CN105461800A - 一种kpv肽及其类似物的多肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种KPV肽及其类似物的多肽制备方法，以全固相合成法合成，包括以下步骤：1、使用聚合物键合型聚氧乙烯-RAM树脂作为合成的固相基质并对其进行预处理；2、肽链的延长；3、将步骤二中得到的肽链以醋酸、二氯甲烷进行羧基化反应得到羧基化的肽链；4、以三氟乙酸或氢氟酸、三异丙基硅烷、水，将步骤三得到的羧基化的肽链进行切割，切割后得到的多肽溶液用甲基第三丁基醚清洗，离心沉淀，干燥沉淀物，以制备型HPLC纯化得到KPV肽或者其类似物的多肽。本发明具有产率高、副产物少，分离纯化简单的特点，适用于中试和工业生产。

Description

一种KPV肽及其类似物的多肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种多肽的制备方法，尤其涉及一种KPV肽及其类似物的多肽的制备方法。
背景技术
黑色素细胞激素(英文名melanocyte-stimulatinghormone，缩写MSH)中的α-MSH的一段多肽SYSMEHFRWGKPV-NH2，被发现具有多种生物用途。在过去几十年，有许多研究报道，α-MSH用于皮肤消炎和其他炎症疾病。此多肽序列中，四肽HFRW以及其同系物序列，包括非多肽类似物，已经被许多制药公司和研究所合成并用于生物医疗领域。人们还发现，这条多肽序列的C端，赖氨酸-脯氨酸-缬氨酸(英文名Lysine-Proline-Valine，缩写KPV)，已经在多项研究中被证明具有预防和皮肤炎症的功效。其类似结构的多肽序列：MEHFRWGKPV、HFRWGKPV、OSSYSMEHFRWGKPV，与三肽KPV有着相同或者相似的功效，可以预防和治疗一系列复杂的皮肤适应症，包括皮肤炎症，水肿，红斑，机会性感染和瘙痒，以及牛皮癣等。MEHFRWGKPV、HFRWGKPV、OSSYSMEHFRWGKPV比KPV更加稳定，药物半衰期时间更长，药物药效持续效果更久(WO2002080858A2)。表1为氨基酸的缩写对照表。
目前，合成KPV肽的方法有液相法和固相法两种(专利US20100120699A1)。液相制备法合成时间长，副产物多，产率低，专利报道中为33％，溶剂消耗量大。
现有的固相制备法，以N,N'-二环己基碳二亚胺(缩写：DCC)和羟基苯并三唑(缩写：HOBt)作为多肽连接的反应物质，以N-乙酰基咪唑(英文名：N-acetylimidazole)将N端羧基化，再通过氢氟酸将多肽从固相树脂上切割。该方法虽然可以将产率提高到56％，但仍然相对繁琐，合成成本高，反应物化合物的使用比较危险。
表1氨基酸的缩写对照表
发明内容
为了获得更高的产率，提高反应速率，反应更安全，本发明提供一种KPV肽及其类似物的多肽制备方法，以全固相合成法合成，包括以下步骤：
步骤一、使用聚合物键合型聚氧乙烯-RAM树脂作为合成的固相基质并对其进行预处理；
步骤二、向树脂中加入N-芴甲氧羰基-AA-OH、多肽连接试剂进行氨基酸合成，清洗树脂，脱去N-芴甲氧羰基保护，再次清洗树脂；
步骤三、将步骤二中得到的肽链以醋酸、二氯甲烷进行羧基化反应得到羧基化的肽链；
步骤四、以三氟乙酸、三异丙基硅烷、水混合溶液，或者氢氟酸、三异丙基硅烷、水混合溶液，将步骤三得到的羧基化的肽链进行切割，切割后得到的多肽溶液用甲基第三丁基醚清洗，离心沉淀，干燥沉淀物，以制备型HPLC纯化得到KPV肽或者其类似物的多肽；
N-芴甲氧羰基-AA-OH中的AA表示氨基酸，步骤二至少重复三次再进入步骤三，N-芴甲氧羰基-AA-OH至少要以N-芴甲氧羰基-Val-OH、N-芴甲氧羰基-Pro-OH和N-芴甲氧羰基-Lys-OH形式分别出现一次；
多肽连接试剂包括2-肟氰乙酸乙酯、N,N'-二异丙基碳二亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺、羟基苯并三唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯、1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐、6-氯-1H-苯并三唑、N,N-二异丙基乙基胺、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯中的一种或者多种。
进一步地，多肽连接试剂包括2-肟氰乙酸乙酯、N,N'-二异丙基碳二亚胺。
进一步地，多肽连接试剂包括N,N-二异丙基乙基胺、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。
进一步地，多肽连接试剂包括1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐、N,N'-二异丙基碳二亚胺。
进一步地，多肽连接试剂包括N,N'-二环己基碳二亚胺和羟基苯并三唑，或者O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N'-二异丙基碳二亚胺，或者6-氯-1H-苯并三唑和N,N'-二异丙基碳二亚胺。
进一步地，步骤一中的预处理是指：以哌啶、二甲基甲酰胺脱去聚合物键合型聚氧乙烯-RAM树脂的N-芴甲氧羰基基团保护，以二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷清洗树脂。
进一步地，步骤二中的清洗树脂，脱去N-芴甲氧羰基保护，再清洗树脂具体是指：以二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷清洗树脂，以哌啶、二甲基甲酰胺脱去N-芴甲氧羰基基团保护，再以二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷清洗树脂。
进一步地，脱去N-芴甲氧羰基基团保护是在加热到70℃-90℃条件下进行的。
进一步地，加热是指用微波、水浴或者油浴加热。
进一步地，脱保护的反应时间是2分钟。
进一步地，步骤二中的氨基酸合成是在加热到70℃-90℃条件下进行的，反应时间是5分钟，加热方式是微波加热。
进一步地，还包括步骤五、将步骤四得到的得到KPV肽或者其类似物的多肽冷冻干燥，于-20℃保存。
进一步地，步骤四中HPLC的流动相为水和乙腈。
进一步地，其类似物的多肽包括MEHFRWGKPV、HFRWGKPV、SYSMEHFRWGKPV。
进一步地，步骤二中的氨基酸合成是在加热到70℃-90℃条件下进行的，反应时间是5分钟，加热方式是微波加热；还包括步骤五、将步骤四得到的得到KPV肽或者其类似物的多肽冷冻干燥，于-20℃保存；步骤四中HPLC的流动相为水和乙腈；其类似物的多肽包括MEHFRWGKPV、HFRWGKPV、SYSMEHFRWGKPV；
多肽连接试剂包括2-肟氰乙酸乙酯和N,N'-二异丙基碳二亚胺，或者N,N-二异丙基乙基胺和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，或者1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐和N,N'-二异丙基碳二亚胺；
N-芴甲氧羰基-AA-OH中的AA表示氨基酸，氨基酸包括缬氨酸、脯氨酸、赖氨酸；
步骤一和步骤二中清洗树脂用的二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷的用量为3～5mL/次。
进一步地，N-芴甲氧羰基-AA-OH中的AA表示氨基酸，氨基酸包括3-氯-D-苯丙氨酸。
本文中，聚合物键合型聚氧乙烯-RAM的英文名是GentaGelSRAM；N-芴甲氧羰基的英文缩写是Fmoc；N-芴甲氧羰基-AA-OH的英文缩写是Fmoc-AA-OH；N-芴甲氧羰基-Val-OH的英文缩写是Fmoc-Val-OH；N-芴甲氧羰基-Pro-OH的英文缩写是Fmoc-Pro-OH；N-芴甲氧羰基-Lys-OH的英文缩写是Fmoc-Lys-OH；二甲基甲酰胺的英文名是dimethylformamide，缩写是DMF；N-乙酰基咪唑的英文名是N-acetylimidazole；三异丙基硅烷的英文名是triisopropylsilane；2-肟氰乙酸乙酯的英文名是ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate；N,N'-二异丙基碳二亚胺的英文名是N,N’-diisopropylcarbodiimide，缩写是DIEA；N,N'-二环己基碳二亚胺的英文名是dicyclohexylcarbodiimide，缩写是DCC；羟基苯并三唑的英文名是1-hydroxybenzotriazole，缩写是HOBt；O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯的英文名是O(7Azabenzotriazol1yl)NNN'N'tetramethyluroniumhexafluophosphate，缩写是HBTU；1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐的英文名是benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphate，缩写是PyBOP；6-氯-1H-苯并三唑的缩写是PyClock；2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的英文名是O-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate，缩写是HATU；叔丁氧羰基的英文名是tert-Butyloxycarbonyl，缩写BOC。
有益效果是：
(1)本方法相对于液相合成法具有更高的产率，总产率可比液相制备法提高近2倍，达65％。副产物无论从种类还是质量都更少，只需要一步分离即可将纯度达到90％以上。
(2)在脱保护反应中，由于常温法需要20分钟，微波法需要2分钟；在连接氨基酸反应中，常温法需要1小时，微波法需要5分钟。因此微波法可以将普通固相反应速率提高10倍以上。
(3)由于微波法副产物非常少，不需要大量溶剂清洗，比如常温法每次冲洗树脂需要N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷各10-15mL，而微波法只需要3-5mL，因此微波法可以减少60％的溶剂使用量。同时总产率也可达到65％以上。
(4)使用醋酸进行羧基化反应，成本更低，更为环保，使用更安全。
(5)使用三氟乙酸进行树脂切割，切割效率更好，成盐效果更好。
(6)此合成制备方法可用于小试以及中试生产，同样适用于工业化生产。
附图说明
图1是KPV结构式的示意图。
图2是本发明的一种较佳实施方式的KPV合成流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的描述。
如图1所示，KPV是赖氨酸、脯氨酸和缬氨酸连接成的三肽——COCH3-Lys-Pro-Val-NH2。如图2所示，依次在树脂上合成出Val-Pro-Lys，然后用醋酸进行羧基化反应，最后用三氟乙酸将树脂切除得到COCH3-Lys-Pro-Val-NH2，即KPV。
GentaGelSRAM树脂的商品名是TentaGelTMSRAM，可以在Sigma-Aldrich公司购买，网址是：http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/86407？lang＝de&region＝CH。
实施例1
1.以全固相合成法合成，使用GentaGelSRAM树脂作为合成的固相基质
2.第一步反应：(树脂脱保护)以15mL哌啶和DMF混合溶液(体积比哌啶：DMF＝1：3)对500mgGentaGelSRAM树脂的Fmoc基团进行脱保护，反应时间20分钟；然后以N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷各10-15mL清洗脱保护后的GentaGelSRAM树脂，得到的脱保护后的GentaGelSRAM树脂的产率是99％。可用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)为染料检测产率。
3.第二步反应：(连接第一个氨基酸Val)加入Fmoc-Val-OH(3倍摩尔量即3e.q)、N,N-二异丙基乙基胺(5e.q)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(3e.q)进行第一步氨基酸合成，反应时间1小时；然后以N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷各10-15mL清洗树脂，得到的连接上第一个氨基酸的树脂的产率是97％。可以用三氟乙酸切割后，以HPLC峰面积计算连接氨基酸的产率。
4.第三步反应：(脱去Val的Fmoc保护基团)以15mL哌啶和DMF混合溶液(体积比哌啶：DMF＝1：3)脱去Fmoc保护，反应时间20分钟；然后以N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷各10-15mL清洗树脂，得到的脱去Val的Fmoc保护基团的树脂的产率是99％。可以用三氟乙酸切割后，以HPLC峰面积计算连接氨基酸的产率。
5.第四步反应：(连接第二个氨基酸Pro)加入Fmoc-Pro-OH(3e.q)、N,N-二异丙基乙基胺(5e.q)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(3e.q)进行第二步氨基酸合成，反应时间1小时；然后以N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷各10-15mL清洗树脂，得到的连接上第二个氨基酸的树脂的产率是95％。可以用三氟乙酸切割后，以HPLC峰面积计算连接氨基酸的产率。
6.第五步反应：(脱去Pro的Fomc保护基团)以15mL哌啶和DMF混合溶液(体积比哌啶：DMF＝1：3)脱去Fmoc保护，反应时间20分钟；然后以N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷各10-15mL清洗树脂，得到的脱去Pro的Fmoc保护基团的树脂的产率是99％。可以用三氟乙酸切割后，以HPLC峰面积计算连接氨基酸的产率。
7.第六步反应：(连接第三个氨基酸Lys)加入Fmoc-Lys(BOC)-OH(3e.q)、N,N-二异丙基乙基胺(5e.q)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(3e.q)进行第三步氨基酸合成，反应时间1小时；然后以N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷各10-15mL清洗树脂，得到的连接上第三个氨基酸的树脂的产率是93％。可以用三氟乙酸切割后，以HPLC峰面积计算连接氨基酸的产率。
8.第七部反应：(脱去Lys的Fmoc保护基团)以哌啶，DMF(1：3)脱去Fmoc保护，反应时间20分钟；然后以N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷各10-15mL清洗树脂，得到的脱去Lys的Fmoc保护基团的树脂的产率是99％。可以用三氟乙酸切割后，以HPLC峰面积计算连接氨基酸的产率。
9.加入10-15mL体积比为1:1的醋酸、二氯甲烷混合液进行羧基化反应。
10.第八步反应：(将连接好的三个氨基酸从树脂上切割下来)以10-15mL三氟乙酸：三异丙基硅烷：水＝9：8：2(v/v/v)，将肽链进行切割。反应时间4小时，得到的KPV的产率是90％。可以用三氟乙酸切割后，以HPLC峰面积计算连接氨基酸的产率。
11.切割后得到的KPV多肽溶液用10-15mL甲基第三丁基醚清洗，离心沉淀。
12.干燥沉淀物，以制备型HPLC纯化，流动相为水和乙腈，分离收率88％，纯度97％，这样总产率为65.2％。总产率为以上每一步产率的乘积，即：99％*97％*99％*95*99％*93％*99％*90％*88％＝65.2％。
13.将纯化的样品冷冻干燥，并于零下20度保存。
副产物主要是短肽PV-NH2，或者V-NH2，其中，P和V为氨基酸的单字母缩写。
同理，MEHFRWGKPV，HFRWGKPV，SYSMEHFRWGKPV也可以用此方法合成。
实施例2
1.以全固相合成法合成，使用GentaGelSRAM树脂作为合成的固相基质。
2.第一步反应：(树脂脱保护)以15mL哌啶和DMF混合溶液(体积比哌啶：DMF＝1：3)对800mgGentaGelSRAM树脂的Fmoc基团进行脱保护，反应时间20分钟；然后以DMF15mL清洗脱保护后的GentaGelSRAM树脂，得到的脱保护后的GentaGelSRAM树脂的产率是99％。
3.第二步反应：(连接第一个氨基酸Val)加入Fmoc-Val-OH(3倍摩尔量即3e.q)、ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate(5e.q)、DIEA(3e.q)进行第一步氨基酸合成，反应时间1小时；然后以DMF15mL清洗树脂，得到的连接上第一个氨基酸的树脂的产率是98％。
4.第三步反应：(脱去Val的Fmoc保护基团)以15mL哌啶和DMF混合溶液(体积比哌啶：DMF＝1：3)脱去Fmoc保护，反应时间20分钟；然后以DMF15mL清洗树脂，得到的脱去Val的Fmoc保护基团的树脂的产率是99％。
5.第四步反应：(连接第二个氨基酸Pro)加入Fmoc-Pro-OH(3e.q)、N,N-二异丙基乙基胺(5e.q)、ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate(3e.q)，DIEA(3e.q)进行第二步氨基酸合成，反应时间1小时；然后以DMF15mL清洗树脂，得到的连接上第二个氨基酸的树脂的产率是95％。
6.第五步反应：(脱去Pro的Fomc保护基团)以15mL哌啶和DMF混合溶液(体积比哌啶：DMF＝1：3)脱去Fmoc保护，反应时间20分钟；然后以DMF15mL清洗树脂，得到的脱去Pro的Fmoc保护基团的树脂的产率是99％。
7.第六步反应：(连接第三个氨基酸Lys)加入Fmoc-Lys(BOC)-OH(3e.q)、N,N-二异丙基乙基胺(5e.q)、ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate(3e.q)，DIEA(3e.q)进行第二步氨基酸合成，反应时间1小时；然后以DMF15mL清洗树脂，得到的连接上第三个氨基酸的树脂的产率是95％。
8.第七部反应：(脱去Lys的Fmoc保护基团)以哌啶，DMF(1：3)脱去Fmoc保护，反应时间20分钟；然后以DMF15mL清洗树脂，得到的脱去Lys的Fmoc保护基团的树脂的产率是99％。
9.加入10-15mL体积比为1:1的醋酸、二氯甲烷混合液进行羧基化反应。
10.第八步反应：(将连接好的三个氨基酸从树脂上切割下来)以10-15mL三氟乙酸：三异丙基硅烷：水＝9：8：2(v/v/v)，将肽链进行切割。反应时间4小时，得到的KPV的产率是92％。
11.切割后得到的多肽溶液用10-15mL甲基第三丁基醚清洗，离心沉淀。
12.干燥沉淀物，以制备型HPLC纯化，流动相为水和乙腈，分离收率88％，纯度97％，这样总产率为68.8％。以上各个产率相乘即为：99％*98％*99％*95*99％*95％*99％*92％*88％＝68.8％。
13.将纯化的样品冷冻干燥，并于零下20度保存。
同理，MEHFRWGKPV，HFRWGKPV，SYSMEHFRWGKPV也可以用此方法合成。
实施例3
1.以全固相合成法合成，使用GentaGelSRAM树脂作为合成的固相基质。
2.第一步反应：(树脂脱保护)以15mL哌啶和DMF混合溶液(体积比哌啶：DMF＝1：3)对1000mgGentaGelSRAM树脂的Fmoc基团以微波加热的方式在70℃-90℃进行脱保护，反应时间2分钟；然后以DMF15mL清洗脱保护后的GentaGelSRAM树脂，得到的脱保护后的GentaGelSRAM树脂的产率是99％。
3.第二步反应：(连接第一个氨基酸Val)加入Fmoc-Val-OH(3倍摩尔量即3e.q)、PyBOP(5e.q)、DIEA(3e.q)以微波加热的方式在70℃-90℃进行第一步氨基酸合成，反应时间5分钟；然后以DMF15mL清洗树脂，得到的连接上第一个氨基酸的树脂的产率是98％。
4.第三步反应：(脱去Val的Fmoc保护基团)以15mL哌啶和DMF混合溶液(体积比哌啶：DMF＝1：3)在微波加热的方式下70℃-90℃脱去Fmoc保护，反应时间2分钟；然后以DMF15mL清洗树脂，得到的脱去Val的Fmoc保护基团的树脂的产率是99％。
5.第四步反应：(连接第二个氨基酸Pro)加入Fmoc-Pro-OH(3e.q)、N,N-二异丙基乙基胺(5e.q)、PyBOP(3e.q)，DIEA(3e.q)以微波加热的方式在70℃-90℃进行第二步氨基酸合成，反应时间5分钟；然后以DMF15mL清洗树脂，得到的连接上第二个氨基酸的树脂的产率是95％。
6.第五步反应：(脱去Pro的Fomc保护基团)以15mL哌啶和DMF混合溶液(体积比哌啶：DMF＝1：3)，用微波加热的方式在70℃-90℃脱去Fmoc保护，反应时间2分钟；然后以DMF15mL清洗树脂，得到的脱去Pro的Fmoc保护基团的树脂的产率是99％。
7.第六步反应：(连接第三个氨基酸Lys)加入Fmoc-Lys(BOC)-OH(3e.q)、N,N-二异丙基乙基胺(5e.q)、PyBOP(3e.q)，DIEA(3e.q)以微波加热的方式在70℃-90℃进行第二步氨基酸合成，反应时间5分钟；然后以DMF15mL清洗树脂，得到的连接上第三个氨基酸的树脂的产率是96％。
8.第七部反应：(脱去Lys的Fmoc保护基团)以哌啶，DMF(1：3)用微波加热的方式在70℃-90℃脱去Fmoc保护，反应时间2分钟；然后以DMF15mL清洗树脂，得到的脱去Lys的Fmoc保护基团的树脂的产率是99％。
9.加入10-15mL体积比为1:1的醋酸、二氯甲烷混合液进行羧基化反应。
10.第八步反应：(将连接好的三个氨基酸从树脂上切割下来)以10-15mL三氟乙酸：三异丙基硅烷：水＝9：8：2(v/v/v)，将肽链进行切割。反应时间4小时，得到的KPV的产率是92％。
11.切割后得到的多肽溶液用10-15mL甲基第三丁基醚清洗，离心沉淀。
12.干燥沉淀物，以制备型HPLC纯化，流动相为水和乙腈，分离收率88％，纯度97％，这样总产率为69.5％。总产率为以上每一步产率的乘积，即：99％*98％*99％*95*99％*96％*99％*92％*88％＝69.5％。
13.将纯化的样品冷冻干燥，并于零下20度保存。
同理，MEHFRWGKPV，HFRWGKPV，SYSMEHFRWGKPV也可以用此方法合成。
实施例4
在氨基酸合成反应中用到的多肽连接试剂的组合除了实施例1的N,N-二异丙基乙基胺(5e.q)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，实施例2的ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate(5e.q)和DIEA(3e.q)，实施例3的PyBOP(5e.q)和DIEA(3e.q)外，
还可以是：
组合四、DCC和HOBt，前者3摩尔量，后者5摩尔量；
组合五、HBTU和DIEA，前者3摩尔量，后者5摩尔量；
组合六、PyClock和DIEA，前者3摩尔量，后者5摩尔量。
其余操作同实施例1、2或3。
从最终实验结果来看，多肽连接试剂PyBOP(5e.q)和DIEA(3e.q)组合得到的KPV的产率最高。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种KPV肽及其类似物的多肽制备方法，其特征在于，以全固相合成法合成，包括以下步骤：
步骤一、使用聚合物键合型聚氧乙烯-RAM树脂作为合成的固相基质并对其进行预处理；
步骤二、向树脂中加入N-芴甲氧羰基-AA-OH、多肽连接试剂进行氨基酸合成，清洗树脂，脱去N-芴甲氧羰基保护，再次清洗树脂；
步骤三、将所述步骤二中得到的肽链以醋酸、二氯甲烷进行羧基化反应得到羧基化的肽链；
步骤四、以三氟乙酸、三异丙基硅烷、水混合溶液，或者氢氟酸、三异丙基硅烷、水混合溶液，将所述步骤三得到的羧基化的肽链进行切割，切割后得到的多肽溶液用甲基第三丁基醚清洗，离心沉淀，干燥沉淀物，以制备型HPLC纯化得到KPV肽或者其类似物的多肽；
所述N-芴甲氧羰基-AA-OH中的AA表示氨基酸，所述步骤二至少重复三次再进入所述步骤三，所述N-芴甲氧羰基-AA-OH至少要以N-芴甲氧羰基-Val-OH、N-芴甲氧羰基-Pro-OH和N-芴甲氧羰基-Lys-OH形式分别出现一次；
所述多肽连接试剂包括2-肟氰乙酸乙酯、N,N'-二异丙基碳二亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺、羟基苯并三唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯、1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐、6-氯-1H-苯并三唑、N,N-二异丙基乙基胺、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯中的一种或者多种。
2.如权利要求1所述的KPV肽及其类似物的多肽制备方法，其特征在于，所述多肽连接试剂包括2-肟氰乙酸乙酯、N,N'-二异丙基碳二亚胺。
3.如权利要求1所述的KPV肽及其类似物的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤一中的预处理是指：以哌啶、二甲基甲酰胺脱去所述聚合物键合型聚氧乙烯-RAM树脂的N-芴甲氧羰基基团保护，以二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷清洗树脂。
4.如权利要求3所述的KPV肽及其类似物的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤一中的脱去聚合物键合型聚氧乙烯-RAM树脂的N-芴甲氧羰基基团保护是在加热到70℃-90℃条件下进行的。
5.如权利要求4所述的KPV肽及其类似物的多肽制备方法，其特征在于，所述加热是指用微波、水浴或者油浴加热。
6.如权利要求1所述的KPV肽及其类似物的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤二中的清洗树脂，脱去N-芴甲氧羰基保护，再清洗树脂具体是指：以二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷清洗树脂，以哌啶、二甲基甲酰胺脱去N-芴甲氧羰基基团保护，再以二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷清洗树脂。
7.如权利要求3所述的KPV肽及其类似物的多肽制备方法，其特征在于，所述脱去N-芴甲氧羰基保护是以微波加热的方式在70℃-90℃进行。
8.如权利要求1所述的KPV肽及其类似物的多肽制备方法，其特征在于，还包括步骤五、将所述步骤四得到的得到KPV肽或者其类似物的多肽冷冻干燥，于-20℃保存。
9.如权利要求1所述的KPV肽及其类似物的多肽制备方法，其特征在于，所述步骤四中HPLC的流动相为水和乙腈。
10.如权利要求1～9任一项所述的KPV肽及其类似物的多肽制备方法，其特征在于，所述其类似物的多肽包括MEHFRWGKPV、HFRWGKPV、SYSMEHFRWGKPV。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106633084A (zh) * 2016-10-14 2017-05-10 中国药科大学 一种用于构建囊泡的具有肿瘤部位酶敏感特性的高分子材料的全固相合成方法
CN107522769A (zh) * 2017-10-23 2017-12-29 希施生物科技（上海）有限公司 多肽加热固相合成方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111153966B (zh) * 2020-01-10 2023-05-16 大理大学 一种胡蜂毒肽反序类似物wvf-ⅱ及其制备方法和应用
CN111100190B (zh) * 2020-01-10 2023-04-28 大理大学 一种胡蜂毒肽反序类似物wvd-ⅱ及其制备方法和应用
CN111116714B (zh) * 2020-01-10 2023-04-25 大理大学 一种胡蜂毒肽反序类似物wvc-ⅱ及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002080858A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Lipton James M Use of kpv tripeptide for dermatological disorders
CN101407538A (zh) * 2007-12-11 2009-04-15 杭州诺泰制药技术有限公司 一种zp120的固相合成方法
US20100120699A1 (en) * 2003-01-24 2010-05-13 L'oreal Method for synthesizing kpv tripeptide diamide derivates
CN105153286A (zh) * 2015-08-25 2015-12-16 苏州强耀生物科技有限公司 一种利用微波固相合成法合成药物多肽那法瑞林的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104098656A (zh) * 2014-07-14 2014-10-15 上海苏豪逸明制药有限公司 一种西那普肽的多肽合成方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002080858A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Lipton James M Use of kpv tripeptide for dermatological disorders
US20100120699A1 (en) * 2003-01-24 2010-05-13 L'oreal Method for synthesizing kpv tripeptide diamide derivates
CN101407538A (zh) * 2007-12-11 2009-04-15 杭州诺泰制药技术有限公司 一种zp120的固相合成方法
CN105153286A (zh) * 2015-08-25 2015-12-16 苏州强耀生物科技有限公司 一种利用微波固相合成法合成药物多肽那法瑞林的方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106633084A (zh) * 2016-10-14 2017-05-10 中国药科大学 一种用于构建囊泡的具有肿瘤部位酶敏感特性的高分子材料的全固相合成方法
CN107522769A (zh) * 2017-10-23 2017-12-29 希施生物科技（上海）有限公司 多肽加热固相合成方法

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