CN105486679B - 一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法 - Google Patents
一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法，属于电化学发光传感器领域。以三联吡啶钌为电化学发光信号源，利用金杂化炭黑插层还原石墨烯优良的生物兼容性和大的比表面积增加抗体的固载量。用纳米多孔银作为二抗标记物，根据对不同浓度的待测物的电化学发光信号强度的不同，实现对肝癌标志物甲胎蛋白的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法。具体涉及一种金杂化炭黑插层还原石墨烯作为基底材料，利用纳米多孔银优良的生物兼容性和大的比表面积来固载三联吡啶钌和检测抗体，制备了一种检测甲胎蛋白的电致化学发光免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
原发性肝癌 (Hepatocellular Carcinoma, HCC)是一种很常见的恶性肿瘤，发病率高，预后差。甲胎蛋白（α-fetoprotein, αFP或AFP）是唯一广泛应用于诊断 HCC的肿瘤标志物，是非侵入性诊断方法中的重要指标。甲胎蛋白主要来自胚胎的肝细胞，但当肝细胞发生癌变时，会产生大量甲胎蛋白，而且随着病情恶化，甲胎蛋白在血清中的含量会急剧增加，因此对甲胎蛋白的早期诊断很重要。
目前已有的甲胎蛋白的临床检测方法很多，如酶联免疫分析、放射免疫分析、化学发光免疫分析等。但是上述方法具有放射性污染，灵敏度低，检测周期长，步骤繁琐等缺点。为了克服以上传统分析方法的缺点，本发明设计了一种特异性强，灵敏度高，无放射性污染，操作快速简便的电致化学发光免疫分析方法。
本发明将炭黑与石墨烯复合，得到了炭黑插层的还原石墨烯，解决了单独使用石墨烯片层容易团聚的问题并提高了传感平台的导电性。金溶胶用于进一步功能化炭黑插层的还原石墨烯，提高了传感器的电致化学发光性能。并采用去合金化的方法直接得到具有较大比表面积的纳米多孔银，用其固载三联吡啶钌和二抗，在检测甲胎蛋白抗原的过程中产生了逐步放大的电化学发光信号，有效地增强了电致化学发光免疫传感器的灵敏度。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，为目前有效检测甲胎蛋白提供了新途径。
发明内容
本发明的目的之一是合成具有较大比表面积的炭黑插层还原石墨烯材料，其可固载大量的金溶胶，提高基底材料的导电性，增强传感器的灵敏度。
本发明的目的之二是通过去合金化的方法得到表面具有负电荷的纳米多孔银，通过静电作用牢固结合三联吡啶钌，提高电致化学发光信号的稳定性。
本发明的目的之三是利用金杂化炭黑插层还原石墨烯作为基底材料，纳米多孔银-三联吡啶钌为标记层，构建一种无酶、快速且超灵敏的夹心型电致化学发光免疫传感器。
本发明的目的之四是将该夹心型电致化学发光免疫传感器应用于甲胎蛋白的快速、灵敏检测。
本发明的技术方案如下：
1. 一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）将2 ~ 10 μL、浓度为1 ~ 3 mg/mL的甲胎蛋白抗体捕获基底材料金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液于电极表面，4 ℃保存；
（3）用3 ~ 9 μL、质量分数为0.5 ~ 1.5%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4 ℃冰箱中孵化1 ~ 5 h，清洗干净；
（4）将2 ~ 6 μL浓度为0.0001 ~ 30 ng/mL的一系列不同浓度的甲胎蛋白用于捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净；
（5）将4 ~ 8 μL浓度为1 ~ 3 mg/mL的纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4 ℃冰箱中储存备用。
2. 甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
（1）炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
将25 ~ 75 mg氧化石墨烯加入到25 ~ 75 mL去离子水中，室温下超声2 h，得到溶液A；称取2 ~ 300 mg炭黑分散在8 ~ 120 mL的N,N-二甲基甲酰胺中，室温下超声2 h，得到溶液B；将1 ~ 100 mL溶液A加入到1 ~ 100 mL溶液B中，室温下超声分散2 h，加入5 ~ 15 μL、体积分数为80 %的水合肼溶液，剧烈振荡5 min，100 ℃下加热1 ~ 5 h，5000 ~ 8000 r/min下离心洗涤10 ~ 30 min，制得炭黑插层还原石墨烯复合材料；
（2）金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
将1 ~ 3 mg炭黑插层还原石墨烯分散到1 mL超纯水中，加入0.5 ~ 1.5 mL金溶胶，得到的混合溶液在室温下振荡12 ~ 36 h，5000 ~ 8000 r/min下离心洗涤10 ~ 30min，制得金杂化炭黑插层还原石墨烯；将金杂化炭黑插层还原石墨烯重新分散于1 mL超纯水中，得到基底材料金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液；
（3）甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
将1 mL、浓度为1 ~ 3 mg/mL的金杂化的炭黑插层还原石墨烯溶液与100 ~ 300 μL、浓度为5 ~ 15 μg/mL的甲胎蛋白捕获抗体混合，振荡12 h，4000 ~ 6000 r/min下离心洗涤10 ~ 20 min，得到甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯孵化物，将其分散于1 ~ 3 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液。
3. 纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液的制备
（1）纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液的制备
将0.1 ~ 10 mg银铝合金放入20 ~ 500 mL、浓度为0.5 ~ 1.5 mol/L的氢氧化钠溶液中，室温下化学腐蚀12 ~ 36 h，5000 ~ 8000 r/min下离心洗涤4 ~ 8次，在真空干燥箱里干燥24 ~ 48 h，制得纳米多孔银；将1 ~ 3 mg的纳米多孔银分散到1 ~ 10 mL超纯水中，加入1 ~ 5 mL、浓度为0.5 ~ 1.5 mmol/L的三联吡啶钌溶液，室温避光振荡12 ~ 36 h，4000 ~ 8000 r/min下离心洗涤3 ~ 9次，将产物重新分散到1 mL超纯水中，得到纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液；
（2）纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液的制备
将1 mL、浓度为1 ~ 3 mg/mL的纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液与100 ~ 500μL、浓度为5 ~ 15 μg/mL甲胎蛋白检测抗体混合，振荡12 ~ 36 h，4000 ~ 6000 r/min下离心洗涤10 ~ 20 min，得到纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体孵化物，将其分散于1 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液。
4. 甲胎蛋白的检测方法
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为600 V，循环伏安扫描电位范围为-1.8 ~ -0.6V，扫描速率为0.10 V/s；
（2）在10 mL、pH 5.5 ~ 8.0的含100 ~ 150 mmol/L三乙醇胺的磷酸盐缓冲溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的甲胎蛋白标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替甲胎蛋白标准溶液进行检测。
本发明的有益成果
（1）本发明将炭黑与石墨烯复合，得到了炭黑插层的还原石墨烯，解决了单独使用石墨烯片层容易团聚的问题，提高了传感平台的导电性。金溶胶用于进一步功能化炭黑插层的还原石墨烯，提高了传感器的电致化学发光性能。
（2）并采用去合金化的方法直接得到具有较大比表面积的纳米多孔银，用其固载三联吡啶钌和二抗，在检测甲胎蛋白抗原的过程中产生了逐步放大的电化学发光信号，有效地增强了电致化学发光免疫传感器的灵敏度。
（3）本发明将制备的夹心电致化学发光免疫传感器用于甲胎蛋白的检测，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、灵敏和特异性检测。本发明对甲胎蛋白抗原检测线性范围为0.0001 ~ 30 ng/mL，检测限达到33 fg/mL。
具体实施方式
实施例1一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）将2 μL、浓度为1 mg/mL的甲胎蛋白抗体捕获基底材料金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液于电极表面，4 ℃保存；
（3）用3 μL、质量分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4 ℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
（4）将2 μL浓度为0.0001 ~ 30 ng/mL的一系列不同浓度的甲胎蛋白用于捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净；
（5）将4 μL浓度为1 mg/mL的纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4 ℃冰箱中储存备用。
实施例2一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）将6 μL、浓度为2 mg/mL的甲胎蛋白抗体捕获基底材料金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液于电极表面，4 ℃保存；
（3）用6 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4 ℃冰箱中孵化3 h，清洗干净；
（4）将4 μL浓度为0.0001 ~ 30 ng/mL的一系列不同浓度的甲胎蛋白用于捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净；
（5）将6 μL浓度为2 mg/mL的纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4 ℃冰箱中储存备用。
实施例3一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法
（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
（2）将10 μL、浓度为3 mg/mL的甲胎蛋白抗体捕获基底材料金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液于电极表面，4 ℃保存；
（3）用9 μL、质量分数为1.5%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4 ℃冰箱中孵化5 h，清洗干净；
（4）将6 μL浓度为0.0001 ~ 30 ng/mL的一系列不同浓度的甲胎蛋白用于捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净；
（5）将8 μL浓度为3 mg/mL的纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4 ℃冰箱中储存备用。
实施例4 甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
（1）炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
将25 mg氧化石墨烯加入到25 mL去离子水中，室温下超声2 h，得到溶液A；称取2mg炭黑分散在8 mL的N,N-二甲基甲酰胺中，室温下超声2 h，得到溶液B；将1 mL溶液A加入到1 mL溶液B中，室温下超声分散2 h，加入5 μL、体积分数为80 %的水合肼溶液，剧烈振荡5min，100 ℃下加热1 h，5000 r/min下离心洗涤10 min，制得炭黑插层还原石墨烯复合材料；
（2）金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
将1 mg炭黑插层还原石墨烯分散到1 mL超纯水中，加入0.5 mL金溶胶，得到的混合溶液在室温下振荡12 h，5000 r/min下离心洗涤10 min，制得金杂化炭黑插层还原石墨烯；将金杂化炭黑插层还原石墨烯重新分散于1 mL超纯水中，得到基底材料金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液；
（3）甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
将1 mL、浓度为1 mg/mL的金杂化的炭黑插层还原石墨烯溶液与100 μL、浓度为5μg/mL的甲胎蛋白捕获抗体混合，振荡12 h，4000 r/min下离心洗涤10 min，得到甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯孵化物，将其分散于1 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液。
实施例5 甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
（1）炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
将50 mg氧化石墨烯加入到50 mL去离子水中，室温下超声2 h，得到溶液A；称取150 mg炭黑分散在60 mL的N,N-二甲基甲酰胺中，室温下超声2 h，得到溶液B；将50 mL溶液A加入到50 mL溶液B中，室温下超声分散2 h，加入10 μL、体积分数为80 %的水合肼溶液，剧烈振荡5 min，100 ℃下加热3 h，6500 r/min下离心洗涤20 min，制得炭黑插层还原石墨烯复合材料；
（2）金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
将2 mg炭黑插层还原石墨烯分散到1 mL超纯水中，加入1.0 mL金溶胶，得到的混合溶液在室温下振荡24 h，6500 r/min下离心洗涤20 min，制得金杂化炭黑插层还原石墨烯；将金杂化炭黑插层还原石墨烯重新分散于1 mL超纯水中，得到基底材料金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液；
（3）甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
将1 mL、浓度为2 mg/mL的金杂化的炭黑插层还原石墨烯溶液与200 μL、浓度为10μg/mL的甲胎蛋白捕获抗体混合，振荡12 h，5000 r/min下离心洗涤15 min，得到甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯孵化物，将其分散于2 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液。
实施例6 甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
（1）炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
将75 mg氧化石墨烯加入到75 mL去离子水中，室温下超声2 h，得到溶液A；称取300 mg炭黑分散在120 mL的N,N-二甲基甲酰胺中，室温下超声2 h，得到溶液B；将100 mL溶液A加入到100 mL溶液B中，室温下超声分散2 h，加入15 μL、体积分数为80 %的水合肼溶液，剧烈振荡5 min，100 ℃下加热5 h， 8000 r/min下离心洗涤30 min，制得炭黑插层还原石墨烯复合材料；
（2）金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
将3 mg炭黑插层还原石墨烯分散到1 mL超纯水中，加入1.5 mL金溶胶，得到的混合溶液在室温下振荡36 h， 8000 r/min下离心洗涤30 min，制得金杂化炭黑插层还原石墨烯；将金杂化炭黑插层还原石墨烯重新分散于1 mL超纯水中，得到基底材料金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液；
（3）甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
将1 mL、浓度为3 mg/mL的金杂化的炭黑插层还原石墨烯溶液与300 μL、浓度为15μg/mL的甲胎蛋白捕获抗体混合，振荡12 h，6000 r/min下离心洗涤20 min，得到甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯孵化物，将其分散于3 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液。
实施例7纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液的制备
（1）纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液的制备
将0.1 mg银铝合金放入20 mL、浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液中，室温下化学腐蚀12 h，5000 r/min下离心洗涤4次，在真空干燥箱里干燥24 h，制得纳米多孔银；将1mg的纳米多孔银分散到1 mL超纯水中，加入1 mL、浓度为0.5 mmol/L的三联吡啶钌溶液，室温避光振荡12 h，4000 r/min下离心洗涤3次，将产物重新分散到1 mL超纯水中，得到纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液；
（2）纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液的制备
将1 mL、浓度为1 ~ 3 mg/mL的纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液与100 μL、浓度为5 μg/mL甲胎蛋白检测抗体混合，振荡12 h，4000 r/min下离心洗涤10 min，得到纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体孵化物，将其分散于1 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液。
实施例8纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液的制备
（1）纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液的制备
将5 mg银铝合金放入300mL、浓度为1.0 mol/L的氢氧化钠溶液中，室温下化学腐蚀24 h，6500 r/min下离心洗涤6次，在真空干燥箱里干燥30 h，制得纳米多孔银；将2 mg的纳米多孔银分散到5 mL超纯水中，加入3mL、浓度为1.0 mmol/L的三联吡啶钌溶液，室温避光振荡24 h，6500 r/min下离心洗涤6次，将产物重新分散到1 mL超纯水中，得到纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液；
（2）纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液的制备
将1 mL、浓度为2 mg/mL的纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液与300 μL、浓度为10 μg/mL甲胎蛋白检测抗体混合，振荡24 h，5000 r/min下离心洗涤15 min，得到纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体孵化物，将其分散于1 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液。
实施例9纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液的制备
（1）纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液的制备
将10 mg银铝合金放入500 mL、浓度为1.5 mol/L的氢氧化钠溶液中，室温下化学腐蚀36 h， 8000 r/min下离心洗涤8次，在真空干燥箱里干燥48 h，制得纳米多孔银；将3mg的纳米多孔银分散到10 mL超纯水中，加入5 mL、浓度为1.5 mmol/L的三联吡啶钌溶液，室温避光振荡36 h，8000 r/min下离心洗涤9次，将产物重新分散到1 mL超纯水中，得到纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液；
（2）纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液的制备
将1 mL、浓度为3 mg/mL的纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液与500 μL、浓度为15 μg/mL甲胎蛋白检测抗体混合，振荡36 h，6000 r/min下离心洗涤20 min，得到纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体孵化物，将其分散于1 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液。
实施例10甲胎蛋白的检测方法
（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为600 V，循环伏安扫描电位范围为-1.8 ~ -0.6V，扫描速率为0.10 V/s；
（2）在10 mL、pH 5.5 ~ 8.0的含100 ~ 150 mmol/L三乙醇胺的磷酸盐缓冲溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的甲胎蛋白标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替甲胎蛋白标准溶液进行检测，测得线性范围为0.0001 ~30 ng/mL，检测限为33 fg/mL。
Claims (2)
1.一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液的制备
1）纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液的制备
将0.1 ~ 10 mg银铝合金放入20 ~ 500 mL、浓度为0.5 ~ 1.5 mol/L的氢氧化钠溶液中，室温下化学腐蚀12 ~ 36 h，5000 ~ 8000 r/min下离心洗涤4 ~ 8次，在真空干燥箱里干燥24 ~ 48 h，制得纳米多孔银；将1 ~ 3 mg的纳米多孔银分散到1 ~ 10 mL超纯水中，加入1 ~ 5 mL、浓度为0.5 ~ 1.5 mmol/L的三联吡啶钌溶液，室温避光振荡12 ~ 36 h，4000~ 8000 r/min下离心洗涤3 ~ 9次，将产物重新分散到1 mL超纯水中，得到纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液；
2）纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液的制备
将1 mL、浓度为1 ~ 3 mg/mL的纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液与100 ~ 500 μL、浓度为5 ~ 15 μg/mL甲胎蛋白检测抗体混合，振荡12 ~ 36 h，4000 ~ 6000 r/min下离心洗涤10 ~ 20 min，得到纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体孵化物，将其分散于1mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液；
（2）电致化学发光免疫传感器的制备方法
1）将直径为4 mm的玻碳电极用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
2）将2 ~ 10 μL、浓度为1 ~ 3 mg/mL的甲胎蛋白抗体捕获基底材料金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液于电极表面，4 ℃保存；
3）用3 ~ 9 μL、质量分数为0.5 ~ 1.5%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4 ℃冰箱中孵化1 ~ 5 h，清洗干净；
4）将2 ~ 6 μL浓度为0.0001 ~ 30 ng/mL的一系列不同浓度的甲胎蛋白用于捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净；
5）将4 ~ 8 μL浓度为1 ~ 3 mg/mL的纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4 ℃冰箱中储存备用。
2.如权利要求1所述的一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法，所述甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备，其特征在于，包括以下步骤：
（1）炭黑插层还原石墨烯复合材料的制备
将25 ~ 75 mg氧化石墨烯加入到25 ~ 75 mL去离子水中，室温下超声2 h，得到溶液A；称取2 ~ 300 mg炭黑分散在8 ~ 120 mL的N,N-二甲基甲酰胺中，室温下超声2 h，得到溶液B；将1 ~ 100 mL溶液A加入到1 ~ 100 mL溶液B中，室温下超声分散2 h，加入5 ~ 15 μL、体积分数为80 %的水合肼溶液，剧烈振荡5 min，100 ℃下加热1 ~ 5 h，5000 ~ 8000 r/min下离心洗涤10 ~ 30 min，制得炭黑插层还原石墨烯复合材料；
（2）金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
将1 ~ 3 mg炭黑插层还原石墨烯分散到1 mL超纯水中，加入0.5 ~ 1.5 mL金溶胶，得到的混合溶液在室温下振荡12 ~ 36 h，5000 ~ 8000 r/min下离心洗涤10 ~ 30 min，制得金杂化炭黑插层还原石墨烯；将金杂化炭黑插层还原石墨烯重新分散于1 mL超纯水中，得到基底材料金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液；
（3）甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备
将1 mL、浓度为1 ~ 3 mg/mL的金杂化的炭黑插层还原石墨烯溶液与100 ~ 300 μL、浓度为5 ~ 15 μg/mL的甲胎蛋白捕获抗体混合，振荡12 h，4000 ~ 6000 r/min下离心洗涤10~ 20 min，得到甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯孵化物，将其分散于1 ~ 3 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液。
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