CN105492017B - 靶向经修饰的tnf家族成员 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及TNF超家族的一种对它的受体具有降低的活性的经修饰的细胞因子，其中所述经修饰的细胞因子被特异性递送至靶细胞。优选地，所述经修饰的细胞因子是TNF超家族的单链变体，甚至更优选地，一个或多个链携带一种或多种突变，从而导致对受体具有低亲和力，其中所述突变细胞因子被特异性递送至靶细胞。靶向通过使所述TNF超家族的经修饰的细胞因子融合于靶向部分，优选是抗体或抗体样分子来实现。本发明进一步涉及所述TNF超家族的所述靶向经修饰的细胞因子治疗疾病的用途。

Description

靶向经修饰的TNF家族成员
本发明涉及TNF超家族的一种对它的受体具有降低的活性的经修饰的细胞因子，其中所述经修饰的细胞因子被特异性递送至靶细胞。优选地，所述经修饰的细胞因子是TNF超家族的成员的单链变体，甚至更优选地，一个或多个链携带一种或多种突变，从而导致对受体具有低亲和力，其中所述突变细胞因子被特异性递送至靶细胞。靶向通过使TNF超家族的经修饰的细胞因子融合于靶向部分，优选是抗体或抗体样分子来实现。本发明进一步涉及TNF超家族的所述靶向经修饰的细胞因子治疗疾病的用途。
TNF超家族由通过调控细胞死亡、增殖和分化而在免疫系统中具有至关重要功能的促炎性细胞因子组成。此外，所述家族的成员被描述为对骨代谢、神经系统、新血管系统和癌发生施加作用。它含有以自我装配性非共价结合的同三聚体形式具有生物活性的19种配体，即II型(细胞内N末端和细胞外C末端)跨膜蛋白。尽管大多数TNF超家族配体以膜结合的蛋白质形式合成，但可通过蛋白水解裂解来产生可溶性形式。它们全都通过它们的C末端TNF同源性结构域来结合一种或多种来自TNF受体超家族的分子，所述结构域在家族成员之间展现约20–30％序列同源性。迄今为止，已在人中鉴定了29种TNF超家族受体。这些主要是在配体结合细胞外结构域中具有富含半胱胺酸的基序的I型(细胞外N末端、细胞内C末端)跨膜糖蛋白。然而，存在一些例外，如通过共价连接的C末端糖脂连接于膜的TRAIL-R3。可溶性受体可通过蛋白水解裂解(例如TNF-R1和TNF-R2)或通过选择性剪接编码跨膜结构域的外显子来产生。这个超家族的受体可基于它们的信号传导性质而被划分在3个组中：诱导凋亡的具有细胞质死亡结构域的受体；诱导如NF-κB、JNK、p38、ERK和PI3K的若干信号传导路径的具有TRAF相互作用基序的受体；和缺乏细胞内信号传导结构域的诱饵受体。TNF通过与TNF-R1(p55)相互作用来诱导凋亡，而与TNF-R2(p75，主要在免疫细胞上表达)结合会促进增殖。TRAIL信号传导更复杂，因为它可结合两种死亡受体(TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5))、两种诱饵受体(TRAIL-R3(DCR1)和TRAIL-R4(DCR2))以及可溶性骨保护素(osteoprotegerin)(OPG)。与后三种受体中的一种结合抑制TRAIL介导的凋亡，因为这栓系TRAIL而远离死亡受体(Gaur和Aggerwal,2003；Hehlgans和Pfeffer,2005；Huang和Sheikh,2007)。
死亡诱导性TNF超家族成员TNF、CD95L(FasL)和TRAIL是针对表达它们的相应受体TNF-R1、CD95、TRAIL-R1和TRAIL-R2的癌症的潜在治疗剂。实际上，TNF最初在超过25年前被发现为一种通过在体内导致某些肿瘤的出血性坏死而具有卓越抗肿瘤活性的因子。稍后，变得明确的是归因于TNF的对肿瘤新血管系统的选择性损害也确定它的抗肿瘤潜力(Lejeune等,2006；van Horssen等,2006)。不幸的是，在癌症治疗中全身性使用TNF仍然受阻于它的休克诱发性质。它当前在临床上仅与化学疗法组合用于隔离肢体灌注的环境中来治疗软组织肉瘤和处于转变中的黑素瘤(Roberts等,2011)。此外，CD95L在全身性施用时是有毒的，因为它导致归因于大量肝细胞凋亡的致死性肝细胞毒性(Galle等,1995)。然而，已显示TRAIL会诱导癌细胞的凋亡，针对非转化细胞具有少许或不具有细胞毒性，并且在各种晚期癌症中进行的临床试验报道在许多情况下疾病稳定。然而，为获得足够总体治疗活性，需要组合治疗，此暗示归因于正常细胞对TRAIL诱导的凋亡敏感的可能的副作用(Ashkenazi和Herbst,2008；Falschlehner等,2009)。已进行不同方法来使全身性施用死亡诱导性TNF超家族成员后的毒性减至最小，如具有较低毒性和较高效率的突变TNF(Li等,2012)，通过肿瘤特异性部分来递送通常呈单链构建体形式的TNF或TRAIL(de Bruyn等,2013；Gregorc等,2009；Liu等,2006；Siegemund等,2012；Wang等,2006)，嵌合可溶性CD95L(Daburon等,2013)或激动性TRAIL-R1、TRAIL-R2或CD95特异性抗体(Johnstone等,2008；Ogasawara等,1993；Fox等,2010)。它们中的一些可增加治疗指数，但从未达到它显著改进临床结果的程度。
惊人地，我们发现有可能制备包含TNF超家族的细胞因子的构建体，其中所述细胞因子被修饰以降低对受体的亲和力，其中所述细胞因子被连接于靶向部分，并且其中所述构建体具有强烈降低的全身性毒性，并且仅对由靶向部分靶向的细胞显示显著生物活性。
本发明的第一方面是一种构建体，其包含(i)TNF超家族的细胞因子链的三个拷贝，其中所得细胞因子被修饰(被称为“经修饰的细胞因子”)以使对它的受体的亲和力降低，(ii)连接子序列和(iii)靶向部分，其中所述连接子序列使细胞因子拷贝连接于所述靶向部分。如此处所用的构建体可为本领域技术人员已知的任何蛋白质构建体，包括但不限于经化学修饰的蛋白质、蛋白质复合物和融合蛋白。在一个优选实施方案中，使用个别自我三聚化细胞因子链，其中一个或多个链可被连接于靶向部分。在另一优选实施方案中，三个拷贝呈现为单链细胞因子；在一优选实施方案中，拷贝由连接子序列分隔以有助于以三聚形式呈现细胞因子。对于本领域技术人员明确的是具有一个游离细胞因子链和两个彼此连接的细胞因子拷贝的混合形式也是可能的。所得三聚细胞因子携带相较于野生型细胞因子使它的生物活性降低的修饰。所述修饰可为降低正常野生型细胞因子的活性的修饰，或它可为增加同源性、非内源性TNF家族细胞因子(如但不限于另一物种的不结合人TNF家族细胞因子受体的TNF家族细胞因子)的活性的修饰。修饰可为本领域技术人员已知的降低或增加活性的任何修饰，包括但不限于化学和/或酶修饰，如聚乙二醇化和糖基化、融合于其它蛋白质以及突变。在细胞因子的两个或更多个拷贝被呈现为单链的情况下，可使连接子的长度适合于扰乱正常三聚结构，从而导致对受体的活性较低。或者，可将特殊氨基酸并入连接子中以修饰结构；所述氨基酸可进一步被修饰。作为一非限制性实例，可将赖氨酸并入连接子中以允许达成聚乙二醇化。优选地，所述修饰是突变，甚至更优选地，它是降低细胞因子对它的受体的亲和力的突变。如此处所用的降低的亲和力和随之发生的降低的生物活性意指相较于正常结合受体的野生型细胞因子，经修饰的细胞因子具有的生物活性小于野生型细胞因子的生物活性的70％，甚至更优选小于野生型细胞因子的生物活性的60％，更优选小于野生型细胞因子的生物活性的50％，更优选小于野生型细胞因子的生物活性的40％，更优选小于野生型细胞因子的生物活性的30％，更优选小于野生型细胞因子的生物活性的20％，最优选小于野生型细胞因子的生物活性的10％。优选地，TNF超家族的经修饰的细胞因子是TNF超家族的野生型细胞因子的突变体，并且将活性与TNF超家族的野生型细胞因子进行比较。可通过为本领域技术人员所知的任何方法测量亲和力和/或活性。可通过Scatchard作图分析和计算机拟合结合数据(例如Scatchard,1949)，或通过如由Brecht等(1993)所述在流通条件下进行反射干涉光谱法来测量相较于野生型TNF对受体的亲和力的突变TNF对受体的亲和力。
优选地，所述细胞因子选自由FasL、TRAIL、TNF、CD30L、CD40L、OX40L、RANKL、TWEAKL、LTα、LTβ、LIGHT、CD27L、41BBL、GITRL、APRIL、EDA、VEGI和BAFF组成的组。优选地，所述细胞因子呈现为单链，其中各链由连接子序列连接。
使经修饰的细胞因子连接于靶向部分。如此处所用的“连接”可通过共价结合达成，或它可通过亲和力结合达成。在一非限制性实例中，所述靶向部分可为对于一种特异性来说针对靶细胞上的结合位点，以及对于另一特异性来说针对经修饰的细胞因子或融合于所述细胞因子的标签的双特异性抗体。在另一非限制性实例中，靶向部分可被以化学方式连接于经修饰的细胞因子，或它可为重组融合蛋白。优选地，所述靶向构建体是重组融合蛋白。优选地，所述靶向部分使细胞因子靶向肿瘤环境，特别是靶向肿瘤血管系统(例如靶向肿瘤的内皮细胞，通常是新内皮细胞)。甚至更优选地，靶向部分是可通过结合位点与结合分子之间的特异性相互作用将融合蛋白向表达TNF超家族的细胞因子的受体，优选是能够与经修饰的细胞因子相互作用的受体的细胞上的结合位点引导的结合分子。在一个优选实施方案中，所述结合分子是特异性结合位于细胞的外部上的分子的小化合物。在另一优选实施方案中，所述结合分子是针对在细胞壁上表达的凝集素(lectin)样分子的糖结构。在另一优选实施方案中，所述结合分子是靶向肿瘤环境，优选靶向肿瘤血管系统的肽。所述肽为本领域技术人员所知，并且包括但不限于NGR(靶向在肿瘤血管中表达的CD13亚型)和RGD肽(Yang等,2011；WO2005054293)。优选地，所述肽是靶向αvβ3整联蛋白(integrin)的RGD-4C肽(Arap等,1998)。在另一优选实施方案中，所述结合分子是包含结合结构域的蛋白质。结合结构域为本领域技术人员所知。所述结合结构域的非限制性实例是碳水化合物结合结构域(CBD)(Blake等,2006)、重链抗体(hcAb)、单结构域抗体(sdAb)、微抗体(Tramontano等,1994)、骆驼科重链抗体的可变结构域(VHH)、新抗原受体的可变结构域(VNAR)、亲和体(Nygren等,2008)、α体(alphabody)(WO2010066740)、设计的锚蛋白(ankyrin)重复结构域(DARPin)(Stumpp等,2008)、抗运载蛋白(anticalin)(Skerra等,2008)、打结素(knottin)(Kolmar等,2008)和工程改造的CH2结构域(纳米抗体；Dimitrov,2009)。优选地，所述靶向部分是纳米抗体。
在一优选实施方案中，在重组融合蛋白中，使靶向部分连接于经修饰的细胞因子。可使靶向部分直接融合于突变细胞因子，或它可借助于连接子片段进行融合。优选地，所述连接子是GGS连接子。甚至更优选地，所述连接子由至少5个GGS重复，更优选至少10个GGS重复，更优选至少15个GGS重复组成，更优选地，所述连接子是由17-23个GGS重复组成的连接子，最优选地，所述连接子由20个GGS重复组成。靶向部分可被融合在突变细胞因子的氨基末端或羧基末端；优选地，所述靶向部分被融合在突变细胞因子分子的氨基末端。除突变细胞因子和靶向部分之外，构建体可进一步包含其它结构域，如但不限于标签序列、信号序列、另一细胞因子或抗体。
优选地，靶向部分针对选自由以下组成的组的靶标：CD20、CD33、CD47、CD70、PSCA、PSMA、Her2、c-Met、EGFR、Axl、腱生蛋白C、αvβ3整联蛋白、纤连蛋白(fibronectin)EDA末端EDB结构域、III型纤连蛋白(FNIII)重复(A1–D)、腱生蛋白-C和CD13及其肿瘤细胞特异性剪接变体。当靶向部分靶向肿瘤血管系统时，具体来说，设想的靶标包括但不限于CD13、αvβ3整联蛋白、纤连蛋白EDA末端EDB结构域、III型纤连蛋白(FNIII)重复(A1–D)和腱生蛋白-C。根据替代性特定实施方案，所述靶向部分针对CD20。特别设想的是靶向部分是抗体(或纳米抗体)，因为针对这些靶标的抗体可易于获得和/或可易于产生。
细胞因子链中的突变可为本领域技术人员已知的任何突变，如缺失、插入或点突变。至少一个链具有至少一种突变；然而，若干种突变可被组合在一个链中。三个链可携带相同突变或不同突变。优选地，所述突变使细胞因子对它的受体或它的一种受体的亲和力降低。优选地，所述突变是点突变。
在一个优选实施方案中，细胞因子是TNF，并且使构建体靶向在TNFR1和/或TNFR2表达细胞上表达的标志物。在另一优选实施方案中，所述标志物是组织特异性标志物，甚至更优选地，所述标志物是新血管系统组织或癌组织特异性标志物。最优选地，所述标志物选自由CD20、Her2、c-Met、EGFR、腱生蛋白C、αvβ3整联蛋白和CD13组成的组。
优选地，经修饰的细胞因子是突变TNF，其中突变选自由在位置R32、N34、Q67、H73、L75、T77、S86、Y87、V91、I97、T105、P106、A109、P113、Y115、E127、N137、D143、A145上的突变组成的组。甚至更优选地，所述突变选自由TNF R32G、N34G、Q67G、H73G、L75G、L75A、L75S、T77A、S86G、Y87Q、Y87L、Y87A、Y87F、V91G、V91A、I97A、I97Q、I97S、T105G、P106G、A109Y、P113G、Y115G、Y115A、E127G、N137G、D143N、A145G和A145T组成的组。甚至更优选地，所述突变选自由Y87X、I97X和Y115X组成的组。最优选地，所述突变选自由TNF Y87Q、Y87F、I97A、I97S、Y115A和Y115G(根据人TNF序列(genbank登记号BAG70306，版本BAG70306.1GI：197692685)进行编号)组成的组。突变可存在于三聚TNF的一个、两个或全部三个拷贝中。三聚构建体内的不同拷贝可携带不同突变；若干突变可被组合在一个或多个链中。除所述的突变之外，其它突变也可存在于一个或多个链中。
TRAIL中优选用于突变的区域是T127-R132、E144-R149、E155-H161、Y189-Y209、T214-I220、K224-A226、W231、E236-L239、E249-K251、T261-H264和H270-E271(基于人序列(genbank登记号NP_003801，版本NP_003801.1，GI：4507593)进行编号)。
本发明的另一方面是一种用作药剂的根据本发明的融合蛋白。在一个优选实施方案中，根据本发明的融合蛋白用于治疗癌症。
这与陈述提供治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用如本文所述的融合蛋白等效。癌症由此得以治疗。这可例如如实施例中所示通过评估肿瘤大小加以评估(也参见图16)。
适于治疗的受试者通常是哺乳动物，最通常是人。然而，本文也设想治疗非人动物。可被治疗的非人动物的实例包括但不限于马、牛、绵羊、猪、山羊、猫、狗和其它驯养动物。如果非人动物被设想用于治疗，那么特别设想的是经修饰的细胞因子来自待治疗的物种。那么通过突变达成的修饰是对相较于人序列的同源位置中的残基的修饰。非限制性地举例来说，如实施例章节中所示，在小鼠TNF中，作为人TNF中的Y87的同源物的残基在位置86处(Y86)。这可如上所详述加以突变(例如Y86F或Y86Q)。
可使用这个策略治疗不同形式的癌症。基本上，可用靶向部分靶向(直接或通过肿瘤环境间接)，由此再活化经修饰的TNF家族细胞因子，以及因此诱导肿瘤细胞死亡的任何肿瘤都适于治疗。
因此，特别设想的癌症是可易于靶向的那些。根据特定实施方案，靶向针对肿瘤血管系统。因此，高度血管化肿瘤是特别设想的。所述肿瘤的实例是可用抗血管生成方法，如抗VEGF药物或抗促血管生成素/Tie2药剂治疗的那些。这些包括但不限于乳腺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、黑素瘤、胃肠基质肿瘤(GIST)、神经内分泌肿瘤、软组织肉瘤、骨髓甲状腺癌和子宫内膜癌(参见例如Welti等,2013，特别是其中表1和补充表1)。
根据特定实施方案，癌症是实体肿瘤。然而，应注意如白血病(例如CML、AML)、多发性骨髓瘤和淋巴瘤的血液癌症也可用抗血管生成剂治疗(Schmidt和Carmeliet,2011；Roccaro等,2006)。因此，根据替代性实施方案，癌症是造血和/或淋巴组织的肿瘤(也参见实施例12)。
因为血管生成在肿瘤转移中以及在活化转移性病变(lestion)方面起主要作用，所以根据特定实施方案，癌症是转移性癌症。新内皮细胞的存在增加将使得这些癌症对靶向这些细胞的标志物(上述肿瘤血管系统标志物)的分子更敏感。
附图简述
图1：不同设置的sc hTNF-纳米抗体融合蛋白的结构元件的表示。
图2：相较于WT hTNF，对于HekT细胞(图A)或Hek-mLR细胞(图B)，由指示的sc hTNF制剂诱导的荧光虫荧光素酶活性。两者均用NF-κB荧光素酶报告基因短暂转染。
图3：对于HekT细胞(图A)或Hek-mLR细胞(图B)，由指示的携带具有6个GGS重复的连接子的sc hTNF制剂诱导的荧光虫荧光素酶活性。两者均用NF-κB荧光素酶报告基因短暂转染。
图4：对于HekT细胞(图A)或Hek-mLR细胞(图B)，由指示的携带具有13个GGS重复的连接子的sc hTNF制剂诱导的荧光虫荧光素酶活性。两者均用NF-κB荧光素酶报告基因短暂转染。
图5：对于HekT细胞(图A)或Hek-mLR细胞(图B)，由指示的携带具有19个GGS重复的连接子的sc hTNF制剂诱导的荧光虫荧光素酶活性。两者均用NF-κB荧光素酶报告基因短暂转染。
图6：相较于未处理细胞和用Her2纳米抗体刺激的细胞中的水平，在用500ng/ml的指示的sc hTNF制剂处理SK-BR-3细胞后对IL-6mRNA水平的诱导倍数。数据代表2次独立实验的平均值±SD(n＝4)。
图7：hTNF突变体相较于WT hTNF的活性％，如通过对MCF7细胞(乳腺癌细胞系)的毒性所度量。
图8：偶联于mLR NB的靶向经修饰的TNF(NB在TNF的C末端)对MCF7(图A)或MCF7-mLR(图B)细胞的毒性。
图9偶联于hCD20NB的靶向经修饰的TNF(NB在TNF的C末端)对MCF7(图A)或MCF7-hCD20(图B)细胞的毒性。
图10：偶联于hCD20或对照BcII10NB的靶向经修饰的TNF(NB在TNF的N末端)对MCF7(图A)或MCF7-hCD20(图B)细胞的毒性。
图11：含有具有组合突变的sc hTNF的靶向经修饰的TNF(NB在TNF的N末端)对MCF7(图A)或MCF7-hCD20(图B)细胞的毒性。
图12：个别三聚化链偶联于mLR NB的靶向经修饰的TNF(NB在TNF的C末端)对MCF7(图A)或MCF7-mLR(图B)细胞的毒性。
图13：个别三聚化链偶联于hCD20NB的靶向经修饰的TNF(NB在TNF的N末端)对MCF7(图A)或MCF7-hCD20(图B)细胞的毒性。
图14：WT hTNF相对于偶联于hCD20或对照BcII10NB的靶向WT和经修饰的sc hTNF(NB在TNF的N末端)的体内毒性比较。(A)低体温症(B)致命性。
图15：偶联于对照BcII10NB的WT或经修饰的(Y86F3×)sc小鼠(m)TNF(NB在TNF的N末端)的体内毒性。(A)低体温症(B)致命性。
图16：偶联于mCD20或对照BcII10NB的WT或经修饰的(Y86F3×)sc小鼠(m)TNF(NB在TNF的N末端)的体内抗肿瘤作用。(A)肿瘤生长(B)致命性。
实施例
实施例的材料和方法
纳米抗体
针对鼠类瘦素(leptin)受体(mLR)的纳米抗体4-10描述于Zabeau等(2012)中。将它的编码序列与SIgK前导肽、HA标签和白蛋白融合克隆至哺乳动物表达载体pMET7中(Takebe等,1988)。质粒名称：pMET7 SIgK-HA-4.11-白蛋白。抗Her2纳米抗体1R59B描述于Vaneycken等(2011)中。使用标准技术产生针对人CD20(hCD20)的NB 2HCD25和针对小鼠CD20(mCD20)的2MC57NB(Gharouhdi等,1997；Pardon等,2014)。对照NB BcII10描述于DeGroeve等(2010)中。
scTNF
由通过GGGGS连接子(SEQ ID NO:1)偶联的三个hTNF单体组成的scTNF已由Boschert等(2010)描述。显示hTNF中的Y87Q突变会完全消除与两种受体TNF-R1和TNF-R2的结合。使I97突变导致hTNF与两种受体的结合降低(Loetscher等,1993)。使hTNF内的整个范围的残基突变(QuikChange定点诱变试剂盒，Stratagene目录号200518)，并且测试它们对MCF7细胞的毒性作用(图7)。我们选择以下突变供靶向构建体使用：Y87Q、Y87F、I97S、I97A、Y115A、Y115G。通过基因合成(GeneArt)产生sc hTNF WT-6×GGS、sc hTNF Y87Q3×-6×GGS、sc hTNF I97A3×-6×GGS、sc hTNF Y87Q1×I97A2×-6×GGS、sc hTNF Y87Q2×I97A1×-6×GGS、sc hTNF WT1×Y87Q2×-6×GGS、sc hTNF WT2×Y87Q1×-6×GGS、sc hTNFI97S3×-6×GGS、sc hTNF Y115A3×-6×GGS、sc hTNF Y87F3×、sc hTNF Y115G3×、scmTNF WT和sc mTNF Y86F3×的编码序列。个别链由GGGGS(SEQ ID NO:1)连接子分隔。
scTNF-纳米抗体融合构建
通过PCR，用以下引物从质粒pHEN6-1R59B合成1R59B Her2纳米抗体的编码序列：正向5’-GTCAAGATCTGGCGGTTCGGCGGCCGCAATGGCCCAGGTGCAGCTGCAG-3’(SEQ ID NO:2)，反向5’-CAGTTCTAGATTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCGAACCGCCGTCCGGAGAGGAGACGGTGAC-3’(SEQID NO:3)。这种PCR在1R59B纳米抗体的氨基末端将GGS引入在BglII与NotI位点之间，并且在羧基末端引入FLAG标签。PCR产物用BglII和XbaI消化。pMK-RQ-sc hTNF WT、pMK-RQ-schTNF Y87Q3×和pMK-RQ-sc hTNF I97A3×用NdeI和BglII消化。将消化的PCR产物和合成基因片段克隆至NdeI-XbaI消化的pMET7 SIgK-HA-瘦素载体中以获得pMET7 SIgK-HA-schTNF WT-6×GGS-1R59B-FLAG、pMET7 SI gK-HA-sc hTNF Y87Q3×-6×GGS-1R59B-FLAG和pMET7 SIgK-HA-sc hTNF I97A3×-6×GGS-1R59B-FLAG。通过在BglII与XbaI之间插入含有GGS和FLAG标签的以下退火的寡聚物而非PCR产物来获得无1R59B纳米抗体的对照载体：正向：
5’GATCTGGCGGTTCGGCGGCCGCAGATTACAAGGATGACGACGATAAGTAAT3’(SEQ ID NO:4)，反向：5’CTAGATTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTGCGGCCGCCGAACCGCCA3’(SEQ ID NO:5)。通过插入以下退火的寡聚物而非NdeI-sc hTNF-BglII片段来获得仅具有1R59B纳米抗体的对照载体：正向：5’-TATGATGTGCCCGACTACGCTGGCGGCAGCA-3’(SEQ ID NO:6)，反向5’-GATCTGCTGCCGCCAGCGTAGTCGGGCACATCA-3’(SEQ ID NO:7)。通过在BglII与NotI位点之间向原始6×GGS添加7×GGS或13×GGS重复(由基因合成(GeneArt)制备)来将GGS连接子的长度调整为具有13个重复和19个重复的GGS连接子。
类似方法用于获得pMET7 SIgK-HA-sc hTNF WT-6×/13×/19×GGS-4.10-FLAG、pMET7 SIgK-HA-sc hTNF Y87Q3×-6×GGS-4.10-FLAG、pMET7 SIgK-HA-sc hTNF I97A3×-6×/13×/19×GGS-4.10-FLAG、pMET7 SIgK-HA-sc hTNF Y87Q1×I97A2×-6×/13×/19×GGS-4.10-FLAG、pMET7 SIgK-HA-sc hTNF Y87Q2×I97A1×-6×/13×/19×GGS-4.10-FLAG、pMET7 SIgK-HA-sc hTNF WT-6×/13×/19×GGS-2HCD25-FLAG、pMET7 SIgK-HA-schTNF I97S3×-6×/13×/19×GGS-2HCD25-FLAG、pMET7 SIgK-HA-sc hTNF I97A3×-6×/13×/19×GGS-2HCD25-FLAG和pMET7 SIgK-HA-sc hTNF Y115A3×-6×/13×/19×GGS-2HCD25-FLAG。
为获得个别三聚化hTNF构建体，pMet7-SIgK-HA-sc hTNF WT-GGS-4.10-Flag中的sc hTNF用以正向引物5’-CATATGATGTGCCCGACTACGCTGGCGGCAGCAGCTCTAGAACCCCCAGCGATAAGCCTGTG-3’(SEQ ID NO:8)和反向引物5’-GTCGACCAGGGCAATGATGCCGAAGT-3’(SEQ ID NO:9)于质粒pMet7-SIgK-His-hTNF WT或pMet7-SIgK-His-hTNF I97A上获得的PCR产物的NdeI-SalI消化物替换。这产生以下载体：pMet7-SIgK-HA-hTNF WT-6×GGS-4.10-Flag和pMet7-SIgK-HA-hTNF I97A-6×GGS-4.10-Flag。
在pMet7中制备在个别三聚化或单链人或小鼠TNF的N末端具有NB的纳米抗体-TNF融合物表达构建体，并且设计成使得各亚单位可通过独特限制位点互换：AgeI-纳米抗体-SalI-GGS连接子-NotI-TNF-XhoI-His-XbaI。
pGL3-(IL6-kB)3-荧光虫荧光素酶由W.Vanden Berghe(Vanden Berghe等,1998)友情提供。
产生用于体外研究的纳米抗体-TNF融合蛋白
使用标准磷酸钙沉淀方法，用蛋白质融合构建体转染HekT细胞。在转染之后48小时，收集培养基并储存在-20℃下。用商业hTNF ELISA(DY210，R1D systems)测定浓度。
产生用于体内研究的纳米抗体-scTNF融合蛋白
根据制造商指南，使用PEIproTM转染试剂(PolyPlus，目录号115-375)用蛋白质融合构建体转染FreeStyleTM293-F细胞。所有制剂中的内毒素含量都低于检测限，如通过显色鲎阿米巴状细胞溶解产物测定(Limulus Amebocyte Lysate Assay)(Lonza，目录号50-647U)所评估。
细胞系
使Hek、HekT、Hek-mLR、MCF7、MCF7-hCD20、MCF7-mLR和B16Bl6-mCD20细胞在补充有10％FCS的DMEM中生长。FreeStyleTM293-F细胞系从Invitrogen,Life Technologies(目录号R790-07)获得，并且维持在来自Gibco,Life Technologies的FreeStyleTM293表达培养基(目录号12338)中。人乳腺癌SK-BR-3(ATCC：HTB-30)细胞系从ATCC获得，并且维持在补充有10％FCS的麦考伊氏5A培养基(McCoy’s 5A medium)中。
如下产生Hek-mLR细胞系：用含有用于获得mEcoR和新霉素抗性的表达盒的质粒以及用pXP2d2-rPAP1-luci报告基因构建体共同稳定转染Flp-In-293细胞(Invitrogen)(Eyckerman等2001)。在含有G418(400ug/ml)的培养基中分离稳定转染的克隆，并且选择具有高LIF(1ng/ml)诱导的荧光素酶活性的克隆。使用Flp‐In重组酶反应(Invitrogen)以及在潮霉素(100μg/ml)上选择10天之后，将含有mLR的表达载体pcDNA5/FRT稳定整合在这个细胞系中。
人乳腺癌MCF7(ATCC：HTB-22)细胞系从ATCC获得。如下产生MCF7-hCD20和MCF7-mLR细胞系：用含有用于获得hCD20或mLR的表达盒的质粒以及用含有新霉素抗性基因的质粒共同稳定转染MCF7细胞。用含有G418(1mg/ml)的培养基选择稳定转染的细胞，随后对hCD20或mLR表达细胞进行FACS分选。
如下产生B16Bl6-mCD20细胞系：用含有用于获得mCD20的表达盒的质粒以及用含有新霉素抗性基因的质粒共同稳定转染B16Bl6细胞。用含有G418(2mg/ml)的培养基选择稳定转染的细胞。
人乳腺癌SK-BR-3(ATCC：HTB-30)细胞系从ATCC获得，并且维持在补充有10％FCS的麦考伊氏5A培养基中。
荧光素酶活性的测量
通过定量受控于NF-κB启动子的荧光素酶活性来测量TNF特异性活性。在通过标准磷酸钙沉淀方法转染NF-κB荧光素酶报告基因(pGL3-(IL6-κB)3-荧光虫荧光素酶)之后两天，用靶向或对照sc hTNF刺激细胞6小时。制备溶解产物(溶解缓冲液：25mM Tris(pH7.8)、2mM EDTA、2mM二硫苏糖醇、10％甘油、1％曲通(Triton)X-100)，并且每50μl溶解产物添加35μl荧光素酶底物缓冲液(20mM三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2·5H2O、2.67mM MgSO4·7H2O、0.1mM EDTA、33.3mM二硫苏糖醇、270μM辅酶A、470μM虫荧光素、530μM ATP，最终pH7.8)。在TopCount化学发光计数器(Packard)中测量光发射5秒。
定量RT-PCR
通过RT-PCR相对于HPRT定量用500ng/ml靶向或对照sc hTNF处理6小时的SK-BR-3细胞中的TNF诱导性基因IL-6的表达。用RNeasy柱(Qiagen)纯化总RNA，并且等量RNA(0.5μg)用于遵循制造商说明书，使用Primescript RT试剂盒(Takara Bio，Shiga,Japan)进行逆转录。添加10倍稀释的cDNA至含有1×SYBR Green I主混合物(04 887 352 001，Roche)和1nM基因特异性引物的RT-QPCR混合物中。在LightCycler 480实时PCR系统热循环仪(RocheApplied Science)上一式三份进行测定，并且使用ΔΔCT方法分析结果。使用以下引物：
HPRT正向：5’TGACACTGGCAAAACAATGCA3’(SEQ ID NO:10)；
HPRT反向：5’GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT3’(SEQ ID NO:11)；
IL-6正向：5’GACAGCCACTCACCTCTTCA3’(SEQ ID NO:12)；
IL-6反向：5’AGTGCCTCTTTGCTGCTTTC3’(SEQ ID NO:13)。
对MCF7细胞的毒性分析
也通过评估对MCF7细胞的细胞毒性来测量TNF特异性活性。将1000个细胞涂铺在黑色96孔板中，并且24小时后用不同TNF构建体刺激。在48-72小时之后，根据制造商指南，使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega目录号G7570)测定活细胞的数目。
体内毒性分析
为体内评估hTNF毒性，用500ng rhTNF或sc hTNF-纳米抗体融合蛋白与10mg D-半乳糖胺组合(于无LPS PBS中稀释，以500μl的体积注射)腹膜内注射雌性8周龄C57BL/6J小鼠(购自Charles River,France)。通过测量外周(直肠)体温来监测致病性。n＝每种融合蛋白2-4。
为评估体内mTNF毒性，用10、35、100或200μg sc mTNF-纳米抗体融合蛋白(注射体积200μl，于无LPS PBS中稀释)静脉内注射小鼠。通过测量外周(直肠)体温来监测致病性。n＝每种融合蛋白每种剂量2，例外之处是200μg(n＝1)。
体内抗肿瘤研究
将8周龄的雌性C57BL/6J小鼠剃毛，并且用6×105个B16Bl6-mCD20肿瘤细胞在背部皮下接种(第0天)。当最大垂直直径的乘积是约50mm2时(在第10天)开始处理。通过在病变旁边注射(在肿瘤部位附近但在肿瘤结节外部皮下注射)来连续8天(第10-17天，以灰色棒条指示在图16A中)施用PBS或35μg纳米抗体-sc mTNF融合蛋白。用测径规每日测量肿瘤，并且示出为平均值±SEM。通过每日测量体重和体温来监测致病性。n＝每种治疗5。
实施例1：sc hTNF-纳米抗体融合蛋白
图1显示在sc hTNF的N末端或C末端具有纳米抗体的sc hTNF-纳米抗体融合蛋白的图示。
实施例2：对mLR表达Hek细胞的靶向TNF活性
测试HekT细胞中以及表达鼠类瘦素受体的Hek细胞(Hek-mLR)中在TNF刺激后对NF-κB荧光素酶报告基因活性的诱导。如图2A中所示，WT sc hTNF诱导的NF-κB诱导作用因Y87Q3×或I97A3×突变而分别被完全(>1000倍)或部分(100倍)消除。此外，在不表达mLR的HekT细胞中，所有sc hTNF构建体(WT、Y87Q3×和I97A3×)都独立于与mLR纳米抗体的融合来诱导类似NF-κB活性(图2A)。相反，偶联于mLR纳米抗体能够在与WT sc hTNF类似的程度上恢复表达mLR的Hek细胞中sc hTNF I97A3×的NF-κB诱导作用(图2B)。我们估计表达mLR的细胞比亲本HekT细胞对纳米抗体偶联的sc hTNF I97A3×敏感100倍。相反，相较于HekT细胞，在Hek-mLR细胞中，三重Y87Q突变不显示对TNF应答性的任何挽救作用(图2B)。
实施例3：不同突变组合和不同连接子长度的比较
为优化构建体，测试在个别链中具有不同突变的sc hTNF构建体以及sc hTNF与靶向部分之间的不同连接子长度。结果概述于图3、4和5中。sc hTNFI97A3×和sc hTNF Y87Q1×I97A2×不显示对不表达瘦素受体的Hek细胞的活性，但在靶向瘦素受体时具有明确剂量依赖性活性。
实施例4：对表达Her2的Hek细胞的靶向TNF活性
我们使用α-Her2纳米抗体1R59B和sc hTNF WT、sc hTNF Y87Q3×或sc hTNFI97A3×产生融合蛋白。纳米抗体与sc hTNF之间的连接子是6×GGS或19×GGS。测试这些分子对过度表达Her2的SK-BR-3乳腺癌细胞系的IL-6TNF诱导性基因的诱导作用，如通过定量RT-PCR相对于HPRT所测定。
图6显示相较于未处理细胞和用Her2纳米抗体刺激的细胞中的IL-6mRNA水平，在sc hTNF处理(500ng/ml)后对IL-6mRNA的诱导倍数。与对NF-κB的转录活化相对应，我们观察到Y87Q3×突变完全阻止TNF诱导的IL-6产生，而sc hTNF I97A3×可仍然诱导IL-6产生，但程度小于WT sc hTNF。当使sc hTNF融合于纳米抗体时，产生较少IL-6mRNA。这可归因于空间位阻，因为相较于其中存在可能更大可挠性的较长19×GGS连接子，在6×GGS连接子的情况下的影响更显著。通过使sc hTNF I97A3×偶联于Her2纳米抗体，可在与WT sc hTNF通过相应连接子偶联于纳米抗体类似的程度上恢复对IL-6的诱导作用。相反，使更重度Y87Q3×sc hTNF突变体特异性靶向Her2表达细胞不能恢复sc hTNF的IL-6诱导性质。
实施例5：比较hTNF突变体对MCF7细胞的毒性
由于I97A3×突变sc hTNF具有相对较高残余活性，所以我们通过将不同个别三聚化hTNF突变体的毒性测量为MCF7细胞中的荧光素酶活性来搜索其它突变。突变体相对于WT个别三聚化TNF的活性显示于图7中。大多数突变不显著影响TNF活性(>1％的WT)，并且由于它们的可能剩余实质性毒性而可能具有较小前途用于开发靶向构建体。我们更关注于(几乎)完全消除TNF功能的突变。使用无效突变(<0,1％的WT)会产生不具有副作用，但具有在靶向后的再活化较不易于实现作为可能缺点的靶向构建体。具有一定残余活性(0,02–5％的WT，特别是0,1％-1％的WT)的突变具有更好机会被再活化，同时不具有毒性。选择6种涵盖在0,02与5％的个别三聚化WT TNF之间的活性范围的不同突变用于开发靶向修饰的细胞因子：Y87Q(0,02％)、I97S和Y115A(0,2％)、Y87F(0,5-1％)、Y115G(1-2％)和I97A(2-5％)。
实施例6：对表达mLR的MCF7细胞的靶向TNF活性
评估mLR NB靶向TNF对MCF7和MCF7-mLR细胞的毒性。测试不同突变(I97A3×、I97S3×和Y115A3×)以及sc hTNF与mLR NB之间的不同连接子(6×GGS、13×GGS、19×GGS)。如图8A中所示，毒性因I97A3×突变而降低20倍，并且因I97S3×和Y115A3×突变而降低500倍，这类似于我们对于个别三聚化TNF所观察到的结果(图7)。此外，在不表达mLR的MCF7细胞中，与mLR NB融合不改变WT或突变sc hTNF的活性(图8A)，而对于MCF7-mLR细胞，这种融合再活化所有sc hTNF突变体(图8B)。我们估计表达mLR的细胞比亲本MCF7细胞对NB偶联的I97S3×和Y115A3×sc hTNF敏感100倍。然而，这些靶向经修饰的TNF的活性仍然比WT sc hTNF小约20倍。相反，对于MCF7-mLR细胞，I97A3×靶向经修饰的TNF被恢复至WT活性水平，此对应于20倍再活化(图8B)。
实施例7：对表达hCD20的MCF7细胞的靶向TNF活性
为评估其它靶向部分用于达成经修饰的TNF的靶向的作用，我们用hCD20NB替换实施例6的构建体中的mLR NB，并且测试它们对MCF7细胞和表达hCD20的MCF7细胞(MCF7-hCD20)的毒性。结果显示于图9中。如所预期，mLR NB和hCD20NB靶向经修饰的TNF对亲本MCF7细胞的行为类似(图8A和9A)。
实施例8：在不同hCD20NB融合物设置的情况下对hCD20表达细胞的靶向TNF活性。
我们试图通过将NB放置在sc hTNF之前而非在其之后来改进hCD20NB-TNF构建体。我们也测试2种显著性较小的其它突变(Y87F3×和Y115G3×，图7)。用这些构建体进行的MCF7和MCF7-hCD20毒性研究显示于图10中。偶联于hCD20NB的Sc hTNF与偶联于对照BcII10NB的相应突变体对MCF7细胞施加相同毒性(图10A)，并且活性水平类似于我们对于个别三聚化TNF突变体所观察到的结果(图7)。对于MCF7-hCD20细胞，突变体的这个毒性降低在hCD20靶向后得以(部分)复原：相较于相应BcII10对照NB偶联的sc hTNF，hCD20NB偶联的经修饰TNF获得活性增加10倍(Y115G3×)、15倍(Y87F3×)、100倍(I97S3×、Y115A3×)或甚至更高(Y87Q3×)(图10B)。在这个实验中，当将hCD20NB放置在sc hTNF的羧基末端而非氨基末端时，再活化较小(图9B)。
实施例9：不同突变组合的比较
尽管存在靶向经修饰的TNF相对于非靶向经修饰的TNF的差异是至少100倍的事实，但一些突变显示低于WT活性水平的挽救活性(Y87Q3×)，此可能影响它的抗肿瘤作用。或者，一些突变仍然具有一定残余活性(I97S3×和Y115A3×)，此在体内使用时可能导致一定(全身性)毒性。为克服这些潜在缺点，我们通过使sc hTNF的个别链中的不同残基突变来测试其它构建体以观察活性水平是否可因此被进一步调节。如图11中所示，在单链中组合不同突变可改变对非靶向细胞的残余活性以及在靶向后的再活化水平。
实施例10：靶向个别三聚化TNF相对于单链经修饰的hTNF的比较。
为比较靶向个别三聚化TNF相对于单链TNF的效率，使WT或I97A hTNF在C末端与mLR NB偶联成单体。测试它们对MCF7细胞以及对表达mLR的MCF7细胞(MCF7-mLR)的毒性，并且显示于图12中。此外，在个别三聚化形式中，I97A突变对MCF7细胞具有毒性，但程度小于WT hTNF(图8A和图12A)。此外，当在C末端偶联于mLR纳米抗体时，个别三聚化而非单链TNF对MCF7细胞的毒性变得较小，并且这对于WT和I97A两者均是这样(图8A和图12A)。最可能的是用个别三聚化TNF-mLR NB构建体形成的hTNF三聚体中存在的3个纳米抗体在空间上阻碍hTNF结合它的受体。然而，这种活性降低可通过靶向MCF7-mLR细胞上的mLR来复原(图12B)。引起关注的是，这提供进一步程度的活性调节：可组合不同突变以及使用空间位阻来影响残余活性和在靶向后的再活化水平。
为阐明这是否是一种一般性现象，我们使个别三聚化WT和Y115A hTNF在N末端偶联于BcII10或hCD20纳米抗体，并且测试它们对MCF7和MCF7-hCD20细胞的毒性。如图13A中所示，这种偶联不影响个别三聚化WT或Y115A3×hTNF的毒性。此外，在靶向后，个别三聚化Y115A3×hTNF变得如同非靶向个别三聚化WT hTNF一样具有活性(图13B)。
实施例11：评估靶向经修饰的hTNF的体内毒性
为评估hTNF突变体的毒性在临床前不明显，因为TNF在小鼠中显示显著物种特异性。不同于mTNF，hTNF仅在极高剂量下诱导致死性(Brouckaert等1992)。尽管这个物种特异性的原因长久被认为由hTNF不与鼠类TNF-R2相互作用引起，但药物代谢动力学研究已显示在小鼠中hTNF比mTNF被快得多地清除，并且随之发生的有限hTNF暴露导致它缺乏致病性(Ameloot等2002)。
然而，当用如D-半乳糖胺的致敏剂处理时，物种特异性被消除，并且极低剂量(≤500ng)的hTNF与mTNF具有同等致死性(Broeckaert等,1992)。为评估各种靶向经修饰的hTNF的体内毒性，我们因此用500ng的重组(r)hTNF、sc hTNF WT或sc突变hTNF(Y87Q3×或Y115A3×)腹膜内注射小鼠。使sc WT和经修饰的hTNF在N末端偶联于BcII10或hCD20NB。如图14中所示，sc WT hTNF至少如同rhTNF一样具有毒性，从而在注射之后10小时内导致重度低体温症和致命性。靶向经修饰的hTNF Y87Q3×和Y115A3×不导致任何致病性征象(竖毛、震颤、嗜睡、理毛行为丧失或体温下降；对于后者，参见图14A)。
实施例12：评估靶向经修饰的mTNF的体内毒性和抗肿瘤作用。
如已提及，不能容易地在小鼠中研究hTNF的体内毒性。因此以及由于预期在免疫活性同基因小鼠中进行抗肿瘤实验，所以我们决定使mTNF的与我们对于hTNF选择的残基同源的残基突变(参见实施例5)。如图15中所说明，当以低至10μg的剂量静脉内注射时，BcII10NB-sc mTNF WT导致重度致病性(图15A)和100％致命性(图15B)。相反，BcII10NB-scmTNFY86F3×不诱导致命性(图15B)，也不导致任何毒性征象(竖毛、震颤、嗜睡、理毛行为丧失或体温下降；对于后者，参见图15A)，甚至当以200μg的静脉内团注形式注射时也不。然而，当以35μg的剂量每日在病变旁边注射于携带B16Bl6-mCD20肿瘤的小鼠中时，纳米抗体偶联的sc mTNFY86F3×可仍然降低/阻止肿瘤生长，尤其当靶向mCD20时(图16A)。非靶向突变TNF对肿瘤生长的作用(图16A)归因于所用高剂量(35μg)，因为较低剂量更接近类似于PBS处理的动物(数据未显示)。每日用NB-sc mTNF Y86F3×处理未导致任何致病性或致命性征象，而用NB-sc mTNF WT处理的携带肿瘤的小鼠在1或2次注射之后死亡(图16B)。
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Figure IDA0000908452810000041
Figure IDA0000908452810000051

Claims (7)

1.一种包含融合蛋白的组合物，其中所述融合蛋白是单链，其包括：
(i)包含经修饰的人TNF的三个拷贝的单链多肽，其中所述经修饰的TNF具有与野生型TNF相比降低的对它的受体的亲和力，并且其中所述经修饰的人TNF包含在一个下列位置的至少一个取代突变：Y87、I97和Y115；其中在位置Y87的所述取代突变选自Y87Q和Y87F，在位置I97的所述取代突变选自I97A和I97S，且在位置Y115的所述取代突变选自Y115A和Y115G；
(ii)连接子序列；和
(iii)单一靶向部分，其中所述连接子序列使所述TNF拷贝连接于所述靶向部分，并且
其中所述组合物仅对由靶向部分靶向的细胞显示显著生物活性。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述靶向部分包括抗体或纳米抗体。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述靶向部分针对选自下述的靶标：CD20、Her2、c-Met、EGFR、腱生蛋白C、ανβ3整联蛋白和CD13。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述靶向部分针对CD20。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述靶向部分针对Her2。
6.一种包括单链融合蛋白的组合物，其中所述融合蛋白包括：
(i)包含经修饰的人TNF的三个拷贝的单链多肽，其中所述人TNF具有与野生型TNF相比降低的对它的受体的亲和力，并且包括在位置Y87的突变，其中在位置Y87的取代突变选自Y87Q和Y87F，
(ii)连接子序列，和
(iii)靶向部分，其包括针对CD20的纳米抗体，
其中所述连接子序列使所述TNF拷贝连接于所述靶向部分，并且
所述组合物仅对表达CD20的细胞显示显著生物活性。
7.一种包括单链融合蛋白的组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述融合蛋白包括：
(i)包含经修饰的人TNF的三个拷贝的单链多肽，其中所述人TNF具有与野生型TNF相比降低的对它的受体的亲和力，并且包括在位置Y87或Y115的突变，其中在位置Y87的取代突变选自Y87Q和Y87F，且在位置Y115的取代突变选自Y115A和Y115G，
(ii)连接子序列，和
(iii)靶向部分，其针对细胞靶标，其中：
所述连接子序列使所述TNF拷贝连接于所述靶向部分，并且其中所述组合物仅对由靶向部分靶向的细胞显示显著生物活性。
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