CN105525020A - 鲬和李氏*的快速鉴别试剂盒及鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

鲬和李氏的快速鉴别试剂盒及鉴别方法，所述试剂盒包括碱基序列为SEQ？ID？No.1/2的引物对，以及限制性内切酶HinfI或其同切酶。本发明提供了一种基于PCR反应-限制性酶切分型的试剂盒产品，并提供基于此的鲬/李氏快速鉴别方法，在扩增受检个体COI片段的基础上，采用限制性内切酶酶切的方法，使不同物种产生特异性酶切图谱，根据图谱中条带的大小判断受检个体的分类归属，避免了扩增后的测序过程，是针对鲬/李氏

Description

鲬和李氏*的快速鉴别试剂盒及鉴别方法
技术领域
本发明属渔业资源调查鱼类的鉴别技术领域，尤其涉及鲬和李氏快速鉴别方法。
背景介绍
鲬是我国的重要经济鱼种之一，在中国渔业经济中占有重要地位。鲬属鲉形目鲬科，为近海底层鱼类，成体体长一般为200～350mm，其幼鱼在外形上与鲈形目科的李氏十分相似。这两种鱼分类地位不同，成鱼形态差异明显，幼鱼却因形态相似不易分辨。实际的海洋渔业资源拖网调查中往往能同时捕获大量的鲬幼体和李氏成体，其体长多在80～120mm之间，根据传统的分类方法不易区分二者，导致渔业资源信息统计错误，甚至Genbank中亦有将李氏序列误作为鲬序列公布的情况，这对于渔业资源的有效利用、可持续发展和系统研究产生负面影响，尤其是对于作为重要经济种类的鲬资源管理利用和相关研究十分不利。
目前，鲬和李氏的分类通常使用两类方法：形态学方法及基因序列法。常规的形态学分类主要通过以下两点区分鲬和李氏
1)第一背鳍：鲬第一背鳍与第二背鳍紧邻，背鳍鳍式为I，VIII；李氏第一背鳍与第二背鳍分开，背鳍鳍式为IV；
2)棘或小刺：鲬的前鳃盖骨后下角有2棘，李氏前鳃盖骨棘末端上缘有3小刺。
如果渔获物形态完整，通过仔细分辨第一背鳍、棘或小刺可区分体长相仿的鲬幼鱼和李氏由于拖网、保存和运输过程中的外力破坏，经常出现一部分形态特征受损甚至个体残缺的不完整渔获样品，无法从形态特征对其种类进行鉴别。近年来许多外形相似的渔获种类都利用基因序列进行鉴别分类，该方法主要是对受检对象线粒体中的COI片段进行扩增、测序，利用DNA中碱基序列的特异性进行物种区分鉴别，该方法虽然准确，但耗时长、花费高，需动用大型实验设备。因此，开发一种快速、准确、成本低廉的方法来鉴别鲬幼鱼与李氏是很有必要的。
发明内容
为了克服形态分类鉴定方法的不准确性以及基因序列分类耗时长、花费高等不足，本发明旨在建立一种稳定性高、快速准确、成本低廉的方法对鲬和李氏进行区分鉴别。
为实现上述目的，本发明首先提供一种鲬和李氏的快速鉴别试剂盒，该试剂盒中包括碱基序列为SEQIDNo.1/2的引物对，以及限制性内切酶HinfI或其同切酶。
序列为SEQIDNo.1的正向引物：F5’-caaccacaaagacattggcacyctc-3’；
序列为SEQIDNo.2的反向引物：R5’-tagacttctgggtggccaaaga-3’。
其中所述的限制性内切酶HinfI或其同切酶的酶切位点为5'…G▼ANTC…3'的限制性内切酶。
另一方面，本发明提供一种鲬和李氏的快速鉴别方法，包括对样品总DNA进行PCR扩增的步骤，所述PCR扩增引物对的碱基序列为SEQIDNo.1/2：
序列为SEQIDNo.1的正向引物：F5’-caaccacaaagacattggcacyctc-3’；
序列为SEQIDNo.2的反向引物：R5’-tagacttctgggtggccaaaga-3’。
进一步地，本发明所述的鲬和李氏的快速鉴别方法中还包括对PCR产物酶切的步骤，所述的酶切步骤使用限制性内切酶HinfI或其同切酶。这些限制性内切酶的酶切位点为5'…G▼ANTC…3'的限制性内切酶。
本发明在扩增受检个体COI片段的基础上，采用限制性内切酶酶切的方法，使不同物种产生特异性酶切图谱，根据图谱中条带的大小判断受检个体的分类归属，避免了扩增后的测序过程，建立了针对鲬/李氏的稳定性高、快速准确、成本低廉的鉴别方法，其有益效果具体包括：
1.不受形态特征影响：能够针对形态特征不明显或外力造成形体损伤等无法利用传统形态法分类的个体进行鉴定。
2.不受个体发育阶段限制：排除了时空限制、遗传因素等造成的表型差异，从DNA分子水平上提供可靠的分类依据。
3.准确快速、成本低廉：与传统形态分类法相比，利用DNA分子手段鉴定更为科学、准确；与常规的DNA检测技术相比，直接对PCR产物进行酶切40min即可电泳检测得出结果，无需测序，节省时间且降低成本。
附图说明
本发明附图1幅：
鲬及李氏聚合酶链式反应-酶切分型琼脂糖凝胶电泳图谱，图中：
M：DL2000DNAMarker；
D1、D2：试剂盒法提取的李氏DNA；
D3、D4：试剂盒法提取的鲬DNA；
P1、P2：李氏PCR扩增产物；
P3、P4：鲬PCR扩增产物；
H1、H2：李氏PCR扩增后HinfI酶切产物；
H3、H4：鲬PCR扩增后HinfI酶切产物。
具体实施方式
本发明是在PCR扩增受检样品COI片段的基础上，采用限制性内切酶对PCR产物进行酶切的方法，使不同物种来源的待测样品产生特异性的酶切图谱，并可根据图谱中条带的大小判断待测样品的分类来源。
本发明首先提供一种鲬和李氏的快速鉴别试剂盒，该试剂盒中包括碱基序列为SEQIDNo.1/2的引物对，以及限制性内切酶HinfI或其同切酶。该所述的试剂盒，可以用于下述本发明的鲬和李氏的快速鉴别方法的任意具体实施方式。所述的鉴别方法，基本地包括对样品总DNA进行PCR扩增的步骤，所述PCR扩增引物对的碱基序列为SEQIDNo.1/2：
序列为SEQIDNo.1的正向引物：F5’-caaccacaaagacattggcacyctc-3’；
序列为SEQIDNo.2的反向引物：R5’-tagacttctgggtggccaaaga-3’。
进一步地，本发明所述的鲬和李氏的快速鉴别方法中还包括对上述PCR产物酶切的步骤，所述的酶切步骤使用限制性内切酶HinfI或其同切酶。这些限制性内切酶的酶切位点为5'…G▼ANTC…3'的限制性内切酶。
更为具体地，本发明的鲬和李氏的快速鉴别方法包括如下步骤：
a.提取样品总DNA；
b.PCR扩增：以步骤a所提取的样品总DNA为模板，使用引物SEQIDNo.1/2进行PCR扩增；
c.使用限制性内切酶HinfI或其同切酶对步骤b所得PCR扩增产物进行酶切；
d.对步骤c所得酶切产物进行电泳检测；
e.结果判定。
本发明的方法中，首先提取待检测样品的总DNA，具体实施方式中，步骤a优选使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒进行。然后本发明利用一对引物SEQIDNo.1/2，通过PCR的方法扩增COI基因的一段DNA片段，并继而以限制性内切酶HinfI或其同切酶对PCR产物进行酶切，以得到特异性的酶切图谱。
所述的PCR扩增可采用本领域常规体系，优选的PCR的扩增参数包括94℃预变性2min；94℃30s,58℃30s,72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。扩增后于相同条件下的凝胶电泳检测，不能完全区分鲬/李氏样品。其中所述及的凝胶电泳检测，在本发明中优选采用的体系为：0.5×TBE缓冲液，1.5％的琼脂糖凝胶电泳，恒压120V、电流50mA，电泳30～35min。
所述的PCR产物以限制性内切酶HinfI或其同切酶进行酶切是产生特异性具有检测意义的产物片段的关键步骤。所述的酶切体系可采用本领域常规体系，优选的酶切体系内添加的PCR产物终浓度不超过50ng/μL，HinfI内切酶终浓度为0.5U/μL，酶切反应液在PCR仪中37℃保温40min。
鲬PCR产物经酶切后被消化为279bp、399bp和24bp的片段，其中24bp因片段因过短导致电泳后不可见，即鲬酶切图谱为399bp和279bp两条清晰条带；李氏的PCR产物经酶切后可被消化为79bp、200bp、399bp和24bp的片段，79bp和24bp片段过短导致电泳后不可见，即李氏酶切图谱为399bp和200bp两条清晰条带。显然，经酶切处理后，来源于鲬或李氏的供试样品的电泳行为有明显差异，根据电泳图谱所显示的DNA片段大小，可准确鉴别其种类，采用的判断标准可简述为：
a.凝胶电泳结果包含399bp和279bp条带，则供试样品来自鲬；
b.凝胶电泳结果包含399bp和200bp条带，则供试样品来自李氏
下述非限制性实施例用于进一步说明本发明内容，不应当理解为对本发明任意形式的限定。如无特殊说明，本发明所使用的鲬和李氏样品捕捞自辽东湾，每个样品设2个平行。
a.DNA的提取：取待测样品，采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取样品总DNA，完成DNA提取后通过Nanodrop微量分光光度计测定浓度，用去离子水将其浓度调至100～200ng/μL备用
b.PCR反应：
b1：反应体系50μL，包括：
组分 用量 终浓度
步骤a制备的供试DNA模板 2.5μL 250ng/50μL
10～5LA PCR Buffer(Mg2+plus) 5μL [1×]
dNTP Mixture 8μL 各400μM
10pmol/μL F引物(SEQ ID No.1) 2μL 0.4μM
10pmol/μL R引物(SEQ ID No.2) 2μL 0.4μM
TaKaRa LA Taq 0.5μL 2.5U/50μL
灭菌去离子水 30μL
b2：PCR反应：
反应在PCR仪上运行，具体条件为：
94℃，2min；
94℃,30s；58℃,30s；72℃,1min，30个循环；
72℃，10min。
反应结束后PCR产物置于4℃保存。
b3：电泳检测：取步骤a制备的样品总DNA、步骤b所制备的PCR产物各2μL，混合6×LoadingBuffer上样缓冲液，以0.5×TBE为缓冲液，用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶在恒压120V、电流50mA条件下电泳35min。结果见图1，在全自动凝胶成像仪中可观测到各样品DNA完整且能扩增出特异性好的单一条带。
c.酶切反应：
以20μL反应体系，具体如下：
将反应液置于PCR仪中37℃保温40min后取出，各添加2μL(反应液体积的1/10)10×LoadingBuffer停止反应。
d.电泳检测：
以0.5×TBE为缓冲液，用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶在恒压120V、电流50mA条件下电泳35min对酶切产物进行检测。
e.图型比对，鉴定供试样品种类：
在全自动凝胶成像仪中对电泳结果进行观测、拍照和分析，结果如附图1所示：鲬为399bp和279bp两条清晰条带，李氏为399bp和200bp两条清晰条带，完全可区分。据此可准确鉴别供试样品的种类。

Claims (9)

1.鲬和李氏的快速鉴别试剂盒，其特征在于包括碱基序列为SEQIDNo.1/2的引物对，以及限制性内切酶HinfI或其同切酶。
2.鲬和李氏的快速鉴别方法，包括对样品总DNA进行PCR扩增的步骤，其特征在于，PCR扩增引物对的碱基序列为SEQIDNo.1/2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括PCR产物酶切的步骤，所述的酶切步骤使用限制性内切酶HinfI或其同切酶。
4.根据权利要求3所述的方法，包括如下步骤：
a.提取样品总DNA；
b.PCR扩增：以步骤a所提取的样品总DNA为模板，使用引物SEQIDNo.1/2进行PCR扩增；
c.使用限制性内切酶HinfI或其同切酶对步骤b所得PCR扩增产物进行酶切；
d.对步骤c所得酶切产物进行电泳检测；
e.结果判定。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤a使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取待测样品总DNA。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤b所述的PCR扩增包括如下参数：
94℃预变性2min；
94℃30s,58℃30s,72℃1min，30个循环；
72℃延伸10min。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤c中酶切反应体系内的PCR产物终浓度不超过50ng/μL，内切酶终浓度0.5U/μL，反应液于37℃保温40min。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤d中，电泳检测条件参数包括：0.5×TBE缓冲液，1.5％的琼脂糖凝胶电泳，恒压120V、电流50mA，电泳30～35min。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤e结果判定是根据下述标准判定样品来源：
a.凝胶电泳结果包含399bp和279bp条带，则供试样品来自鲬；
b.凝胶电泳结果包含399bp和200bp条带，则供试样品来自李氏
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