CN105524911A - 一种纳米纤维素载体固定化β-甘露聚糖酶制备低聚甘露糖的方法 - Google Patents

一种纳米纤维素载体固定化β-甘露聚糖酶制备低聚甘露糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纳米纤维素载体固定化β-甘露聚糖酶制备低聚甘露糖的方法，属于低聚甘露糖制备领域。本发明以魔芋粉为原料，制成的固化酶为催化剂，水解得到的低聚甘露糖产率大、纯度高，而且制备工艺简单、成本低，以纳米纤维素材料为β-甘露聚糖酶载体得固定化酶，由于纳米纤维素巨大的比表面积，可以有利于酶固定量的提高，促使固定化酶和底物频繁碰撞，很好地保持酶的活性，大幅度提高催化效率，并且其贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用。

Description

一种纳米纤维素载体固定化β-甘露聚糖酶制备低聚甘露糖的方法
技术领域
本发明公开了一种纳米纤维素载体固定化β-甘露聚糖酶制备低聚甘露糖的方法，属于低聚甘露糖制备领域。
背景技术
聚甘露糖是由2~10个甘露糖通过β-1,4糖苷键聚合而成的低聚糖，又称甘露寡糖。它可有效促进生物体内以双歧杆菌为代表的肠道益生菌群的增殖，并具有抑制体内病原菌生长、减少有毒代谢产物产生、防止便秘、保护肝脏、抗肿瘤及增强机体免疫力等多种生理功能，是新一代功能性食品。目前低聚甘露糖的制备通常都是利用高温水解、酸水解或者碱水解，酶法水解虽然也有报道，但条件还不够成熟。酶法生产低聚甘露糖主要受制于生产所用的关键酶的催化效率较低、酶的生产和使用成本较高，以及底物的粘度过大难以实现高浓度的生产等。
酶作为生物催化剂，具有反应条件温和、催化效率高、对底物具有高度的选择性，活性可控等优点。但在自由状态的游离酶具有不稳定性，在高温、强酸、强碱及部分有机溶液中容易导致酶的构象变化，甚至是蛋白变性，其催化活性降低甚至完全丧失。即使在反应最适条件下，也往往会很快失活。另外，自由酶混入反应体系中，使得产品分离纯化变得更加复杂，酶也因此难以重复使用。
发明内容
本发明主要解决的技术问题：针对目前传统的固定化酶的载体大多采用常规薄膜、微粒或普通纤维等，存在固定量小，空间位阻大，而且酶法生产低聚甘露糖所用的酶催化效率较低、酶的生产和使用成本较高的问题，提供了一种纳米纤维素载体固定化β-甘露聚糖酶制备低聚甘露糖的方法，本发明以纳米纤维素材料为β-甘露聚糖酶载体得固定化酶，由于纳米纤维素巨大的比表面积，可以有利于酶固定量的提高，促使固定化酶和底物频繁碰撞，很好地保持酶的活性，大幅度提高催化效率，并且其贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用，以魔芋粉为原料，制成的固化酶为催化剂，水解得到的低聚甘露糖产率大、纯度高，而且制备工艺简单、成本低。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
（1）取5～8g纳米纤维素，将其浸泡在质量分数5%氢氧化钠溶液中，搅拌混合15～20min后抽滤，将滤渣用去离子水洗涤3～5次再抽滤，将滤渣烘干，烘干后按1.5～2.5g/L加入质量浓度10%高碘酸钠溶液中，在40～50℃下置于摇床中避光振荡30～40min，振荡后过滤，得到滤渣放入质量浓度0.2mol/L乙二醇中浸泡25～35min，洗除多余高碘酸钠，浸泡后再将滤渣用去离子冲洗3～5次，烘干得改性纳米纤维素；
（2）将pH6.5～8.0磷酸盐缓冲液中按1～3mg/mL加入β-甘露聚糖酶，在35～45℃水浴下搅拌至固体溶解，将溶液用超声波在400～500W进行破碎，破碎8～10s后隔3～5s再破碎，15～20min后得到破碎液放入冰箱中冷却至4℃，取出立即加入分离机中，在5000～6000r/min转速下离心分离15～20min，收集上清液，得到β-甘露聚糖酶酶液；
（3）将步骤（1）得到的改性纳米纤维素按0.1～0.3g/L加入到上述β-甘露聚糖酶酶液，温度控制在4℃在恒温摇床中以200～300r/min转速下进行振荡1～2h，振荡后放入冰箱中静置固化10～12h，固化完全后过滤，将滤渣分别用pH6.5～8.0磷酸盐缓冲溶液和去离子水冲洗1～3次，冲洗后冷冻干燥就可得到纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶；
（4）按质量比3:5称取50～80g魔芋粉加入到质量浓度为85～90%的乙醇溶液中，在55～65℃水浴中进行搅拌混合15～20min，得魔芋浊液，用冰醋酸调节pH为4.0～5.0，调节后加入总质量0.5～0.8%纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶，在55～65℃水浴下进行搅拌反应4～6h，反应结束后把滤渣用水洗涤，得滤液和魔芋浊液合并，用质量浓度15%氢氧化钠溶液调节滤液pH为7.5～8.5，调节后将滤液在50～60℃下真空浓缩至过饱和糖浆；
（5）向上述过饱和糖浆中加入0.1～0.3mg甘露糖晶体，室温静置20～22h，待有晶体析出时，在90～95℃的水浴下缓慢加入5～8mL质量分数无水乙醇溶液，有大量晶体析出，室温静置20～22h后抽滤，将得到的晶体干燥至恒重，即为低聚甘露糖。
本发明的应用方法：本发明制得的低聚甘露糖可以应用于食品中，例如替代饮料中白砂糖的30～60%，具有低热值、低甜度、不引发龋齿、不增加血糖浓度效果；添加在奶油食品中，可将原来白砂糖的10～15％更换为低聚甘露糖，可提高产品的乳化性，而且食用起来避免油腻口感；将低聚甘露糖替代白砂糖添加在保健食品中，具有增强免疫力，抗病防病，改善肠道健康状况的功能。
本发明的有益效果是：
（1）本发明以纳米纤维素巨大的比表面积，可以有利于酶固定量的提高，促使固定化酶和底物频繁碰撞，很好地保持酶的活性，大幅度提高催化效率，并且其贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用；
（2）本发明制成的固化酶为催化剂，水解得到的低聚甘露糖产率大、纯度高，而且制备工艺简单、成本低。
具体实施方式
取5～8g纳米纤维素，将其浸泡在质量分数5%氢氧化钠溶液中，搅拌混合15～20min后抽滤，将滤渣用去离子水洗涤3～5次再抽滤，将滤渣烘干，烘干后按1.5～2.5g/L加入质量浓度10%高碘酸钠溶液中，在40～50℃下置于摇床中避光振荡30～40min，振荡后过滤，得到滤渣放入质量浓度0.2mol/L乙二醇中浸泡25～35min，洗除多余高碘酸钠，浸泡后再将滤渣用去离子冲洗3～5次，烘干得改性纳米纤维素；将pH6.5～8.0磷酸盐缓冲液中按1～3mg/mL加入β-甘露聚糖酶，在35～45℃水浴下搅拌至固体溶解，将溶液用超声波在400～500W进行破碎，破碎8～10s后隔3～5s再破碎，15～20min后得到破碎液放入冰箱中冷却至4℃，取出立即加入分离机中，在5000～6000r/min转速下离心分离15～20min，收集上清液，得到β-甘露聚糖酶酶液；将得到的改性纳米纤维素按0.1～0.3g/L加入到β-甘露聚糖酶酶液，温度控制在4℃在恒温摇床中以200～300r/min转速下进行振荡1～2h，振荡后放入冰箱中静置固化10～12h，固化完全后过滤，将滤渣分别用pH6.5～8.0磷酸盐缓冲溶液和去离子水冲洗1～3次，冲洗后冷冻干燥就可得到纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶；按质量比3:5称取50～80g魔芋粉加入到质量浓度为85～90%的乙醇溶液中，在55～65℃水浴中进行搅拌混合15～20min，得魔芋浊液，用冰醋酸调节pH为4.0～5.0，调节后加入总质量0.5～0.8%纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶，在55～65℃水浴下进行搅拌反应4～6h，反应结束后把滤渣用水洗涤，得滤液和魔芋浊液合并，用质量浓度15%氢氧化钠溶液调节滤液pH为7.5～8.5，调节后将滤液在50～60℃下真空浓缩至过饱和糖浆；向过饱和糖浆中加入0.1～0.3mg甘露糖晶体，室温静置20～22h，待有晶体析出时，在90～95℃的水浴下缓慢加入5～8mL质量分数无水乙醇溶液，有大量晶体析出，室温静置20～22h后抽滤，将得到的晶体干燥至恒重，即为低聚甘露糖。
实例1
取5g纳米纤维素，将其浸泡在质量分数5%氢氧化钠溶液中，搅拌混合15min后抽滤，将滤渣用去离子水洗涤3次再抽滤，将滤渣烘干，烘干后按1.5g/L加入质量浓度10%高碘酸钠溶液中，在40℃下置于摇床中避光振荡30min，振荡后过滤，得到滤渣放入质量浓度0.2mol/L乙二醇中浸泡25min，洗除多余高碘酸钠，浸泡后再将滤渣用去离子冲洗3次，烘干得改性纳米纤维素；将pH6.5磷酸盐缓冲液中按1mg/mL加入β-甘露聚糖酶，在35℃水浴下搅拌至固体溶解，将溶液用超声波在400W进行破碎，破碎8s后隔3s再破碎，15min后得到破碎液放入冰箱中冷却至4℃，取出立即加入分离机中，在5000r/min转速下离心分离15min，收集上清液，得到β-甘露聚糖酶酶液；将得到的改性纳米纤维素按0.1g/L加入到β-甘露聚糖酶酶液，温度控制在4℃在恒温摇床中以200r/min转速下进行振荡1h，振荡后放入冰箱中静置固化10h，固化完全后过滤，将滤渣分别用pH6.5磷酸盐缓冲溶液和去离子水冲洗1次，冲洗后冷冻干燥就可得到纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶；按质量比3:5称取50g魔芋粉加入到质量浓度为85%的乙醇溶液中，在55℃水浴中进行搅拌混合15min，得魔芋浊液，用冰醋酸调节pH为4.0，调节后加入总质量0.5%纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶，在55℃水浴下进行搅拌反应4h，反应结束后把滤渣用水洗涤，得滤液和魔芋浊液合并，用质量浓度15%氢氧化钠溶液调节滤液pH为7.5，调节后将滤液在50℃下真空浓缩至过饱和糖浆；向过饱和糖浆中加入0.1mg甘露糖晶体，室温静置20h，待有晶体析出时，在90℃的水浴下缓慢加入5mL质量分数无水乙醇溶液，有大量晶体析出，室温静置20h后抽滤，将得到的晶体干燥至恒重，即为低聚甘露糖。
本发明制得的低聚甘露糖可以应用于食品中，例如替代饮料中白砂糖的30%，具有低热值、低甜度、不引发龋齿、不增加血糖浓度效果；添加在奶油食品中，可将原来白砂糖的10％更换为低聚甘露糖，可提高产品的乳化性，而且食用起来避免油腻口感；将低聚甘露糖替代白砂糖添加在保健食品中，具有增强免疫力，抗病防病，改善肠道健康状况的功能。
实例2
取7g纳米纤维素，将其浸泡在质量分数5%氢氧化钠溶液中，搅拌混合18min后抽滤，将滤渣用去离子水洗涤4次再抽滤，将滤渣烘干，烘干后按2.0g/L加入质量浓度10%高碘酸钠溶液中，在45℃下置于摇床中避光振荡35min，振荡后过滤，得到滤渣放入质量浓度0.2mol/L乙二醇中浸泡30min，洗除多余高碘酸钠，浸泡后再将滤渣用去离子冲洗4次，烘干得改性纳米纤维素；将pH7.5磷酸盐缓冲液中按2mg/mL加入β-甘露聚糖酶，在40℃水浴下搅拌至固体溶解，将溶液用超声波在450W进行破碎，破碎9s后隔4s再破碎，17min后得到破碎液放入冰箱中冷却至4℃，取出立即加入分离机中，在5500r/min转速下离心分离17min，收集上清液，得到β-甘露聚糖酶酶液；将得到的改性纳米纤维素按0.2g/L加入到β-甘露聚糖酶酶液，温度控制在4℃在恒温摇床中以250r/min转速下进行振荡1.5h，振荡后放入冰箱中静置固化11h，固化完全后过滤，将滤渣分别用pH6.5～8.0磷酸盐缓冲溶液和去离子水冲洗2次，冲洗后冷冻干燥就可得到纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶；按质量比3:5称取65g魔芋粉加入到质量浓度为87%的乙醇溶液中，在60℃水浴中进行搅拌混合17min，得魔芋浊液，用冰醋酸调节pH为4.5，调节后加入总质量0.6%纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶，在60℃水浴下进行搅拌反应5h，反应结束后把滤渣用水洗涤，得滤液和魔芋浊液合并，用质量浓度15%氢氧化钠溶液调节滤液pH为8.0，调节后将滤液在55℃下真空浓缩至过饱和糖浆；向过饱和糖浆中加入0.2mg甘露糖晶体，室温静置21h，待有晶体析出时，在93℃的水浴下缓慢加入7mL质量分数无水乙醇溶液，有大量晶体析出，室温静置21h后抽滤，将得到的晶体干燥至恒重，即为低聚甘露糖。
本发明制得的低聚甘露糖可以应用于食品中，例如替代饮料中白砂糖的40%，具有低热值、低甜度、不引发龋齿、不增加血糖浓度效果；添加在奶油食品中，可将原来白砂糖的13％更换为低聚甘露糖，可提高产品的乳化性，而且食用起来避免油腻口感；将低聚甘露糖替代白砂糖添加在保健食品中，具有增强免疫力，抗病防病，改善肠道健康状况的功能。
实例3
取5～8g纳米纤维素，将其浸泡在质量分数5%氢氧化钠溶液中，搅拌混合20min后抽滤，将滤渣用去离子水洗涤5次再抽滤，将滤渣烘干，烘干后按2.5g/L加入质量浓度10%高碘酸钠溶液中，在50℃下置于摇床中避光振荡40min，振荡后过滤，得到滤渣放入质量浓度0.2mol/L乙二醇中浸泡35min，洗除多余高碘酸钠，浸泡后再将滤渣用去离子冲洗5次，烘干得改性纳米纤维素；将pH8.0磷酸盐缓冲液中按3mg/mL加入β-甘露聚糖酶，在45℃水浴下搅拌至固体溶解，将溶液用超声波在500W进行破碎，破碎10s后隔5s再破碎，20min后得到破碎液放入冰箱中冷却至4℃，取出立即加入分离机中，在6000r/min转速下离心分离20min，收集上清液，得到β-甘露聚糖酶酶液；将得到的改性纳米纤维素按0.3g/L加入到β-甘露聚糖酶酶液，温度控制在4℃在恒温摇床中以300r/min转速下进行振荡2h，振荡后放入冰箱中静置固化12h，固化完全后过滤，将滤渣分别用pH8.0磷酸盐缓冲溶液和去离子水冲洗3次，冲洗后冷冻干燥就可得到纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶；按质量比3:5称取80g魔芋粉加入到质量浓度为90%的乙醇溶液中，在65℃水浴中进行搅拌混合20min，得魔芋浊液，用冰醋酸调节pH为5.0，调节后加入总质量0.8%纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶，在65℃水浴下进行搅拌反应6h，反应结束后把滤渣用水洗涤，得滤液和魔芋浊液合并，用质量浓度15%氢氧化钠溶液调节滤液pH为8.5，调节后将滤液在60℃下真空浓缩至过饱和糖浆；向过饱和糖浆中加入0.3mg甘露糖晶体，室温静置22h，待有晶体析出时，在95℃的水浴下缓慢加入8mL质量分数无水乙醇溶液，有大量晶体析出，室温静置22h后抽滤，将得到的晶体干燥至恒重，即为低聚甘露糖。
本发明制得的低聚甘露糖可以应用于食品中，例如替代饮料中白砂糖的60%，具有低热值、低甜度、不引发龋齿、不增加血糖浓度效果；添加在奶油食品中，可将原来白砂糖的15％更换为低聚甘露糖，可提高产品的乳化性，而且食用起来避免油腻口感；将低聚甘露糖替代白砂糖添加在保健食品中，具有增强免疫力，抗病防病，改善肠道健康状况的功能。

Claims (1)

1.一种纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶制备低聚甘露糖的方法，其特征在于具体制备步骤为：
（1）取5～8g纳米纤维素，将其浸泡在质量分数5%氢氧化钠溶液中，搅拌混合15～20min后抽滤，将滤渣用去离子水洗涤3～5次再抽滤，将滤渣烘干，烘干后按1.5～2.5g/L加入质量浓度10%高碘酸钠溶液中，在40～50℃下置于摇床中避光振荡30～40min，振荡后过滤，得到滤渣放入质量浓度0.2mol/L乙二醇中浸泡25～35min，洗除多余高碘酸钠，浸泡后再将滤渣用去离子冲洗3～5次，烘干得改性纳米纤维素；
（2）将pH6.5～8.0磷酸盐缓冲液中按1～3mg/mL加入β-甘露聚糖酶，在35～45℃水浴下搅拌至固体溶解，将溶液用超声波在400～500W进行破碎，破碎8～10s后隔3～5s再破碎，15～20min后得到破碎液放入冰箱中冷却至4℃，取出立即加入分离机中，在5000～6000r/min转速下离心分离15～20min，收集上清液，得到β-甘露聚糖酶酶液；
（3）将步骤（1）得到的改性纳米纤维素按0.1～0.3g/L加入到上述β-甘露聚糖酶酶液，温度控制在4℃在恒温摇床中以200～300r/min转速下进行振荡1～2h，振荡后放入冰箱中静置固化10～12h，固化完全后过滤，将滤渣分别用pH6.5～8.0磷酸盐缓冲溶液和去离子水冲洗1～3次，冲洗后冷冻干燥就可得到纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶；
（4）按质量比3:5称取50～80g魔芋粉加入到质量浓度为85～90%的乙醇溶液中，在55～65℃水浴中进行搅拌混合15～20min，得魔芋浊液，用冰醋酸调节pH为4.0～5.0，调节后加入总质量0.5～0.8%纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶，在55～65℃水浴下进行搅拌反应4～6h，反应结束后把滤渣用水洗涤，得滤液和魔芋浊液合并，用质量浓度15%氢氧化钠溶液调节滤液pH为7.5～8.5，调节后将滤液在50～60℃下真空浓缩至过饱和糖浆；
（5）向上述过饱和糖浆中加入0.1～0.3mg甘露糖晶体，室温静置20～22h，待有晶体析出时，在90～95℃的水浴下缓慢加入5～8mL质量分数无水乙醇溶液，有大量晶体析出，室温静置20～22h后抽滤，将得到的晶体干燥至恒重，即为低聚甘露糖。
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