CN105527425A - 一种复合病毒半定量检测金标卡及制备方法 - Google Patents

一种复合病毒半定量检测金标卡及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105527425A
CN105527425A CN201510951214.1A CN201510951214A CN105527425A CN 105527425 A CN105527425 A CN 105527425A CN 201510951214 A CN201510951214 A CN 201510951214A CN 105527425 A CN105527425 A CN 105527425A
Authority
CN
China
Prior art keywords
detection line
gold
line
control line
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510951214.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105527425B (zh
Inventor
张玉宝
王亚军
谢忠奎
王若愚
郭志鸿
王乐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwest Institute of Eco Environment and Resources of CAS
Original Assignee
Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute of CAS filed Critical Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute of CAS
Priority to CN201510951214.1A priority Critical patent/CN105527425B/zh
Publication of CN105527425A publication Critical patent/CN105527425A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105527425B publication Critical patent/CN105527425B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种百合X病毒、百合李属坏死环斑病毒和百合草莓潜隐环斑病毒复合半定量检测金标卡及制备方法，为了进一步提高胶体金免疫层析检测方法的使用效率和田间普及率，降低检测成本，实现对百合病毒的同步、快速且半定量检测，将检测线增加至九条，再将已知量的有浓度差异的抗体分别包被于检测线，研制能同时半定量检测LVX、PNRSV和SLRSV的金标卡，满足百合大规模脱毒及田间对百合病毒快速半定量检测的需求；本发明金标卡检测效率高，检测成本进一步降低，一次性检测病毒种类更齐全；此外，操作简便，准确性高，特异性强，重复性好。

Description

一种复合病毒半定量检测金标卡及制备方法
技术领域
本发明涉及一种能实现百合三种病毒快速半定量检测的复合金标卡及制备方法，具体指运用胶体金免疫层析法，研制出同时能快速半定量检测百合X病毒（LVX）、百合李属坏死环斑病毒（PNRSV）和百合草莓潜隐环斑病毒(SLRSV)的复合金标卡及其制备方法。
背景技术
百合（Liliumspp.）是百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）多年生草本植物，是一种集观赏、食用、药用价值于一身的重要经济作物；在中国，食用和药用百合产业发展较好；食用百合属于稀有特种蔬菜，是具有清热润肺、增强免疫力等保健功能的绿色食品，市场需求量很大，尤其是兰州百合以含糖量高，粗纤维少，肉质细腻，营养丰富而享有很高的声誉；对于切花百合，我国上世纪80年代末就开始了切花生产，但自繁百合种球病毒病等病害严重，种球质量难以达到国外同类产品的水平，目前国内百合切花生产中90%以上的种球依赖进口，每年进口百合种球1.5亿个，耗资巨大。
随着国内百合种植面积的扩大，加之进口种球质量参差不齐，无性繁殖使病毒广泛传播并积累，除了常见的百合斑驳病毒－Lilymottlevirus,LMoV、百合黄瓜花叶病毒－Cucumbermosaicvirus,CMV和百合隐症病毒－Lilysymptomlessvirus,LSV）外，近年来，相继有百合X病毒（LilyvirusX,LVX）、李属坏死环斑病毒（Prunusnecroticringspotvirus,PNRSV）和草莓潜隐环斑病毒（Strawberrylatentringspotvirus,SLRSV）等被报道可以侵染百合，且侵染率超过了20%，造成百合叶片褪绿并出现黄条纹、叶畸形、植株矮化、产量以及品质下降等现象，严重时可引起毁灭性灾害。
LVX为马铃薯X病毒属(Potexvirus)成员，LVX粒子无包膜，呈弯曲纤丝状，长470nm，直径13nm，外壳蛋白（CP）呈螺旋状，其上有模糊的沟状结构；LVX基因组由5823个核苷酸组成，3'-末端具有poly(A)尾巴，CP亚基分子量大小为22.0kDa左右；PNRSV属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)，PNRSV是正单链的RNA病毒，核酸大小为8.056kb，PNRSV病毒粒子形态为等轴对称多面体，直径约为22-23nm，CP蛋白含一种亚基，分子量约为25.0kDa；SLRSV隶属于伴生豇豆病毒科（Secoviridae）温州蜜柑矮缩病毒属（Sadwavirus），SLRSV是单链的RNA病毒，病毒粒子形态为球状，大小相等，直径30nm，CP蛋白包含大小两种亚基，分子量分别约为43.0和26.0kDa。
经过大量的调查和田间取样检测，发现病毒病可使食用百合的产量由每亩1500公斤降至600公斤，甚至更少，2012年7月，兰州百合种植区域爆发了严重的病毒病灾害，导致大面积枯死，给农户带来了巨大的经济损失；病毒病已造成百合种源严重退化，已是制约百合产业发展的重要因素；如何对百合常见病毒实现全面、快速检测，已成为百合产业发展的迫切需要。
目前，对LVX、PNRSV和SLRSV检测的主要技术和方法有电子显微镜技术、酶联免疫法（ELISA)和核酸检测法（PCR）等，但这些技术和方法普遍存在检测程序复杂、耗时（6-7h/样）、分析费用高、对仪器和实验人员的技术水平要求高等问题，很难在生产中得到普遍推广应用；胶体金免疫层析是以硝酸纤维素膜为载体，通过液体的渗移，利用抗原抗体的结合，以及胶体金呈现颜色反应来检测抗原或抗体；该方法可以避免以上几种检测方法的缺点，以其特异性强、成本低、操作简便、不需任何仪器、适合现场快速检测等优点已被广泛接受，已用于包括烟草斑驳病毒、南瓜花叶病毒等多种植物病毒的检测。
对于百合病毒，目前已有用胶体金免疫层析法检测LMoV和LSV等的相关报道(Zhangetal.,2015,JVirolMethods,220)，但是其只能进行定性检测，也就是说检测结果仅能定性判断病毒的有或无，对于阳性结果无法得知被检样品病毒含量的差异，田间防治病毒时依旧盲目而缺乏科学依据，从而阻碍了该方法的广泛普及与推广。
近年来，通过我们对田间感病毒程度不同的百合叶片叶绿体超微结构、光合色素含量、防御酶活性等生理生化指标的测定和分析，发现许多阳性植株通常无明显症状，其叶绿体结构、光合色素含量以及株高、茎粗、叶片形状等生长指标与健康植株没有差异；而部分阳性植株叶片形成了轻微的斑驳条纹，叶绿体结构被部分破坏，光合色素含量以及株高、茎粗等生长指标显著低于健康植株；也发现少量的阳性植株出现了明显的斑驳条纹或坏死斑，叶片严重变小，植株严重矮化，生理测定发现其叶绿体结构被严重破坏，光合色素含量显著低于健康植株(Zhangetal.,2014,PhilippAgricScientist,97(1))；进一步通过对病毒含量的Real-timePCR检测，证实出现严重症状的阳性植株，其病毒相对含量是无症状阳性植株的1000倍以上(Zhangetal.,2014,PhilippAgricScientist,97(2))；以上实验结果说明病毒含量的差异对百合生长影响的差异较大，所以对于感病程度不同的阳性植株应该采取不同的策略，科学管理、合理防治，最大程度降低病毒对百合生长的危害；可见，检测病毒含量的差异将对田间病毒管理起到非常重要的指导意义。
此外，目前对于百合病毒的防治主要以杀灭传播介体-蚜虫为主，对于如何科学地喷施抗百合病毒药剂，喷施抗病毒药剂后百合病毒增殖是否被抑制，若已抑制，抑制的程度如何等问题均没有相关报道，而这些问题的解决首先依赖于半定量检测；因此，实现半定量检测的意义重大。
本发明为了进一步提高胶体金免疫层析检测方法的使用效率和田间普及率，降低检测成本，实现对百合常见病毒的快速且半定量检测，我们通过对已有胶体金免疫层析技术进行不断优化和改进，采用了多向免疫层析技术，研制能一次性同时半定量检测LVX、PNRSV和SLRSV的复合金标卡，解决LVX、PNRSV和SLRSV单一半定量检测金标卡技术存在的单一性、局限性以及传统的百合病毒检测方法成本高、耗时长、对仪器设备和专业技能要求高等问题的束缚，让种植人员在田间便可掌握病毒快速检测技术，在健康种源的选择以及百合种植和生长的全过程内随时检测病毒，为百合病毒病的动态监测和防治提供数据支持。该LVX、PNRSV和SLRSV的多向复合金标卡的开发，将为加快百合产业化的发展、提高百合产区农业的经济效益，增加农民收入，促进脱贫致富做出贡献。
发明内容
本发明的目的是运用胶体金免疫层析法研制一种能同时快速半定量检测三种百合病毒LVX、PNRSV和SLRSV的复合金标卡及其制备方法。
本发明金标卡可一次性同时快速半定量检测LVX、PNRSV和SLRSV，无需任何仪器和设备，便可准确检测样品之间三种病毒含量的差异；较LVX、PNRSV和SLRSV单一半定量检测金标卡，本发明金标卡检测效率更高，检测成本进一步降低，一次性检测病毒种类更齐全；此外，其操作简便，携带方便，检测快速，特异性强，重复性好；可见本发明特别适用于百合病毒的动态监测，也特别适合在田间推广应用，并且可靠性很高。
本发明的技术方案为：
一种百合X病毒、百合李属坏死环斑病毒和百合草莓潜隐环斑病毒复合半定量检测金标卡，包括：金标卡槽1，衬板26，样品垫18，第一胶体金结合垫19，第二胶体金结合垫21，第三胶体金结合垫23，第一硝酸纤维素膜20，第二硝酸纤维素膜22，第三硝酸纤维素膜24，吸水滤纸25，其特征在于：金标卡槽1包括上壳体和下壳体，上壳体和下壳体通过卡扣连接，上壳体设有加样孔2、第一反应窗3、第二反应窗4和第三反应窗5，样品垫18置于加样孔2下方，第一硝酸纤维素膜20置于第一反应窗3下方，第二硝酸纤维素膜22置于第二反应窗4下方，第三硝酸纤维素膜24置于第三反应窗5下方，第一胶体金结合垫19上含有兔抗LVXIgG，第二胶体金结合垫21上含有兔抗PNRSVIgG，第三胶体金结合垫23上含有兔抗SLRSVIgG，衬板26固定于金标卡槽1中，样品垫18、第一胶体金结合垫19、第一硝酸纤维素膜20和吸水滤纸25依次排列连接于衬板26右侧上表面，第二胶体金结合垫21、第二硝酸纤维素膜22和吸水滤纸25依次排列连接于衬板26下侧上表面，第三胶体金结合垫23、第三硝酸纤维素膜24和吸水滤纸25依次排列连接于衬板26左侧上表面，第一硝酸纤维素膜20上设有第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8和第一对照线9，第二硝酸纤维素膜22上设有第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12和第二对照线13，第三硝酸纤维素膜24上设有第七检测线14、第八检测线15、第九检测线16和第三对照线17，第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗LVXIgG，第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗PNRSVIgG，第七检测线14、第八检测线15、第九检测线16上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗SLRSVIgG，第一对照线9、第二对照线13和第三对照线17上均包被的是羊抗兔IgG，第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8上LVXIgG包被量分别为1.5～2.0pg、0.75～1.0μg和1.5～2.0μg蛋白，第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12上PNRSVIgG包被量分别为2.5～3.0pg、1.25～1.5μg和2.5～3.0μg蛋白，第七检测线14、第八检测线15、第九检测线16上兔抗SLRSVIgG包被量分别为2.5～3.0pg、1.25～1.5μg和2.5～3.0μg蛋白，第一胶体金结合垫19上兔抗LVXIgG标记量为16μg/mL，第二胶体金结合垫21上兔抗PNRSVIgG标记量为20μg/mL，第三胶体金结合垫23上兔抗SLRSVIgG标记量为22μg/mL，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5～3.0μg蛋白。
其中在用所述金标卡检测时，在所述加样孔处加入百合样品的待检溶液，对比第一反应窗、第二反应窗和第三反应窗内第一至第九检测线以及第一至第三对照线的颜色，即可判定被检百合是否感染了百合X病毒、李属坏死环斑病毒或草莓潜隐环斑病毒，若已感染，可以进一步判定被检测样品病毒含量的差异。
其中将待检溶液加入所述金标卡的加样孔内，若待检溶液中含有LVX，在第一反应窗3内，检测样品经过所述第一胶体金结合垫19时，LVX与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一至第三检测线6、7、8方向渗移，当接触到所述第一检测线6时发生抗原抗体结合反应而被全部截留下来，形成可见的淡红色条带；金标垫上剩余的金标多克隆抗体继续向所述第二检测线7和第三检测线8方向渗移，当接触到所述第二检测线7和第三检测线8时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9方向渗移，当接触到所述第一对照线9时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第二反应窗4和第三反应窗5内，检测样品经过所述第二和第三胶体金结合垫21、23时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第四至第九检测线10、11、12、14、15、16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第二对照线13和第三对照线17方向渗移，当接触到所述第二和第三对照线13和17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第二至第九检测线7、8、10、11、12、14、15、16没有颜色变化，而第一检测线6出现淡红色、第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合X病毒，病毒含量低，田间防治以杀灭蚜虫为主；
若待检溶液中含有LVX，在第一反应窗3内，检测样品经过所述第一胶体金结合垫19时，LVX与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一至第三检测线6、7、8方向渗移，当接触到所述第一检测线6时发生抗原抗体结合反应而被部分截留下来，形成可见的淡红色条带；剩余的复合物继续往第二检测线7、第三检测线8方向渗移，当接触到第二检测线7时发生抗原抗体结合反应被全部截留下来，形成淡红色条带；剩余的金标多克隆抗体继续向所述第三检测线8和第一对照线9方向渗移，当接触到所述第三检测线8时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9方向渗移，当接触到所述第一对照线9时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第二反应窗4和第三反应窗5内，检测样品经过所述第二和第三胶体金结合垫21、23时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第四至第九检测线10、11、12、14、15、16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第二对照线13和第三对照线17方向渗移，当接触到所述第二和第三对照线13和17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第三至第九检测线8、10、11、12、14、15、16没有颜色变化，而第一检测线6和第二检测线7出现淡红色、第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合X病毒，田间防治采取杀灭蚜虫并喷施抗病毒药剂；
若待检溶液中含有LVX，在第一反应窗3内，检测样品经过所述第一胶体金结合垫19时，LVX与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一至第三检测线6、7、8方向渗移，当接触到所述第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8时分别发生抗原抗体结合反应而被截留下来，第一检测线6、第二检测线7形成淡红色、而第三检测线8形成棕红色条带；剩余的金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9方向渗移，当接触到所述第一对照线9时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第二反应窗4和第三反应窗5内，检测样品经过所述第二和第三胶体金结合垫21、23时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第四至第九检测线10、11、12、14、15、16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第二对照线13和第三对照线17方向渗移，当接触到所述对照线13和17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第四至第九检测线10、11、12、14、15、16没有颜色变化，而第一检测线6和第二检测线7出现淡红色、第三检测线8以及第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合X病毒，且病毒含量高，田间防治应增加抗病毒药剂的使用量和使用频次，同时杀灭蚜虫；
若待检溶液中含有PNRSV，在第二反应窗4内，检测样品经过所述第二胶体金结合垫21时，PNRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第四至第六检测线10、11、12方向渗移，当接触到所述第四检测线10时发生抗原抗体结合反应而被全部截留下来，形成可见的淡红色条带；金标垫上剩余的金标多克隆抗体继续向所述第五检测线11、第六检测线12方向渗移，当接触到所述第五检测线11和第六检测线12时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第二对照线13方向渗移，当接触到所述第二对照线13时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗3和第三反应窗5内，检测样品经过所述第一和第三胶体金结合垫19、23时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线6、7、8以及第七至第九检测线14、15、16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9和第三对照线17方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线9、17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第三、第五至第九检测线6、7、8、11、12、14、15、16没有颜色变化，而第四检测线10出现淡红色、第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合李属坏死环斑病毒，病毒含量低，田间防治以杀灭蚜虫为主；
若待检溶液中含有PNRSV，在第二反应窗4内，检测样品经过所述第二胶体金结合垫21时，PNRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第四至第六检测线10、11、12方向渗移，当接触到所述第四检测线10时发生抗原抗体结合反应而被部分截留下来，形成可见的淡红色条带；剩余的复合物继续往所述第五检测线11、第六检测线12方向渗移，当接触到所述第五检测线11时发生抗原抗体结合反应而被全部截留下来，形成可见的淡红色条带；剩余的金标多克隆抗体继续向所述第六检测线12和第二对照线13方向渗移，当接触到所述第六检测线12时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第二对照线13方向渗移，当接触到所述第二对照线13时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗3和第三反应窗5内，检测样品经过所述第一和第三胶体金结合垫19、23时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线6、7、8以及第七至第九检测线14、15、16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9和第三对照线17方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线9、17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第三、第六至第九检测线6、7、8、12、14、15、16没有颜色变化，而第四检测线10和第五检测线11出现淡红色、第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合李属坏死环斑病毒，田间防治采取杀灭蚜虫并喷施抗病毒药剂；
若待检溶液中含有PNRSV，在第二反应窗4内，检测样品经过所述第二胶体金结合垫21时，PNRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第四至第六检测线10、11、12方向渗移，当接触到所述第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，第四检测线10、第五检测线11形成淡红色、而第六检测线12形成棕红色条带；剩余的金标多克隆抗体继续向所述第二对照线13方向渗移，当接触到所述第二对照线13时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗3和第三反应窗5内，检测样品经过所述第一和第三胶体金结合垫19、23时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线6、7、8以及第七至第九检测线14、15、16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9和第三对照线17方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线9、17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第三、第七至第九检测线6、7、8、14、15、16没有颜色变化，而第四检测线10和第五检测线11出现淡红色、第六检测线12以及第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合李属坏死环斑病毒，且病毒含量高，田间防治应增加抗病毒药剂的使用量和使用频次，同时杀灭蚜虫；
若待检溶液中含有SLRSV，在第三反应窗5内，检测样品经过所述第三胶体金结合垫23时，SLRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第七至第九检测线14、15、16方向渗移，当接触到所述第七检测线14时发生抗原抗体结合反应而被全部截留下来，形成可见的淡红色条带；金标垫上剩余的金标多克隆抗体继续向所述第八检测线15、第九检测线16方向渗移，当接触到所述第八检测线15和第九检测线16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第三对照线17方向渗移，当接触到所述第三对照线17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗3和第二反应窗4内，检测样品经过所述第一和第二胶体金结合垫19、21时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线6、7、8以及第四至第六检测线10、11、12时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9和第二对照线13方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线9、13时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第六、第八至第九检测线6、7、8、10、11、12、15、16没有颜色变化，而第七检测线14出现淡红色、第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合草莓潜隐环斑病毒，病毒含量低，田间防治以杀灭蚜虫为主；
若待检溶液中含有SLRSV，在第三反应窗5内，检测样品经过所述第三胶体金结合垫23时，SLRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第七至第九检测线14、15、16方向渗移，当接触到所述第七检测线14时发生抗原抗体结合反应而被部分截留下来，形成可见的淡红色条带；剩余的复合物继续往所述第八检测线15、第九检测线16方向渗移，当接触到所述第八检测线15时发生抗原抗体结合反应而被全部截留下来，形成可见的淡红色条带；金标垫上剩余的金标多克隆抗体继续往所述第九检测线16和第三对照线17方向渗移，当接触到所述第九检测线16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第三对照线17方向渗移，当接触到所述第三对照线17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗3和第二反应窗4内，检测样品经过所述第一和第二胶体金结合垫19、21时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线6、7、8以及第四至第六检测线10、11、12时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9和第二对照线13方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线9、13时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第六、以及第九检测线6、7、8、10、11、12、16没有颜色变化，而第七检测线14和第八检测线15出现淡红色、第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合草莓潜隐环斑病毒，田间防治采取杀灭蚜虫并喷施抗病毒药剂；
若待检溶液中含有SLRSV，在第三反应窗5内，检测样品经过所述第三胶体金结合垫23时，SLRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第七至第九检测线14、15、16方向渗移，当接触到所述第七检测线14、第八检测线15、第九检测线16时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，第七检测线14、第八检测线15形成淡红色条带，第九检测线16形成淡红色条带；剩余的金标多克隆抗体继续向所述第三对照线17方向渗移，当接触到所述第三对照线17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗3和第二反应窗4内，检测样品经过所述第一和第二胶体金结合垫19、21时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线6、7、8以及第四至第六检测线10、11、12时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9和第二对照线13方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线9、13时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第六检测线6、7、8、10、11、12没有颜色变化，而第七检测线14和第八检测线15出现淡红色、第九检测线16以及第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合草莓潜隐环斑病毒，且病毒含量高，田间防治应增加抗病毒药剂的使用量和使用频次，同时杀灭蚜虫；
若待检溶液中不含LVX、PNRSV和SLRSV，在第一、第二和第三反应窗3、4、5内，检测样品经过所述第一、第二和第三胶体金结合垫19、21、23时，则不能与金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第九检测线6、7、8、10、11、12、14、15、16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一、第二和第三对照线9、13、17方向渗移，当接触到所述第一、第二和第三对照线9、13、17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第九检测线6、7、8、10、11、12、14、15、16均没有颜色变化，而仅第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品没有感染百合X病毒、百合李属坏死环斑病毒和百合草莓潜隐环斑病毒。
一种百合X病毒、百合李属坏死环斑病毒和百合草莓潜隐环斑病毒复合半定量检测金标卡的制备方法，按以下步骤进行：（1）兔抗LVXIgG、PNRSVIgG和SLRSVIgG的制备：分别从感染了LVX、PNRSV和SLRSV的百合叶片中提取总RNA进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），扩增LVX、PNRSV和SLRSV的CP基因片段；通过双酶切分别克隆至pET-28a载体；重组质粒转化入E.coliBL21(DE3)，37℃震荡培养，IPTG诱导表达，Ni-NTA柱纯化获得大小分别为22.0、25.0和26.0kDa的高纯度LVX、PNRSV和SLRSV重组蛋白；分别用0.5mg的LVX、PNRSV和SLRSVCP重组蛋白作为免疫原免疫日本大耳白兔，获得抗血清；所得抗血清依次通过20%、50%、33%三个饱和度的硫酸铵沉淀粗提后，透析至pH7.8的磷酸缓冲液，然后使用ProteinG柱进行纯化而分别获得高纯度兔抗LVXIgG、PNRSVIgG和SLRSVIgG；（2）胶体金分别标记兔抗LVXIgG、PNRSVIgG和SLRSVIgG的方法：取半径为30nm的胶体金100mL和兔抗LVXIgG1.6mg（1mg/mL）、半径为30nm的胶体金100mL和兔抗PNRSVIgG2.0mg（1mg/mL）、以及半径为30nm的胶体金100mL和兔抗SLRSVIgG2.2mg（1mg/mL），分别在pH7.8、8.0和7.9的条件下通过磁力搅拌器缓慢搅拌1h使其结合，分别加牛血清白蛋白（BSA）作为稳定剂，使得终浓度为1%，采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及去凝聚物，将沉淀缓慢悬浮于一定体积的缓冲液中，继续离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，反复3次，在离心管底部的深红色沉淀即分别为胶体金-LVXIgG结合物、胶体金-PNRSVIgG结合物以及胶体金-SLRSVIgG结合物；（3）第一、第二、第三胶体金结合垫19、21、23的制备：用1/10标记前胶体金溶液体积的缓冲液分别悬浮胶体金-LVXIgG结合物、胶体金-PNRSVIgG结合物以及胶体金-SLRSVIgG结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，室温下晾干，分别制成第一胶体金结合垫19、第二胶体金结合垫21和第三胶体金结合垫23；（4）第一免疫层析膜20的包被：第一检测线6、第二检测线7及第三检测线8上均包被的是兔抗LVXIgG，第一对照线9上包被的是羊抗兔IgG；（5）第二免疫层析膜22的包被：第四检测线10、第五检测线11及第六检测线12上均包被的是兔抗PNRSVIgG，第二对照线13上包被的是羊抗兔IgG；（6）第三免疫层析膜24的包被：第七检测线14、第八检测线15及第九检测线16上均包被的是兔抗SLRSVIgG，第三对照线17上包被的是羊抗兔IgG；（7）复合半定量检测金标卡的组装：将聚氯乙烯衬板作为支撑载体固定于金标卡槽下壳体中，然后样品垫18、第一胶体金结合垫19、第一硝酸纤维素膜20和吸水滤纸25依次排列连接于衬板右侧上表面，第二胶体金结合垫21、第二硝酸纤维素膜22和吸水滤纸25依次排列连接于衬板下侧上表面，第三胶体金结合垫23、第三硝酸纤维素膜24和吸水滤纸25依次排列连接于衬板左侧上表面，再将金标卡槽上壳体与下壳体通过卡扣连接，就得到LVX、PNRSV和SLRSV复合半定量检测金标卡。
本发明金标卡检测针对性强，成本低，操作简便，结果直观，准确性高，灵敏性强，相比于其他只能进行定性的检测方法，本发明无需借助任何仪器和设备，一次性便可以准确检样品之间三种病毒含量的差异，实现三种病毒同时半定量检测的目的。
附图说明
图1为本发明复合病毒半定量检测金标卡平面结构示意图
图2为本发明复合病毒半定量检测金标卡内部结构示意图
其中：
1——金标卡槽
2——加样孔
3——第一反应窗
4——第二反应窗
5——第三反应窗
6——第一检测线
7——第二检测线
8——第三检测线
9——第一对照线
10——第四检测线
11——第五检测线
12——第六检测线
13——第二对照线
14——第七检测线
15——第八检测线
16——第九检测线
17——第三对照线
18——样品垫
19——第一胶体金结合垫
20——第一硝酸纤维素膜
21——第二胶体金结合垫
22——第二硝酸纤维素膜
23——第三胶体金结合垫
24——第三硝酸纤维素膜
25——吸水滤纸
26——衬板。
具体实施方式
如图1和图2所示的LVX、PNRSV和SLRSV复合半定量检测金标卡，包括：金标卡槽1，衬板26，样品垫18，第一胶体金结合垫19，第二胶体金结合垫21，第三胶体金结合垫23，第一硝酸纤维素膜20，第二硝酸纤维素膜22，第三硝酸纤维素膜24，吸水滤纸25，其特征在于：金标卡槽1包括上壳体和下壳体，上壳体和下壳体通过卡扣连接，上壳体设有加样孔2、第一反应窗3、第二反应窗4和第三反应窗5，样品垫18置于加样孔2下方，第一硝酸纤维素膜20置于第一反应窗3下方，第二硝酸纤维素膜22置于第二反应窗4下方，第三硝酸纤维素膜24置于第三反应窗5下方，第一胶体金结合垫19上含有兔抗LVXIgG，第二胶体金结合垫21上含有兔抗PNRSVIgG，第三胶体金结合垫23上含有兔抗SLRSVIgG，衬板26固定于金标卡槽1中，样品垫18、第一胶体金结合垫19、第一硝酸纤维素膜20和吸水滤纸25依次排列连接于衬板26右侧上表面，第二胶体金结合垫21、第二硝酸纤维素膜22和吸水滤纸25依次排列连接于衬板26下侧上表面，第三胶体金结合垫23、第三硝酸纤维素膜24和吸水滤纸25依次排列连接于衬板26左侧上表面，第一硝酸纤维素膜20上设有第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8和第一对照线9，第二硝酸纤维素膜22上设有第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12和第二对照线13，第三硝酸纤维素膜24上设有第七检测线14、第八检测线15、第九检测线16和第三对照线17，第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗LVXIgG，第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗PNRSVIgG，第七检测线14、第八检测线15、第九检测线16上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗SLRSVIgG，第一对照线9、第二对照线13和第三对照线17上均包被的是羊抗兔IgG，第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8上LVXIgG包被量分别为1.5～2.0pg、0.75～1.0μg和1.5～2.0μg蛋白，第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12上PNRSVIgG包被量分别为2.5～3.0pg、1.25～1.5μg和2.5～3.0μg蛋白，第七检测线14、第八检测线15、第九检测线16上兔抗SLRSVIgG包被量分别为2.5～3.0pg、1.25～1.5μg和2.5～3.0μg蛋白，第一胶体金结合垫19上兔抗LVXIgG标记量为16μg/mL，第二胶体金结合垫21上兔抗PNRSVIgG标记量为20μg/mL，第三胶体金结合垫23上兔抗SLRSVIgG标记量为22μg/mL，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5～3.0μg蛋白。
其中，样品垫、第一、第二和第三胶体金结合垫19、21、23材质均为玻璃纤维素膜，衬板为聚氯乙烯材质做成，起支持作用。
在本实施例中，通过我们前期对不同阳性植株百合叶片病毒含量的检测，结合田间症状的差异，发现出现严重症状的阳性植株，病毒相对含量是无症状阳性植株的1000倍以上，据此，我们设计了9条检测线，即第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8、第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12、第七检测线14、第八检测线15、第九检测线16，其中第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8代表LVX含量的低、居中、高；第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12代表PNRSV含量的低、居中、高；第七检测线14、第八检测线15、第九检测线16代表SLRSV含量的低、居中、高；第一检测线6上抗体包被量分别是第二检测线7和第三检测线8上抗体包被量的1/500和1/1000；第四检测线10上抗体包被量分别是第五检测线11和第六检测线12上抗体包被量的1/500和1/1000；第七检测线14上抗体包被量分别是第八检测线15和第九检测线16上抗体包被量的1/500和1/1000；根据优化实验，最终确定了第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8上LVXIgG包被量分别为1.5～2.0pg、0.75～1.0μg和1.5～2.0μg蛋白；第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12上PNRSVIgG包被量分别为2.5～3.0pg、1.25～1.5μg和2.5～3.0μg蛋白；第七检测线14、第八检测线15、第九检测线16上兔抗SLRSVIgG包被量分别为2.5～3.0pg、1.25～1.5μg和2.5～3.0μg蛋白。
本发明金标卡的制备方法：
1、本发明中兔抗LVXIgG、PNRSVIgG和SLRSVIgG的制备：分别从感染了LVX、PNRSV和SLRSV的百合叶片中提取总RNA进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），扩增LVX、PNRSV和SLRSV的CP基因片段；通过双酶切分别克隆至pET-28a载体；重组质粒转化入E.coliBL21(DE3)，37℃震荡培养，IPTG诱导表达，Ni-NTA柱纯化获得大小分别为22.0、25.0和26.0kDa的高纯度LVX、PNRSV和SLRSV重组蛋白；分别用0.5mg的LVX、PNRSV和SLRSVCP重组蛋白作为免疫原免疫日本大耳白兔；初次免疫中，将蛋白抗原与弗氏完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射；两周后进行加强免疫，将蛋白抗原与弗氏不完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射；以后每两周加强免疫一次，在第4次加强免疫后的5～7天颈动脉采血，静至，离心，收集到的血清加入质量百分比浓度0.02%的叠氮钠，－20℃保存；所得抗血清依次通过20%、50%、33%三个饱和度的硫酸铵沉淀粗提后，透析至pH7.8的磷酸缓冲液，然后使用ProteinG柱进行纯化而分别获得高纯度兔抗LVXIgG、PNRSVIgG和SLRSVIgG。
2、胶体金分别标记兔抗LVXIgG、PNRSVIgG和SLRSVIgG的方法：取半径为30nm的胶体金100mL和兔抗LVXIgG1.6mg（1mg/mL）、半径为30nm的胶体金100mL和兔抗PNRSVIgG2.0mg（1mg/mL）、以及半径为30nm的胶体金100mL和兔抗SLRSVIgG2.2mg（1mg/mL），分别在pH7.8、8.0和7.9的条件下通过磁力搅拌器缓慢搅拌1h使其结合，分别加牛血清白蛋白（BSA）作为稳定剂，使得终浓度为1%，采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及去凝聚物，将沉淀缓慢悬浮于一定体积的缓冲液中，继续离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，反复3次，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-LVXIgG结合物、胶体金-PNRSVIgG结合物以及胶体金-SLRSVIgG结合物；
3、第一、第二、第三胶体金结合垫19、21、23的制备：用1/10标记前胶体金溶液体积的缓冲液分别悬浮胶体金-LVXIgG结合物、胶体金-PNRSVIgG结合物以及胶体金-SLRSVIgG结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，室温下晾干，分别制成第一胶体金结合垫19、第二胶体金结合垫21和第三胶体金结合垫23。
4、第一免疫层析膜20的包被：第一检测线6、第二检测线7及第三检测线8上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗LVXIgG，第一对照线9上包被的是羊抗兔IgG，每条线宽2mm，第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8上LVXIgG包被量分别为1.5～2.0pg、0.75～1.0μg和1.5～2.0μg蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5～3.0μg蛋白。
5、第二免疫层析膜22的包被：第四检测线10、第五检测线11及第六检测线12上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗PNRSVIgG，第二对照线13上包被的是羊抗兔IgG，每条线宽2mm，第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12上PNRSVIgG包被量分别为2.5～3.0pg、1.25～1.5μg和2.5～3.0μg蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5～3.0μg蛋白。
6、第三免疫层析膜24的包被：第七检测线14、第八检测线15及第九检测线16上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗SLRSVIgG，第三对照线17上包被的是羊抗兔IgG，每条线宽2mm，第七检测线14、第八检测线15、第九检测线16上兔抗SLRSVIgG包被量分别为2.5～3.0pg、1.25～1.5μg和2.5～3.0μg蛋白。
7、复合半定量检测金标卡的组装：将聚氯乙烯衬板作为支撑载体固定于金标卡槽下壳体中，然后样品垫18、第一胶体金结合垫19、第一硝酸纤维素膜20和吸水滤纸25依次排列连接于衬板右侧上表面，第二胶体金结合垫21、第二硝酸纤维素膜22和吸水滤纸25依次排列连接于衬板下侧上表面，第三胶体金结合垫23、第三硝酸纤维素膜24和吸水滤纸25依次排列连接于衬板左侧上表面，再将金标卡槽上壳体与下壳体通过卡扣连接，就得到LVX、PNRSV和SLRSV复合半定量检测金标卡。
8、复合半定量检测金标卡的使用及结果判定
吸取百合样品的待检测溶液，滴在金标卡的加样孔处，由于毛细效应液体往前移动，若待检溶液中含有LVX，在第一反应窗3内，检测样品经过所述第一胶体金结合垫19时，LVX与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一至第三检测线6、7、8方向渗移，当接触到所述第一检测线6时发生抗原抗体结合反应而被全部截留下来，形成可见的淡红色条带；金标垫上剩余的金标多克隆抗体继续向所述第二检测线7和第三检测线8方向渗移，当接触到所述第二检测线7和第三检测线8时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9方向渗移，当接触到所述第一对照线9时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第二反应窗4和第三反应窗5内，检测样品经过所述第二和第三胶体金结合垫21、23时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第四至第九检测线10、11、12、14、15、16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第二对照线13和第三对照线17方向渗移，当接触到所述对照线13和17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第二至第九检测线7、8、10、11、12、14、15、16没有颜色变化，而第一检测线6出现淡红色、第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合X病毒，病毒含量低，田间防治以杀灭蚜虫为主；
若待检溶液中含有LVX，在第一反应窗3内，检测样品经过所述第一胶体金结合垫19时，LVX与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一至第三检测线6、7、8方向渗移，当接触到所述第一检测线6时发生抗原抗体结合反应而被部分截留下来，形成可见的淡红色条带；剩余的复合物继续往所述第二检测线7、第三检测线8方向渗移，当接触到所述第二检测线7时发生抗原抗体结合反应被全部截留下来，形成淡红色条带；剩余的金标多克隆抗体继续向所述第三检测线8和第一对照线9方向渗移，当接触到所述第三检测线8时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9方向渗移，当接触到所述第一对照线9时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第二反应窗4和第三反应窗5内，检测样品经过所述第二和第三胶体金结合垫21、23时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第四至第九检测线10、11、12、14、15、16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第二对照线13和第三对照线17方向渗移，当接触到所述对照线13和17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第三至第九检测线8、10、11、12、14、15、16没有颜色变化，而第一检测线6和第二检测线7出现淡红色、第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合X病毒，且病毒含量居中，田间防治采取杀灭蚜虫并喷施抗病毒药剂；
若待检溶液中含有LVX，在第一反应窗3内，检测样品经过所述第一胶体金结合垫19时，LVX与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一至第三检测线6、7、8方向渗移，当接触到所述第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8时分别发生抗原抗体结合反应而被截留下来，第一检测线6、第二检测线7形成淡红色、而第三检测线8形成棕红色条带；剩余的金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9方向渗移，当接触到所述第一对照线9时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第二反应窗4和第三反应窗5内，检测样品经过所述第二和第三胶体金结合垫21、23时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第四至第九检测线10、11、12、14、15、16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第二对照线13和第三对照线17方向渗移，当接触到所述对照线13和17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第四至第九检测线10、11、12、14、15、16没有颜色变化，而第一检测线6和第二检测线7出现淡红色、第三检测线8以及第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合X病毒，且病毒含量高，田间防治应增加抗病毒药剂的使用量和使用频次，同时杀灭蚜虫；
若待检溶液中含有PNRSV，在第二反应窗4内，检测样品经过所述第二胶体金结合垫21时，PNRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第四至第六检测线10、11、12方向渗移，当接触到所述第四检测线10时发生抗原抗体结合反应而被全部截留下来，形成可见的淡红色条带；金标垫上剩余的金标多克隆抗体继续向所述第五检测线11、第六检测线12方向渗移，当接触到所述第五检测线11和第六检测线12时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第二对照线13方向渗移，当接触到所述第二对照线13时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗3和第三反应窗5内，检测样品经过所述第一和第三胶体金结合垫19、23时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线6、7、8以及第七至第九检测线14、15、16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9和第三对照线17方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线9、17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第三、第五至第九检测线6、7、8、11、12、14、15、16没有颜色变化，而第四检测线10出现淡红色、第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合李属坏死环斑病毒，病毒含量低，田间防治以杀灭蚜虫为主；
若待检溶液中含有PNRSV，在第二反应窗4内，检测样品经过所述第二胶体金结合垫21时，PNRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第四至第六检测线10、11、12方向渗移，当接触到所述第四检测线10时发生抗原抗体结合反应而被部分截留下来，形成可见的淡红色条带；剩余的复合物继续往所述第五检测线11、第六检测线12方向渗移，当接触到所述第五检测线11时发生抗原抗体结合反应而被全部截留下来，形成可见的淡红色条带；剩余的金标多克隆抗体继续向所述第六检测线12和第二对照线13方向渗移，当接触到所述第六检测线12时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第二对照线13方向渗移，当接触到所述第二对照线13时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗3和第三反应窗5内，检测样品经过所述第一和第三胶体金结合垫19、23时，则不能与所述金标垫上上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线6、7、8以及第七至第九检测线14、15、16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9和第三对照线17方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线9、17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第三、第六至第九检测线6、7、8、12、14、15、16没有颜色变化，而第四检测线10和第五检测线11出现淡红色、第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合李属坏死环斑病毒，且病毒含量居中，田间防治采取杀灭蚜虫并喷施抗病毒药剂；
若待检溶液中含有PNRSV，在第二反应窗4内，检测样品经过所述第二胶体金结合垫21时，PNRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第四至第六检测线10、11、12方向渗移，当接触到所述第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，第四检测线10、第五检测线11形成淡红色、而第六检测线12形成棕红色条带；剩余的金标多克隆抗体继续向所述第二对照线13方向渗移，当接触到所述第二对照线13时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗3和第三反应窗5内，检测样品经过所述第一和第三胶体金结合垫19、23时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线6、7、8以及第七至第九检测线14、15、16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9和第三对照线17方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线9、17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第三、第七至第九检测线6、7、8、14、15、16没有颜色变化，而第四检测线10和第五检测线11出现淡红色、第六检测线12以及第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合李属坏死环斑病毒，且病毒含量高，田间防治应增加抗病毒药剂的使用量和使用频次，同时杀灭蚜虫；
若待检溶液中含有SLRSV，在第三反应窗5内，检测样品经过所述第三胶体金结合垫23时，SLRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第七至第九检测线14、15、16方向渗移，当接触到所述第七检测线14时发生抗原抗体结合反应而被全部截留下来，形成可见的淡红色条带；金标垫上剩余的金标多克隆抗体继续向所述第八检测线15、第九检测线16方向渗移，当接触到所述第八检测线15和第九检测线16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第三对照线17方向渗移，当接触到所述第三对照线17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗3和第二反应窗4内，检测样品经过所述第一和第二胶体金结合垫19、21时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线6、7、8以及第四至第六检测线10、11、12时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9和第二对照线13方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线9、13时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第六、第八至第九检测线6、7、8、10、11、12、15、16没有颜色变化，而第七检测线14出现淡红色、第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合草莓潜隐环斑病毒，病毒含量低，田间防治以杀灭蚜虫为主；
若待检溶液中含有SLRSV，在第三反应窗5内，检测样品经过所述第三胶体金结合垫23时，SLRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第七至第九检测线14、15、16方向渗移，当接触到所述第七检测线14时发生抗原抗体结合反应而被部分截留下来，形成可见的淡红色条带；剩余的复合物继续往所述第八检测线15、第九检测线16方向渗移，当接触到所述第八检测线15时发生抗原抗体结合反应而被全部截留下来，形成可见的淡红色条带；金标垫上剩余的金标多克隆抗体继续向所述第九检测线16和第三对照线17方向渗移，当接触到所述第九检测线16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第三对照线17方向渗移，当接触到所述第三对照线17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗3和第二反应窗4内，检测样品经过所述第一和第二胶体金结合垫19、21时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线6、7、8以及第四至第六检测线10、11、12时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9和第二对照线13方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线9、13时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第六、以及第九检测线6、7、8、10、11、12、16没有颜色变化，而第七检测线14和第八检测线15出现淡红色、第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合草莓潜隐环斑病毒，且病毒含量居中，田间防治采取杀灭蚜虫并喷施抗病毒药剂；
若待检溶液中含有SLRSV，在第三反应窗5内，检测样品经过所述第三胶体金结合垫23时，SLRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第七至第九检测线14、15、16方向渗移，当接触到所述第七检测线14、第八检测线15、第九检测线16时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，第七检测线14、第八检测线15形成淡红色条带，第九检测线16形成淡红色条带；剩余的金标多克隆抗体继续向所述第三对照线17方向渗移，当接触到所述第三对照线17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗3和第二反应窗4内，检测样品经过所述第一和第二胶体金结合垫19、21时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线6、7、8以及第四至第六检测线10、11、12时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线9和第二对照线13方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线9、13时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第六检测线6、7、8、10、11、12没有颜色变化，而第七检测线14和第八检测线15出现淡红色、第九检测线16以及第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合草莓潜隐环斑病毒，且病毒含量高，田间防治应增加抗病毒药剂的使用量和使用频次，同时杀灭蚜虫；
若待检溶液中不含LVX、PNRSV和SLRSV，在第一、第二和第三反应窗3、4、5内，检测样品经过所述第一、第二和第三胶体金结合垫19、21、23时，则不能与金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第九检测线6、7、8、10、11、12、14、15、16时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一、第二和第三对照线9、13、17方向渗移，当接触到所述第一、第二和第三对照线9、13、17时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第九检测线6、7、8、10、11、12、14、15、16均没有颜色变化，而仅第一至第三对照线9、13、17出现棕红色条带时，则判定被检样品没有感染百合X病毒、百合李属坏死环斑病毒和百合草莓潜隐环斑病毒。
上述实施例可以看出，本发明可对LVX、PNRSV和SLRSV同时进行半定量检测，一般人员不需专门培训即可操作，5～10分钟即可准确检测样品之间三种病毒含量的差异，达到快速、简便检测这三种病毒的目的。

Claims (3)

1.一种百合X病毒、百合李属坏死环斑病毒和百合草莓潜隐环斑病毒复合半定量检测金标卡，其特征在于包括金标卡槽(1)，衬板(26)，样品垫(18)，第一胶体金结合垫(19)，第二胶体金结合垫(21)，第三胶体金结合垫(23)，第一硝酸纤维素膜(20)，第二硝酸纤维素膜(22)，第三硝酸纤维素膜(24)，吸水滤纸(25)，其特征在于：金标卡槽(1)包括上壳体和下壳体，上壳体和下壳体通过卡扣连接，上壳体设有加样孔(2)、第一反应窗(3)、第二反应窗(4)和第三反应窗(5)，样品垫(18)置于加样孔(2)下方，第一硝酸纤维素膜(20)置于第一反应窗(3)下方，第二硝酸纤维素膜(22)置于第二反应窗(4)下方，第三硝酸纤维素膜(24)置于第三反应窗(5)下方，第一胶体金结合垫(19)上含有兔抗LVXIgG，第二胶体金结合垫(21)上含有兔抗PNRSVIgG，第三胶体金结合垫(23)上含有兔抗SLRSVIgG，衬板(26)固定于金标卡槽(1)中，样品垫(18)、第一胶体金结合垫(19)、第一硝酸纤维素膜(20)和吸水滤纸(25)依次排列连接于衬板(26)右侧上表面，第二胶体金结合垫(21)、第二硝酸纤维素膜(22)和吸水滤纸(25)依次排列连接于衬板(26)下侧上表面，第三胶体金结合垫(23)、第三硝酸纤维素膜(24)和吸水滤纸(25)依次排列连接于衬板(26)左侧上表面，第一硝酸纤维素膜(20)上设有第一检测线(6)、第二检测线(7)、第三检测线(8)和第一对照线(9)，第二硝酸纤维素膜(22)上设有第四检测线(10)、第五检测线(11)、第六检测线(12)和第二对照线(13)，第三硝酸纤维素膜(24)上设有第七检测线(14)、第八检测线(15)、第九检测线(16)和第三对照线(17)，第一检测线(6)、第二检测线(7)、第三检测线(8)上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗LVXIgG，第四检测线(10)、第五检测线(11)、第六检测线(12)上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗PNRSVIgG，第七检测线(14)、第八检测线(15)、第九检测线(16)上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗SLRSVIgG，第一对照线(9)、第二对照线(13)和第三对照线(17)上均包被的是羊抗兔IgG，第一检测线(6)、第二检测线(7)、第三检测线(8)上LVXIgG包被量分别为1.5～2.0pg、0.75～1.0μg和1.5～2.0μg蛋白，第四检测线（10）、第五检测线(11)、第六检测线(12)上PNRSVIgG包被量分别为2.5～3.0pg、1.25～1.5μg和2.5～3.0μg蛋白，第七检测线(14)、第八检测线(15)、第九检测线(16)上兔抗SLRSVIgG包被量分别为2.5～3.0pg、1.25～1.5μg和2.5～3.0μg蛋白，第一胶体金结合垫(19)上兔抗LVXIgG标记量为16μg/mL，第二胶体金结合垫(21)上兔抗PNRSVIgG标记量为20μg/mL，第三胶体金结合垫(23)上兔抗SLRSVIgG标记量为22μg/mL，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5～3.0μg蛋白；
用所述金标卡检测时，在所述加样孔（2）处加入百合样品的待检溶液，对比第一反应窗(3)、第二反应窗(4)和第三反应窗(5)内第一至第九检测线(6)、(7)、(8)、(10)、(11)、(12)、(14)、(15)、(16)以及第一至第三对照线(9)、(13)、(17)的颜色，即可判定被检百合是否感染了百合X病毒、百合李属坏死环斑病毒或百合草莓潜隐环斑病毒；
将待检溶液加入所述金标卡的加样孔内，若待检溶液中含有LVX，在第一反应窗(3)内，检测样品经过所述第一胶体金结合垫(19)时，LVX与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一至第三检测线(6)、(7)、(8)方向渗移，当接触到所述第一检测线(6)时发生抗原抗体结合反应而被全部截留下来，形成可见的淡红色条带；金标垫上剩余的金标多克隆抗体继续向所述第二检测线(7)和第三检测线(8)方向渗移，当接触到所述第二检测线(7)和第三检测线(8)时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线(9)方向渗移，当接触到所述第一对照线(9)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第二反应窗(4)和第三反应窗(5)内，检测样品经过所述第二和第三胶体金结合垫(21)、(23)时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第四至第九检测线（10）、(11)、(12)、(14)、(15)、(16)时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第二对照线(13)和第三对照线(17)方向渗移，当接触到所述第二和第三对照线(13)和(17)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第二至第九检测线(7)、(8)、(10)、(11)、(12)、(14)、(15)、(16)没有颜色变化，而第一检测线(6)出现淡红色、第一至第三对照线(9)、(13)、(17)出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合X病毒，病毒含量低，田间防治以杀灭蚜虫为主；
若待检溶液中含有LVX，在第一反应窗(3)内，检测样品经过所述第一胶体金结合垫(19)时，LVX与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一至第三检测线(6)、(7)、(8)方向渗移，当接触到所述第一检测线(6)时发生抗原抗体结合反应而被部分截留下来，形成可见的淡红色条带；剩余的复合物继续往所述第二检测线(7)、第三检测线(8)方向渗移，当接触到所述第二检测线(7)时发生抗原抗体结合反应被全部截留下来，形成淡红色条带；剩余的金标多克隆抗体继续向所述第三检测线(8)和第一对照线(9)方向渗移，当接触到所述第三检测线(8)时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线(9)方向渗移，当接触到所述第一对照线(9)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第二反应窗(4)和第三反应窗(5)内，检测样品经过所述第二和第三胶体金结合垫(21)、(23)时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第四至第九检测线(10)、(11)、(12)、(14)、(15)、(16)时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第二对照线(13)和第三对照线(17)方向渗移，当接触到所述第二和第三对照线(13)和(17)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第三至第九检测线(8)、(10)、(11)、(12)、(14)、(15)、(16)没有颜色变化，而第一检测线(6)和第二检测线(7)出现淡红色、第一至第三对照线(9)、(13)、(17)出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合X病毒，田间防治采取杀灭蚜虫并喷施抗病毒药剂；
若待检溶液中含有LVX，在第一反应窗(3)内，检测样品经过所述第一胶体金结合垫(19)时，LVX与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一至第三检测线(6)、(7)、(8)方向渗移，当接触到所述第一检测线(6)、第二检测线(7)、第三检测线(8)时分别发生抗原抗体结合反应而被截留下来，第一检测线(6)、第二检测线(7)形成淡红色、而第三检测线(8)形成棕红色条带；剩余的金标多克隆抗体继续向所述第一对照线(9)方向渗移，当接触到所述第一对照线(9)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第二反应窗(4)和第三反应窗(5)内，检测样品经过所述第二和第三胶体金结合垫(21)、(23)时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第四至第九检测线(10)、(11)、(12)、(14)、(15)、(16)时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第二对照线(13)和第三对照线(17)方向渗移，当接触到所述第二和第三对照线(13)和(17)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第四至第九检测线(10)、(11)、(12)、(14)、(15)、(16)没有颜色变化，而第一检测线(6)和第二检测线(7)出现淡红色、第三检测线(8)以及第一至第三对照线(9)、(13)、(17)出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合X病毒，且病毒含量高，田间防治应增加抗病毒药剂的使用量和使用频次，同时杀灭蚜虫；
若待检溶液中含有PNRSV，在第二反应窗(4)内，检测样品经过所述第二胶体金结合垫(21)时，PNRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第四至第六检测线(10)、(11)、(12)方向渗移，当接触到所述第四检测线(10)时发生抗原抗体结合反应而被全部截留下来，形成可见的淡红色条带；金标垫上剩余的金标多克隆抗体继续向所述第五检测线(11)、第六检测线(12)方向渗移，当接触到所述第五检测线(11)和第六检测线(12)时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第二对照线(13)方向渗移，当接触到所述第二对照线(13)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗(3)和第三反应窗(5)内，检测样品经过所述第一和第三胶体金结合垫(19)、(23)时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线(6)、(7)、(8)以及第七至第九检测线(14)、(15)、(16)时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线(9)和第三对照线(17)方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线(9)、(17)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第三、第五至第九检测线(6)、(7)、(8)、(11)、(12)、(14)、(15)、(16)没有颜色变化，而第四检测线(10)出现淡红色、第一至第三对照线(9)、(13)、(17)出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合李属坏死环斑病毒，病毒含量低，田间防治以杀灭蚜虫为主；
若待检溶液中含有PNRSV，在第二反应窗(4)内，检测样品经过所述第二胶体金结合垫(21)时，PNRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第四至第六检测线(10)、(11)、(12)方向渗移，当接触到所述第四检测线(10)时发生抗原抗体结合反应而被部分截留下来，形成可见的淡红色条带；剩余的复合物继续往所述第五检测线(11)、第六检测线(12)方向渗移，当接触到所述第五检测线(11)时发生抗原抗体结合反应而被全部截留下来，形成可见的淡红色条带；剩余的金标多克隆抗体继续向所述第六检测线(12)和第二对照线(13)方向渗移，当接触到所述第六检测线(12)时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第二对照线(13)方向渗移，当接触到所述第二对照线(13)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗(3)和第三反应窗(5)内，检测样品经过所述第一和第三胶体金结合垫(19)、(23)时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线(6)、(7)、(8)以及第七至第九检测线(14)、(15)、(16)时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线(9)和第三对照线(17)方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线(9)、(17)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第三、第六至第九检测线(6)、(7)、(8)、(12)、(14)、(15)、(16)没有颜色变化，而第四检测线(10)和第五检测线(11)出现淡红色、第一至第三对照线(9)、(13)、(17)出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合李属坏死环斑病毒，田间防治采取杀灭蚜虫并喷施抗病毒药剂；
若待检溶液中含有PNRSV，在第二反应窗(4)内，检测样品经过所述第二胶体金结合垫(21)时，PNRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第四至第六检测线(10)、(11)、(12)方向渗移，当接触到所述第四检测线(10)、第五检测线(11)、第六检测线(12)时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，第四检测线(10)、第五检测线(11)形成淡红色、而第六检测线(12)形成棕红色条带；剩余的金标多克隆抗体继续向所述第二对照线(13)方向渗移，当接触到所述第二对照线(13)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗(3)和第三反应窗(5)内，检测样品经过所述第一和第三胶体金结合垫(19)、(23)时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线(6)、(7)、(8)以及第七至第九检测线(14)、(15)、(16)时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线(9)和第三对照线(17)方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线(9)、(17)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第三、第七至第九检测线(6)、(7)、(8)、(14)、(15)、(16)没有颜色变化，而第四检测线(10)和第五检测线(11)出现淡红色、第六检测线(12)以及第一至第三对照线(9)、(13)、(17)出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合李属坏死环斑病毒，且病毒含量高，田间防治应增加抗病毒药剂的使用量和使用频次，同时杀灭蚜虫；
若待检溶液中含有SLRSV，在第三反应窗(5)内，检测样品经过所述第三胶体金结合垫(23)时，SLRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第七至第九检测线(14)、(15)、(16)方向渗移，当接触到所述第七检测线(14)时发生抗原抗体结合反应而被全部截留下来，形成可见的淡红色条带；金标垫上剩余的金标多克隆抗体继续向所述第八检测线(15)、第九检测线(16)方向渗移，当接触到所述第八检测线(15)和第九检测线(16)时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第三对照线(17)方向渗移，当接触到所述第三对照线(17)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗(3)和第二反应窗(4)内，检测样品经过所述第一和第二胶体金结合垫(19)、(21)时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线(6)、(7)、(8)以及第四至第六检测线(10)、(11)、(12)时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线(9)和第二对照线(13)方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线(9)、(13)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第六、第八至第九检测线(6)、(7)、(8)、(10)、(11)、(12)、(15)、(16)没有颜色变化，而第七检测线(14)出现淡红色、第一至第三对照线(9)、(13)、(17)出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合草莓潜隐环斑病毒，病毒含量低，田间防治以杀灭蚜虫为主；
若待检溶液中含有SLRSV，在第三反应窗(5)内，检测样品经过所述第三胶体金结合垫(23)时，SLRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第七至第九检测线(14)、(15)、(16)方向渗移，当接触到所述第七检测线(14)时发生抗原抗体结合反应而被部分截留下来，形成可见的淡红色条带；剩余的复合物继续往所述第八检测线(15)、第九检测线(16)方向渗移，当接触到所述第八检测线(15)时发生抗原抗体结合反应而被全部截留下来，形成可见的淡红色条带；金标垫上剩余的金标多克隆抗体继续向第九检测线(16)和第三对照线(17)方向渗移，当接触到所述第九检测线(16)时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第三对照线(17)方向渗移，当接触到所述第三对照线(17)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗(3)和第二反应窗(4)内，检测样品经过所述第一和第二胶体金结合垫(19)、(21)时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线(6)、(7)、(8)以及第四至第六检测线(10)、(11)、(12)时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线(9)和第二对照线(13)方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线(9)、(13)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第六、以及第九检测线(6)、(7)、(8)、(10)、(11)、(12)、(16)没有颜色变化，而第七检测线(14)和第八检测线(15)出现淡红色、第一至第三对照线(9)、(13)、(17)出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合草莓潜隐环斑病毒，田间防治采取杀灭蚜虫并喷施抗病毒药剂；
若待检溶液中含有SLRSV，在第三反应窗(5)内，检测样品经过所述第三胶体金结合垫(23)时，SLRSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第七至第九检测线(14)、(15)、(16)方向渗移，当接触到所述第七检测线(14)、第八检测线(15)、第九检测线(16)时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，第七检测线(14)、第八检测线(15)形成淡红色条带，第九检测线(16)形成淡红色条带；剩余的金标多克隆抗体继续向所述第三对照线(17)方向渗移，当接触到所述第三对照线(17)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；此外，在第一反应窗(3)和第二反应窗(4)内，检测样品经过所述第一和第二胶体金结合垫(19)、(21)时，则不能与所述金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第三检测线(6)、(7)、(8)以及第四至第六检测线(10)、(11)、(12)时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一对照线(9)和第二对照线(13)方向渗移，当接触到所述第一和第三对照线(9)、(13)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第六检测线(6)、(7)、(8)、(10)、(11)、(12)没有颜色变化，而第七检测线(14)和第八检测线(15)出现淡红色、第九检测线(16)以及第一至第三对照线(9)、(13)、(17)出现棕红色条带时，则判定被检样品感染了百合草莓潜隐环斑病毒，且病毒含量高，田间防治应增加抗病毒药剂的使用量和使用频次，同时杀灭蚜虫；
若待检溶液中不含LVX、PNRSV和SLRSV，在第一、第二和第三反应窗(3)、(4)、(5)内，检测样品经过所述第一、第二和第三胶体金结合垫(19)、(21)、(23)时，则不能与金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一至第九检测线(6)、(7)、(8)、(10)、(11)、(12)、(14)、(15)、(16)时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述第一、第二和第三对照线(9)、(13)、(17)方向渗移，当接触到所述第一、第二和第三对照线(9)、(13)、(17)时与羊抗兔IgG结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一至第九检测线(6)、(7)、(8)、(10)、(11)、(12)、(14)、(15)、(16)均没有颜色变化，而仅第一至第三对照线(9)、(13)、(17)出现棕红色条带时，则判定被检样品没有感染百合X病毒、百合李属坏死环斑病毒和百合草莓潜隐环斑病毒。
2.一种权利要求1所述的百合X病毒、百合李属坏死环斑病毒和百合草莓潜隐环斑病毒复合半定量检测金标卡的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
①兔抗LVXIgG、PNRSVIgG和SLRSVIgG的制备：分别从感染了LVX、PNRSV和SLRSV的百合叶片中提取总RNA进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），扩增LVX、PNRSV和SLRSV的CP基因片段；通过双酶切分别克隆至pET-28a载体；重组质粒转化入E.coliBL(21)(DE3)，37℃震荡培养，IPTG诱导表达，Ni-NTA柱纯化获得大小分别为22.0、25.0和26.0kDa的高纯度LVX、PNRSV和SLRSV重组蛋白；分别用0.5mg的LVX、PNRSV和SLRSVCP重组蛋白作为免疫原免疫日本大耳白兔，获得抗血清；所得抗血清依次通过20%、50%、33%三个饱和度的硫酸铵沉淀粗提后，透析至pH7.8的磷酸缓冲液，然后使用ProteinG柱进行纯化而分别获得高纯度兔抗LVXIgG、PNRSVIgG和SLRSVIgG；
②胶体金分别标记兔抗LVXIgG、PNRSVIgG和SLRSVIgG的方法：取半径为30nm的胶体金100mL和兔抗LVXIgG1.6mg（1mg/mL）、半径为30nm的胶体金100mL和兔抗PNRSVIgG2.0mg（1mg/mL）、以及半径为30nm的胶体金100mL和兔抗SLRSVIgG2.2mg（1mg/mL），分别在pH7.8、8.0和7.9的条件下通过磁力搅拌器缓慢搅拌1h使其结合，分别加牛血清白蛋白（BSA）作为稳定剂，使得终浓度为1%，采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及去凝聚物，将沉淀缓慢悬浮于一定体积的缓冲液中，继续离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，反复3次，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-LVXIgG结合物、胶体金-PNRSVIgG结合物以及胶体金-SLRSVIgG结合物；
③第一、第二、第三胶体金结合垫(19)、(21)、(23)的制备：用1/10标记前胶体金溶液体积的缓冲液分别悬浮胶体金-LVXIgG结合物、胶体金-PNRSVIgG结合物以及胶体金-SLRSVIgG结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，室温下晾干，分别制成第一胶体金结合垫(19)、第二胶体金结合垫(21)和第三胶体金结合垫(23)；
④第一免疫层析膜(20)的包被：第一检测线(6)、第二检测线(7)及第三检测线(8)上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗LVXIgG，第一对照线(9)上包被的是羊抗兔IgG，每条线宽2mm，第一检测线(6)、第二检测线(7)、第三检测线(8)上LVXIgG包被量分别为1.5～2.0pg、0.75～1.0μg和1.5～2.0μg蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5～3.0μg蛋白；
⑤第二免疫层析膜(22)的包被：第四检测线(10)、第五检测线(11)及第六检测线(12)上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗PNRSVIgG，第二对照线(13)上包被的是羊抗兔IgG，每条线宽2mm，第四检测线（10）、第五检测线(11)、第六检测线(12)上PNRSVIgG包被量分别为2.5～3.0pg、1.25～1.5μg和2.5～3.0μg蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5～3.0μg蛋白；
⑥第三免疫层析膜(24)的包被：第七检测线(14)、第八检测线(15)及第九检测线(16)上包被的是已知量的有浓度差异的兔抗SLRSVIgG，第三对照线(17)上包被的是羊抗兔IgG，每条线宽2mm，第七检测线(14)、第八检测线(15)、第九检测线(16)上兔抗SLRSVIgG包被量分别为2.5～3.0pg、1.25～1.5μg和2.5～3.0μg蛋白；
⑦复合半定量检测金标卡的组装：将聚氯乙烯衬板作为支撑载体固定于金标卡槽下壳体中，然后样品垫(18)、第一胶体金结合垫(19)、第一硝酸纤维素膜(20)和吸水滤纸(25)依次排列连接于衬板右侧上表面，第二胶体金结合垫(21)、第二硝酸纤维素膜(22)和吸水滤纸(25)依次排列连接于衬板下侧上表面，第三胶体金结合垫(23)、第三硝酸纤维素膜(24)和吸水滤纸(25)依次排列连接于衬板左侧上表面，再将金标卡槽上壳体与下壳体通过卡扣连接，就得到LVX、PNRSV和SLRSV复合半定量检测金标卡。
3.根据权利要求2所述的百合X病毒、百合李属坏死环斑病毒和百合草莓潜隐环斑病毒复合半定量检测金标卡的制备方法，其中LVX、PNRSV和SLRSV分别为百合X病毒、百合李属坏死环斑病毒和百合草莓潜隐环斑病毒。
CN201510951214.1A 2015-12-19 2015-12-19 一种百合复合病毒半定量检测金标卡的制备方法 Active CN105527425B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510951214.1A CN105527425B (zh) 2015-12-19 2015-12-19 一种百合复合病毒半定量检测金标卡的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510951214.1A CN105527425B (zh) 2015-12-19 2015-12-19 一种百合复合病毒半定量检测金标卡的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105527425A true CN105527425A (zh) 2016-04-27
CN105527425B CN105527425B (zh) 2017-11-14

Family

ID=55769778

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510951214.1A Active CN105527425B (zh) 2015-12-19 2015-12-19 一种百合复合病毒半定量检测金标卡的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105527425B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018009143A1 (en) * 2016-07-07 2018-01-11 Cell Id Pte Ltd Haemoglobin test kit

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101915833A (zh) * 2010-09-10 2010-12-15 中国科学院东北地理与农业生态研究所 牛初乳及其制品中免疫球蛋白g半定量快速检测试纸条及其制备方法
CN103045635A (zh) * 2012-07-12 2013-04-17 陈定虎 李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法及抗血清和试剂盒
CN203786122U (zh) * 2014-04-16 2014-08-20 普生（天津）科技有限公司 一种测量精度高的瘦肉精检测试纸卡
CN104122389A (zh) * 2014-04-14 2014-10-29 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所 一种百合斑驳病毒胶体金免疫层析检测试剂卡及制备方法
CN204374210U (zh) * 2014-12-09 2015-06-03 李溢军 一种四联对猪瘟、猪伪狂犬、猪蓝耳和猪口蹄疫抗体快速金标检测卡

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101915833A (zh) * 2010-09-10 2010-12-15 中国科学院东北地理与农业生态研究所 牛初乳及其制品中免疫球蛋白g半定量快速检测试纸条及其制备方法
CN103045635A (zh) * 2012-07-12 2013-04-17 陈定虎 李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法及抗血清和试剂盒
CN104122389A (zh) * 2014-04-14 2014-10-29 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所 一种百合斑驳病毒胶体金免疫层析检测试剂卡及制备方法
CN203786122U (zh) * 2014-04-16 2014-08-20 普生（天津）科技有限公司 一种测量精度高的瘦肉精检测试纸卡
CN204374210U (zh) * 2014-12-09 2015-06-03 李溢军 一种四联对猪瘟、猪伪狂犬、猪蓝耳和猪口蹄疫抗体快速金标检测卡

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
于翠等: "进境百合种球上草莓潜隐环斑病毒的检测方法", 《植物保护学报》 *
沈嘉乐等: "三种百合线状病毒的外壳蛋白抗血清制备", 《科技通报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018009143A1 (en) * 2016-07-07 2018-01-11 Cell Id Pte Ltd Haemoglobin test kit
CN109564228A (zh) * 2016-07-07 2019-04-02 源鉴定私人有限公司 血红蛋白检测试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN105527425B (zh) 2017-11-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104122389B (zh) 一种百合斑驳病毒胶体金免疫层析检测试剂卡及制备方法
CN102426234B (zh) 一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法
CN109900902B (zh) 一种猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
CN104459144B (zh) 一种猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒株鉴别检测试纸
CN103665152B (zh) 犬细小病毒单域抗体及其制备方法和应用
CN105950563A (zh) 杂交瘤细胞株7e3及其分泌的抗口蹄疫a型病毒的单克隆抗体与应用
CN101581726A (zh) 新一代布鲁氏菌病抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒
CN201867414U (zh) 一种检测多种植物病毒的蛋白芯片
CN101592661A (zh) 布鲁氏菌病抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒
CN102994455B (zh) 一种黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体及试剂盒
CN103901195B (zh) 一种检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸及其制备方法
CN102243238B (zh) 病原体的核酸金标快速检测方法及试剂盒
CN105527425A (zh) 一种复合病毒半定量检测金标卡及制备方法
CN105348386B (zh) 抗口蹄疫o型病毒的单克隆抗体组合及检测试剂盒
CN1996020A (zh) 黄瓜花叶病毒双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒及制备方法
CN109406788A (zh) 一种单克隆抗体及其应用
CN105527424A (zh) 一种百合李属坏死环斑病毒半定量检测金标卡及制备方法
CN104764887A (zh) 一种1型鸭甲肝病毒抗体竞争elisa检测方法
CN104122391B (zh) 一种百合隐症病毒和百合斑驳病毒复合胶体金免疫层析检测试剂卡及制备方法
CN104374912B (zh) 一种百合隐症病毒、斑驳病毒和黄瓜花叶病毒双向胶体金免疫层析速测卡及制备方法
CN109851671B (zh) 检测口蹄疫o型广西株抗原的单克隆抗体及其应用
CN102633878B (zh) 一种甲型h1亚型流感病毒双抗体夹心elisa试剂盒及应用
CN105606801B (zh) 一种百合x病毒lvx半定量检测金标卡的制备方法
CN104155443A (zh) 一种基于弓形虫基质蛋白1的间接elisa检测试剂盒
CN105510582A (zh) 一种百合草莓潜隐环斑病毒半定量检测金标卡及制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210201

Address after: 730000 No.318 Donggang West Road, Chengguan District, Lanzhou City, Gansu Province

Patentee after: NORTHWEST INSTITUTE OF ECO-ENVIRONMENT AND RESOURCES, CAS

Address before: 730000 Gansu city of Lanzhou province Donggang West Road No. 320

Patentee before: Institute of environment and Engineering in cold and dry areas, Chinese Academy of Sciences