CN105483031A - 一种转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子及其制备和应用方法 - Google Patents

一种转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子及其制备和应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子及其制备和应用方法。该制备方法包括以下步骤：1)固态发酵法培养：获取胞内含高活性葡萄糖氧化酶的黑曲霉孢子；2)水洗、冻融和加入萜类试剂处理：获取通透性好且在生物转化过程中不会萌发的黑曲霉孢子。将制备的黑曲霉孢子加入转化容器，转化200h后，采用二硝基水杨酸法和葡萄糖酸试剂盒分别测定葡萄糖和葡萄糖酸的含量。结果表明，本法制备的孢子可用于转化葡萄糖产葡萄糖酸，且转化过程中具有不易失活，无需固定，易于分离，可反复使用的特点。该方法为黑曲霉孢子在生物转化葡萄糖产葡萄糖酸的实际应用提供了理论基础与技术支撑。

Description

一种转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子及其制备和应用方法
技术领域
本发明涉及一种转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子及其制备和应用方法。
背景技术
葡萄糖酸是一种多功能有机酸，广泛应用于食品、洗涤、药物和建筑等行业。葡萄糖酸能够通过葡萄糖氧化酶在有氧气的条件下专一性催化β-D-葡萄糖生成。由于微生物具有生长繁殖速度快、来源广等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主要来源，微生物中的主要生产菌株为黑曲霉(NRRL3)。工业上常采用黑曲霉营养细胞或者合成酶作为生物催化剂在生物催化系统中的连续化操作获取葡萄糖酸。各种理化因素，化学品以及降解酶的释放，易引起酶的失活。加之，葡萄糖转化成葡糖酸的生物催化反应是氧化反应，如果通气不好该过程不能很好地进行，而利用菌丝营养体形式的黑曲霉使得发酵液变得非常粘稠，导致通风和产品混合困难。
孢子是生物体产生的一种具有繁殖或休眠作用的特殊生命形式，能在恶劣的环境下保持自有的传播能力，并再在有利条件下直接发育成新个体。尽管孢子被认为是代谢惰性的，但它们却是极好的酶贮藏库和非常有前景的生物催化剂。大量研究表明，霉菌孢子具有很高的特异性催化活性，能介导高效的生物转化反应。SchlegandKnight等首先将赭曲霉孢子应用于11a羟化类固醇的催化中，并推广应用于一定规模的工业生产中；Larroche等将青霉孢子应用于催化辛酸转变成2-庚酮从而产生蓝乳酪味上；Wolken等利用鲁氏毛霉孢子产生β-酮酯。Ramachandran等研究表明黑曲霉孢子具有葡萄糖氧化酶活性，即使孢子在-20℃下贮存3个月也不会丢失任何酶活性。因此，开发黑曲霉孢子作为转化葡萄糖产葡萄糖酸的生物催化剂具有以下优势：消除反应的迟滞期、可重复使用孢子、减少副产物、易于进行产物分离。此外，相对小的、椭圆形和圆形的孢子可避免转化液的粘稠化所带来的不易通风通气的劣势。但是黑曲霉孢子的刚性膜结构充当了天然屏障，导致酶与催化底物无法接触。因此，利用新鲜孢子作为催化剂生物转化葡萄糖产葡萄糖酸的反应不能顺利进行，葡萄糖酸产量接近零。此外，生物转化反应进行过程中如果孢子萌发将大大降低葡萄糖酸的产量。
基于以上原因，本发明提出了一种可转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子及其制备和应用方法。
发明内容
本发明的目的是要克服现有方法不足之处而提供一种在转化葡萄糖产葡萄糖酸反应中不易失活、易于分离的生物催化剂黑曲霉孢子及其制备和应用方法。
为了实现上述技术目的，本发明的技术方案如下。
一种转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将黑曲霉接种于斜面固体培养基活化；
步骤二：活化后的黑曲霉接种于液体培养基培养后收集黑曲霉孢子；
步骤三：将收集的黑曲霉孢子进行水洗、冻融和加入萜类试剂处理，获得能够进行生物转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子。
所述步骤一：将黑曲霉接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面，25～35℃培养7～10日。
所述步骤二：用含有0.05％～0.5％(V/V)Tween-80或Tween-20的灭菌去离子水冲洗培养黑曲霉7-10日的斜面后，调取108～109spores/mL的黑曲霉孢子悬液，将其接种于荞麦种子培养基，接种量为108～109spores/100g荞麦种子，培养168～240h。
所述的荞麦种子培养基的制备方法如下：荞麦种子300g用去离子水洗净，用等量的去离子水煮熟，100℃沸水浴15～20min软化组织；倒掉多余的水分，分装于锥形瓶中，高压蒸汽灭菌处理，通过该方法处理所获得的荞麦种子培养基为：100g荞麦种子含水50g。
所述步骤二：将含有0.05％～0.5％(V/V)Tween-80或Tween-20的灭菌去离子水加入培养后的黑曲霉的荞麦种子培养基中，100～500rmp振摇1～5h后，无菌条件下，用灭菌薄纱布过滤，收集滤液，5,000～20,000g离心10～20min，弃掉上清液，收集下部黑曲霉孢子沉淀。
所述步骤三水洗过程是将含有0.05％～0.5％(V/V)Tween-80或Tween-20的灭菌去离子水于收集的黑曲霉孢子中，在5,000～20,000g，4℃下离心10～30min，弃掉上清液，收集下部沉淀，重复水洗步骤n次后，1≤n≤25，收集孢子待用。
所述步骤三将水洗后获得的黑曲霉孢子沉淀置入-20℃冰箱、-80℃低温冰箱或液氮罐中保持48h以上，然后从冰箱中取出，置于室温条件下，让其迅速溶解。
所述步骤三加入1-10wt％萜类化合物处理3-18h，收集孢子待用。
所述的萜类化合物为单萜或类单萜化合物，包括：柠檬醛、柠檬烯、萜品醇、月桂烯、芳樟醇、苔黑酚、松油醇、香芹醇中的一种或几种。
一种转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子，是由上述的方法制备而成的。
所述的转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子的应用方法：
将所述的黑曲霉孢子葡萄糖溶液加入带搅拌设备的反应容器中使得黑曲霉孢子终浓度为108～1010spores/mL，和葡萄糖溶液终浓度为20～60g/L，反应器的底部以0.05～0.5L/min连续通风，且装有KOH溶液的柱子吸收CO2，25～35℃下转化168～240h。
本发明在生物转化反应结束后，采用二硝基水杨酸法和葡萄糖酸试剂盒分别测定转化溶液中葡萄糖和葡萄糖酸的含量。在生物转化反应结束后回收作为生物转化的黑曲霉孢子进行重复转化使用，使用次数可达14次。
本发明对比已有方法来说，提出了使用黑曲霉孢子生物转化葡萄糖产葡萄糖酸的新思路，是对传统方法的思维创新；提出了采用水洗、冻融和加入萜类试剂处理孢子，解决胞内葡萄糖氧化酶不易与底物接触的不足，是对传统方法的技术创新；所制备的孢子在催化转化反应中具有不易丢失酶活性，反应产物易于分离，同时还避免了转化液的粘稠化所带来的不易通风通气的劣势。
本发明的技术效果在于：
1、本发明提供了一种可用作转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子及其制备和应用方法；
2、黑曲霉孢子制备方法简单、易于保存、批次稳定、可实现重复使用；
3、转化培养基成分简单，转化产物易于分离，生产成本低，工艺简单，易于工业化应用。
附图说明
图1(a)新鲜黑曲霉孢子；(b)经冻融(48h)+3％citral(10h)处理的黑曲霉孢子；(c)经冻融(48h)+10％citral(10h)处理的黑曲霉孢子。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1相关培养基的制备
1)PDA培养基将马铃薯洗净、去皮、切成小块，再称取200g，加水煮烂(煮沸20-30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，再根据实际实验需要加15g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，121℃灭菌20min左右后取出试管摆斜面，获得PDA培养基，冷却后贮存备用。
2)荞麦种子培养基荞麦种子(300g)用去离子水洗净，用等量的去离子水煮熟，沸水浴(100℃，15min)软化组织，倒掉多余的水分，分装于锥形瓶中，瓶口用棉塞和报纸包扎好，高压蒸汽灭菌处理(121℃，15psi约0.1MPa下15min)。通过该方法处理所获得的荞麦种子培养基为：100g荞麦种子含水50g。
实施例2黑曲霉孢子(源自黑曲霉ATCC9029，购自美国模式培养物集成库，但不限于这一种菌株)的获取
将黑曲霉接种于PDA培养基斜面，30℃培养7日；用含有0.1％Tween-80(或Tween-20)的灭菌去离子水冲洗黑曲霉PDA培养斜面，获得黑曲霉孢子悬液，采用比浊法调节成浓度为108spores/mL的孢子悬液，将其接种于荞麦种子培养基(接种量为108spores/100g荞麦种子)，培养200h。加入含有0.1％Tween-80(或Tween-20)的灭菌去离子水于培养了200h黑曲霉的荞麦种子培养基中，180rmp振摇1h后，无菌条件下用灭菌薄纱布过滤，收集滤液10,000g离心10分钟，弃掉上清液，收集下部沉淀(黑曲霉孢子)。
实施例3黑曲霉孢子的处理
以上获得的黑曲霉孢子，由于其孢壁是其天然的屏障，阻碍了葡萄糖与胞内葡萄糖氧化酶的接触，因此，要对黑曲霉孢子进行处理，方法为：
1、加入含有0.1％Tween-80(或Tween-20)的灭菌去离子水于黑曲霉孢子沉淀中，在10,000g，4℃下离心10min，弃掉上清液，收集下部沉淀，重复上述步骤n次(1≤n≤25)后，收集孢子待用。
2、将获得的黑曲霉孢子沉淀置入-20℃冰箱、-80℃低温冰箱或液氮罐中保持48h以上，然后从冰箱中取出，置于室温条件下，让其迅速溶解，加入一定浓度萜类化合物(本实例为柠檬醛citral)处理一定时间(3-18h)，收集孢子待用。
实施例4黑曲霉孢子转化葡萄糖产葡萄糖酸
将不同方法处理(新鲜孢子、冻融孢子(均指冰冻48h后置室温迅速溶解)、1％citral+新鲜孢子、1％citral+冻融孢子、3％citral+冻融孢子、10％citral+冻融孢子，citral处理均为10h)的黑曲霉孢子(终浓度为109spores/mL)和葡萄糖糖溶液(终浓度为40g/L)加入生物转化反应容器中，生物反应器的底部以0.075L/min连续通风(装有KOH溶液的柱子吸收释放的CO2)，在30℃下转化200h后，采用二硝基水杨酸法测定葡萄糖的含量，葡萄糖酸试剂盒测定葡萄糖酸的含量，其结果如表1所示。由表可知，未经任何形式处理的新鲜孢子，经过长达200h的转化后，葡萄糖含量仍保持在40g/L左右，葡萄糖酸含量为零，结果表明，新鲜孢子不能转化葡萄糖产葡萄糖酸；冻融处理孢子经200h转化后葡萄糖含量由40g/L降低为(25±2)g/L，葡萄糖酸含量增加为(15±1)g/L，冻融处理孢子能够转化葡萄糖产葡萄糖酸；1％citral处理的新鲜孢子，转化液中葡萄糖酸含量为(17±2)g/L，略高于冻融法，说明经1％citral处理的孢子也能够转化葡萄糖产酸，其效能略高于冻融法。因此，将冻融法与citral结合处理可望进一步提高孢子的转化效能。由表可知，1％citral与冻融法结合处理孢子后所获得的孢子转化葡萄糖产酸含量为(30±3)g/L，转化效能明显高于仅用冻融法处理或仅用citral处理。随着citral浓度的增加，孢子转化能力增加，当citral浓度达到3％时，孢子转化产葡萄糖酸的含量与经10％的citral处理的含量近似，因此，3％citral为最优处理浓度。我们用扫描电子显微镜(SEM)观察了新鲜黑曲霉孢子(图1(a))、冻融+3％citral处理的孢子(图1(b))以及冻融+10％citral处理的孢子(图1(c))，由图可知，孢子经冻融+1％citral处理后，孢子壁出现褶皱，但提高citral浓度至10％后没有显著提高孢子壁的褶皱度，与转化产葡萄糖酸的含量结果一致，说明结合冻融与citral处理改变了孢子壁结构，提高了其通透性，增加了底物与胞内葡萄糖氧化酶接触的机会。此外，将经处理孢子与新鲜孢子接种于PDA培养基中培养7日，经处理孢子未见生长，而新鲜孢子生长良好，说明经处理孢子生长已被抑制，有利于转化反应的进行。选用冻融+3％citral处理的孢子研究了其可重复利用性，结果表明，经14次转化后，葡萄糖酸产量仍可达到(34±3)g/L；此外，孢子在-20℃冰箱保存3个月后，经测定，葡萄糖酸产量仍可达到(37±5)g/L(葡萄糖底物浓度均为40g/L)。
利用制备的孢子进行转化反应具备如下优势：1)减少在转化产物中杂质，产物后处理简单，没有培养基成分的污染，分离纯化比较容易；2)制备的孢子可在低温下长时间保持其活性稳定不变，反应孢子还能多次反复使用；3)与生长培养法相比，能缩短反应时间，能降低整个转化反应的成本。
表1不同处理条件下黑曲霉孢子转化葡萄糖产葡萄糖酸结果

Claims (10)

1.一种转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将黑曲霉接种于斜面固体培养基活化；
步骤二：活化后的黑曲霉接种于液体培养基培养后收集黑曲霉孢子；
步骤三：将收集的黑曲霉孢子进行水洗、冻融和加入萜类试剂处理，获得能够进行生物转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子。
2.根据权利要求1所述的转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子制备方法，其特征在于，所述步骤二：用含有0.05％～0.5％(V/V)Tween-80或Tween-20的灭菌去离子水冲洗培养黑曲霉7-10日的斜面后，调取108～109spores/mL的黑曲霉孢子悬液，将其接种于荞麦种子培养基，接种量为108～109spores/100g荞麦种子，培养168～240h。
3.根据权利要求2所述的转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子制备方法，其特征在于，所述的荞麦种子培养基的制备方法如下：荞麦种子300g用去离子水洗净，用等量的去离子水煮熟，100℃沸水浴15～20min软化组织；倒掉多余的水分，分装于锥形瓶中，高压蒸汽灭菌处理，通过该方法处理所获得的荞麦种子培养基为：100g荞麦种子含水50g。
4.根据权利要求1所述的转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子制备方法，其特征在于，所述步骤二：将含有0.05％～0.5％(V/V)Tween-80或Tween-20的灭菌去离子水加入培养后的黑曲霉的荞麦种子培养基中，100～500rmp振摇1～5h后，无菌条件下，用灭菌薄纱布过滤，收集滤液，5,000～20,000g离心10～20min，弃掉上清液，收集下部黑曲霉孢子沉淀。
5.根据权利要求1所述的转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子制备方法，其特征在于，所述步骤三水洗过程是将含有0.05％～0.5％(V/V)Tween-80或Tween-20的灭菌去离子水于收集的黑曲霉孢子中，在5,000～20,000g，4℃下离心10～30min，弃掉上清液，收集下部沉淀，重复水洗步骤n次后，1≤n≤25，收集孢子待用。
6.根据权利要求1所述的转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子制备方法，其特征在于，所述步骤三将水洗后获得的黑曲霉孢子沉淀置入-20℃冰箱、-80℃低温冰箱或液氮罐中保持48h以上，然后从冰箱中取出，置于室温条件下，让其迅速溶解。
7.根据权利要求1所述的转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子制备方法，其特征在于，所述步骤三加入1-10wt％萜类化合物处理3-18h，收集孢子待用。
8.根据权利要求7所述的转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子制备方法，其特征在于，所述的萜类化合物为单萜或类单萜化合物，包括：柠檬醛、柠檬烯、萜品醇、月桂烯、芳樟醇、苔黑酚、松油醇、香芹醇中的一种或几种。
9.一种转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子，其特征在于，是由权利要求1-8任一项所述的方法制备而成的。
10.权利要求9所述的转化葡萄糖产葡萄糖酸的黑曲霉孢子的应用方法，其特征在于，将所述的黑曲霉孢子葡萄糖溶液加入带搅拌设备的反应容器中使得黑曲霉孢子终浓度为108～1010spores/mL，和葡萄糖溶液终浓度为20～60g/L，反应器的底部以0.05～0.5L/min连续通风，且装有KOH溶液的柱子吸收CO2，25～35℃下转化168～240h。
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