合形式的化合物A和抗癌剂(维罗非尼或达拉非尼或曲美替尼)的处理比
表7A中示出了化合物A(用A表示)和维罗非尼(用V表示)单独或组合的处理比。
表7A：
表7B中示出了化合物A(用A表示)和达拉非尼(用D表示)单独或组合的处理比。
表7B：
表7C中示出了化合物A(用A表示)和曲美替尼(用T表示)单独或组合的处理比。
表7C：
结果:
这些研究的结果在图7-13中示出。
结论：
1.从图7a和7b可以得出以下结论：A375细胞系对维罗非尼非常敏感而A375R对其具有抗性。而且，A375和A375R对化合物A(voruciclib)同样敏感。
2.从图8a和8b可以得出以下结论：化合物A(voruciclib)和维罗非尼的组合在A375细胞系中显示了强协同作用(CI<0.5)。
3.从图9a和9b可以得出以下结论：化合物A(voruciclib)和维罗非尼的组合在A375R细胞系中显示了强协同作用(CI<0.5)。
4.从图10a和10b可以得出以下结论：化合物A(voruciclib)和达拉非尼的组合在A375细胞系中显示了强协同作用(CI<0.5)。
5.从图11a和11b可以得出以下结论：化合物A(voruciclib)和达拉非尼的组合在A375R细胞系中显示了强协同作用(CI<0.5)。
6.从图12a和12b可以得出以下结论：化合物A(voruciclib)和曲美替尼的组合在A375细胞系中显示了强协同作用(CI<0.5)。
7.从图13a和13b可以得出以下结论：化合物A(voruciclib)和曲美替尼的组合在A375R细胞系中显示了强协同作用(CI<0.5)。

Claims (19)

1.式I化合物或其药学上可接受的盐的CDK(细胞周期蛋白依赖性激酶)抑制剂，和选自维罗非尼、达拉非尼和曲美替尼的至少一种抗癌剂的组合在制备用于治疗需要其的受试者中的黑素瘤的药物中的用途；
其中Ar是2-氯-4-三氟甲基苯基。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述CDK抑制剂是(+)-反式-2-(2-氯-4-三氟甲基苯基)-5,7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基-吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮盐酸盐。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述抗癌剂是维罗非尼。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述抗癌剂是达拉非尼。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述抗癌剂是曲美替尼。
6.根据权利要求1到5中的任一项所述的用途，其中向有需要的受试者同时施用所述CDK抑制剂和所述至少一种抗癌剂。
7.根据权利要求1到5中的任一项所述的用途，其中向有需要的受试者依次施用所述CDK抑制剂和所述至少一种抗癌剂。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述黑素瘤是非难治性黑素瘤。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述黑素瘤是非难治性BRAF突变型黑素瘤。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述黑素瘤是非难治性BRAFV600突变型黑素瘤。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述黑素瘤是非难治性BRAFV600E或BRAFV600K突变型黑素瘤。
12.根据权利要求1所述的用途，其中所述黑素瘤是复发性或难治性黑素瘤。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述黑素瘤是复发性或难治性BRAF突变型黑素瘤。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述黑素瘤是复发性或难治性BRAFV600突变型黑素瘤。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述黑素瘤是复发性或难治性BRAFV600E黑素瘤或BRAFV600K突变型黑素瘤。
16.根据权利要求1所述的用途，其中所述黑素瘤是转移性黑素瘤。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述黑素瘤是转移性BRAF突变型黑素瘤。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述黑素瘤是转移性BRAFV600突变型黑素瘤。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述黑素瘤是转移性BRAFV600E黑素瘤或BRAFV600K突变型黑素瘤。
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