CN105440138A - 一种长效内皮抑素融合蛋白的制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，涉及一种长效内皮抑素(Endo-CTP)融合蛋白及其制备方法和用途，本发明利用毕赤酵母表达系统高表达长效蛋白，通过基因工程手段构建人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)与人血管内皮抑素(Endostatin)融合基因的表达载体，转染毕赤酵母细胞高表达生产Endo-CTP融合蛋白，然后纯化、鉴定和生物学活性检测，制得长效内皮抑素(Endo-CTP)融合蛋白。本发明的Endo-CTP融合蛋白具有良好的生物活性，且获得的蛋白稳定性好、半衰期长，可用于制备治疗非小细胞肺癌、乳腺癌等肿瘤的药物。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及长效融合蛋白药物，具体涉及一种长效内皮抑素(Endo-CTP)融合蛋白及其制备方法和用途，尤其是长效融合蛋白药物人血管内皮抑素与人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)的融合蛋白及其制备方法和用途
背景技术
现有技术公开了内皮抑素是人胶原蛋白18的C末端片段，由184个氨基酸残基组成，其分子量20kDa，它是血管生成的特异性抑制剂。目前已有超过千余篇文献报道了内皮抑素可以通过抑制血管内皮细胞的增殖及血管生成作用来抗肿瘤。在体内，内皮抑素由肝脏合成。内皮抑素在抑制血管内皮细胞的增殖及迁移方面表现良好，并且，在几种肿瘤模型的研究中证实内皮抑素的使用不会存在耐药性。目前，E.coli和酵母表达系统是两种主要的重组内皮抑素生产的表达系统。然而，E.coli表达的重组内皮抑素蛋白折叠错误导致其溶解性很低，这大大限制了其在临床上的应用；此外，重组内皮抑素临床效果不佳，这主要是由其半衰期较短引起的；重组内皮抑素的半衰期不足1小时，因此，延长其半衰期将会改善其在临床上的应用。融合蛋白技术是延长蛋白药物半衰期的一种重要手段。之前的报道中，IgG的Fc区和人血清白蛋白都可以显著延长重组内皮抑素的半衰期，通常蛋白的PEG化或融合Fc、血清白蛋白会降低蛋白活性。
近来，人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)被越来越多的用于延长蛋白药物的半衰期。研究显示，人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)是一段富含可糖基化氨基酸的肽段，人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)上氨基酸残基的糖基化会形成空间上的障碍，阻碍蛋白药物被蛋白酶降解；此外，人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)对蛋白药物的分泌表达、与受体的结合及生物活性几乎没有任何影响。
发明内容：
本发明的目的是提供一种新的长效融合蛋白药物，具体涉及一种长效内皮抑素(Endo-CTP)融合蛋白，尤其是长效融合蛋白药物人血管内皮抑素与人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)的融合蛋白及其制备方法和用途，本发明制得的内皮抑素在体内能延长其半衰期。
本发明的长效内皮抑素(Endo-CTP)融合蛋白，包括与人内皮抑素至少85％序列同源的第一区和与人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)至少85％序列同源的第二区。所述与人内皮抑素同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人内皮抑素同源的第一区位于融合蛋白的C末端，所述与人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)同源的第二区位于融合蛋白的N末端，中间不加任何连接肽。
本发明中，所述融合蛋白的第二区由人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)组成。
本发明中，所述融合蛋白包括去人内皮抑素氨基酸残基序列相同的第一区和与人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)氨基酸序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。
本发明中，所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
本发明提供了利用毕赤酵母表达系统高表达长效蛋白的制备方法，该方法中，主要通过基因工程技术构建人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)与人血管内皮抑素(Endostatin)融合基因的表达载体，转染毕赤酵母细胞高表达生产Endo-CTP融合蛋白，然后纯化、鉴定和生物学活性检测，获得Endo-CTP融合蛋白。
更具体的，本发明的制备人血管内皮抑素与人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)的融合蛋白的方法，其特征在于，其包括构建毕赤酵母表达系统以及表达与纯化融合蛋白；该方法中利用全基因合成技术合成人内皮抑素基因片段；以及利用全基因合成技术合成人绒毛膜促性腺激素β亚单位基因片段，中间不加入任何连接肽将两者连接，将基因片段插入到pPIC9k载体上并转入到宿主表达系统中进行表达。
所述的方法中，宿主表达系统是酵母、昆虫细胞，哺乳动物细胞或植物细胞等真核表达系统，本发明的实施例中优选的宿主表达系统是酵母，更优选的是毕赤酵母，最优选的是毕赤酵母GS115。
本发明的实施例中，通过下述步骤制备所述的融合蛋白：
1)构建毕赤酵母表达系统
Endo-CTP基因由Genescript公司合成，其基因序列为：
catagccatcgtgatttccagccggtgctccacctggttgcgctcaacagccccctgtcaggcggcatgcggggcatccgcggggccgacttccagtgcttccagcaggcgcgggccgtggggctggcgggcaccttccgcgccttcctgtcctcgcgcctgcaggacctgtacagcatcgtgcgccgtgccgaccgcgcagccgtgcccatcgtcaacctcaaggacgagctgctgtttcccagctgggaggctctgttctcaggctctgagggtccgctgaagcccggggcacgcatcttctcctttgacggcaaggacgtcctgaggcaccccacctggccccagaagagcgtgtggcatggctcggaccccaacgggcgcaggctgaccgagagctactgtgagacgtggcggacggaggctccctcggccacgggccaggcctcctcgctgctggggggcaggctcctggggcagagtgccgcgagctgccatcacgcctacatcgtgctctgcattgagaacagcttcatgactgcctccaagtcttcctcaaaggcccctccccccagccttccaagcccatcccgactcccggggccctcggacaccccgatcctcccgcagtcttcctcaaaggcccctccccccagccttccaagcccatcccgactcccggggccctcggacaccccgatcctcccgcagtaa；
其氨基酸序列为：
HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGAFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK；
将所述基因片段插入到pUC57载体上，并转化Top10大肠杆菌感受态细胞，转化物涂布含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃过夜培养；挑取单菌落，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；提取质粒，质粒和pPIC9K载体分别用XhoI和NotI限制性内切酶于37℃酶切过夜；用琼脂糖凝胶电泳纯化，并用胶回收试剂盒分别将目的基因片段和pPIC9K片段回收；用T4DNA连接酶将回收到的目的基因片段和pPIC9K片段于16℃连接过夜；连接产物转化Top10大肠杆菌感受态细胞，转化物涂布含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃过夜培养；挑取多个单菌落，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；提取质粒，并用XhoI和NotI限制性内切酶于37℃酶切过夜后，用琼脂糖凝胶电泳的方法检测目的基因片段；取阳性克隆37℃过夜培养；挑取单菌落，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养并提取质粒，质粒经SacI酶线性化并回收后，电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，在含有100μg/mlG418的YPD琼脂平板涂布，30℃过夜培养；挑取单菌落，接种于BMGY液体培养基并在30℃培养48h后，连续添加1％的甲醇诱导4天后，收取培养基上清，用westernblot的方法鉴定产物表达(如图2所示)，将阳性克隆用YPD液体培养基扩增培养后用含50％甘油的冻存液-70℃保存；
2)融合蛋白的表达与纯化
取酵母阳性克隆菌株接种于100ml液体YPD培养基中，180rpm摇床培养24h后转接至2L含1％甘油的BMGY培养基中，180rpm摇床培养36h；4℃静置过夜待菌体沉淀完全后，弃去上清，并再添加含1％甲醇的BMMY培养基，继续在摇床上培养并每24h添加1％的甲醇，连续诱导96h；
诱导完成后，发酵液于4000rpm离心10min，弃菌体，上清于8000rpm离心10min，得澄清的上清液，上清液用10kD超滤膜(GE公司)20倍超滤浓缩，并等体积置换成pH＝7.4的30mMTris-HCl缓冲液；
将置换后的产物用SPSepharoseFastFlow阳离子交换层析柱从0mMNaCl到500mMNaCl进行梯度洗脱，收集含目的蛋白的洗脱峰，从1MNaCl30mMTris-HCl(pH＝7.4)的缓冲液到30mMTris-HCl(pH＝7.4)的缓冲液进行梯度洗脱，收集目的产物洗脱峰；纯化结果如图3所示。
本发明的Endo-CTP融合蛋白具有良好的生物活性，且获得的蛋白稳定性好、半衰期长，可用于制备治疗非小细胞肺癌、乳腺癌等肿瘤的药物。
附图说明
图1CTP长效内皮抑素概述图。
图2Endo-CTP的westernblot鉴定，其中1，2为Endo-CTP发酵液；3，4为endostatin标品。
图3Endo-CTP的纯化SDS-PAGE鉴定，其中，
1为Marker；2，3为Endo-CTP发酵液；4，5为纯化后的Endo-CTP；；6为endostatin标品。
图4Endo-CTP对人血管内皮细胞增殖的影响。
图5Endo-CTP对人血管内皮细胞增殖的影响。
图6Endo-CTP诱导人血管内皮细胞的凋亡western鉴定。
图7Endo-CTP诱导人血管内皮细胞的凋亡AnnexinV/PI染色鉴定。
图8融合蛋白对HUVEC细胞凋亡的影响。
图9融合蛋白对HUVEC细胞迁移的影响。
图10Endo-CTP抑制HUVEC细胞迁移实验统计。
图11Endo-CTP的药代动力学分析。
具体实施方式
实施例1构建毕赤酵母表达系统
Endo-CTP基因由Genescript公司合成，基因片段插入到pUC57载体上，并转化Top10大肠杆菌感受态细胞，转化物涂布含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃过夜培养；挑取单菌落，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；提取质粒，质粒和pPIC9K载体分别用XhoI和NotI限制性内切酶于37℃酶切过夜；用琼脂糖凝胶电泳纯化，并用胶回收试剂盒分别将目的基因片段和pPIC9K片段回收；用T4DNA连接酶将回收到的目的基因片段和pPIC9K片段于16℃连接过夜；连接产物转化Top10大肠杆菌感受态细胞，转化物涂布含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃过夜培养；挑取多个单菌落，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；提取质粒，并用XhoI和NotI限制性内切酶于37℃酶切过夜后，用琼脂糖凝胶电泳的方法检测目的基因片段。取阳性克隆37℃过夜培养；挑取单菌落，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养并提取质粒，质粒经SacI酶线性化并回收后，电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，在含有100μg/mlG418的YPD琼脂平板涂布，30℃过夜培养；挑取单菌落，接种于BMGY液体培养基并在30℃培养48h后，连续添加1％的甲醇诱导4天后，收取培养基上清，用westernblot的方法鉴定产物表达(如图2所示)，将阳性克隆用YPD液体培养基扩增培养后用含50％甘油的冻存液-70℃保存。
实施例2融合蛋白的表达与纯化
取酵母阳性克隆菌株接种于100ml液体YPD培养基中，180rpm摇床培养24h后转接至2L含1％甘油的BMGY培养基中，180rpm摇床培养36h。4℃静置过夜待菌体沉淀完全后，倒去上清，并再添加含1％甲醇的BMMY培养基，继续在摇床上培养并每24h添加1％的甲醇，连续诱导96h；
诱导完成后，发酵液于4000rpm离心10min，弃菌体，上清于8000rpm离心10min，得到澄清的上清液。上清液用GE公司的10kD超滤膜20倍超滤浓缩，并等体积置换成pH＝7.4的30mMTris-HCl缓冲液；
将置换后的产物用SPSepharoseFastFlow阳离子交换层析柱从0mMNaCl到500mMNaCl进行梯度洗脱，收集含目的蛋白的洗脱峰，从1MNaCl30mMTris-HCl(pH＝7.4)的缓冲液到30mMTris-HCl(pH＝7.4)的缓冲液进行梯度洗脱，收集目的产物洗脱峰。纯化结果如图3所示。
实施例2：融合蛋白对HUVEC细胞生长的影响
人内皮细胞HUVEC细胞(购买自中科院生化所细胞库)，添加10％胎牛血清，10μg/mlECGF，50μg/ml肝素，2mMof谷氨酰胺，100unites/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中培养；
HUVEC细胞以1＊103/孔的密度种于96孔板中，培养24h后，将培养基更换成添加2％胎牛血清的RPMI1640培养基，用2μg/ml的β-FGF和不同浓度的Endo-CTP处理细胞48h，或用IC50浓度Endo-CTP处理细胞48h，，72h，96h；MTT法检测Endo-CTP对HUVEC细胞生长的抑制作用，每个浓度或时间点均重复五次，结果如图4、图5所示。
实施例3：融合蛋白对HUVEC细胞凋亡的影响
HUVEC细胞以1＊104个/ml的密度种于六孔板中，培养24h后，将培养基更换成添加2％胎牛血清的RPMI1640培养基；用2μg/ml的β-FGF和5μg/ml，10μg/ml，和20μg/ml的Endo-CTP处理细胞48h；用westernblot法检测HUVEC细胞PARP蛋白的表达情况，用AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂染色后用流式细胞仪分析细胞凋亡情况，结果如图6、图7、图8所示。
实施例4：融合蛋白对HUVEC细胞迁移的影响
将1＊104个HUVEC细胞悬浮于100μlRPMI1640培养基中(含0.5％FBS及5μg/ml，10μg/ml和20μg/ml的Endo-CTP)并加入到24孔Transwell板(Corning，NY，USA)的上层小室中，下层添加600μl含25ng/mlβ-FGF作为激动剂的RPMI1640培养基，37℃培养12h后，移除上层小室中的培养基，PBS洗两次，用90％的乙醇固定30min，0.1％的结晶紫染色20min，用棉签擦掉小室底部上层的细胞，显微镜观察小室底部下层的细胞，结果如图9、图10所示。
实施例5：Endo-CTP的药代动力学分析
实验动物为体重约180g的SD雌性大鼠，按1mg/只的剂量尾静脉给药，给药0.5h，1h，6h，12h，24h，48h后眼球取血，血样于3000rpm离心15min后取血清于-70℃保存，用Elisa的方法检测血浆中内皮抑素的浓度，结果如图11所示。
上述实验表明，本发明的Endo-CTP融合蛋白具有良好的生物活性，且所述蛋白稳定性好、半衰期长，可进一步用于制备治疗非小细胞肺癌、乳腺癌等肿瘤的药物。
Claims (10)
1.一种长效内皮抑素融合蛋白，其特征在于，其包括与人内皮抑素至少85％序列同源的第一区和与人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)至少85％序列同源的第二区。
2.按权利要求1所述的长效内皮抑素融合蛋白，其特征在于，所述与人内皮抑素同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人内皮抑素同源的第一区位于融合蛋白的C末端，所述与人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)同源的第二区位于融合蛋白的N末端，中间不加任何连接肽。
3.按权利要求1或2所述的长效内皮抑素融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的第二区由人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)组成。
4.按权利要求1或2所述的长效内皮抑素融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括去人内皮抑素氨基酸残基序列相同的第一区和与人绒毛膜促性腺激素β亚单位(CTP)氨基酸序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。
5.按权利要求4所述的长效内皮抑素融合蛋白，其特征在于，所述的功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
6.制备权利要求1所述的长效内皮抑素融合蛋白的方法，其特征在于，利用毕赤酵母表达系统高表达长效蛋白，其中，利用全基因合成技术合成人内皮抑素基因片段；以及利用全基因合成技术合成人绒毛膜促性腺激素β亚单位基因片段，中间不加入任何连接肽将两者连接，将基因片段插入到pPIC9k载体上并转入到宿主表达系统中进行表达，获得长效内皮抑素Endo-CTP融合蛋白。
7.按权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的方法中，宿主表达系统是真核表达系统，选自酵母、昆虫细胞，哺乳动物细胞或植物细胞。
8.按权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的方法中，宿主表达系统是酵母。
9.按权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的方法中，宿主表达系统是毕赤酵母。
10.按权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的方法中，宿主表达系统是毕赤酵母GS115。
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