CN1737565A - 鲍鱼种类鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
鲍鱼种类鉴别方法，涉及一种鲍类生物材料的鉴别方法，尤其是涉及一种鲍鱼种类鉴别方法。提供一种简便的鲍鱼种类鉴别方法。其步骤为取鲍组织样品10～25mg，用蛋白酶K－苯酚－氯仿法或DNA抽提试剂盒提取总DNA，用蒸馏水或TE溶液溶解；取上述抽提的总DNA，按照通常的PCR反应条件，用特异性引物分别对之进行PCR扩增；取PCR反应产物，用琼脂糖凝胶电泳，凝胶中加入溴化乙锭，在紫外线灯下观察经过电泳后的凝胶，每种特异性引物都从其相应的鲍总DNA中扩增出显著的条带。灵敏准确，可用于鉴别以肉眼难以分辨的不同种鲍鱼的幼体，并对幼体进行所属物种的鉴定；也可用于鉴定鲍鱼加工品是使用什么种类的鲍鱼为原料加工而成。
Description
技术领域
本发明涉及一种鲍类生物材料的鉴别方法，尤其是涉及一种鲍鱼种类鉴别方法。
背景技术
鲍俗称鲍鱼，是一类经济价值很高的海产经济动物，其肉可食且味道鲜美，是我国传统的著名海珍品，其壳可入药，中药称为石决明，有平肝潜阳、清肝明目的功效。近几年来，随着野生鲍资源减少和市场需求增加，九孔鲍(杂色鲍)、盘鲍和皱纹盘鲍的人工养殖业得到很大的发展，羊鲍、耳鲍养殖也已经在试验之中，预计今后也将逐步得到发展。
不同种类的鲍其品质(肉质、风味、营养价值)不同，售价也不一样。新鲜的或未经加工的鲍可以通过其贝壳的形态等加以识别，但是经过加工的产品则无法从形态上判断是由何种鲍加工而成。国外已经出现用廉价的鲍为原料制造罐头食品，却谎称是高价的鲍而以高价出售的例子，国内今后同样可能出现这种情况。为此需要一种灵敏可靠的从加工品鉴别原料鲍种类的技术。另外，不同种的鲍其幼虫(早期幼体)阶段形态相同或非常相似，往往难以鉴别，这给其幼体分类和生态学等研究带来困难。为此也需要一种可靠灵敏的对不同种类鲍的幼体进行鉴别与鉴定的技术。
不同种生物其基因序列间通常存在着比较固定的差异，因此可以根据基因(DNA)序列的不同进行物种鉴别，这种方法不受生物生活环境以及生长发育状态的影响，鉴别的准确性很高。其中最可靠的方法是克隆出某个基因或DNA片段进行测序，但是测序的操作复杂，成本也比较高。对于鱼类已经有人建立了抽提线粒体DNA(mtDNA)，用多种限制性内切酶对mtDNA进行切割，根据酶切结果的差异识别与鉴定鱼类加工品的原材料鱼种的方法。这种方法需要比较多的组织样品来抽提mtDNA，因此无法用于细小的动物幼体如鲍鱼幼虫的鉴别。PCR技术是一种非常灵敏的体外DNA扩增技术，它同时具有很高的特异性，通过设计适宜的引物和控制适宜的反应条件，利用它可以鉴别出受检DNA上的微小的序列差异，已经被广泛应用到生命科学研究众多领域，及至刑征、法医鉴定等领域。
发明内容
本发明的目的在于针对已有的根据酶切结果的差异识别与鉴定鱼类加工品的原材料鱼种的方法无法用于鲍鱼幼虫以及加工品鉴别的问题，提供一种简便的鲍鱼种类鉴别方法。
本发明采用的技术方案是根据鲍鱼线粒体16S rRNA基因序列的差异设计特异性PCR引物，通过对受检材料进行PCR(聚合酶链式反应)扩增，采用琼脂糖凝胶电泳检测有无预期的扩增产物出现，据此即可准确地对受检测材料进行物种的鉴定。
本发明所说的鲍鱼种类鉴别方法其步骤为：
1)、DNA的提取：取鲍组织样品10～25mg，用蛋白酶K-苯酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取总DNA，用蒸馏水或TE溶液溶解；
2)、PCR扩增：取上述抽提的总DNA，按照通常的PCR反应条件，用特异性引物分别对之进行PCR扩增；
3)、取PCR反应产物3～5μL，用1％～1.5％的琼脂糖凝胶电泳10～20min，凝胶中加入溴化乙锭(EB)，所说的溴化乙锭的加入量为0.5～2μg/ml；
4)、在紫外线灯下观察经过电泳后的凝胶，每种特异性引物都从其相应的鲍总DNA中扩增出显著的条带，而对其它鲍种DNA扩增反应结果则无明显扩增条带产生。
在步骤1)中，所说的取鲍组织样品最好用腹足的肌肉。所说的TE溶液为10mM PH8.0Tris-HCl，1mM EDTA。
在步骤2)中，所说的特异性引物的序列如表1。
表1
| 鲍种名 | 特异性引物序列 |
| 杂色鲍九孔鲍 | F：5’TCTGAACATATCTTTATGTC3’R：5’AGTACGTCCGTTGATGAATG3’ |
| 皱纹盘鲍盘鲍 | F：5’GCTCCTTGGTTGTGATAATATA3’R：5’GAATAAATTTAAAATCCTCTATTC3’ |
| 耳鲍 | F：5’GGTTTATATTTCCTAGTTG3’R：5’CGGATCATTAGCTAGCAAG3’ |
| 多变鲍 | F：5’AAGCTGTGCTCCTGAAG3’R：5’CCCAGTCAGAAAACCAAAAAT3’ |
| 羊鲍 | F：5’AATTTCTAGTTGTACTAG3’R：5’ATCAGTCGGCAGACCAAATTC3’ |
所说的PCR扩增反应条件为：
反应体系(10～20μL)：DNA模板10～100ng；1X PCR缓冲液；dNTPs2mM；MgCl21.5mM；正向和反向特异性引物各0.2mM；Taq酶0.5～1.0U(市售)；
PCR循环条件：94℃ 2min；94℃ 30sec，52℃ 1min，72℃ 1min，循环30次；72℃延伸5～10min。
本发明根据鲍鱼线粒体16S rRNA基因序列的差异设计特异性PCR引物，通过对受检材料进行PCR(聚合酶链式反应)扩增，采用琼脂糖凝胶电泳检测有无预期的扩增产物出现，据此即可准确地对受检测材料进行物种的鉴定。其特点是灵敏、准确。该方法可用于鉴别以肉眼难以分辨的不同种鲍鱼的幼体，并对幼体进行所属物种的鉴定；也可用于鉴定鲍鱼加工品是使用什么种类的鲍鱼为原料加工而成，在商业上和生态学等科学研究上都有应用价值。所说的鲍鱼主要为经济鲍种，例如盘鲍、皱纹盘鲍、杂色鲍或九孔鲍、羊鲍、耳鲍、多变鲍等。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明。
实施例1
取盘鲍以及皱纹盘鲍组织样品8～10mg，分别用蛋白酶K-苯酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取总DNA，用蒸馏水溶解。取上述抽提的总DNA，用表1所述5对特异性引物，按照以下PCR扩增反应条件分别进行PCR扩增(共10个反应)：反应体系(10～20μL)：DNA模板10～100ng；1X PCR缓冲液；dNTPs2mM；MgCl21.5mM；正向和反向特异性引物各0.2mM；Taq酶0.5～1.0U(市售)。PCR循环条件：94℃ 2min；94℃ 30sec，52℃ 1min，72℃ 1min，循环30次；72℃延伸5～10min。取PCR反应产物4μL，用1.1％的琼脂糖凝胶电泳12min，电压5～10v/cm，凝胶中加入0.5～2μg/ml溴化乙锭。在紫外线灯下观察经过电泳后的凝胶，用盘鲍与皱纹盘鲍特异性引物的2个反应可见到显著的扩增条带，而其余8个反应则无扩增条带。所用的盘鲍与皱纹盘鲍特异性引物的序列为F：5’GCTCCTTGGTTGTGATAATATA3’和R：5’GAATAAATTTAAAATCCTCTATTC3’。
实施例2
取杂色鲍或九孔鲍组织样品15mg，按照实施例1的方法抽提总DNA，并用与实施例1相同的条件和方法进行PCR反应和琼脂糖电泳检测反应产物。在紫外线灯下观察经过电泳后的凝胶，发现用九孔鲍(杂色鲍)特异性引物的2个反应可见到显著的扩增条带，而用其它鲍特异引物的反应都无扩增条带。所用的九孔鲍(杂色鲍)特异性引物的序列为F：5’TCTGAACATATCTTTATGTC3’和R：5’AGTACGTCCGTTGATGAATG3’。
实施例3
取耳鲍组织样品20mg，用蛋白酶K-苯酚－氯仿法或DNA抽提试剂盒提取总DNA，用TE溶液溶解。取上述抽提的总DNA，按照以下PCR扩增反应条件进行PCR扩增：反应体系(10～20μL)：DNA模板10～100ng；1X PCR缓冲液；dNTPs2mM；MgCl21.5mM；正向和反向特异性引物各0.2mM；Taq酶0.5～1.0U(市售)。PCR循环条件：94℃ 2min；94℃ 30sec，52℃ 1min，72℃ 1min，循环30次；72℃延伸5～10min。取PCR反应产物4.5μL，用1.3％的琼脂糖凝胶电泳20min，凝胶中加入0.5～2μg/ml溴化乙锭。在紫外线灯下观察经过电泳后的凝胶，发现其显著的扩增条带。所用的特异性引物的序列为F：5’GGTTTATATTTCCTAGTTG3’和R：5’CGGATCATTAGCTAGCAAG3’。同时用其它种类鲍特异性引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶上都没有出现显著的扩增条带。
实施例4
取多变鲍组织样品25mg，用蛋白酶K-苯酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取总DNA，用蒸馏水溶解。取上述抽提的总DNA，按照以下PCR扩增反应条件进行PCR扩增：反应体系(10～20μL)：DNA模板10～100ng；1X PCR缓冲液；dNTPs2mM；MgCl21.5mM；正向和反向特异性引物各0.2mM；Taq酶0.5～1.0U(市售)。PCR循环条件：94℃ 2min；94℃ 30sec，52℃ 1min，72℃ 1min，循环30次；72℃延伸5～10min。取PCR反应产物3μL，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳18min，凝胶中加入0.5～2μg/ml溴化乙锭。在紫外线灯下观察经过电泳后的凝胶，发现其显著的扩增条带。所用的特异性引物的序列为F：5’AAGCTGTGCTCCTGAAG3’和R：5’CCCAGTCAGAAAACCAAAAAT3’。同时用其它种类鲍特异性引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶上都没有出现显著的扩增条带。
实施例5
取羊鲍组织样品18mg，用蛋白酶K-苯酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取总DNA，用蒸馏水溶解。取上述抽提的总DNA，按照以下PCR扩增反应条件进行PCR扩增：反应体系(10～20μL)：DNA模板10～100ng；1X PCR缓冲液；dNTPs2mM；MgCl21.5mM；正向和反向特异性引物各0.2mM；Taq酶0.5～1.0U(市售)。PCR循环条件：94℃ 2min；94℃ 30sec，52℃ 1min，72℃ 1min，循环30次；72℃延伸5～10min。取PCR反应产物5μL，用1.4％的琼脂糖凝胶电泳10min，凝胶中加入0.5～2μg/ml溴化乙锭。在紫外线灯下观察经过电泳后的凝胶，发现其显著的扩增条带。所用的特异性引物的序列为F：5’AATTTCTAGTTGTACTAG3’和R：5’ATCAGTCGGCAGACCAAATTC3’。同时用其它种类鲍特异性引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶上都没有出现显著的扩增条带。
实施例6
取经过加水煮沸30min的盘鲍肌肉样品15mg，用蛋白酶K-苯酚-氯仿法抽提总DNA，按照实施例1相同的条件和方法进行PCR反应和琼脂糖电泳检测。在紫外线灯下观察经过电泳后的凝胶，发现用盘鲍与皱纹盘鲍特异性引物的反应可见到预期的显著的扩增条带，而用其它鲍特异引物的反应都无扩增条带。
实施例7
取经过在高压锅中加水煮沸30min以上的九孔鲍(杂色鲍)肌肉样品20mg，用蛋白酶K-苯酚-氯仿法抽提总DNA，按照实施例1相同的条件和方法进行PCR反应和琼脂糖电泳检测。在紫外线灯下观察经过电泳后的凝胶，发现用盘鲍与皱纹盘鲍特异性引物的反应可见到预期的显著的扩增条带，而用其它鲍特异引物的反应都无扩增条带。
实施例8
取九孔鲍(杂色鲍)担轮幼体若干个，用DNA抽提试剂盒(市售)抽提总DNA，用蒸馏水溶解。取上述抽提的总DNA，按照以下PCR扩增反应条件进行PCR扩增：反应体系(10～20μL)：DNA模板10～30ng；1X PCR缓冲液；dNTPs2mM；MgCl21.5mM；正向和反向盘鲍与皱纹盘鲍特异性引物各0.2mM；Taq酶0.5～1.0U(市售)。PCR循环条件：94℃ 2min；94℃ 30sec，52℃ 1min，72℃ 1min，循环30次；72℃延伸5～10min。取PCR反应产物4μL，用1.1％的琼脂糖凝胶电泳12min，电压5～10v/cm，凝胶中加入0.5～2μg/ml溴化乙锭。在紫外线灯下观察经过电泳后的凝胶，在预期的位置发现其特异的扩增条带。所用的特异性引物的序列为F：5’GCTCCTTGGTTGTGATAATATA3’和R：5’GAATAAATTTAAAATCCTCTATTC3’。
实施例9
取九孔鲍(杂色鲍)担轮幼体用蒸馏水漂洗干净，然后取单个个体，直接按照以下PCR扩增反应条件进行PCR扩增：反应体系(10～20μL)：DNA模板10～30ng；1X PCR缓冲液；dNTPs2mM；MgCl21.5mM；正向和反向盘鲍与皱纹盘鲍特异性引物各0.2mM；Taq酶0.5～1.0U(市售)。PCR循环条件：95℃ 3min；94℃ 30sec，52℃ 1min，72℃ 1min，循环30次；72℃延伸5～10min。取PCR反应产物4μL，用1.1％的琼脂糖凝胶电泳12min，电压5～10v/cm，凝胶中加入0.5～2μg/ml溴化乙锭。在紫外线灯下观察经过电泳后的凝胶，在预期的位置发现其特异的扩增条带。所用的特异性引物的序列为F：5’GCTCCTTGGTTGTGATAATATA3’和R：5’GAATAAATTTAAAATCCTCTATTC3’。
Claims (5)
1、鲍鱼种类鉴别方法，其特征在于其步骤为：
1)、DNA的提取：取鲍组织样品10～25mg，用蛋白酶K-苯酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取总DNA，用蒸馏水或TE溶液溶解：
2)、PCR扩增：取上述抽提的总DNA，按照通常的PCR反应条件，用特异性引物分别对之进行PCR扩增；
3)、取PCR反应产物3～5μL，用1％～1.5％的琼脂糖凝胶电泳10～20min，凝胶中加入溴化乙锭；
4)、在紫外线灯下观察经过电泳后的凝胶，检查鲍种DNA扩增反应结果是否有明显扩增条带产生。
2、如权利要求1所述的鲍鱼种类鉴别方法，其特征在于在步骤1)中，所说的取鲍组织样品用腹足的肌肉。
3、如权利要求1所述的鲍鱼种类鉴别方法，其特征在于在步骤1)中，所说的TE溶液为10mM PH8.0Tris-HCl，1mM EDTA。
4、如权利要求1所述的鲍鱼种类鉴别方法，其特征在于在步骤2)中，所说的特异性引物的序列如下表：
鲍种名
特异性引物序列
杂色鲍九孔鲍
F：5’TCTGAACATATCTTTATGTC3’R：5’AGTACGTCCGTTGATGAATG3’
皱纹盘鲍盘鲍
F：5’GCTCCTTGGTTGTGATAATATA3’R：5’GAATAAATTTAAAATCCTCTATTC3’
耳鲍
F：5’GGTTTATATTTCCTAGTTG3’R：5’CGGATCATTAGCTAGCAAG3’
多变鲍
F：5’AAGCTGTGCTCCTGAAG3’R：5’CCCAGTCAGAAAACCAAAAAT3’
羊鲍
F：5’AATTTCTAGTTGTACTAG3’R：5’ATCAGTCGGCAGACCAAATTC3’
所说的PCR扩增反应条件为：反应体系10～20μL：DNA模板10～100ng；1X PCR缓冲液；dNTPs2mM；MgCl21.5mM；正向和反向特异性引物各0.2mM；Taq酶0.5～1.0U；PCR循环条件：94℃ 2min；94℃ 30sec，52℃ 1min，72℃ 1min，循环30次；72℃延伸5～10min。
5、如权利要求1所述的鲍鱼种类鉴别方法，其特征在于在步骤3)中，所说的溴化乙锭的加入量为0.5～2μg/ml。
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