CN105432466A - 一种海桐体细胞胚胎发生和植株再生的方法 - Google Patents
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Abstract
一种海桐体细胞胚胎发生和植株再生的方法，包括如下步骤：(1)取海桐新鲜种子为外植体，进行消毒；(2)将消毒外植体置于MS基本培养基中诱导无菌试管苗；(3)将所述无菌试管苗的子叶置于MS胚性愈伤诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织；(4)将所述胚性愈伤组织置于MS胚状体萌发培养基中，诱导再生植株；(5)将所述再生植株置于MS壮苗培养基中培养，获得完整小苗；(6)将所述完整小苗组培瓶瓶盖打开，室温炼苗4-7d，取出幼苗并洗净根部培养基，移栽到浇透水的蛭石基质中，室温生长一个月后，移栽到大田，每天早晚各喷雾一次。采用本发明能够在短时间内获得大量、优质海桐种苗，移栽成活率在95％以上，有效解决规模化育苗问题，也为实现海桐转基因研究、生物技术育种等提供了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物繁殖方法，特别是一种海桐体细胞胚胎发生和植株再生方法。
背景技术
海桐(Pittosporumtobira(Thunb.)Ait))主要分布于长江流域以南各省区，海桐属常绿灌木或小乔木，对二氧化硫、氯气、氟化氢等有害气体有较强抗性，是国内外首次发现各部位均具有较强化感作用的园林绿化植物。海桐枝叶，异名七里香叶(台湾)，具有解毒、杀虫的功能，主要用于治疗疥疮、肿毒(国家中医药管理局《中华本草》编委会编，中华本草4，上海科学技术出版社，1999：65-66)。
现代研究表明，海桐的根、茎、叶、花、果实和种子中均含有类胡萝卜素、萜类等复杂化学成分，表现抗菌、抗肿瘤、杀虫、神经保护、除草等多种生物活性和很高的药用价值，海桐具有保护谷氨酸诱导的神经毒性的活性，其枝叶可以止血、解毒、抗菌，根可以散瘀止痛、祛风活络，果实总皂苷能抑制肿瘤细胞的增生，种子具有固精、涩肠、保护心血管系统、预防冠心病等功效，因此，海桐具有医药工业、食品(保健型食用油)、日用化妆品等广泛开发前景，其种植需求量日益增长(孙卓，刘红星与黄初升，海桐植物化学成分以及生物活性的研究，化工技术与开发，2014(01)，22-26)。
海桐的传统繁育方法为压条、扦插和播种，但压条繁殖既破坏树形又难以大量繁殖，扦插繁殖的繁殖系数受生根效率的影响，且根系不发达，株型不丰满；经长期栽培，海桐雄蕊常表现退化而不育，结实率低，播种种源有限，且受生理休眠影响，海桐种子在自然条件下难以萌发，种子成苗率低(米银法，宋乾江与李巍，不同浓度NAA和IBA处理对海桐扦插生根的影响，山东农业科学，2011(08)：44-47；)，(唐安军与柳建平，海桐种子的休眠解除与萌发，种子，2011(05)：46-49；)，(http://frps.eflora.cn/frps/Pittosporum：中国植物志第35(2)卷，海桐花科海桐花属3，海桐)。
发明内容
本发明的目的是提供一种海桐体细胞胚胎发生和植株再生的方法，能够解决海桐种子在自然条件下难以萌发，种子成苗率低的问题。
本发明的技术方案是：一种海桐体细胞胚胎发生和植株再生的方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：取海桐新鲜种子作为外植体，依次用2v/v％洗洁精水溶液浸泡5min，线状自来水冲洗15-30min，添加了2-3滴吐温-20的0.1v/v％升汞100mL消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中，无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
(2)外植体诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于超净工作台内，接种到MS培养基中，在培养温度为23-27℃，黑暗的条件下培养20d得到无菌试管苗，其中，MS培养基中添加GA30.1-0.5mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8；
(3)胚性愈伤组织的诱导：将步骤(2)中得到的无菌试管苗的子叶置于MS胚性伤组织诱导培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10h/d的条件下培养30d，得到胚性愈伤组织，其中，MS胚性伤组织诱导培养基添加2，4-D0.5-2.5mg/L、TDZ0.5-2.0、CH200mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值5.8；
(4)胚状体诱导与萌发：将步骤(3)中得到胚性愈伤组织置于MS萌发培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间8-10h/d的条件下培养30d，得到体细胞胚胎再生小植株，其中，MS萌发培养基中中添加蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8；
(5)壮苗培养：将步骤(4)中得到的体细胞胚胎再生小植株置于MS壮苗培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间8-10h/d的条件下培养30d，得到完整自根苗，其中，MS壮苗培养基中添加6-BA0.1-0.5mg/L、NAA0.05-0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值5.8；
(6)炼苗移栽：将所述完整自根苗在温度为25℃的室内炼苗4-7d，待培养基表面形成角质后，取出幼苗，洗净根部培养基，移栽到灭菌蛭石的基质中，生长一个月后移栽到大田。
本发明的突出优点在于：海桐体细胞胚胎发生和植株再生方法技术方法简便，从外植体到植株再生，炼苗移栽整个培养周期打破传统组培繁殖方式，将芽诱导和得根一步完成，缩短培养周期，提高繁殖系数，移栽成活率高，出苗整齐一致，便于管理。
实施例1
本发明所述的海桐体细胞胚胎发生和植株再生方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：取海桐新鲜种子作为外植体，依次用2v/v％洗洁精水溶液浸泡5min，线状自来水冲洗15-30min，添加了2-3滴吐温-20的0.1v/v％升汞100mL消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体。其中，无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
(2)外植体诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于超净工作台内，接种到MS培养基中，在培养温度为23-27℃，黑暗条件下培养20d得到无菌试管苗。其中，MS培养基中添加GA30.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8。
(3)胚性愈伤组织的诱导：将步骤(2)中得到的无菌试管苗的子叶，在超净台内用解剖刀划伤子叶，平贴于MS胚性愈伤诱导培养基上，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10h/d的条件下培养30d，得到胚性愈伤组织，其中，MS胚性愈伤组织诱导培养基中添加2，4-D0.5mg/L、TDZ0.5mg/L、CH200mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值5.8；
(4)胚状体诱导与萌发：将步骤(3)中得到胚性愈伤置于MS萌发培养基中在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间8-10h/d的条件下培养30d，得到体细胞胚胎再生小植株。其中，MS萌发培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8。
(5)壮苗培养：将步骤(4)中得到的体细胞胚胎再生小植株置于MS壮苗培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间8-10h/d的条件下培养30d，得到完整自根苗。其中，MS壮苗培养基中添加6-BA0.5mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8。
(6)炼苗移栽：将所述完整自根苗在室温下炼苗4-7d，待培养基表面形成角质后，取出幼苗，洗净根部培养基，移栽到灭菌蛭石的基质中，生长一个月后，移栽到大田。每天早晚各喷雾一次。
实施例2
(1)外植体的选择与消毒：取海桐新鲜种子作为外植体，依次用2v/v％洗洁精水溶液浸泡5min，线状自来水冲洗15-30min，添加了2-3滴吐温-20的0.1v/v％升汞100mL消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体。其中，无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
(2)外植体诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于超净工作台内，接种到MS培养基中，在培养温度为23-27℃，黑暗条件下培养20d得到无菌试管苗。其中，MS培养基中添加GA30.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8。
(3)胚性愈伤组织的诱导：将步骤(2)中得到的无菌试管苗的子叶，在超净台内用解剖刀划伤子叶，平贴于MS胚性愈伤诱导培养基上，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10h/d的条件下培养30d，得到胚性愈伤组织，其中，MS胚性愈伤组织诱导培养基中添加2，4-D1.0mg/L、TDZ2.0mg/L、CH200mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值5.8；
(4)胚状体诱导与萌发：将步骤(3)中得到胚性愈伤置于MS萌发培养基中在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间8-10h/d的条件下培养30d，得到体细胞胚胎再生小植株。其中，MS萌发培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8。
(5)壮苗培养：将步骤(4)中得到的体细胞胚胎再生小植株置于MS壮苗培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间8-10h/d的条件下培养30d，得到完整自根苗。其中，MS壮苗培养基中添加6-BA0.5mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8。
(6)炼苗移栽：将所述完整自根苗在室温下炼苗4-7d，待培养基表面形成角质后，取出幼苗，洗净根部培养基，移栽到灭菌蛭石的基质中，生长一个月后，移栽到大田。每天早晚各喷雾一次。
实施例3
(1)外植体的选择与消毒：取海桐新鲜种子作为外植体，依次用2v/v％洗洁精水溶液浸泡5min，线状自来水冲洗15-30min，添加了2-3滴吐温-20的0.1v/v％升汞100mL消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体。其中，无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
(2)外植体诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于超净工作台内，接种到MS培养基中，在培养温度为23-27℃，黑暗条件下培养20d得到无菌试管苗。其中，MS培养基中添加GA30.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8。
(3)胚性愈伤组织的诱导：将步骤(2)中得到的无菌试管苗的子叶，在超净台内用解剖刀划伤子叶，平贴于MS胚性愈伤诱导培养基上，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10h/d的条件下培养30d，得到胚性愈伤组织，其中，MS胚性愈伤组织诱导培养基中添加2，4-D1.5mg/L、TDZ1.5mg/L、CH200mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值5.8；
(4)胚状体诱导与萌发：将步骤(3)中得到胚性愈伤置于MS萌发培养基中在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间8-10h/d的条件下培养30d，得到体细胞胚胎再生小植株。其中，MS萌发培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8。
(5)壮苗培养：将步骤(4)中得到的体细胞胚胎再生小植株置于MS壮苗培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间8-10h/d的条件下培养30d，得到完整自根苗。其中，MS壮苗培养基中添加6-BA0.5mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8。
(6)炼苗移栽：将所述完整自根苗在室温下炼苗4-7d，待培养基表面形成角质后，取出幼苗，洗净根部培养基，移栽到灭菌蛭石的基质中，生长一个月后，移栽到大田。每天早晚各喷雾一次。
实施例4
本发明所述的海桐体细胞胚胎发生和植株再生方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：取海桐新鲜种子作为外植体，依次用2v/v％洗洁精水溶液浸泡5min，线状自来水冲洗15-30min，添加了2-3滴吐温-20的0.1v/v％升汞100mL消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体。其中，无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
(2)外植体诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于超净工作台内，接种到MS培养基中，在培养温度为23-27℃，黑暗条件下培养20d得到无菌试管苗。其中，MS培养基中添加GA30.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8。
(3)胚性愈伤组织的诱导：将步骤(2)中得到的无菌试管苗的子叶，在超净台内用解剖刀划伤子叶，平贴于MS胚性愈伤诱导培养基上，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10h/d的条件下培养30d，得到胚性愈伤组织，其中，MS胚性愈伤组织诱导培养基中添加2，4-D2.5mg/L、TDZ0.5mg/L、CH200mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值5.8；
(4)胚状体诱导与萌发：将步骤(3)中得到胚性愈伤置于MS萌发培养基中在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间8-10h/d的条件下培养30d，得到体细胞胚胎再生小植株。其中，MS萌发培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8。
(5)壮苗培养：将步骤(4)中得到的体细胞胚胎再生小植株置于MS壮苗培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间8-10h/d的条件下培养30d，得到完整自根苗。其中，MS壮苗培养基中添加6-BA0.5mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8。
(6)炼苗移栽：将所述完整自根苗在室温下炼苗4-7d，待培养基表面形成角质后，取出幼苗，洗净根部培养基，移栽到灭菌蛭石的基质中，生长一个月后，移栽到大田。每天早晚各喷雾一次。
Claims (1)
1.一种海桐体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：取海桐新鲜种子作为外植体，依次用2v/v％洗洁精水溶液浸泡5min，线状自来水冲洗15-30min，添加了2-3滴吐温-20的0.1v/v％升汞100mL消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中，无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
(2)外植体诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体置于超净工作台内，接种到MS培养基中，在培养温度为23-27℃，黑暗的条件下培养20d得到无菌试管苗，其中，MS培养基中添加GA30.1-0.5mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8；
3)胚性愈伤组织的诱导：将步骤(2)中得到的无菌试管苗的子叶置于MS胚性伤组织诱导培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10h/d的条件下培养30d，得到胚性愈伤组织，其中，MS胚性伤组织诱导培养基添加2，4-D0.5-2.5mg/L、TDZ0.5-2.0、CH200mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值5.8；
(4)胚状体诱导与萌发：将步骤(3)中得到胚性愈伤组织置于MS萌发培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间8-10h/d的条件下培养30d，得到体细胞胚胎再生小植株，其中，MS萌发培养基中中添加蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值为5.8；
(5)壮苗培养：将步骤(4)中得到的体细胞胚胎再生小植株置于MS壮苗培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间8-10h/d的条件下培养30d，得到完整自根苗，其中，MS壮苗培养基中添加6-BA0.1-0.5mg/L、NAA0.05-0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值5.8；
(6)炼苗移栽：将所述完整自根苗在温度为25℃的室内炼苗4-7d，待培养基表面形成角质后，取出幼苗，洗净根部培养基，移栽到灭菌蛭石的基质中，生长一个月后移栽到大田。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Granted publication date: 20170815 Termination date: 20191113 |