CN101037683B - 一种高效木聚糖酶固定化以及提高固定化木聚糖酶重复利用效果的方法 - Google Patents
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Abstract
一种高效木聚糖酶固定化以及提高固定化木聚糖酶重复利用效果的方法，其固定化方法为：Eudragit L-100与木聚糖酶按一定比例混合，在25℃下连续振摇1.5～3小时，即制成固定化酶。固定化酶与底物反应完毕后，添加凝聚剂，再用醋酸调pH值到3.8～4.2，静置25～40分钟后，在5000×g的条件下离心30分钟，即完成固定化酶的回收。本发明用于工业化酶法生产低聚木糖的优点是：高效的固定化效率，能有效地将酶固定化在载体上；固定化酶能与底物均相反应，提高了酶的效率；通过提高固定化酶重复利用的方法能显著提高以可逆溶解性材料Eudragit L-100为载体的固定化木聚糖酶的重复利用效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效木聚糖酶固定化以及提高固定化木聚糖酶重复利用效果的方法。
背景技术
低聚木糖(Xylooligosaccharide)作为一种附加值高、市场前景看好的功能性食品添加剂，是目前国内外竞相研究开发的功能性低聚糖之一。低聚木糖也称木寡糖，由2～7个D-木糖以β-1，4-木糖苷键连接而成，部分还含有阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等侧链。它是从棉籽壳、玉米芯、甘蔗渣等天然食物纤维(半纤维素)中，采用木聚糖酶糖化分解制取的一种低聚糖。在日本，低聚木糖被认为是最有前途的功能性低聚糖之一，已得到广泛的应用。
功能性低聚木糖除了具有低热、稳定、安全、无毒等良好的理化特性外，还能促进肠内有益菌繁殖、抑制有害菌生长的独特生理功能。双歧杆菌是最具代表性的有益菌，该菌对维持人体健康具有重要作用，具体表现为：(1)产生有机酸使肠道pH值下降，抑制病源菌的感染；(2)抑制腐败细菌的发育，使肠内腐败物质减少；(3)合成B族维生素，促进肠道蠕动，防止便秘；(4)提高人体免疫力等。
对于工业化生产低聚木糖的研究发现，酶法制备低聚木糖是解决规模化生产的最可行的方法，但价格昂贵的木聚糖酶所引起的生产成本过高一直困扰着低聚木糖的工业化生产，采用传统的固定化酶方法，其固定化效率比较低，且由于底物的难溶性，固定化酶与底物接触面积受影响，间接降低了酶的催化效率。可逆溶解性材料的出现，能极大地促进酶法制备低聚木糖的工业化生产，以可逆溶解性材料固定化的木聚糖酶不仅能够使反应体系在均相的条件下进行，增加了酶与底物的接触面积，而且其固定化得率非常高。因此，以可逆溶解性材料为载体固定化木聚糖酶在工业上的应用前景广阔，但是以可逆溶解性材料为固定化木聚糖酶时，调节pH值后，固定化酶在5000×g的离心力条件下不能完全分离，且固定化与底物的结合方式为非共价键的吸附方式，它们之间的结合不够紧密，导致此固定化酶的重复利用率偏低。
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术中所存在的不足而提供的一种高效木聚糖酶固定化以及提高固定化木聚糖酶重复利用效果的方法。
本发明的目的之一——高效木聚糖酶固定化方法是通过以下方案来实现的：本高效木聚糖酶固定化方法包括以下工艺步骤：按1mL的可逆溶解性材料与600～1000u木聚糖酶液的比例混合，在25℃下连续振摇1.5～3小时，即制成固定化酶。
在本发明中，所述可逆溶解性材料为Eudragit L-100，是pH敏感型材料，浓度为0.5～1.5％；所述木聚糖酶为Novozymes公司的商业木聚糖酶，其处理后的酶活大约为2000～4000u/mL。
本发明的另一目的——提高以可逆溶解性材料的固定化木聚糖酶重复利用方法，即固定化木聚糖酶的回收利用方法，包括以下工艺步骤：
(1)固定化木聚糖酶与底物反应后，加入凝聚剂，使其充分溶解；
(2)用0.5mol/L的醋酸溶液调节上述溶液pH值为3.8～4.2，并静置25～40分钟；(也可选用其他弱酸，弱酸的选择以不能影响固定化酶的酶活为条件)
(3)将步骤(2)中的溶液在5000×g的离心力下离心30min，倾倒出上层清液，回收沉淀；
(4)将上述沉淀用pH 4.0的醋酸缓冲液冲洗三次后，加入pH 5.8的柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，即完成一次固定化酶的回收。(缓冲液的选择要求不能影响固定化酶和酶的酶活，并且能保护酶)
上述凝聚剂为明矾，其添加量相对于反应液为15～25mg/mL，加入凝聚剂明矾后，振荡混合均匀，直到明矾全部溶解为止。
提高以可逆溶解性材料的固定化木聚糖酶重复利用具体操作过程是：所述步骤(1)中根据反应液的体积添加相对于总反应液体积15～25mg/mL的明矾，振荡混合均匀，直到明矾全部溶解为止；步骤(2)将上述液体中加入0.5mol/L的醋酸溶液，调节pH值至3.8～4.2，并静置30分钟；步骤(3)溶液在5000×g的离心力下离心半小时，倾倒出上层清液，回收沉淀；步骤(4)将上述沉淀用pH值为4.0的醋酸缓冲液冲洗三次后，加入pH 5.8的柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，这就完成了一次固定化酶的回收。
本发明用于工业化酶法生产低聚木糖的优点是：高效的固定化效率，能有效地将酶固定化在载体上，其固定化得率达到90％～135％；固定化酶能与底物均相反应，提高了酶的效率；通过提高固定化酶重复利用的方法能显著提高以可逆溶解性材料Eudragit L-100为载体的固定化木聚糖酶的重复利用效率；操作简单，价格低廉，对仪器设备要求不高，能在较低的转速下达到较好的固定化酶回收效率，每次固定化酶酶活回收，相比不采用该技术时提高了近30％；操作简单，能够很方便地用于工业化生产，能显著降低回收成本，具有良好的工业前景。
具体实施方式
实施例1：高效木聚糖酶固定化方法
4mL的0.5％的可逆溶解性材料Eudragit L-100中加入1mL2500u的Novozymes公司的商业木聚糖酶，在25℃下不停振摇2小时，其固定化酶得率达到105％。(计算方法为：固定化得率(％)＝固定化酶活力/加入酶活力×100％)
实施例2：高效木聚糖酶固定化方法
4mL的1％的可逆溶解性材料Eudragit L-100中加入1mL4000u的Novozymes公司的商业木聚糖酶，在25℃下不停振摇1.5小时，其固定化酶得率达到123％。
实施例3：高效木聚糖酶固定化方法
4mL的1％的可逆溶解性材料Eudragit L-100中加入1mL3000u的Novozymes公司的商业木聚糖酶，在25℃下不停振摇3小时，其固定化酶得率达到127％。
实施例4：提高固定化木聚糖酶重复利用效果的方法
步骤1：2mL固定化酶与20mL的底物反应完毕后，加入0.3g的明矾，振荡混合均匀，直到明矾全部溶解为止；
步骤2：将步骤1中的液体中加入0.5mol/L的醋酸溶液，调节pH值至3.8，并静置25分钟；
步骤3：溶液在5000×g的离心力下离心30min，倾倒出上层清液，回收沉淀；
步骤4：将上述沉淀用pH 4.0的醋酸缓冲液冲洗三次后，加入pH 5.8的柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，这就完成了一次固定化酶的回收。固定化木聚糖酶的回收率提高近29％。
实施例5：提高固定化木聚糖酶重复利用效果的方法
步骤1：2mL固定化酶与20mL的底物反应完毕后加入0.4g的明矾，振荡混合均匀，直到明矾全部溶解为止；
步骤2：将步骤1中的液体中加入0.5mol/L的醋酸溶液，调节pH值至3.8，并静置25分钟；
步骤3：溶液在5000×g的离心力下离心30min，倾倒出上层清液，回收沉淀；
步骤4：将上述沉淀用pH 4.0的醋酸缓冲液冲洗三次后，加入pH 5.8的柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，这就完成了一次固定化酶的回收。固定化木聚糖酶的回收率提高近26％。
实施例6：提高固定化木聚糖酶重复利用效果的方法
步骤1：2mL固定化酶与20mL的底物反应完毕后加入0.3g的明矾，振荡混合均匀，直到明矾全部溶解为止；
步骤2：将步骤1中的液体中加入0.5mol/L的醋酸溶液，调节pH值至4.0，并静置40分钟；
步骤3：溶液在5000×g的离心力下离心30min，倾倒出上层清液，回收沉淀；
步骤4：将上述沉淀用pH 4.0的醋酸缓冲液冲洗三次后，加入pH 5.8的柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，这就完成了一次固定化酶的回收。固定化木聚糖酶的回收率提高近27％。
实施例7：提高固定化木聚糖酶重复利用效果的方法
步骤1：2mL固定化酶与20mL的底物反应完毕后加入0.5g的明矾，振荡混合均匀，直到明矾全部溶解为止；
步骤2：将步骤1中的液体中加入0.5mol/L的醋酸溶液，调节pH值至4.2，并静置25分钟；
步骤3：溶液在5000×g的离心力下离心30min，倾倒出上层清液，回收沉淀；
步骤4：将上述沉淀用pH 4.0的醋酸缓冲液冲洗三次后，加入pH 5.8的柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，这就完成了一次固定化酶的回收。固定化木聚糖酶的回收率提高近26％。
Claims (3)
1.一种提高固定化木聚糖酶重复利用效果的方法，其特征在于；它包括以下工艺步骤：
(1)液态的固定化酶与底物反应后，加入凝聚剂明矾，使其充分溶解；所述液态的固定化酶是由以下步骤制成：按1mL的可逆溶解性材料与600-1000u木聚糖酶液的比例混合，在25℃下连续振摇1.5-3小时，制得固定化酶；所述可逆溶解性材料为EudragitL-100，是pH敏感型材料，浓度为0.5-1.5％；所述木聚糖酶为Novozymes公司的商业木聚糖酶，其处理后的酶活为2000-4000u/mL；
(2)用0.5mo l/L的醋酸溶液调节上述溶液pH值为3.8～4.2，并静置25～40分钟；
(3)将步骤(2)中的溶液在5000×g的离心力下离心30min，倾倒出上层清液，回收沉淀；
(4)将上述沉淀用pH 4.0的醋酸缓冲液冲洗三次后，加入pH 5.8的柠檬酸钠缓冲液溶解沉淀，得到的溶液即为可重复利用的液态固定化木聚糖酶。
2.根据权利要求1所述的提高固定化木聚糖酶重复利用效果的方法，其特征在于；明矾的添加量相对于反应液为15～25mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的提高固定化木聚糖酶重复利用效果的方法，其特征在于；加入凝聚剂明矾后，振荡混合均匀，直到明矾全部溶解为止。
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