CN101702998B - 一种珊瑚草种苗组织培养的繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种珊瑚草种苗组织培养的繁殖方法，旨在提供一种繁殖速度快、成本低的珊瑚草种苗组织培养的繁殖方法。该繁殖方法包括以下步骤：(a)芽的诱导和分化步骤；(b)无菌苗的增殖培养步骤；(c)无菌苗的驯化移栽步骤，本发明采用加有0.5～1.5mg/L的6-苄氨基嘌呤(6BA)和0.05～0.15mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的MS培养基，可以有效促进珊瑚草叶片快速分化出不定芽；采用0.3～1mg/L的6-苄氨基嘌呤(6BA)，糖为3％的MS培养基中增殖培养，不定芽能旺盛增殖；最后增殖苗置于0.8～1.5mg/L的3吲哚丁酸(3IBA)，糖3％的MS培养基中培养，增殖苗四周即可快速生根。本发明可广泛应用于珊瑚草种苗组织培养领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种珊瑚草种苗组织培养的繁殖方法。
背景技术
珊瑚草又名缠百合，为鸭跖草科植物竹叶吉祥草的花，竹叶吉祥草(《植物名实图考》)攀援状草本，长0.5～1米，单叶互生，狭披针形，长5～10厘米，宽1.2～1.5厘米，先端长渐尖，基部阔楔形，全缘；叶柄长3～6毫米，叶鞘抱茎。花紫色，杂性，为顶生的圆锥花序，雄花多数，生于花序的上部；萼片3，披针状卵形；花瓣线形，与萼等长；雄蕊6，基部有须毛；雌花少数，生于花序的基部，大于雄花，包藏于佛焰苞状的叶腋内，有不发育雄蕊3；子房圆柱状，花柱圆柱状，柱头3裂。蒴果纸质，椭圆球形3瓣裂。种子5～7粒，近多角形，淡棕色，排成2裂。生长于山坡阴湿处。分布云南、广西和湖南。珊瑚草具有调和气血，止痛，治疗月经不调，神经性头痛以及便秘，有排毒等功效。以前采用分株进行繁殖的方法，一棵珊瑚草一年只能繁殖出6～8棵，因其繁殖系数低，远不能满足市场的需要。因此，目前珊瑚草的繁殖方法大多采用组织培养法，它是一种利用植物细胞的全能性，离体培养植物组织小块，进行植物无性快繁的工厂化育苗技术，具体工艺是：切下珊瑚草的幼嫩叶片，先诱导出愈伤组织，再分化出不定芽，再培育成可以移栽驯化的壮苗。一般情况下此过程需要四个月以上，而且需要较高的生产成本(包括培养基成本和培养条件耗费)等，所以现有的珊瑚草种苗繁殖技术仍存在以下缺陷：繁殖速度较慢，成本较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种繁殖速度快、成本低的珊瑚草种苗组织培养的繁殖方法。
本发明所采用的技术方案是：本发明包括以下步骤：
(a)芽的诱导和分化步骤：取珊瑚草的嫩叶作为外植体，将所述外植体加入培养基进行芽分化培养，所述培养基为加有0.5～1.5mg/L的6-苄氨基嘌呤(6BA)和0.05～0.15mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的MS培养基，培养温度为24～26度，光照强度为1800～2000lux，光照时间为每天10～14小时；
(b)无菌苗的增殖培养步骤：取所述分化出的不定芽置于0.3～1mg/L的6-苄氨基嘌呤(6BA)，糖为3％的MS培养基中增殖培养，分化出增殖苗，培养温度为24～26度，光照强度为2000～3000lux，光照时间为每天10～14小时；
(c)无菌苗的驯化移栽步骤：将所述增殖苗置于培养基中进行生根培养，培养基为0.8～1.5mg/L的3吲哚丁酸，糖3％的MS培养基，培养四周且在无菌苗长出1.5cm的根后，在栽前4天打开瓶盖使无菌苗逐步适应外界条件，洗净根部后移栽入泥炭土和珍珠岩的基质内，培养温度为18～28度，弱光条件。
所述外植体来源于开放带菌环境的活体植物，需经消毒处理再作为外植体，消毒处理是指所述活体植物先用75％的酒精处理，再在0.1％的升汞溶液中浸泡后取出，然后用无菌水冲洗。
所述酒精处理时间为8～12秒，所述升汞溶液浸泡时间为8～12分钟，所述无菌水冲洗4～5次。
本发明的有益效果是：本发明采用加有0.5～1.5mg/L的6-苄氨基嘌呤(6BA)和0.05～0.15mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的MS培养基，所以可以有效促进珊瑚草叶片快速分化出不定芽；又由于本发明采用0.3～1mg/L的6-苄氨基嘌呤(6BA)，糖为3％的MS培养基中增殖培养，所以不定芽能旺盛增殖；最后增殖苗置于0.8～1.5mg/L的3吲哚丁酸(3IBA)，糖3％的MS培养基中培养，所以增殖苗四周即可快速生根。本发明通过直接诱导出分化芽，分化芽又直接快速增殖减少了愈伤组织的诱导这一步骤，简化培养条件或培养方式等工艺，可以降低生产成本，提高商品化生产的效率和利润，因此本发明珊瑚草种苗组织培养的繁殖方法繁殖速度快，成本低。
具体实施方式
实施例一：
(一)芽的诱导和分化步骤：取珊瑚草刚展开一天的嫩叶作为外植体；将所述叶片先用75％的酒精处理8秒，再在0.1％的升汞溶液中浸泡8分钟取出，然后用无菌水冲洗4～5次；取经升汞消毒后的所述叶片切成1cm的小块，放入加有0.5mg/L的6苄氨基嘌呤(6BA)和0.05mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的MS培养基中，所述叶片放入培养基中时保持叶片切块的叶面向上；培养温度为24～26度，光照1800lux，光照时间每天10小时，培养6周后，可见叶片切口处分化出不定芽。
(二)无菌苗的增殖培养：取分化出的不定芽置于0.3mg/L的6苄氨基嘌呤(6BA)，糖为3％的MS培养基中，培养四周后，每个分化芽可多分化出3～4个新的植株；培养温度要求：24～26度，光照2000lux，每天光照10小时。
(三)无菌苗的驯化移栽：所述增殖苗置于0.8mg/L的3吲哚丁酸(3IBA)，糖3％的MS培养基中培养四周后，无菌苗长出1.5cm的根后，可进行移栽驯化；栽前4天打开瓶盖使无菌苗逐步适应外界条件；洗净所述无菌苗根部培养基并移栽入泥炭土和珍珠岩比例为4∶1的基质内；保持温度为18～28度，弱光条件，移栽后的第一周用无纺布覆盖，控制湿度85～95％，保持叶表面水雾不干。MS培养基组成元素包括大量元素、微量元素、有机成分，大量元素：NH4NO3 1650mg/L、KNO3 1900mg/L、CaCl 2·2H2O 440mg/L、MgSO4·7H2O370mg/L、KH2PO4 1700mg/L。
微量元素：KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MnO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、FeSO4·7H2O(27.8)+Na2-EDTA·2H2O(37.3)mg/L。
有机成分：肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5mg/L、盐酸硫胺素(维生素B1)0.5mg/L、甘氨酸2mg/L。
实施例二：
(一)芽的诱导和分化步骤：取珊瑚草刚展开两天的嫩叶作为外植体；将所述叶片先用75％的酒精处理10秒，再在0.1％的升汞溶液中浸泡10分钟取出，然后用无菌水冲洗4～5次；取经升汞消毒后的所述叶片切成1cm的小块，放入加有1mg/L的6苄氨基嘌呤(6BA)和0.1mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的MS培养基中，所述叶片放入培养基中时保持叶片切块的叶面向上；培养温度为24～26度，光照2000lux，光照时间每天12小时，培养4周后，可见叶片切口处分化出不定芽。
(二)无菌苗的增殖培养：取分化出的不定芽置于1mg/L的6苄氨基嘌呤(6BA)，糖为3％的MS培养基中，培养四周后，每个分化芽可多分化出3～4个新的植株；培养温度要求：24～26度，光照3000lux，每天光照10小时。
(三)无菌苗的驯化移栽：所述增殖苗置于1mg/L的3吲哚丁酸(3IBA)，糖3％的MS培养基中培养四周后，无菌苗长出1.5cm的根后，可进行移栽驯化；栽前4天打开瓶盖使无菌苗逐步适应外界条件；洗净所述无菌苗根部培养基并移栽入泥炭土和珍珠岩比例为4∶1的基质内；保持温度为18～28度，弱光条件，移栽后的第一周用无纺布覆盖，控制湿度85～95％，保持叶表面水雾不干。MS培养基组成元素与实施例一相同。
实施例三：
(一)芽的诱导和分化步骤：取珊瑚草刚展开两天的嫩叶作为外植体；将所述叶片先用75％的酒精处理12秒，再在0.1％的升汞溶液中浸泡12分钟取出，然后用无菌水冲洗5次；取经升汞消毒后的所述叶片切成1cm的小块，放入加有1.5mg/L的6苄氨基嘌呤(6BA)和0.15mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的MS培养基中，所述叶片放入培养基中时保持叶片切块的叶面向上；培养温度为24～26度，光照2000lux，光照时间每天14小时，培养4周后，可见叶片切口处分化出不定芽。
(二)无菌苗的增殖培养：取分化出的不定芽置于1mg/L的6苄氨基嘌呤(6BA)，糖为3％的MS培养基中，培养四周后，每个分化芽可多分化出3～4个新的植株；培养温度要求：24～26度，光照3000lux，每天光照14小时。
(三)无菌苗的驯化移栽：所述增殖苗置于1.5mg/L的3吲哚丁酸(3IBA)，糖3％的MS培养基中培养四周后，无菌苗长出1.5cm的根后，可进行移栽驯化；栽前4天打开瓶盖使无菌苗逐步适应外界条件；洗净所述无菌苗根部培养基并移栽入泥炭土和珍珠岩比例为4∶1的基质内；保持温度为18～28度，弱光条件，移栽后的第一周用无纺布覆盖，控制湿度85～95％，保持叶表面水雾不干。MS培养基组成元素与实施例一相同。
Claims (3)
1.一种珊瑚草种苗组织培养的繁殖方法，所述珊瑚草为竹叶吉祥草，其特征在于：该繁殖方法包括以下步骤：
(a)芽的诱导和分化步骤：取珊瑚草的嫩叶作为外植体，将所述外植体加入培养基进行芽分化培养，所述培养基为加有0.5～1.5mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.05～0.15mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸的MS培养基，培养温度为24～26度，光照强度为1800～2000lux，光照时间为每天10～14小时，培养4～6周后，可见叶片切口处分化出不定芽；
(b)无菌苗的增殖培养步骤：取所述分化出的不定芽置于0.3～1mg/L的6-苄氨基嘌呤，糖为3％的MS培养基中增殖培养，分化出增殖苗，培养温度为24～26度，光照强度为2000～3000lux，光照时间为每天10～14小时；
(c)无菌苗的驯化移栽步骤：将所述增殖苗置于培养基中进行生根培养，培养基为0.8～1.5mg/L的3吲哚丁酸，糖3％的MS培养基，培养四周且在无菌苗长出1.5cm的根后，在栽前4天打开瓶盖使无菌苗逐步适应外界条件，洗净根部后移栽入泥炭土和珍珠岩的基质内，培养温度为18～28度，弱光条件。
2.根据权利要求1所述的一种珊瑚草种苗组织培养的繁殖方法，其特征在于：所述外植体来源于开放带菌环境的活体植物，需经消毒处理再作为外植体，消毒处理是指所述活体植物先用75％的酒精处理，再在0.1％的升汞溶液中浸泡后取出，然后用无菌水冲洗。
3.根据权利要求2所述的一种珊瑚草种苗组织培养的繁殖方法，其特征在于：所述酒精处理时间为8～12秒，所述升汞溶液浸泡时间为8～12分钟，所述无菌水冲洗4～5次。
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