CN105481689B - 一种隐绿原酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种隐绿原酸的制备方法，该制备方法步骤为：取绿原酸，甲醇溶解，然后加1～2mol/L盐酸，搅拌反应6～8h，1～2mol/LNaOH溶液调pH至中性，浓缩，甲醇溶解，过滤，减压浓缩，加水溶解，滤过，得滤液；取滤液经反相C₁₈柱预处理，水洗，收集水洗液浓缩，离心，过滤，利用反相工业制备色谱法制备得到隐绿原酸。本发明提供的隐绿原酸的制备方法，经过系统实验筛选得到最佳的酸转化条件和碱中和反应条件，并经过反相工业制备色谱制备得到高纯度的隐绿原酸，产率高，适合大规模制备，取得了很好的技术效果。

Description

一种隐绿原酸的制备方法

技术领域

本发明涉及一种有机酸的制备方法，具体涉及一种隐绿原酸的制备方法。

背景技术

隐绿原酸即4-咖啡酰奎宁酸，属于单咖啡酰奎宁酸类化合物，是绿原酸(3-咖啡酰奎宁酸)同分异构体。近年来，国内外学者就咖啡酰奎宁酸类化合物药理活性进行了深入研究，发现其具有一些重要生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抑制平滑肌收缩、降血脂等，极具临床应用价值，有望在治疗病毒性肝炎及宫颈癌疾病中发挥重要的作用。但由于目前此类化合物仅停留在是实验室研究阶段，还未见规模制备的方法技术，这样很大地限制了此类化合物的深入研究开发。因此，对于此类化合物包括隐绿原酸的规模分离、纯化及制备成为其深入开发的关键问题。

国内外关于隐绿原酸的分离纯化仅少数文献报道，许小方(许小方,李会军,李萍,冯煦,袁昌齐.灰毡毛忍冬花蕾中的化学成分[J],中国天然药物,2006,4(1):45-47.)从15kg灰毡毛忍冬中通过D101大孔树脂、SephadexLH-20、RP-C₁₈和重结晶等方法分离得到200mg隐绿原酸。王琦(王琦.金银花的化学成分研究[D].沈阳药科大学,2008.)采用萃取、反复硅胶柱层析、SephadexLH-20和重结晶等方法从280g金银花浸膏中分离得到隐绿原酸30mg。王岱杰(王岱杰.忍冬叶化学成分及其抗H5亚型禽流感病毒研究[D].山东农业大学,2013.)从10kg忍冬叶中通过MCI树脂、SephadexLH-20及制备液相等手段分离得到13mg隐绿原酸。然而，上述研究中普遍存在一个问题，隐绿原酸都是在化学成分研究过程中发现的，这些方法并不是针对隐绿原酸的分离、纯化和制备，具有随机性、重现性差，而且分离纯化步骤较繁琐，不适合大规模分离制备。另外，由于隐绿原酸在植物中含量低，通过植物化学手段来分离得到的量非常小，无法满足动物实验的研究应用。同时，也有报道国外学者采用化学合成隐绿原酸(张亚梅.咖啡酰奎宁酸类化合物的合成研究[J].江西中医药,2012,8(43):78.)，但隐绿原酸通过奎宁酸选择性酯化合成收率很低，且成本高，污染很大，未进入规模化生产，而国内无人问津，所有以上均制约了其进一步的开发应用。

因此，很有必要在现有技术的基础之上，研究开发一种制备效率高，产率高，生产成本低，具有很好应用前景的隐绿原酸的制备方法。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，经过大量实验筛选，提供优选的隐绿原酸的制备方法。本发明提供的隐绿原酸的制备方法，以绿原酸为原料，采用优选的酸处理工艺使绿原酸稳定的、高效的转化为隐绿原酸，并通过优选的工业制备色谱纯化方法，将性质较接近的绿原酸和隐绿原酸等分离纯化，制备得到纯度高的隐绿原酸，工艺简单，步骤简便，制备效率高，得率高，制备得到的隐绿原酸纯度高，整个过程生产成本低，可操作性强，适合大规模制备，具有很好的应用前景。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

一种隐绿原酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取绿原酸，加5～10倍量体积浓度为50％～80％甲醇溶解，加10～20倍量的1～2mol/L盐酸，于60℃水浴上搅拌反应6～8h，反应结束后冷却至室温，得反应液；

(2)反应液中加1～2mol/LNaOH溶液调pH至中性，50℃以下减压浓缩至干，加甲醇溶解，析出白色固体滤过，滤液在50℃以下减压浓缩至干，加少量水溶解，滤过，得滤液；

(3)取滤液经反相C₁₈柱预处理，水洗，收集水洗液浓缩，离心，过0.45μm滤膜，反相工业制备色谱法制备得到隐绿原酸。

作为优选方案，以上所述的隐绿原酸的制备方法，步骤(1)中，取绿原酸，加10倍量体积浓度为50％甲醇溶解，然后加20倍量的1mol/L盐酸，然后于60℃水浴上搅拌反应6h，反应结束后冷却至室温。

作为优选方案，以上所述的隐绿原酸的制备方法，反相工业制备色谱法的色谱条件为：色谱柱为反相C18色谱柱(30～150×250～600mm))，流速为15～1000mL/min，波长为326nm，流动相为乙腈(A)-0.5％甲酸溶液(B)，梯度洗脱，进样量1.0～20.0g。

实验例

(一)酸反应优选试验：

由于绿原酸结构不稳定，极易发生变化，本发明通过大量实验筛选转化条件，在60℃水浴下进行反应。

1、考察60℃下，绿原酸的转化实验：

(1)0.1mol/L盐酸反应8个小时，每隔2h取样，以绿原酸为对照进行HPLC检测。

(2)0.1mol/L氢氧化钠反应8个小时，每隔2h取样，以绿原酸为对照进行HPLC检测。

检测结果：在酸性条件下，绿原酸可转化为隐绿原酸；但是在碱性条件下，无隐绿原酸生成。

因此，本发明选择酸性条件下进行隐绿原酸的转化。

2、考察60℃下，在不同浓度的酸性条件下绿原酸的转化实验：

(1)0.01mol/L盐酸反应8个小时，每隔2h取样，以绿原酸为对照进行HPLC检测。

(2)0.1mol/L盐酸反应8个小时，每隔2h取样，以绿原酸为对照进行HPLC检测。

(3)1mol/L盐酸反应8个小时，每隔2h取样，以绿原酸为对照进行HPLC检测。

检测结果：

a、0.01mol/L盐酸反应条件下，反应终点隐绿原酸生成量很少。

b、0.1mol/L盐酸反应6h有微量隐绿原酸生成，8h有少量隐绿原酸生成。

c、1mol/L盐酸反应4h有少量隐绿原酸生成，6h有大量隐绿原酸生成，8h的生成杂质较多。

因此，本发明优选的隐绿原酸的最佳转化反应条件为：浓度为1mol/L盐酸下，反应6h。

(二)工业制备色谱法制备条件的优选

1、检测波长：本发明通过全波长扫描和3D等高线检测，优选出最佳的检测波长为326nm，在该波长下隐绿原酸有最大吸收，故选择检测波长为326nm。

2、流动相的组成，本发明以甲醇-水，甲醇-0.5％甲酸溶液，乙腈-水和乙腈-0.5％甲酸溶液分别为流动相，实验结果表明，以甲醇-水，甲醇-0.5％甲酸溶液，乙腈-水为流动相时，系统分离效果较差，洗脱速度慢，峰形不佳，因此本发明选择乙腈(A)-0.5％甲酸溶液(B)为洗脱剂。

3、洗脱程序筛选：由于隐绿原酸和绿原酸极性接近，在色谱柱上完全分离具有较大的难度，并且绿原酸和隐绿原酸的化学性质很不稳定，因此，本发明通过大量实验筛选梯度洗脱条件，优选得到最佳的梯度洗脱程序为：0～30min，8％～30％A；30～35min，30％～100％A。

本发明提供的隐绿原酸的制备方法，采用优选的酸性条件下转化后，再用优选浓度的碱将过量的酸进行中和，通过实验筛选，采用1～2mol/LNaOH溶液不仅可以将反应体系中过量的酸中和，并且不会影响隐绿原酸的结构稳定性，可防止隐绿原酸结构再次转化，保证产率。

经过酸性转化和碱性中和后，反应体系中存有一定的杂质和未反应完的绿原酸等，为了提高后续制备液相的纯化效率，本发明通过大量实验筛选，将碱中和后的反应液先经反相C₁₈柱预处理，可以将反应体系中的部分杂质去掉，大大提高后续工业制备色谱的制备效率和提高隐绿原酸的纯度，取得了很好的技术效果。

有益效果：本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明提供的隐绿原酸的制备方法，经过系统实验筛选得到最佳的酸转化条件和碱中和反应条件，并经过大量实验优选出工业制备色谱纯化方法，制备得到高纯度的隐绿原酸，本发明的优点是工艺合理，步骤简便，绿原酸经酸碱处理后，再经C18预处理及工业色谱两步纯化即可得到高纯度的隐绿原酸，避免了常规分离从药材提取经大孔树脂纯化、反复硅胶或凝胶等色谱纯化的繁杂步骤，可将化学性质不稳定、容易得到的的绿原酸转化为目标产物隐绿原酸，并能通过工业制备色谱方法，将极性近似的隐绿原酸和绿原酸及其它杂质高效的分离，制备得到纯度高的隐绿原酸，制备效率高，适合大规模制备，取得了很好的技术效果。

附图说明

图1为工业制备色谱纯化制备得到的隐绿原酸的液相色谱图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

1、一种隐绿原酸的制备方法，其包括以下步骤：

(1)取绿原酸10g，加10倍量体积浓度为50％甲醇溶解，加20倍量的1mol/L盐酸，于60℃水浴上搅拌反应6h，反应结束后冷却至室温，得反应液；

(2)反应液中加1mol/LNaOH溶液调pH至中性，50℃以下减压浓缩至干，加甲醇溶解，析出的白色固体滤过，滤液在50℃以下减压浓缩至干，加少量水溶解，滤过，得滤液；

(3)取滤液经反相C₁₈柱预处理，水洗，收集水洗液浓缩，离心，过0.45μm滤膜，利用工业制备色谱法制备得到纯度为98.2％隐绿原酸3.48g，产率34.8％。

所述的工业制备色谱法的色谱条件为：色谱柱为反相C18色谱柱(50×250mm)，流速为20mL/min，波长为326nm，流动相为乙腈(A)-0.5％甲酸溶液(B)，梯度洗脱，进样量1.0g。

梯度洗脱条件为：0～30min，8％～30％A；30～35min，30％～100％A。

如图1所示，为本发明制备得到的隐绿原酸的液相色谱图。

实施例2

1、一种隐绿原酸的制备方法，其包括以下步骤：

(1)取绿原酸200g，加10倍量体积浓度为50％甲醇溶解，加20倍量的1mol/L盐酸，于60℃水浴上搅拌反应6h，反应结束后冷却至室温，得反应液；

(2)反应液中加1mol/LNaOH溶液调pH至中性，50℃以下减压浓缩至干，加甲醇溶解，析出的白色固体滤过，滤液在50℃以下减压浓缩至干，加少量水溶解，滤过，得滤液；

(3)取滤液经反相C₁₈柱预处理，水洗，收集水洗液浓缩，离心，过0.45μm滤膜，利用工业制备色谱法制备得到纯度为98.7％隐绿原酸68.5g，产率34.3％。

所述的工业制备色谱法的色谱条件为：色谱柱为反相C18色谱柱(80×600mm)，流速为60mL/min，波长为326nm，流动相为乙腈(A)-0.5％甲酸溶液(B)，梯度洗脱，进样量5.0g。

梯度洗脱条件为：0～30min，8％～30％A；30～35min，30％～100％A。

如图1所示，为本发明制备得到的隐绿原酸的液相色谱图。

实施例3

一种隐绿原酸的制备方法，包括以下步骤：

(1)取绿原酸500g，加10倍量体积浓度为80％甲醇溶解，加10倍量的2mol/L盐酸，于60℃水浴上搅拌反应8h，反应结束后冷却至室温，得反应液；

(2)反应液中加2mol/LNaOH溶液调pH至中性，50℃以下减压浓缩至干，加甲醇溶解，析出的白色固体滤过，滤液在50℃以下减压浓缩至干，加少量水溶解，滤过，得滤液；

(3)取滤液经反相C₁₈柱预处理，水洗，收集水洗液浓缩，离心，过0.45μm滤膜，利用工业制备色谱法制备得到纯度为98.6％隐绿原酸178.6g，产率35.7％。

所述的工业制备色谱法的色谱条件为：反相C18色谱柱(150×600mm))，流速为1L/min，波长为326nm，流动相为乙腈(A)-0.5％甲酸溶液(B)，梯度洗脱，进样量20g。

梯度洗脱条件为：0～30min，8％～30％A；30～35min，30％～100％A。

如图1所示，为本发明制备得到的隐绿原酸的液相色谱图。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种隐绿原酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取绿原酸，加5～10倍量体积浓度为50％～80％甲醇溶解，加10～20倍量的1～2mol/L盐酸，于60℃水浴上搅拌反应6～8h，反应结束后冷却至室温，得反应液；

(2)反应液中加1～2mol/LNaOH溶液调pH至中性，50℃以下减压浓缩至干，加甲醇溶解，析出白色固体滤过，滤液在50℃以下减压浓缩至干，加少量水溶解，滤过，得滤液；

(3)取滤液经反相C₁₈柱预处理，水洗，收集水洗液浓缩，离心，过0.45μm滤膜，工业制备色谱法制备得到隐绿原酸。

2.根据权利要求1所述的隐绿原酸的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，取绿原酸，加10倍量体积浓度为50％甲醇溶解，加20倍量的1mol/L盐酸，于60℃水浴上搅拌反应6h，反应结束后冷却至室温，得反应液。

3.根据权利要求1所述的隐绿原酸的制备方法，其特征在于，工业制备色谱法的色谱条件为：色谱柱为反相C₁₈色谱柱，30～150×250～600mm，流速为15～1000mL/min，波长为326nm，流动相为:乙腈A和0.5％甲酸溶液B，梯度洗脱，进样量1.0～20.0g。

4.根据权利要求3所述的隐绿原酸的制备方法，其特征在于，梯度洗脱条件为：0～30min，8％～30％A；30～35min，30％～100％A。

5.根据权利要求1所述的隐绿原酸的制备方法，其特征在于，步骤(3)制备得到的隐绿原酸的纯度达98％以上。