CN105475138A - 一种毛棉杜鹃的快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种毛棉杜鹃的快速繁殖方法，包括以下步骤：外植体采集与消毒、初代培养、增殖培养、丛生芽伸长培养、壮苗生根培养和炼苗与移栽。这种毛棉杜鹃的快速繁殖方法克服了组培中无菌体系建立难度大、丛生苗细弱、移栽成活率低等技术问题，实现了不受季节影响的、规模化、低成本的毛棉杜鹃生产，而且该繁殖遗传性状稳定，能很好地保持原植株基因型和优良观赏特性，并且所选用的最佳培养基激素配比，试验重复性非常好。
Description
技术领域
本发明属于植物的栽培及移植技术领域，特别涉及一种毛棉杜鹃的快速繁殖方法。
背景技术
毛棉杜鹃(RhododendronmoulmainenseHook.f.)，又名白杜鹃、丝线吊芙蓉，为杜鹃花科杜鹃属马银花亚属长蕊组的灌木或小乔木型常绿植物，主要分布在海拔700-1500米的灌丛或疏林中。毛棉杜鹃极具观赏价值，伞形花序，花淡紫色、粉红色或淡红白色，开花时节花覆盖整个树冠，非常艳丽，在园林绿化开发中具有非常大的应用价值。
目前，国内有关毛棉杜鹃的育种和繁殖技术研究非常少，仅有少数有关毛棉杜鹃种子繁殖和扦插繁殖的报道，但种子繁殖极其缓慢，从播种到开花，少则3-4年，多则8年以上，且种子播种困难，幼苗死亡率比较高。Sal-chitNg和RichardT.Corlett研究表明毛棉杜鹃或多或少自交不育。李文华等对毛棉杜鹃的扦插繁殖进行研究，采用不同浓度的生根剂和栽培基质但是生根率最高只达到22％。赵富群以毛棉杜鹃种子为外植体，对毛棉杜鹃的组织培养进行研究。但是通过种子繁殖得到的实生苗存在不一致现象，且张长芹等研究发现种子繁殖的幼苗生长极其缓慢，而且毛棉杜鹃自然结实率低，不利于毛棉杜鹃的推广和应用。
为了使观赏应用价值非常高的高山杜鹃毛棉杜鹃为城市园林绿化所用，增加景观植物种类的多样性，从而提升园林生态城市水平，开发一种不受季节影响、繁殖速度快且适合大范围推广应用的繁殖方法，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种毛棉杜鹃的快速繁殖方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种毛棉杜鹃的快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体采集与消毒：采集毛棉杜鹃嫩茎，洗净并消毒，剪去变黑部分，放入装入滤纸的无菌培养皿中吸干表面水分，得到无菌外植体；
(2)初代培养：将外植体接种至外植体初代诱导培养基中，控制培养条件为：25±1℃、光照8-12h/d、光照强度为1500-2500LX，培养至得到不定芽；
(3)增殖培养：将不定芽转移至丛生芽增殖培养基中，培养条件同步骤(2)，培养至得到丛生芽团；
(4)丛生芽伸长培养：将丛生芽团切成小块，接种至丛生芽伸长培养基中，培养条件同步骤(2)，进行丛生芽伸长生长；
(5)壮苗生根培养：将伸长的丛生芽接种至壮苗生根培养基中，培养条件同步骤(2)，得到生根小苗；
(5)炼苗与移栽：将生根小苗开口炼苗，再定植于基质中，浇透水，覆盖农用膜保湿，培养条件同步骤(2)，得到组培苗。
优选地，所述的毛棉杜鹃嫩茎采集自生长健壮、无病害的实生苗。
优选地，所述的外植体的消毒是在无菌超净台上，用浓度为70％的酒精处理10s，无菌水冲洗一次；浓度为2％的NaClO浸泡15min，不停摇动瓶子，使外植体与NaClO溶液充分接触，再用无菌水冲洗4次以上。
优选地，所述的外植体初代诱导培养基pH＝5.0，且其成分为：WPM+NAA0.01mg/L+ZT0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L。
优选地，所述的丛生芽增殖培养基pH＝5.0，且其成分为：WPM+TDZ0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L。
优选地，所述的丛生芽伸长培养基pH＝5.0，且其成分为：WPM+ZT0.5mg/L+GA32.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L。
优选地，所述的壮苗生根培养基pH＝5.0，且其成分为：WPM+IAA0.1mg/L+1％蔗糖+琼脂8g/L。
优选地，伸长的丛生芽其长度≥2cm。
优选地，丛生芽伸长培养，每瓶培养基中接种4块丛生芽团。
优选地，所述的壮苗生根培养，每瓶接种4个丛生芽。
本发明的有益效果是：
本发明针对毛棉杜鹃种子繁殖苗成活率、常规扦插、嫁接繁殖率低且操作繁琐困难额现状，提供了一种毛棉杜鹃的快速繁殖方法，步骤依次为外植体采集及消毒、初代培养、增殖培养、丛生芽伸长培养、壮苗生根培养和炼苗移栽，克服组培中无菌体系建立难度大、丛生苗细弱、移栽成活率低等技术问题，实现了不受季节影响的、规模化、低成本的毛棉杜鹃生产，而且该繁殖遗传性状稳定，能很好地保持原植株基因型和优良观赏特性，并且所选用的最佳培养基激素配比，试验重复性非常好。
附图说明
图1为毛棉杜鹃外植体腋芽萌发图；
图2为诱导不定芽诱导所得愈伤组织；
图3为诱导不定芽诱导所得愈伤组织分化不定芽；
图4为诱导不定芽诱导所得愈伤组织分化的不定芽伸长；
图5为诱导不定芽诱导出的愈伤组织分化的伸长不定芽生根。
图6为组培苗穴盘培养。
具体实施方式
1、外植体的采集
取温室毛棉杜鹃生长健壮、无病害的实生苗嫩茎做外植体。外植体用清水洗净，尤其是叶腋处，用自来水淋洗2小时，备用。
2、外植体的消毒
在无菌超净台上，对外植体采用四种不同的灭菌方法进行处理，第一种采用浓度为75％的酒精处理10s，无菌水冲洗1次，再用浓度为0.1％的升汞浸泡20min，期间不停摇动瓶子，使外植体与升汞溶液充分接触，再用无菌水冲洗5次；第二种采用浓度为75％的酒精处理10s，无菌水冲洗一次，再用浓度为2％的NaClO溶液浸泡15min，期间不停摇动瓶子，使外植体与NaClO溶液充分接触，再用无菌水冲洗5次；第三种采用浓度为75％的酒精处理3s，无菌水冲洗一次，再用浓度为2％的NaClO溶液浸泡15min，期间不停摇动瓶子，使外植体与NaClO溶液充分接触，再用无菌水冲洗5次；第四种采用浓度为75％的酒精处理10s，无菌水冲洗一次，再用浓度为2％的NaClO溶液浸泡15min，期间不停摇动瓶子，使外植体与NaClO溶液充分接触，再用浓度为0.1％的升汞浸泡5min，期间不停摇动瓶子，使外植体与升汞溶液充分接触，之后用无菌水冲洗5次。消毒后，除去茎尖和尖段上变黑的部分，放入装入滤纸的无菌培养皿中吸干表面水分，接种于成分为WPM+NAA0.01mg/L+ZT0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH＝5.0的培养基中，控制培养条件为：温度为25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000LX，每组接种10瓶，每隔一个星期，观察其腋芽萌发情况及染菌情况，得到实验结果如表1。
表1外植体灭菌方法的筛选
由表1可以得出，用升汞灭菌时，外植体不会染菌，但是外植体表现为植株萌发慢，生长缓慢。第三组在无菌超净台上，用浓度为70％的酒精处理10s，无菌水冲洗一次；浓度为2％的NaClO浸泡15min，不停摇动瓶子，使外植体与NaClO溶液充分接触，再用无菌水冲洗5-6次，采用此方法对外植体进行消毒，外植体染菌较低，不仅植株萌发快，而且长势好。
3、初代培养
将萌发的腋芽接种于成分为WPM+NAA0.01mg/L+ZT0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH＝5.0的培养基中，每瓶接种4个外植体，控制培养条件为：温度为25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000LX。培养20天后，嫩茎腋芽萌发，具体细节如图1，培养40天后，基部开始形成愈伤组织，具体细节图如图,2，愈伤组织继续生长团状，60天后愈伤组织开始分化形成不定芽，不定芽高为0.2cm，具体细节图如图3。
4、不定芽增殖培养
将不定芽切割成1cm×1cm大小的不定芽团，分不同组接种在不同增殖培养基中进行增殖，培养基pH均为5.0，其成分分别为：①WPM+TDZ0.2mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、②WPM+TDZ0.2mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、③WPM+TDZ0.2mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、④WPM+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、⑤WPM+TDZ0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、⑥WPM+TDZ0.5mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、⑦WPM+TDZ1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、⑧WPM+TDZ1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、⑨WPM+TDZ1.0mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L。控制培养条件为：温度为25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000LX。每种增殖培养基接种10瓶，每瓶接种4块不定芽团。培养40天后，观察结果如表2。由表2可以得出，不定芽最佳的增殖培养基成分为WPM+TDZ0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH＝5.0。
表2不同激素浓度下不定芽增值培养情况
注：“+”表示增殖后丛生芽团的大小，“+”越多表示增殖后丛生芽团越大，即增殖倍数越高。
5、丛生芽伸长培养基
将增殖后的不定芽切割成1cm×1cm大小的不定芽团，分不同组转接在不同丛生芽伸长培养基上，培养基pH均为5.0，其成分分别为：①WPM+TDZ0.1mg/L+GA32mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、②WPM+TDZ0.5mg/L+GA32mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、③WPM+TDZ1.0mg/L+GA32mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、④WPM+ZT0.1mg/L+GA32mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、⑤WPM+ZT0.5mg/L+GA32mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、⑥WPM+ZT1.0mg/L+GA32mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、⑦WPM+KT0.1mg/L+GA32mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、⑧WPM+KT0.5mg/L+GA32mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、⑨WPM+KT1.0mg/L+GA32mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L。控制培养条件为：温度为25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000LX。每种丛生芽伸长培养基接种10瓶，每瓶培养基中接种4块丛生芽团。培养30天后，观察结果如表3。由表3可知，WPM+ZT0.5mg/L+GA32.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L的培养基较适宜对丛生芽进行伸长培养，在此培养基上，观察到培养30d后丛生芽苗生长健壮，单株丛生芽可以伸长到1-5cm不等，具体细节图如图4。
表3不同激素浓度配比下丛生芽的伸长和壮苗生长情况
6、壮苗生根培养
将长度＞2cm的伸长的丛生芽剪成单株，分不同组转接在不同壮苗生根培养基上，培养基pH均为5.0，其成分分别为：①WPM+IAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、②WPM+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、③WPM+IAA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、④WPM+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、⑤WPM+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L、⑥WPM+NAA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L。控制培养条件为：温度为25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000LX。每种壮苗生根培养基接种10瓶，每瓶接种4个丛生芽，壮苗和生根同时进行。培养50天后，观察结果如表4。由表4可知，IAA含量对毛棉杜鹃组培苗生根有很大影响，当IAA浓度在0.1mg/L时生根率最高，培养50天后，开始长出长短不等的不定根，生根率为90％，具体细节图如图5。
表4不同激素浓度下组培苗的生根情况
7、炼苗与移栽
将具有4条根以上的生根小苗开口炼苗2天后，移入穴盘中。洗掉附着根部的培养基，定植在珍珠岩：草炭土体积比为1:1配制的基质中，浇透水，覆盖农用膜保湿。控制培养条件为：温度为25℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000LX，培养一周后，揭开薄膜，得到组培苗，组培苗移栽成活率在90％以上，具体细节图如图6。
Claims (10)
1.一种毛棉杜鹃的快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体采集与消毒：采集毛棉杜鹃嫩茎，洗净并消毒，剪去变黑部分，放入装入滤纸的无菌培养皿中吸干表面水分，得到无菌外植体；
（2）初代培养：将外植体接种至外植体初代诱导培养基中，控制培养条件为：25±1℃、光照8-12h/d、光照强度为1500-2500LX，培养至得到不定芽；
（3）增殖培养：将不定芽转移至丛生芽增殖培养基中，培养条件同步骤（2），培养至得到丛生芽团；
（4）丛生芽伸长培养：将丛生芽团切成小块，接种至丛生芽伸长培养基中，培养条件同步骤（2），进行丛生芽伸长生长；
（5）壮苗生根培养：将伸长的丛生芽接种至壮苗生根培养基中，培养条件同步骤（2），得到生根小苗；
（5）炼苗与移栽：将生根小苗开口炼苗，再定植于基质中，浇透水，覆盖农用膜保湿，培养条件同步骤（2），得到组培苗。
2.根据权利要求1所述的毛棉杜鹃的快速繁殖方法，其特征在于，所述的毛棉杜鹃嫩茎采集自生长健壮、无病害的实生苗。
3.根据权利要求1所述的毛棉杜鹃的快速繁殖方法，其特征在于，所述的外植体的消毒是在无菌超净台上，用浓度为70%的酒精处理10s，无菌水冲洗一次；浓度为2%的NaClO浸泡15min，不停摇动瓶子，使外植体与NaClO溶液充分接触，再用无菌水冲洗4次以上。
4.根据权利要求1所述的毛棉杜鹃的快速繁殖方法，其特征在于，所述的外植体初代诱导培养基pH=5.0，且其成分为：WPM+NAA0.01mg/L+ZT0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L。
5.根据权利要求1所述的毛棉杜鹃的快速繁殖方法，其特征在于，所述的丛生芽增殖培养基pH=5.0，且其成分为：WPM+TDZ0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L。
6.根据权利要求1所述的毛棉杜鹃的快速繁殖方法，其特征在于，所述的丛生芽伸长培养基pH=5.0，且其成分为：WPM+ZT0.5mg/L+GA32.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L。
7.根据权利要求1所述的毛棉杜鹃的快速繁殖方法，其特征在于，所述的壮苗生根培养基pH=5.0，且其成分为：WPM+IAA0.1mg/L+1%蔗糖+琼脂8g/L。
8.根据权利要求1所述的毛棉杜鹃的快速繁殖方法，其特征在于，伸长的丛生芽其长度≥2cm。
9.根据权利要求1所述的毛棉杜鹃的快速繁殖方法，其特征在于，丛生芽伸长培养，每瓶培养基中接种4块丛生芽团。
10.根据权利要求1所述的毛棉杜鹃的快速繁殖方法，其特征在于，所述的壮苗生根培养，每瓶接种4个丛生芽。
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