CN105400859A - 一种小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法 - Google Patents

一种小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法，其步骤包括：去蛹→风选→粉碎→脱胶→水解→过滤→透析→酶解→灭酶→纳滤→干燥，其中水解是将茧片置于盛放浓度为1～1.3％的KCl和/或MgCl2水溶液的密闭容器中升温，在0.5～0.6Mpa、130～140℃的条件下使蚕丝丝素蛋白溶解；酶解是将未溶部分的胶状固态物用清洁水冲净，与蚕丝丝素蛋白溶液混合，加入总重量1.2～2％的蛋白酶进行酶解，PH值为6～7，温度32～37℃，时间7～10h；纳滤是用相对分子质量为1000道尔顿的纳滤膜去除掉大分子蚕丝丝素蛋白肽。本发明能制得纯度99％以上、分子量小于1000道尔顿的小分子蚕丝丝素蛋白肽。

Description

一种小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法，属于生物提取技术领域。
背景技术：
蛋白质是组成人体一切细胞、组织的重要成分。机体所有重要的组成部分都需要有蛋白质的参与。可以说，没有蛋白质就没有生命。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。
蛋白质的结构可以分为四级：一级结构是氨基酸的线性排列顺序；二级结构是一级结构中部分肽链的弯曲或折叠；三级结构是在二级结构基础上进一步折叠成紧密的三维形式；四级结构是由蛋白质亚基结构形成的多于一条多肽链的蛋白质分子的空间排列。大分子蛋白可能比小分子蛋白多几条肽链或者在结构上更为复杂，因此大分子蛋白在吸收上比小分子要困难很多，只有当其经过多级消化变为氨基酸之后才能便于被吸收，吸收效率低，身体缺少某些蛋白酶或对蛋白质过敏的人群很难有效吸收到，尤其是医药中使用的用于身体表面的蛋白，必须要分解为小分子肽才能被人体有效吸收。
经过多年来的研究，生物界形成共识，分子量小于1000道尔顿的小分子肽，无论透皮吸收还是口服，都有特殊功能，不同于其它分子量大一些的肽。因此，小分子蛋白肽的研究十分重要。
丝素蛋白是一种从蚕丝中提取的蛋白质，具有很好的生物相容性，能制备成膜、凝胶、微胶囊等多种形态的材料，由于它独特的理化性能，目前丝素蛋白材料在生物医学材料领域被广泛的研究，如固定化酶材料、细胞培养基质、药物缓释剂、人工器官等等。
蚕丝丝素蛋白肽含有十七种氨基酸，其中人体所需的氨基酸几乎具备，特别是人体皮肤、毛发十分需要的营养氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸)其含量占到氨基酸总量的80％以上，这是其他水解蛋白所不可及的。蚕丝丝素蛋白肽是由天然蚕丝经特殊工艺提取而成，因此，氨基酸组成与含量是衡量产品质量的重要指标之一；而蚕丝丝素蛋白肽分子量的大小与护肤功效的发挥又有着密切的联系。尤其是小分子的蚕丝丝素蛋白肽，作用十分显著。
但是，目前在纯度高的、分子量小于1000道尔顿的小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法研究上，鲜有成果。
发明内容：
本发明克服了上述技术的不足提供了一种纯度99％以上、分子量小于1000道尔顿的小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明的小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法包含以下步骤：
(1)去蛹：选取优质的桑蚕丝茧，煮沸，切开将死蛹剥除；
(2)风选：用风扇吹，控制风力，将密度比茧轻的杂物吹走；
(3)粉碎：用粉碎机械将去蛹的茧粉碎为直径5mm以下的茧片；
(4)脱胶：将茧片置于0.7～1％的弱碱溶液中煮沸35～40min，并同时用强力搅拌设备搅拌，取出茧片用水漂洗几次，烘干；
(5)水解：将茧片置于盛放浓度为1～1.3％的KCl和/或MgCl2水溶液的密闭容器中升温，在0.5～0.6Mpa、130～140℃的条件下使蚕丝丝素蛋白溶解；
(6)过滤：对混合物进行过滤，得到未溶部分的胶状固态物和滤液；
(7)透析：将滤液置于透析袋中用水透析纯化，以除去KCl和/或MgCl2以及其它小分子杂质，从而制得蚕丝丝素蛋白溶液；
(8)酶解：将未溶部分的胶状固态物用清洁水冲净，与上一步骤制得的蚕丝丝素蛋白溶液混合，加入总重量1.2～2％的蛋白酶进行酶解，PH值为6～7，温度32～37℃，时间7～10h；
(9)灭酶：酶解结束后升温到70～80℃，保温20～30min灭酶，得到纯度大于90％、相对分子质量小于1000道尔顿的小分子蚕丝丝素蛋白肽溶液；
(10)纳滤：用相对分子质量为1000道尔顿的纳滤膜去除掉大分子蚕丝丝素蛋白肽，得到纯度大于99％的小分子蚕丝丝素蛋白肽溶液；
(11)干燥：利用喷雾干燥快速干燥，得到小分子蚕丝丝素蛋白肽。
上述的小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法，其中优选方案为：步骤(5)中KCl和/或MgCl2水溶液的浓度为1.25％。
上述的小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法，其中优选方案为：步骤(5)中压力为0.57Mpa、温度为138℃。
上述的小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法，其中优选方案为：步骤(8)中蛋白酶的种类为木瓜蛋白酶和/或中性蛋白酶。
上述的小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法，其中优选方案为：步骤(8)中蛋白酶的加入量为总重量1.3％，温度36℃，时间8h.
上述的小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法，其中优选方案为：步骤(9)中灭酶温度为78℃、保温30min。
本发明采用了这样的工艺方法之后，与现有技术相比，具有以下优点：弱碱煮沸脱胶同时采用强力搅拌，脱胶效果好；水解采取高温高压同时用KCl和/或MgCl2水溶液进行溶解，溶解率高的同时使肽键产生初级断裂；酶解采用中性的木瓜蛋白酶和/或中性蛋白酶，效率高，且酶解后无需中和反应；用1000道尔顿的纳滤膜除去大分子蚕丝丝素蛋白肽，得到纯度99％以上的小于1000道尔顿的小分子蚕丝丝素蛋白肽。因此，本发明制得的小分子蚕丝丝素蛋白肽分子量小、纯度高。采用这种小分子蚕丝丝素蛋白肽制造内服药物能不需进行二次降解，直接吸收，不增加人体负担，且吸收快速，吸收率极高，尤其是对消化系统未发育成熟的婴幼儿，对消化系统开始退化的老年人以及因过度运动而急需氮源，而又不能增加胃肠功能负担的运动员、体力劳动者有着重要的意义。采用这种小分子蚕丝丝素蛋白肽制造外用产品如面膜、膏剂等，更新陈旧老化的细胞成分，修复细胞组织，置换排除细胞内的毒素，同时消除过度活跃的自由基，推迟皮肤衰老，从而恢复皮肤的年轻态。
具体实施方式：
以下结合较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。
实施例1：
一种小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法，包含以下步骤：
(1)去蛹：选取优质的桑蚕丝茧，煮沸，切开将死蛹剥除；
(2)风选：用风扇吹，将密度比茧轻的杂物吹走；
(3)粉碎：用粉碎机械将去蛹的茧粉碎为直径5mm以下；
(4)脱胶：将茧片置于1％的弱碱溶液中煮沸35～40min，并同时用强力搅拌设备搅拌，取出茧片用水漂洗几次，烘干；
(5)水解：将茧片置于盛放浓度为1.25％的MgCl2水溶液的密闭容器中升温，在0.57Mpa、138℃的条件下使蚕丝丝素蛋白溶解；
(6)过滤：对混合物进行过滤，得到未溶部分的胶状固态物和滤液；
(7)透析：将滤液置于透析袋中用水透析纯化，以除去MgCl2以及其它小分子杂质，从而制得蚕丝丝素蛋白溶液；
(8)酶解：将未溶部分的胶状固态物用清洁水冲净，与上一步骤制得的蚕丝丝素蛋白溶液混合，加入总重量1.2～2％的木瓜蛋白酶进行酶解，PH值为6，温度36℃，时间8h；
(9)灭酶：酶解结束后升温到78℃，保温30min灭酶，得到纯度大于90％、相对分子质量小于1000道尔顿的小分子蚕丝丝素蛋白肽溶液；
(10)纳滤：用相对分子质量为1000道尔顿的纳滤膜去除掉大分子蚕丝丝素蛋白肽，得到纯度大于99％的小分子蚕丝丝素蛋白肽溶液；
(11)干燥：利用喷雾干燥快速干燥，得到小分子蚕丝丝素蛋白肽。
实施例2：
一种小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法，包含以下步骤：
(1)去蛹：选取优质的桑蚕丝茧，煮沸，切开将死蛹剥除；
(2)风选：用风扇吹，将密度比茧轻的杂物吹走；
(3)粉碎：用粉碎机械将去蛹的茧粉碎为直径5mm以下；
(4)脱胶：将茧片置于0.7％的弱碱溶液中煮沸40min，并同时用强力搅拌设备搅拌，取出茧片用水漂洗几次，烘干；
(5)水解：将茧片置于盛放浓度为1％的KCl水溶液的密闭容器中升温，在0.5Mpa、130℃的条件下使蚕丝丝素蛋白溶解；
(6)过滤：对混合物进行过滤，得到未溶部分的胶状固态物和滤液；
(7)透析：将滤液置于透析袋中用水透析纯化，以除去KCl以及其它小分子杂质，从而制得蚕丝丝素蛋白溶液；
(8)酶解：将未溶部分的胶状固态物用清洁水冲净，与上一步骤制得的蚕丝丝素蛋白溶液混合，加入总重量1％的中性蛋白酶进行酶解，PH值为6.3，温度37℃，时间10h；
(9)灭酶：酶解结束后升温到70℃，保温30min灭酶，得到纯度大于90％、相对分子质量小于1000道尔顿的小分子蚕丝丝素蛋白肽溶液；
(10)纳滤：用相对分子质量为1000道尔顿的纳滤膜去除掉大分子蚕丝丝素蛋白肽，得到纯度大于99％的小分子蚕丝丝素蛋白肽溶液；
(11)干燥：利用喷雾干燥快速干燥，得到小分子蚕丝丝素蛋白肽。
实施例3：
一种小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法，包含以下步骤：
(1)去蛹：选取优质的桑蚕丝茧，煮沸，切开将死蛹剥除；
(2)风选：用风扇吹，将密度比茧轻的杂物吹走；
(3)粉碎：用粉碎机械将去蛹的茧粉碎为直径5mm以下；
(4)脱胶：将茧片置于0.7％的弱碱溶液中煮沸40min，并同时用强力搅拌设备搅拌，取出茧片用水漂洗几次，烘干；
(5)水解：将茧片置于盛放浓度为1.3％的KCl和MgCl2水溶液的密闭容器中升温，在0.6Mpa、140℃的条件下使蚕丝丝素蛋白溶解；
(6)过滤：对混合物进行过滤，得到未溶部分的胶状固态物和滤液；
(7)透析：将滤液置于透析袋中用水透析纯化，以除去KCl和MgCl2以及其它小分子杂质，从而制得蚕丝丝素蛋白溶液；
(8)酶解：将未溶部分的胶状固态物用清洁水冲净，与上一步骤制得的蚕丝丝素蛋白溶液混合，加入总重量2％的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行酶解，PH值为7，温度32℃，时间7h；
(9)灭酶：酶解结束后升温到80℃，保温20min灭酶，得到纯度大于90％、相对分子质量小于1000道尔顿的小分子蚕丝丝素蛋白肽溶液；
(10)纳滤：用相对分子质量为1000道尔顿的纳滤膜去除掉大分子蚕丝丝素蛋白肽，得到纯度大于99％的小分子蚕丝丝素蛋白肽溶液；
(11)干燥：利用喷雾干燥快速干燥，得到小分子蚕丝丝素蛋白肽。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)去蛹：选取优质的桑蚕丝茧，煮沸，切开将死蛹剥除；
(2)风选：用风扇吹，控制风力，将密度比茧轻的杂物吹走；
(3)粉碎：用粉碎机械将去蛹的茧粉碎为直径5mm以下的茧片；
(4)脱胶：将茧片置于0.7～1％的弱碱溶液中煮沸35～40min，并同时用强力搅拌设备搅拌，取出茧片用水漂洗几次，烘干；
(5)水解：将茧片置于盛放浓度为1～1.3％的KCl和/或MgCl2水溶液的密闭容器中升温，在0.5～0.6Mpa、130～140℃的条件下使蚕丝丝素蛋白溶解；
(6)过滤：对混合物进行过滤，得到未溶部分的胶状固态物和滤液；
(7)透析：将滤液置于透析袋中用水透析纯化，以除去KCl和/或MgCl2以及其它小分子杂质，从而制得蚕丝丝素蛋白溶液；
(8)酶解：将未溶部分的胶状固态物用清洁水冲净，与上一步骤制得的蚕丝丝素蛋白溶液混合，加入总重量1.2～2％的蛋白酶进行酶解，PH值为6～7，温度32～37℃，时间7～10h；
(9)灭酶：酶解结束后升温到70～80℃，保温20～30min灭酶，得到纯度大于90％、相对分子质量小于1000道尔顿的小分子蚕丝丝素蛋白肽溶液；
(10)纳滤：用相对分子质量为1000道尔顿的纳滤膜去除掉大分子蚕丝丝素蛋白肽，得到纯度大于99％的小分子蚕丝丝素蛋白肽溶液；
(11)干燥：利用喷雾干燥快速干燥，得到小分子蚕丝丝素蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤(5)中KCl和/或MgCl2水溶液的浓度为1.25％。
3.根据权利要求1所述的小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤(5)中压力为0.57Mpa、温度为138℃。
4.根据权利要求1所述的小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤(8)中蛋白酶的种类为木瓜蛋白酶和/或中性蛋白酶。
5.根据权利要求4所述的小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤(8)中蛋白酶的加入量为总重量1.3％，温度36℃，时间8h。
6.根据权利要求1所述的小分子蚕丝丝素蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤(9)中灭酶温度为78℃、保温30min。
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