CN102660532A - 一种木聚糖酶的固定方法 - Google Patents

Abstract

本发明所属酶工程研究开发技术领域。本发明涉及木聚糖酶载体的制备和木聚糖酶的固定化方法研究。取对苯二酚30-40g、福尔马林水溶液80-90mL、盐酸20-30mL，搅拌混匀；混合液搅拌加热至形成凝胶；凝胶用去离子水洗涤至中性，干燥，研磨，过筛，取直径大约0.05～0.2mm的颗粒，经水溶涨即得固定化载体；取凝胶载体1g，加入3～4％的戊二醛溶液5-8mL，室温下搅拌0.5h，室温交联5-6h，离心去上清，水洗除去残余戊二醛，留沉淀；沉淀载体加入10-15mL稀释的木聚糖酶，搅拌均匀，4℃固定5～6h，离心，留沉淀；沉淀用0.1mol/L HAc-NaAc缓冲液洗涤，除去多余酶液；抽真空得到固定化木聚糖酶。本发明载体和固定化酶的制备方法，载体原料廉价易得，工艺简单，条件温和，对酶活性损失小，酶活回收率可达到80.5％。

Description

一种木聚糖酶的固定方法

技术领域

本发明所属酶工程研究开发技术领域。本发明涉及木聚糖酶固定化方法的研究，适合科学研究或工业化生产。

背景技术

木聚糖是半纤维素的主要成分，属于植物细胞壁中的结构性非淀粉性多糖，约占细胞干重的15％～30％，为自然界第二大可再生性资源。木聚糖酶(endo-1，4-β-D-xylanxylanohydrolase EC3.2.1.8)以内切方式作用于木聚糖分子中β-1，4-木糖苷键，其主要水解产物为木二糖与木二糖以上的低聚木糖，还有少量木糖和阿拉伯糖。木聚糖酶降解过程具有得率高、污染小和产物的安全性高等优点，是降解半纤维素最有潜力的方法。

木聚糖酶是半纤维素酶的一种，是一种能降解木聚糖的复合酶。被广泛用于酿造中的澄清以及食品、饲料、造纸和纺织工业中。

目前国内大多数厂家使用的都是进口酶。但该酶稳定性差，保质期短，重复利用率低，往往使应用成本增高而限制了其应用。所以在酶的应用研究中，固定化酶的研究是生物技术领域中新兴的一门技术。

酶的固定化是指用载体材料将酶限制于一定空间内进行催化反应，固定化酶可回收及反复连续利用的一类技术。固定化酶保留了游离酶高效专一、温和的催化性质，同时又克服了游离酶的缺点，具有高稳定性、易分离纯化、回收使用、操作简便等优点。然而，广泛投入工业化应用的固定化酶却不多。因此，进一步开发更经济适用的固定化方法，使更多的酶取得工业上的广泛应用，仍是科技工作者追求的目标。

酶的固定化方法常用的是：吸附法、交联法、共价结合和法包埋法。在此基础上还出现了上述方法的结合法等

酶固定化研究中，良好的载体是固定化酶成功的关键。所以在酶固定化领域，作为固定化载体的筛选和制备就成为了主要研究方向。选择合适的载体，从实用性方面来考虑，探索研制高效、廉价且制备简单的载体乃是酶工程应用基础研究急需解决的一个重要课题。

在近几年来，我们在工作中发现，苯酚类物质和福尔马林作用可产生一种凝胶状物质，此类物质疏松多孔，具有极强的亲水性.不溶于水和有机溶剂，有很好的机械强度.可快速、有效地对各种酶和蛋白质加以固定，对蛋白质有很高的结合量。此类固定化剂在国内外尚未见报道。

尽管木聚糖酶的固定化载体目前很多，但该方法所制备的凝胶成本低廉，且操作简单、无毒性，是一种可以推广使用的优良酶载体.所以利用廉价的该载体固定木聚糖糖酶具有较大的理论和实践意义。而本方法研究的目的是开发新型的酶的固定化载体，并可以增强木聚糖酶在工业、医学、食品、环境保护等领域的应用。

发明内容

1.本发明涉及木聚糖酶固定化载体的制备和木聚糖酶的固定化方法，其特征在木聚糖酶载体的制备和木聚糖酶的固定化方法，包括以下过程：

步骤(一)：取对苯二酚30-40g、福尔马林水溶液80-90mL、盐酸20-30mL，搅拌混匀；

步骤(二)：将步骤(一)的混合液搅拌加热至形成凝胶；

步骤(三)：将步骤(二)的凝胶用去离子水洗涤至中性，干燥，研磨，过筛，取直径大约0.05～0.2mm的颗粒，经水溶涨即得固定化载体；

步骤(四)：取步骤(三)的凝胶载体1克(含水量85％)，加入3～4％的戊二醛溶液5-8mL，室温下搅拌0.5小时，室温交联5-6小时，离心去上清，水洗除去残余戊二醛，留沉淀；

步骤(五)：步骤(四)中的沉淀载体加入10-15mL稀释的木聚糖酶，搅拌均匀，4℃固定5～6小时，离心，留沉淀；

步骤(六)：步骤(五)中的沉淀用0.1mol/L HAc-NaAc缓冲液洗涤，除去多余酶液；

步骤(七)：将步骤(六)中的固定化酶抽真空得到固定化木聚糖酶。

2.根据本发明所述，制备固定化木聚糖酶的载体是对苯二酚、福尔马林水溶液和盐酸的混合物。

具体实施方式

本发明所述的涉及凝胶载体的制备和木聚糖酶的固定化方法包括以下实施例，下面的实施例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：

步骤(一)：取对苯二酚30g、福尔马林水溶液80mL、盐酸20mL，搅拌混匀；

步骤(二)：将步骤(一)的混合液搅拌加热至形成凝胶；

步骤(三)：将步骤(二)的凝胶用去离子水洗涤至中性，干燥，研磨，过筛，取直径大约0.05～0.2mm的颗粒，经水溶涨即得固定化载体；

步骤(四)：取步骤(三)的凝胶载体1克，加入3％的戊二醛溶液5mL，室温下搅拌0.5小时，室温交联5小时，离心去上清，水洗除去残余戊二醛，留沉淀；

步骤(五)：步骤(四)中的沉淀载体加入10mL稀释的木聚糖酶，搅拌均匀，4℃固定5小时，离心，留沉淀；

步骤(六)：步骤(五)中的沉淀用0.1mol/L HAc-NaAc缓冲液洗涤，除去多余酶液；

步骤(七)：将步骤(六)中的固定化酶抽真空得到固定化木聚糖酶。

实施例2：

步骤(一)：取对苯二酚40g、福尔马林水溶液90mL、盐酸30mL，搅拌混匀；

步骤(二)：将步骤(一)的混合液搅拌加热至形成凝胶；

步骤(三)：将步骤(二)的凝胶用去离子水洗涤至中性，干燥，研磨，过筛，取直径大约0.05～0.2mm的颗粒，经水溶涨即得固定化载体；

步骤(四)：取步骤(三)的凝胶载体1克，加入4％的戊二醛溶液8mL，室温下搅拌0.5小时，室温交联6小时，离心去上清，水洗除去残余戊二醛，留沉淀；

步骤(五)：步骤(四)中的沉淀载体加入15mL稀释的木聚糖酶，搅拌均匀，4℃固定6小时，离心，留沉淀；

步骤(六)：步骤(五)中的沉淀用0.1mol/L HAc-NaAc缓冲液洗涤，除去多余酶液；

步骤(七)：将步骤(六)中的固定化酶抽真空得到固定化木聚糖酶。

附：实验例证

1.凝胶与蛋白质的结合量：凝胶与蛋白质的结合量受其成分、反应时间和pH的影响.

凝胶成分对载体的影响改变凝胶成分的比例可影响载体与蛋白质的结合量(表1)

表1凝胶成分对载体的影响

从表1可见，处理1和5与蛋白结合量较大些，其次是处理4和3，最差的是2，所以在制备载体时采用的是福尔马林为对苯二酚的二倍量，而盐酸约为福尔马林的1/3倍量(1∶2∶1/3)。

2.作为载体固定木聚糖酶

2.1温度对固定化反应的影响

当在pH4.6、0.1mol/L HAc-NaAc缓冲液中，以不同的温度进行固定化反尖，可得不同温度下固定化酶的活力回收，得知其活力回收随温度升高而下降，所以在对酶进行固定化时，尽量在低温下(冰箱)进行(表2)。

表2.温度对固定化反应的影响

2.2pH值对固定化反应的影响

温度为10℃时，在不同pH(2.0～5.5)的缓冲液中进行固定化反应，发现当pH值为4.5时，其固定化效果最好(表3)。

pH对固定化反应的影响

2.3固定化木聚糖酶对木聚糖的转化及转化率

准确称取凝胶1g(含水量85％)，加入过量酶液，在10℃、pH4.5介质中进行固定6h，过滤，用0.1mol/L pH5.0的缓冲液充分洗涤后，加入2ml1％的木聚糖溶液和2ml缓冲液，在55℃下酶解1h，测其转化率，经多闪测定，其平均转化率可达91.8％。

2.4固定化木聚糖酶的稳定性

在最佳条件下所得固定化酶，其活力回收为80.5％，在室温下贮存4个月，测得活力回收78.8％.可见，固定化木聚酶的稳定性优良。

由上述可知，所制备的凝胶成本低廉，且操作简单、无毒性；用其固定的木聚糖酶转化率、活力回收都较高，半衰期可达三个月。因此是一种可以推广使用的优良酶载体。

Claims (2)

1.本发明涉及木聚糖酶固定化载体的制备和木聚糖酶的固定化方法，其特征在木聚糖酶载体的制备和木聚糖酶的固定化方法，包括以下过程：

步骤(一)：取对苯二酚30-40g、福尔马林水溶液80-90mL、盐酸20-30mL，搅拌混匀；

步骤(二)：将步骤(一)的混合液搅拌加热至形成凝胶；

步骤(三)：将步骤(二)的凝胶用去离子水洗涤至中性，干燥，研磨，过筛，取直径大约0.05～0.2mm的颗粒，经水溶涨即得固定化载体；

步骤(四)：取步骤(三)的凝胶载体1克，加入3～4％的戊二醛溶液5-8mL，室温下搅拌0.5小时，室温交联5-6小时，离心去上清，水洗除去残余戊二醛，留沉淀；

步骤(五)：步骤(四)中的沉淀载体加入10-15mL稀释的木聚糖酶，搅拌均匀，4℃固定5～6小时，离心，留沉淀；

步骤(六)：步骤(五)中的沉淀用0.1mol/L HAc-NaAc缓冲液洗涤，除去多余酶液；

步骤(七)：将步骤(六)中的固定化酶抽真空得到固定化木聚糖酶。

2.根据本发明所述，制备固定化木聚糖酶的载体是对苯二酚、福尔马林水溶液和盐酸的混合物，其三者比例约为：1∶2∶1/3。