CN105392498A - 抗恶性肿瘤剂组合物 - Google Patents

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真-弗朗丝瓦·裴龙
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Abstract

本发明提供一种新型抗恶性肿瘤剂组合物，其包含LAT1抑制剂和选自烷化剂、铂制剂、代谢拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、微管聚合抑制剂、内分泌疗法药剂、微管解聚抑制剂、抗肿瘤性抗生素及分子靶向药物构成的组中的一种以上药剂作为有效成分。

Description

抗恶性肿瘤剂组合物
技术领域
本发明涉及一种新型抗恶性肿瘤剂组合物，例如，新型的T细胞急性淋巴性白血病/淋巴瘤治疗用医药组合物、胃癌治疗用医药组合物、胰腺癌治疗用医药组合物或大肠癌治疗用医药组合物。
背景技术
目前，尚未发现能够切实抑制癌(恶性肿瘤)的增殖、且几乎没有副作用的令人满意的抗恶性肿瘤剂组合物或治疗法，强烈期望对其进行开发。
一般而言，癌细胞由于快速地反复增殖，因此无法通过细胞内代谢产生的必需氨基酸的摄入会异常亢进。本发明人等成功地对包括多种必需氨基酸在内的中性支链氨基酸、芳香族氨基酸的细胞内摄入所必需的膜蛋白、即癌特异性L型氨基酸转运蛋白进行了分子克隆，并将其命名为系统L氨基酸转运蛋白1(LAT1)(KanaiY.etal.，JournalofBiologicalChemistry，273，23629(1998))。而且，本发明人等对选择性抑制LAT1及LAT1基因的药剂组合物进行了研究。
作为癌的种类，可以列举例如肺癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、乳腺癌、大肠癌、膀胱癌、前列腺癌、血癌等，以下以血癌、胃癌、胰腺癌、大肠癌为例进行说明。
血癌(造血器官肿瘤)中包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等。
白血病分为4类(急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性淋巴性白血病(AcuteLymphocyticLeukemia：ALL)、慢性淋巴性白血病)。急性白血病为在造血干细胞或造血前体细胞中发生肿瘤化、仅特定的细胞以白血病细胞形式增殖的疾病。
淋巴瘤为来自构成淋巴组织的细胞的肿瘤，是主要由淋巴细胞的肿瘤化引起的造血器官肿瘤。恶性淋巴瘤分为何杰金氏病和非何杰金氏淋巴瘤。
淋巴性白血病、淋巴瘤是淋巴细胞的主要构成细胞发生肿瘤化的疾病，分为B细胞肿瘤和T细胞肿瘤。T细胞肿瘤中包含T细胞急性淋巴性白血病(T－ALL)、T细胞淋巴母细胞性淋巴瘤(T－LymphoblasticLymphoma：T－LL)、T细胞慢性淋巴性白血病(T－CLL)、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)等。
淋巴母细胞性淋巴瘤(LymphoblasticLymphoma：LL)是与一般的淋巴瘤相比处于更早期分化阶段的淋巴细胞发生癌化的疾病，认为癌细胞的本质与急性淋巴性白血病是相同的。因此，在WHO分类中，作为“前体T或B淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤”(PrecursorT－orB－LymphoblasticLeukemia/Lymphoma)分类在一组疾病中。
T细胞淋巴母细胞性淋巴瘤(T－LL)及T细胞急性淋巴性白血病(T－ALL)是由于胸腺细胞的转化在分化的各阶段被抑制而产生的、恶性度非常高的疾病(非专利文献1)。T－ALL在全部成人及儿童期非何杰金氏淋巴瘤中分别占大约15及30％。近年，T－ALL患者中，利用侵入性化学疗法进行的治疗在成人中治愈率超过40％，在儿童患者中治愈率超过80％，改善了治愈率(非专利文献2)，但已知难治性的复发在所有能够利用的药物疗法中均会发生(非专利文献3)。结果，本发明人等认为，与T细胞恶性疾病的病因相关的分子机理的更多相关知识，对于认定用于提高其治愈率的新型治疗和/或并用治疗(combinationaltreatment)确实非常重要。
已知肿瘤化细胞(癌细胞)显示出持续增殖、逃避了细胞凋亡所致的清除、扩散、且能够抵抗治疗的显著特性(hallmarkproperty)(非专利文献4)。癌细胞其自身的代谢进行了重编(非专利文献5)，这是一种由于癌细胞快速生长且活跃地分裂，而按照占有产生新蛋白质、脂质、及DNA所必需的营养素的方式来增强其自身的能力的特性。由于其中包含了促进肿瘤形成性的增殖且扰乱分化的染色体异位等各种基因损伤，因此T－ALL/T－LL细胞在分子水平是非常不均质的(非专利文献1)。但是，已经公开了它们以磷脂酰肌醇3－激酶/蛋白激酶B；PKB(PI3K/Akt)通路的共通具有本质的活化(非专利文献6)。PI3K/Akt受在人类癌症中被频繁不活化的肿瘤抑制基因PTEN(phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosome10)的抑制(非专利文献7)。PTEN脂质磷酸酶的活性是通过将磷脂酰肌醇(3,4,5)－三磷酸(PIP3)转变为阻碍Akt活化及其下游的增殖活动的磷脂酰肌醇4,5－双磷酸(PIP2)，从而对抗明确地影响细胞生存(即生长、增殖、细胞内输送)的PI3K的作用。在PTEN不存在时，Akt具有充分的活性，刺激细胞使其发生癌性的转化(非专利文献8、9)。
为了调查T－ALL/T－LL的病因中的分子水平的PTEN的相关性，本发明人等利用了显示条件性T细胞特异性PTEN缺失(PTENf/fxlck－Cre)的小鼠模型(非专利文献10)。结果产生的后代(tPTEN－/－小鼠)很快罹患高恶性度、侵袭性的T细胞性淋巴瘤，在6～20周内死亡。为了强调支持tPTEN－/－淋巴瘤形成的紊乱基因，进行了用于鉴定SLC7A5基因上调的转录组(表达谱)分析。SLC7A5对系统L氨基酸转运蛋白1(LAT1)进行编码。近年的很多发现证实了：多种癌性细胞和/或增殖细胞与LAT1表达强烈相关(非专利文献11)、(非专利文献12)、(非专利文献13)、(非专利文献14)、(非专利文献15)、(非专利文献16)；开发LAT1的强力选择性抑制剂的活动在进行中(非专利文献17)。截至目前，已经鉴定出4个LAT蛋白质(即LAT1～4)，LAT1及LAT3是在肿瘤细胞中最为频繁地过量表达的2异形体种异形体(非专利文献18)。LAT蛋白质通过与谷氨酰胺交换而移入亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、及酪氨酸等这些较大的中性必需氨基酸(LNEAA)中。为了发挥运载作用，LAT1必需具有与1次跨膜蛋白4F2细胞表面抗原重链(CD98hc/4F2hc，由SLC3A2基因编码)键合的二硫键(非专利文献11)。已知其还与β整联蛋白相互作用(非专利文献19)。我们推测，在tPTEN－/－及T－ALL/T－LL细胞表面观察到的LAT1表达与更高度的必需氨基酸摄入是一致的，因此其是T－ALL/T－LL白血病细胞的生长及生存的必要因素。
因此，本发明人的进行研究的主要研究目标是，利用强力的、选择性的LAT1抑制剂COMPOUND-JP来调查关于靶向LAT1的有力的药理学作用(可以为多种)(非专利文献18)；(非专利文献17)；(非专利文献20)。
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发明内容
发明要解决的课题
因此，本发明的课题在于，提供一种切实抑制癌(恶性肿瘤)的增殖、且几乎没有副作用的令人满意的抗恶性肿瘤剂组合物，例如用于提高T－LL及T－ALL患者的治愈率的新型医药组合物、胃癌治疗用医药组合物、胰腺癌治疗用医药组合物或大肠癌治疗用医药组合物。
用于解决课题的手段
经过了重编的癌细胞为了支持其病态生长及增殖速度，而需要流入大量的营养素。本发明人进行了深入研究，结果明确了对系统L氨基酸转运蛋白1(LAT1)进行编码的基因(SLC7A5)在利用是pten肿瘤抑制因子由T细胞中缺失从而生成的小鼠淋巴瘤细胞中以及人T细胞急性淋巴性白血病(T－ALL)/淋巴瘤(T－LL)细胞中均过量表达。并且，在本研究中，本发明人等利用了某些种类的LAT1选择性抑制剂{例如，O－(5－氨基－2－苯基苯并噁唑－7－基)甲基－3,5－二氯－L－酪氨酸或其药理学上可接受的盐，以下称为“COMPOUND-JP”}。COMPOUND-JP能够降低白血病性细胞的生存能力及增殖，诱导一过性的自噬作用，然后进入细胞凋亡，进而COMPOUND-JP能够改变给药至裸小鼠中的异种移植表达荧光素酶tPTEN－/－细胞的体内生长。作为参照，COMPOUND-JP对于正常小鼠胸腺细胞及人末梢血淋巴细胞是无毒的。在分子水平，COMPOUND-JP抑制mTORC1及Akt的组成性活化。COMPOUND-JP引起与细胞死相关的CHOP转录因子介导的非折叠蛋白反应(UnfoldedProteinResponse)(UPR)。颇有意味的是，本发明人还得到了CHOP诱导缺损的COMPOUND-JP抵抗性tPTEN－/－克隆。进而，本发明人等观察到COMPOUND-JP与雷帕霉素、地塞米松、阿霉素、万珂、及L－天冬酰胺酶显示出协同作用，能够改变白血病性细胞的生存能力。结果证实了由LAT1介导的必需氨基酸流入的靶向能够成为治疗致命性T细胞恶性疾病的一种有效的广谱性辅助手段。
即，本发明人的研究所得到的实验结果支持了如下见解：癌细胞为了生存、增殖，T－ALL及T－LL细胞以及tPTEN－/－小鼠依赖LAT1介导的高水平的氨基酸流入。使用COMPOUND-JP的LAT1抑制影响用来维持tPTEN－/－肿瘤细胞的生存的mTOR通路的组成型活化，引起CHOP依赖性细胞死响应，显示出颇有意味的体外辅助剂特性。
进而，根据由人各种癌建立的培养细胞中表达的中性氨基酸转运蛋白、LAT1及LAT2基因的定量结果，LAT2仅在5种细胞中确认到较低的值，但LAT1mRNA在46种细胞中均表达，LAT1可以称为癌型的转运蛋白。而LAT2在癌细胞中的表达为零或者为极低的值，因此可以理解为正常型。并且，在来自人硬胃癌的44As3-11细胞和来自人胰腺癌的Panc-1细胞这两种细胞中，均明显确认到COM-JP用量依赖性的增殖活性降低。在此外的多种表达LAT1的癌细胞中，也可以期待与其自身的LAT1表达量相应的COM-JP的增殖抑制效果。
接着，对于胃癌、胰腺癌、大肠癌中的COM-JP与其它药剂的并用效果，给出本发明人进行深入研究的结果。首先，关于COM-JP和其它药剂(Gemstabine以及Paclitaxel)对来自人硬胃癌的44As3-11细胞的增殖的并用效果，并用所产生的抑制效果为将各自单独时的作用叠加的结果，显示出所谓的相加效果。其次，关于COM-JP和其它药剂(Gemstabine以及Paclitaxel)对来自人胰腺癌的Panc－1细胞的增殖的并用效果，Panc-1细胞中的各并用所产生的抑制效果是将各单独的作用叠加的结果，与44As3-11细胞时同样为所谓的相加效果。接下来，关于COM-JP和5-FU对来自人大肠癌的HT-29细胞移植裸小鼠模型中的肿瘤增殖的并用效果，通过两者的并用，各单独组的残存肿瘤增大进一步减少。明确了该并用效果是相加性的，是由两药物的作用机理不同带来的。这样的并用所产生的、能够进一步增强各自单独的治疗效果的药效在临床中的大肠癌治疗中也能够充分期待。最后，关于COM－JP和CDDP对来自人大肠癌的HT－29细胞的原位移植裸小鼠模型(SOImodel)中的肿瘤增殖的由并用产生的协同效果，确认到两者并用时的明显的药效，这些药效在COM－JP和CDDP均单独给药时无法确认到。该并用所产生的药效可以说是两者的协同效果。
因此，本发明人等发现了LAT1抑制剂以及LAT1抑制剂与其它药剂的并用作为前述抗恶性肿瘤剂组合物是有效的，至此完成了本发明。
即，本发明(1)为一种抗恶性肿瘤剂组合物，其包含LAT1抑制剂和选自烷化剂、铂制剂、代谢拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、微管聚合抑制剂、内分泌疗法药剂、微管解聚抑制剂、抗肿瘤抗生素及分子靶向药物构成的组中的一种以上药剂作为有效成分。
本发明(2)为根据前述发明(1)所述的组合物，其中，所述抗恶性肿瘤剂组合物为T细胞急性淋巴性白血病/淋巴瘤治疗用医药组合物、胃癌治疗用医药组合物、胰腺癌治疗用医药组合物或大肠癌治疗用医药组合物。
本发明(3)为根据前述发明(1)或(2)所述的组合物，其中，所述LAT1抑制剂为O－(5－氨基－2－苯基苯并噁唑－7－基)甲基－3,5－二氯－L－酪氨酸、其类似物或它们的药理学上可接受的盐。
本发明(4)为根据前述发明(1)～(3)中任一项所述的组合物，其中，所述药剂为选自顺铂、5－氟尿嘧啶即5－FU、吉西他滨、L－天冬酰胺酶即左旋天冬酰胺酶、紫杉醇、地塞米松、以阿霉素为首的蒽环类抗生素、万珂即硼替佐米、雷帕霉素、KU0063794及PI－103中的一种以上药剂。
本发明(5)为一种抗恶性肿瘤剂组合物，其包含LAT1抑制剂和选自mTOR抑制剂、PI3K抑制剂及Akt抑制剂中的一种以上药剂作为有效成分。
本发明(6)为根据前述发明(5)所述的组合物，其中，前述抗恶性肿瘤剂组合物为T细胞急性淋巴性白血病/淋巴瘤治疗用医药组合物、胃癌治疗用医药组合物、胰腺癌治疗用医药组合物或大肠癌治疗用医药组合物。
本发明(7)为根据前述发明(5)或(6)所述的组合物，其中，前述LAT1抑制剂为O－(5－氨基－2－苯基苯并噁唑－7－基)甲基－3,5－二氯－L－酪氨酸或其药理学上可接受的盐。
本发明(8)为根据前述发明(5)～(7)中任一项所述的组合物，其中，前述药剂为选自雷帕霉素、KU0063794及PI－103中的一种以上药剂。
本发明中，各种用语的含义如下所述。
(LAT1抑制剂)
“LAT1抑制剂”只要是选择性抑制系统L氨基酸转运蛋白1(LAT1)及LAT1基因的药剂就没有特别限制，包括化合物及其盐、抗LAT1抗体、适体、核酸医药。该LAT1抑制剂既可以是单独一种药剂，也包括2种以上药剂的并用。
(烷化剂)
“烷化剂”只要是使DNA烷基化的药剂就没有特别限制，例如是指政府机构允许作为医药品制造、销售的现有的1种或多种任意的烷化剂，或者现在处于临床试验或前临床试验中或将来用于临床试验且在该试验后将来政府机构可能允许作为医药品制造、销售的1种或多种任意的烷化剂。烷化剂既可以是单独一种药剂，也包括2种以上药剂的并用。
(铂制剂)
“铂制剂”只要是含铂的抗恶性肿瘤剂就没有特别限制，例如是指政府机构允许作为医药品制造、销售的现有的1种或多种任意的铂制剂，或者现在处于临床试验或前临床试验中或将来用于临床试验且在该试验后将来政府机构可能允许作为医药品制造、销售的1种或多种任意的铂制剂。铂制剂既可以是单独一种药剂，也包括2种以上药剂的并用。
(代谢拮抗剂)
“代谢拮抗剂”只要是抑制癌细胞的代谢、抑制增殖的药剂就没有特别限制，例如是指政府机构允许作为医药品制造、销售的现有的1种或多种任意的代谢拮抗剂，或者现在处于临床试验或前临床试验中或将来用于临床试验且在该试验后将来政府机构可能允许作为医药品制造、销售的1种或多种任意的代谢拮抗剂。代谢拮抗剂既可以是单独一种药剂，也包括2种以上药剂的并用。
(拓扑异构酶抑制剂)
“拓扑异构酶抑制剂”只要是阻碍被称为拓扑异构酶的酶的作用的药剂就没有特别限制，例如是指政府机构允许作为医药品制造、销售的现有的1种或多种任意的拓扑异构酶抑制剂，或者现在处于临床试验或前临床试验中或将来用于临床试验且在该试验后将来政府机构可能允许作为医药品制造、销售的1种或多种任意的拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂既可以是单独一种药剂，也包括2种以上药剂的并用。
(微管聚合抑制剂)
“微管聚合抑制剂”只要是阻碍微管形成的药剂就没有特别限制，例如是指政府机构允许作为医药品制造、销售的现有的1种或多种任意的微管聚合抑制剂，或者现在处于临床试验或前临床试验中或将来用于临床试验且在该试验后将来政府机构可能允许作为医药品制造、销售的1种或多种任意的微管聚合抑制剂。微管聚合抑制剂既可以是单独一种药剂，也包括2种以上药剂的并用。
(内分泌疗法药剂)
“内分泌疗法药剂”只要是抑制内分泌(激素)的分泌或作用的药剂就没有特别限制，例如是指政府机构允许作为医药品制造、销售的现有的1种或多种任意的内分泌疗法药剂，或者现在处于临床试验或前临床试验中或将来用于临床试验且在该试验后将来政府机构可能允许作为医药品制造、销售的1种或多种任意的内分泌疗法药剂。内分泌疗法药剂既可以是单独一种药剂，也包括2种以上药剂的并用。
(微管解聚抑制剂)
“微管解聚抑制剂”只要是使微管聚合稳定化的药剂就没有特别限制，例如是指政府机构允许作为医药品制造、销售的现有的1种或多种任意的微管解聚抑制剂，或者现在处于临床试验或前临床试验中或将来用于临床试验且在该试验后将来政府机构可能允许作为医药品制造、销售的1种或多种任意的微管解聚抑制剂。微管解聚抑制剂既可以是单独一种药剂，也包括2种以上药剂的并用。
(抗肿瘤性抗生素)
“抗肿瘤性抗生素”只要是作为抗肿瘤剂发挥作用的、来自微生物的产物的物质就没有特别限制，例如是指政府机构允许作为医药品制造、销售的现有的1种或多种任意的抗肿瘤性抗生素，或者现在处于临床试验或前临床试验中或将来用于临床试验且在该试验后将来政府机构可能允许作为医药品制造、销售的1种或多种任意的抗肿瘤性抗生素。抗肿瘤性抗生素既可以是单独一种药剂，也包括2种以上药剂的并用。
(分子靶向药物)
“分子靶向药物”只要是以肿瘤细胞的增殖、浸润、转移等的相关分子为靶标的药剂就没有特别限制，例如是指政府机构允许作为医药品制造、销售的现有的1种或多种任意的分子靶向药物，或者现在处于临床试验或前临床试验中或将来用于临床试验且在该试验后将来政府机构可能允许作为医药品制造、销售的1种或多种任意的分子靶向药物。该分子靶向药物既可以是单独一种药剂，也包括2种以上药剂的并用。
(抗恶性肿瘤剂)
“抗恶性肿瘤剂”可以列举例如烷化剂、铂制剂、代谢拮抗剂、植物生物碱(拓扑异构酶抑制剂、微管聚合抑制剂、微管解聚抑制剂等)、内分泌疗法药剂、抗肿瘤性抗生素、分子靶向药物、生物学响应调节剂及其它药剂等，例如是指政府机构允许作为医药品制造、销售的现有的1种或多种任意的抗恶性肿瘤剂，或者现在处于临床试验或前临床试验中或将来用于临床试验且在该试验后将来政府机构可能允许作为医药品制造、销售的1种或多种任意的抗恶性肿瘤剂。该抗恶性肿瘤剂既可以是单独一种药剂，也包括2种以上药剂的并用。
“类似物”是指在结构、功能方面与O－(5－氨基－2－苯基苯并噁唑－7－基)甲基－3,5－二氯－L－酪氨酸实质上类似的分子。
(顺铂)
“顺铂”是指作为铂制剂的顺铂(CDDP)，包含顺铂、以及具有与顺铂相同药理学特性的所有类似物、衍生物及同属物。
(5－氟尿嘧啶(5－FU))
“5－氟尿嘧啶(5－FU)”是指作为代谢拮抗剂的5－氟尿嘧啶(5－FU)，包含5－氟尿嘧啶(5－FU)、以及具有与5－氟尿嘧啶(5－FU)相同药理学特性的所有类似物、衍生物及同属物。
(吉西他滨)
“吉西他滨”是指作为代谢拮抗剂的吉西他滨，包含吉西他滨、以及具有与吉西他滨相同药理学特性的所有类似物、衍生物及同属物。
(L－天冬酰胺酶(左旋天冬酰胺酶))
“L－天冬酰胺酶(左旋天冬酰胺酶)”是指作为抗恶性肿瘤剂的L－天冬酰胺酶(左旋天冬酰胺酶)，包含L－天冬酰胺酶(左旋天冬酰胺酶)、以及具有与L－天冬酰胺酶(左旋天冬酰胺酶)相同药理学特性的所有类似物、衍生物及同属物。
(紫杉醇)
“紫杉醇”是指作为微管解聚抑制剂的紫杉醇(taxol)，包含紫杉醇、以及具有与紫杉醇相同药理学特性的所有类似物、衍生物及同属物。
(地塞米松)
“地塞米松”是指包含肾上腺皮质甾醇作为主要成分的、具有抗炎症作用、免疫抑制作用等的药物地塞米松，包含地塞米松、以及具有与地塞米松相同药理学特性的所有类似物、衍生物及同属物。
(以阿霉素为首的蒽环类抗生素)
“蒽环类抗生素”只要是来自链霉菌属微生物的作为抗肿瘤性抗生素使用的一组药剂就没有特别限制，例如是指政府机构允许作为医药品制造、销售的现有的1种或多种任意的，或者现在处于临床试验或前临床试验中或将来用于临床试验且在该试验后将来政府机构可能允许作为医药品制造、销售的1种或多种任意的蒽环类抗生素。该蒽环类抗生素既可以是单独一种药剂，也包括2种以上药剂的并用。“阿霉素”是指作为蒽环类抗生素的阿霉素，包含阿霉素、以及具有与阿霉素相同药理学特性的所有类似物、衍生物及同属物。
(万珂(硼替佐米))
“万珂(硼替佐米)”是指作为分子靶向药物的万珂(硼替佐米)，包含万珂(硼替佐米)、以及具有与万珂(硼替佐米)相同药理学特性的所有类似物、衍生物及同属物。
(雷帕霉素)
“雷帕霉素”是指作为分子靶向药物的雷帕霉素，包含雷帕霉素、以及具有与雷帕霉素相同药理学特性的所有类似物、衍生物及同属物。
(KU0063794)
“KU0063794”是指作为分子靶向药物的KU0063794，包含KU0063794、以及具有与KU0063794相同药理学特性的所有类似物、衍生物及同属物。
(PI－103)
“PI－103”是指作为分子靶向药物的PI－103，包含PI－103、以及与PI－103具有相同药理学特性的所有类似物、衍生物及同属物。
(mTOR抑制剂)
“mTOR抑制剂”只要是直接或间接以mTOR(mammaliantargetofrapamycin)为靶标、或者降低或抑制mTOR的活性/功能的药剂就没有特别限制，例如是指政府机构允许作为医药品制造、销售的现有的1种或多种任意的mTOR抑制剂，或者现在处于临床试验或前临床试验中或将来用于临床试验且在该试验后将来政府机构可能允许作为医药品制造、销售的1种或多种任意的mTOR抑制剂。该mTOR抑制剂既可以是单独一种药剂，也包括2种以上药剂的并用。
(P13K抑制剂)
“P13K抑制剂”只要是直接或间接以P13K(PI3激酶)靶标的、或者降低或抑制P13K的活性/功能的药剂就没有特别限制，例如是指政府机构允许作为医药品制造、销售的现有的1种或多种任意的P13K抑制剂，或者现在处于临床试验或前临床试验中或将来用于临床试验且在该试验后将来政府机构可能允许作为医药品制造、销售的1种或多种任意的P13K抑制剂。该P13K抑制剂既可以是单独一种药剂，也包括2种以上药剂的并用。
(Akt抑制剂)
“Akt抑制剂”只要是直接或间接以Akt为靶标的、或者降低或抑制Akt的活性/功能的药剂就没有特别限制，例如是指政府机构允许作为医药品制造、销售的现有的1种或多种任意的Akt抑制剂，或者现在处于临床试验或前临床试验中或将来用于临床试验且在该试验后将来政府机构可能允许作为医药品制造、销售的1种或多种任意的Akt抑制剂。该Akt抑制剂既可以是单独一种药剂，也包括2种以上药剂的并用。
附图说明
【图1】图1是关于CD98的表达水平上调的tPTEN－/－肿瘤、T－ALL/T－LL细胞株、及初代样品的图。
【图1A】图1A是表示PTEN－KO肿瘤(n＝4)及正常小鼠胸腺细胞(n＝3)之间的基因表达的热图(heatmap)分析的图。将倍数变化表达值(log2)与p值一起示出。
【图1B－E】图1B－E为表示利用抗小鼠CD98大鼠mAb染色、然后接着利用第二抗体即抗大鼠FITC抗体显色后的表面CD98水平的流式细胞术分析、特异性MFI/非特异性MFI之比的图。
【图1B】图1B为将来自tPTEN－/－小鼠(n＝5)的初代肿瘤细胞与来自正常WT小鼠的胸腺细胞进行比较的图。P值通过在95％的置信水平下使用方差分析后接着进行Dunnett多重比较检验进行计算。
【图1C】图1C为表示静息或PMA+离子霉素活化(24小时)的正常小鼠胸腺细胞及KO99L细胞之间的CD98表达水平的图。
【图1D】图1D为表示初代T－ALL样品(n＝3)、T－ALL/T－LL人细胞株、及正常静息PBL或活化PBL中的CD98表达的图。P值使用方差分析－Dunnett进行计算。
【图1E】图1E为表示静息或24小时活化的人PBL及T－ALL样品#1之间的CD98表达的Facs谱的图。
【图2】图2为关于在tPTEN－/－及T－ALL/T－LL细胞模型中的LAT－1抑制功能的效果图。
【图2A】图2A为表示在氨基酸摄入的干扰物(disruptor)存在下使用WST－1细胞生存能力检测进行的代谢活性分析的图。将细胞与COMPOUND-JP、BCH、或D－亮氨酸一起孵育48小时。COMPOUND-JP：三次重复的7次独立实验的平均+/－SEM；p值使用双侧studentt检验来计算；BCH、D－Leu：三次重复的1个实验。
【图2B】图2B为通过BrdU摄入Elisa对增殖进行评价的图。数据表示的是进行了四次重复的2次独立实验的平均值(平均+/－SEM；studentt检验)。
【图2C】图2C为对细胞用COMPOUND-JP治疗或不用其治并显示于培养基时补充非必需(N)或必需(E)氨基酸的图。在48小时后测定细胞生存能力(三次重复的3次独立实验的平均+/－SEM；studentt检验)。
【图2D】图2D为在治疗48小时后在DAPI染色后用流式细胞术对细胞死进行分析的图(三次重复的3次独立实验的平均+/－SEM、studentt检验)。
【图2E－G】图2E～G中，对裸小鼠皮下移植KO99L－LUC细胞，48小时后每天用COMPOUND-JP(1.5mg/小鼠/天)进行治疗。18天后进行肿瘤的测定；平均+/－SEM。在D－荧光素的腹腔内注射后用BioImager记录生物发光。
【图2E】图2E为表示肿瘤体积、studentt检验的图。
【图2F】图2F为表示全身小鼠成像的图。伪彩色尺度表示某个期间内相对的生物发光变化(ph/s/r：光子/秒/亮度(radiance))。
【图2G】图2G为表示肿瘤的生物发光定量化的图。p值使用双侧Mann－Whitney试验计算。
【图2H】图2H为表示所示用量的COMPOUND-JP存在下的Jurkat人T－ALL细胞的细胞生存能力的测定的图。COMPOUND-JP对于T－ALL/T－LL模型有影响。
【图2I】图2I为表示对所述细胞增殖能力进行测定的图(3次独立实验的平均+/－SEM；studentt检验)。
【图2J】图2J为显示COMPOUND-JP对人T－ALL初代样品的细胞生存能力的效果的图(n＝5；1次实验、平均+/－SEM；p值使用方差分析后接着进行Dunnett多重比较检验而计算；95％置信水平)。
【图3】图3为关于COMPOUND-JP诱导半胱天冬酶活化、细胞凋亡细胞死、及自噬作用的图。
【图3A】图3A为显示在效应物存在下孵育48小时期间、然后接着用膜联蛋白－V－FITC及DAPI染色后的KO99L细胞的代表性细胞计数图的图。在象限中示出各状态下的细胞的％。数据以5次独立实验为代表。
【图3B】图3B为利用COMPOUND-JP刺激KO99L细胞48小时后在TMRE染色后用Facs测定线粒体的电位差的图。B1、Facs谱；B2、结果的定量化。两次独立实验的代表。
【图3C】图3C为表示KO99L细胞的半胱天冬酶3活化的时间经过的蛋白质印迹分析的图。CldC3＝被切断的半胱天冬酶3(活性)。3次独立实验的代表。
【图3D】图3D中，D1为显示使用Red－DEVD－fmk荧光底物的48小时后的半胱天冬酶3活化的Facs谱图。D2为将代表两次独立实验的结果定量化。
【图3E】图3E为显示KO99L细胞的利用半胱天冬酶3进行的PARP切断的时间经过的蛋白质印迹分析的图。
【图3F】图3F为显示治疗48小时、然后接着进行PI染色及Facs分析后的、初代tPTEN－/－株的利用COMPOUND-JP进行的细胞死诱导的图(n＝5、平均+/－SEM、studentt检验)。
【图3G】图3G为显示初代tPTEN－/－肿瘤细胞的半胱天冬酶3活化及PARP切断的蛋白质印迹分析的图。COMPOUND-JP5.0μM(J5)、10.0μM(J10)；PI－10310.0μM(PI)、雷帕霉素(R：10.0nM)。
【图3H】图3H为KO99L细胞的利用COMPOUND-JP(10.0μM)诱导的LC3加工的蛋白质印迹分析的图。
【图3I】图3I为显示半胱天冬酶对KO99L细胞的COMPOUND-JP诱导性的LC3加工及JNK活化的抑制的时间经过效果的图。QVD－OH以20.0μM来使用。蛋白质印记数据均代表至少3次独立实验。
【图4】图4为LAT1功能的靶向在体外及体内干扰mTORC1活化的图。
【图4A】图4A为显示所示用量的COMPOUND-JP对于KO99L细胞的时间经过实验的图。总细胞溶解物通过利用特定抗体的蛋白质印迹来分析。数据代表至少3次独立实验。
【图4B】图4B为显示用COMPOUND-JP治疗(红色/蓝色的线)(10μM)的、或未治疗的T－ALL初代样品(n＝2、两次重复)(黑色的线)的用phosphoS6RPmAb进行phospho流式染色的图。异形体参照以灰色线表示(平均+/－SEM)。将未治疗或治疗样品的曲线相对于峰的高度进行标准化。对各样品获得事件(104)。对于条件，重复实施两次。
【图4C】图4C为显示关于未治疗或用COMPOUND-JP治疗的小鼠(50mg/kg/天＝1.5mg/小鼠/天)的肿瘤内的坏死(HES染色、左边的带)及mTORC1活化(phosphoS6RP水平、右边的带)的免疫组织化学的检查分析的图。倍率：40×；标尺50μm。
【图4D】图4D为显示用所示抑制剂刺激KO99L细胞后的c－myc水平的蛋白质印迹分析的图。COMPOUND-JP(JPH)(10.0μM)、万珂(Vel)(15.0nM)、雷帕霉素(Rapa)(100nM)、KU0063794(KU)(10.0μM)、MK2206(MK；5.0μM)。数据代表至少3次独立实验。
【图5】图5为诱导性的应激响应对COMPOUND-JP的作用的影响的图。
【图5A】图5A为显示利用蛋白质印迹进行的KO99L细胞的CHOP蛋白质水平的分析的图。COMPOUND-JP10.0μM、L－天冬酰胺酶2.5UI/ml(L－asp)、Erwinase2.5UI/ml(Erw)。
【图5B】图5B为显示利用蛋白质印迹进行的KO99L细胞的CHOP蛋白质水平的分析的图。COMPOUND-JP5.0μM(J5)、10.0μM(J10)；万珂8.0nM(V8)、15.0nM(J15)、雷帕霉素10.0nM(R)。
【图5C】图5C为氨基酸枯竭/补充对信号通路的效果的图。培养基用HBSS稀释至10％，在回收及蛋白质印迹分析前补充非必需(NEAA)(100×)或必需(EAA)氨基酸(50×)。
【图5D】图5D中，在COMPOUND-JP(10μM)存在下在完全培养基中追加氨基酸。
【图5E】图5E中，在追加COMPOUND-JP(10μM)前的30分钟用salubrinal(50μM)对细胞进行治疗。
【图5F】图5F为显示COMPOUND-JP对salubrinal的效果的反应性的图。通过DAPI染色可视化的细胞死(数据代表进行了三次重复的3次独立实验；平均+/－SEM；studentt检验)。增殖：BrdUElisa
【图5G】图5G为显示COMPOUND-JP对salubrinal的效果的反应性的图。(三次重复的1次实验；平均+/－SEM；studentt检验)或细胞计数。
【图5H】图5H为显示COMPOUND-JP对salubrinal的效果的反应性的图。利用(数据代表进行了三次重复的3次独立实验；平均+/－SEM；studentt检验)进行评价。
【图6】图6为对被COMPOUND-JP动员的、诱导性的应激响应的分子进行鉴定的图。
【图6A－C】图6A～C为显示KO99L细胞在COMPOUND-JP(10μM)刺激时的ISR构成成分的时间经过的蛋白质印迹分析的图。
【图6D】图6D为显示KO99L细胞在COMPOUND-JP(10μM)刺激时的Bcl2家族成员的时间经过的蛋白质印迹分析的图。
【图6E】图6E为显示salubrinal对COMPOUND-JP诱导性的Bcl2家族成员的效果的图。Hsp90用作内参照。数据均代表至少3次独立实验。
【图7】图7为对COMPOUND-JP抵抗性的变异体进行鉴定的图。
【图7A－C】使对COMPOUND-JP为感受性的KO99L细胞的母细胞(KO99－S)在药剂浓度增加下孵育数月，获得生存的抵抗性的细胞(KO99－RJ)。
【图7A】图7A为显示在COMPOUND-JP浓度增加下培养48小时后的、利用WST－1检测进行的细胞生存能力分析的图(进行了四次重复的5次独立实验的平均+/－SEM；studentt检验)。
【图7B】图7B在显示在COMPOUND-JP浓度增加下培养48小时后的、利用PI染色进行的细胞死分析的图(进行了四次重复的至少3次独立实验的平均；平均+/－SEM、studentt检验)。
【图7C】图7C为显示与母细胞相比的、抵抗性变异体中的CHOP诱导及S6RP磷酸化的蛋白质印迹分析的图。数据代表至少3次独立实验。
【图8】图8为对COMPOUND-JP及化疗剂之间的组合进行研究的图。
【图8A－B】KO99L细胞与和雷帕霉素、PI－103、KU0063794、阿霉素、地塞米松(DXM)、万珂、或L－天冬酰胺酶(L－asp)组合的最适以下浓度的COMPOUND-JP一起孵育。利用WST－1检测在48小时后测定生存能力。结果为3次独立实验的平均+/－s.e.m。P值使用方差分析后接着进行Tukey的多重比较检验而计算。
【图8A】图8A为显示关于组合指数(CI)的表达的热图的图。药剂之间的协同作用使用Chou－Talalay法来分析。
【图8B】图8B为显示关于组合效果的等效线图的图。右上框中包围的数字表示活细胞的％。
【图9－1、2】图9－1、2为显示本发明的化合物的反应流程的图。
【图S1A】图S1A为显示COMPOUND-JP不干扰正常胸腺细胞而干扰初代tPTEN－/－细胞的生存的图。在关于细胞生存能力的WST－1分析前，将tPTENKO肿瘤(－/－)或来自正常胸腺细胞(+/+)的新鲜初代细胞与所示用量的COMPOUND-JP一起孵育。
【图S1B－D】图S1B～D为显示COMPOUND-JP对正常人血球没有毒性的图。
【图S1B－C】图S1B、C中，在进行活细胞的DAPI染色及Facs定量化的48小时前，将人脐带血单核细胞与所示用量的COMPOUND-JP一起孵育。该图是显示来自健康供体的静息或抗CD3(48小时、1.0μg/ml)活化人末梢血淋巴细胞的细胞死分析(B)及增殖响应(C)(n＝3)的图。STS＝十字孢碱(1.0μM)为细胞死的积极诱导因子。
【图S1D】图S1D为显示在活细胞的DAPI染色及Facs定量化后分析的COMPOUND-JP(48小时)存在下的正常人脐带血细胞的生存能力的图。
【图S2】图S2为显示信号转导抑制剂的效果的图。显示在用特定抗体进行蛋白质印迹分析前利用SDS－PAGE分离的总细胞溶解物。该实验是所示用量的MK2206(5μM)、KU0063794(5μM)、雷帕霉素(10nM)、Erwinase(2.5UI/ml)、L－天冬酰胺酶(2.5UI/ml)、万珂(15nM)作用下的、KO99L细胞的时间经过实验。数据代表3次独立实验。
【图S3－1、2】图S3－1、2为显示组合研究的图。在使用WST1检测的生存能力测定前，将KO99LtPTEN－/－细胞在所示浓度下与和其它药剂组合的COMPOUND-JP一起孵育48小时。
【图S4】图S4为显示COMPOUND-JP作用下的LAT1靶向的分子事件的图。
【图10】图10为显示在来自人的各种癌的所建立的培养细胞中表达的中性氨基酸转运蛋白、LAT1及LAT2基因的定量结果的图。以每单位RNA的mRNA量为纵轴、以使用的癌细胞名为横軸，并在表中记载癌症种类名称。上段记载LAT1，下段记载LAT2。
【图11】图11为显示LAT1选择性抑制剂COM-JP对来自人硬胃癌的44As3-11细胞和来自人胰腺癌的Panc-1细胞的增殖的抑制效果的图。以COM-JP不存在时的活性为100％，将相同条件下的4例的平均值以相对于该100％的相对值形式来表示各个值。将平均值和标准误差以及差异显著性检验的p值示于图中。
【图12】图12为显示表示LAT1选择性抑制剂COM-JP与现有药物吉西他滨(GEM)、紫杉醇(Pac)的单独以及并用作用的实验步骤的图。
【图13】图13为显示COM-JP与其它药剂的并用对来自人硬胃癌的44As3-11细胞的增殖的效果的图。Gemstabine以及Paclitaxel单独作用2小时对来自人硬胃癌的44As3-11细胞的增殖的效果相当于各组柱的左侧棒图的值的差。各实验对相同条件的组分别测定3例，将平均值和标准误差以及差异显著性检验的p值示于图中。
【图14】图14为COM-JP与其它药剂的并用对来自人胰腺癌的Panc-1细胞的增殖的效果的图。Gemstabine以及Paclitaxel单独作用2小时对来自人胰腺癌的Panc-1细胞的增殖的效果相当于各组柱的左侧棒图的值的差。各实验对相同条件的组分别测定3例，将平均值和标准误差以及差异显著性检验的p值示于图中。
【图15】图15为显示COM-JP和5-FU的并用对来自人大肠癌的HT-29细胞移植裸小鼠模型中的肿瘤增殖的效果的图。
【图16】图16为显示COM-JP和CDDP的并用对来自人大肠癌的HT-29细胞的原位移植裸小鼠模型(SOImodel)中的肿瘤增殖的协同效果的图。图16中在棒图中示出各处置组中的肿瘤的尺寸。组1为参照组、组2～4进行分别将COM-JP分别按照3.1、12.5、50mg/Kg体重/天的量连续4周每天单独腹腔给药，组5进行将CDDP按照2.5mg/Kg/天在第0、6、13天3次单独腹腔给药，组6～8进行组2～4和5的组合的并用给药，组9进行将COM－JP按照300mg/Kg/天口服4周连续每天给药。
具体实施方式
《有效成分》
本发明的LAT1抑制剂包含下述化合物1～10所述的芳香族氨基酸衍生物或其药理学上可接受的盐作为有效成分。
化合物1为式(I)所示的芳香族氨基酸衍生物或其药理学上可接受的盐。
[式中，X为卤素原子、烷基或烷氧基，
Y为O或NH，
l为0或1，
m为0、1或2，
n为0～5的整数，
R1为氢原子或氨基保护基，
R2为氢原子或烷基、芳烷基或芳基，
R3为(1)卤素原子；
(2)氨基部分可以被低级烷基取代的芳酰基氨基；
(3)被苯基、苯氧基、吡啶基、嘧啶基或喹啉基取代的苯基(这里，该苯基中的各取代基可以进一步被卤素原子、氰基、羟基、羧基、低级烷氧基、低级烷氧基羰基、苯基、二低级烷基氨基或硫代吗啉基取代)；
(4)萘基或四氢萘基(这里，该萘基可以被羟基、低级烷氧基或二低级烷基氨基取代，二低级烷基氨基可以进一步被卤素原子或羟基取代，萘基未被取代时，n为0或2，萘基被羟基取代时，X为氯原子，m不为0)；
(5)被低级烷基、苯基、萘基或四氢喹啉基取代的含有N、O和/或S的不饱和的单环杂环式基(这里，该单环杂环式基中的各取代基可以进一步被卤素原子、羟基或苯基取代，此时，m为1或2，l为1)；或
(6)可以被氧基(oxo)、羧基、氨基、低级烷基、低级烷氧基、环烷基、二低级烷基氨基、低级烷氧基羰基、二低级烷基氨基甲酰基、苯基或含有N、O和/或S的饱和或不饱和的单环杂环式基取代的含有N、O和/或S的可以是不饱和或部分饱和的稠合杂环式基(这里，该稠合杂环式基中的各取代基可以进一步被卤素原子、羟基、低级烷基、低级烷氧基、苯基、二低级烷基氨基、低级烷酰基氧基、双〔卤代(低级)烷基〕氨基或N－低级烷基－N－羟基(低级)烷基氨基取代，此时，m为1或2)]。
化合物2为式(I)所示的芳香族氨基酸衍生物或其药理学上可接受的盐。
[式中，X为氯或碘原子或烷基或烷氧基，
Y为O或NH，
l为0或1，
m为0或2，
n为0～5的整数，
R1为氢原子或三氟乙酰基或叔丁氧基羰基，
R2为氢原子或烷基，
R3为(1)溴原子；
(2)氨基部分可以被低级烷基取代的芳酰基氨基；
(3)被苯基、苯氧基、吡啶基、嘧啶基或喹啉基取代的苯基(这里，该苯基中的各取代基可以进一步被卤素原子或氰基、羟基、羧基、低级烷氧基、低级烷氧基羰基、苯基、二低级烷基氨基或硫代吗啉基取代，此时，X为氯原子)；
(4)萘基或四氢萘基(这里，该萘基可以被羟基、二(2－羟基乙基)氨基或二(2－氯乙基)氨基取代，萘基未被取代时、n为0或2，萘基被羟基取代时，X为氯原子，m为2)；或、
(5)被苯基、萘基或四氢喹啉基取代的含有N、O和/或S的不饱和的单环杂环式基(这里，该单环杂环式基中的各取代基可以进一步被卤素原子或羟基或苯基取代，此时，X为氯原子，m为2，l为1)]。
化合物3为化合物2所述的芳香族氨基酸衍生物或其药理学上可接受的盐，其中，R3的(5)中的不饱和的单环杂环式基为含有N的、含有N及O的或含有N及S的5元环或6元杂环式基。
化合物4为化合物2或3所述的芳香族氨基酸衍生物或其药理学上可接受的盐，其中，R3的(5)中的不饱和的单环杂环式基为吡啶基、噁唑基或噻唑基。
化合物5为化合物2～4中任一芳香族氨基酸衍生物或其药理学上可接受的盐，其中，R1为氢原子。
化合物6为化合物2～4中任一芳香族氨基酸衍生物或其药理学上可接受的盐，其中，R1为三氟乙酰基或叔丁氧基羰基。
化合物7为化合物2所述的芳香族氨基酸衍生物或其药理学上可接受的盐，其中，R3为
(3)被苯基、苯氧基、吡啶基、嘧啶基或喹啉基取代的苯基(这里，该苯基中的各取代基可以进一步被卤素原子或羟基或二低级烷基氨基取代，此时，X为氯原子)；
(4)可以被羟基取代的萘基(这里，萘基被羟基取代时，X为氯原子，m为2)；或
(5)被苯基或萘基取代的含有N及O的不饱和的单环杂环式基(这里，该单环杂环式基中的各取代基可以进一步被羟基取代，此时，X为氯原子，m为2，l为1)。
化合物8为化合物2所述的芳香族氨基酸衍生物或其药理学上可接受的盐，其中，R3为
(3)被苯基或吡啶基取代的苯基(这里，该苯基中的各取代基可以进一步被卤素原子或二低级烷基氨基取代，此时，X为氯原子)；或
(4)可以被羟基取代的萘基(这里，萘基被羟基取代时，X为氯原子，m为2)。
化合物9为化合物2所述的芳香族氨基酸衍生物或其药理学上可接受的盐，其中，R3为
(3)被取代有二低级烷基氨基的吡啶基取代的苯基(这里，此时，X为氯原子)；
(4)萘基(这里，n为0或2)；或
(5)被萘基取代的含有N及O的不饱和单环杂环式基。
化合物10为化合物2～9中任一芳香族氨基酸衍生物或其药理学上可接受的盐，其中，X为氯或碘原子。
此外，本发明的LAT1抑制剂COMPOUND-JP为下述式(II)所示的O－(5－氨基－2－苯基苯并噁唑－7－基)甲基－3,5－二氯－L－酪氨酸或其药理学上可接受的盐。该化合物11或其药理学上可接受的盐特别适合作为本发明的抗恶性肿瘤剂组合物。
这里，“药理学上可接受的盐”可以列举例如碱金属盐(钠盐、钾盐等)、碱土金属盐(钙盐、镁盐等)、铵盐、与有机碱(三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、二环己胺、二苄基乙二胺等)的盐、与有机酸(乙酸、苯甲酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、葡糖酸、甲磺酸、苯磺酸、甲酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸等)的盐、与无机酸(盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等)的盐、与氨基酸(精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等)的盐。
此外，该化合物及其盐可以是水合物、乙醇盐之类的溶剂化物的形态。进而，为了提高水溶性，该化合物或其盐优选为环糊精(例如，β－环糊精)的包接物。这里，该化合物或其盐：环糊精(质量比)优选为1：10～70、更优选为1：20～50、特别优选为1：25～35。
本发明的LAT1抑制剂包含抗LAT1抗体。抗LAT1抗体只要是能够特异性识别LAT1的抗体就没有特别限制，可以列举例如抗hLAT1单克隆抗体、抗小鼠LAT1单克隆抗体、抗hLAT1多克隆抗体、抗小鼠LAT1多克隆抗体。
这里，抗LAT1抗体只要以LAT1为抗原并与该抗原结合就没有特别限制，可以适当使用小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、羊抗体等。
此外，用于产生单克隆抗体的杂交瘤基本上可以使用公知技术按照下述方式制作。即，可以通过使用期望的抗原、表达期望的抗原的细胞作为致敏抗原，将其按照通常的免疫方法进行免疫，将获得的免疫细胞按照通常的细胞融合法与公知的母细胞融合，利用通常的筛选方法筛选单克隆的抗体产活细胞(杂交瘤)，从而进行制作。杂交瘤的制作例如可以根据Milstein等人的方法(Kohler.G.andMilstein,C.,MethodsEnzymol.(1981)73:3-46)等进行。并且，在制作抗LAT1单克隆抗体时，可以使用LAT1或该蛋白质的片段作为抗原，此外，还可以使用表达LAT1或该蛋白质的片段的细胞作为抗原。需要说明的是，LAT1或该蛋白质的片段可以根据例如MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版第1－3卷Sambrook,J.等著、ColdSpringHarberLaboratoryPress出版、NewYork1989年)中记载的方法来获得。此外，表达LAT1或该蛋白质的片段的细胞也可以根据MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版第1－3卷Sambrook,J.等著、ColdSpringHarberLaboratoryPress出版、NewYork1989年)中记载的方法来获得。
多克隆抗体可以如下方式获得，即，将抗原与市售的佐剂(例如，完全或不完全弗氏佐剂)一起每隔2～3周地对动物的皮下或腹腔给药2～4次左右(利用公知的抗原抗体反应测得部分采血而得的血清的抗体效价，预先确认其上升)，在最终免疫起约3～10天后采集全血并纯化抗血清。作为给予抗原的动物，可以列举大鼠、小鼠、兔、山羊、土拨鼠、仓鼠等哺乳动物。
《给药方法》
本发明的抗恶性肿瘤剂组合物可以通过例如口服、经皮或注射来给药。
口服给药用的片剂、颗粒及胶囊剂可以含有惯用的添加剂，例如粘合剂(例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄芪胶或聚乙烯基吡咯烷酮)；填充剂(例如乳糖、砂糖、玉米澱粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨酸)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉)或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。片剂、颗粒及胶囊剂可以用通常在制剂领域公知的方法形成被膜。
口服给药用的液体制剂可以为例如水性或油性的悬浊液、溶液、胶乳、糖浆或配剂(elixir)的形态，也可以为在使用前溶解于水或其它适当溶剂的冻干制剂。液体制剂可以含有通常的添加剂，例如悬浊剂(例如山梨糖醇、糖浆、甲基纤维素、葡萄糖浆、明胶氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂、山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶)；非水性赋形剂(例如杏仁油、分级椰子油或甘油、丙二醇或乙醇之类的油性酯)；保存剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)及着香剂或着色剂。
经皮给药时，有效成分可以采取霜剂、洗剂或软膏的形态。可以作为药剂使用的霜剂或软膏制剂可以利用该领域中公知的方法来制备。
此外，注射剂可以通过将该化合物或其盐悬浊或溶解在适当的介质中从而制造。注射剂中还可以包含局部麻醉剂、保存剂及缓冲剂之类的佐剂等。
《给药量》
本发明的抗恶性肿瘤剂组合物的给药量可以根据包括患者的年龄、体重、全身的健康程度、性别、给药时间、给药途径、疾病的严重度在内的各种因素适当调整，没有限定，例如，优选将通常成人每天的10～5000mg左右、优选100～3000mg左右分成1～5次给药。
关于本发明的LAT1抑制剂和选自烷化剂、铂制剂、代谢拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、微管聚合抑制剂、内分泌疗法药剂、微管解聚抑制剂、抗肿瘤性抗生素及分子靶向药物构成的组中的一种以上药剂的用量(质量比)，可以根据包括患者的年龄、体重、全身的健康程度、性别、给药时间、给药途径、疾病的严重度在内的各种因素适当调整，没有限定，例如，将各自单独使用时的成人每天的通常用量设为1时，通常成人每天的LAT1抑制剂和选自烷化剂、铂制剂、代谢拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、微管聚合抑制剂、内分泌疗法药剂、微管解聚抑制剂、抗肿瘤性抗生素及分子靶向药物构成的组中的一种以上药剂的质量比优选为0.1：1～1：0.1。
实施例
以下通过制造例详细说明该化合物的制造方法，此外，通过试验例、其结果及考察详细说明前述医药组合物的作用等。通过制造例32说明前述环糊精包接物的制造例。
《制造例》
(制造例1)
1)在28％氨水(20ml)和四氢呋喃(30ml)的混合液中，在冰冷却、搅拌下滴加2－萘甲酰氯(5.70g，29.9mmol)的四氢呋喃(60ml)溶液，室温下搅拌4小时。从反应液减压馏去溶剂，在残渣中加入水，滤取析出物，干燥，得到为无色固体的2－氨基甲酰基萘(2.68g，52％)。
IR(Nujol)3378，3194，1685，1655cm－1、APCI－MSm/z：172[M+H]+
2)将2－氨基甲酰基萘(2.64g，15.4mmol)和4－氯乙酰乙酸乙酯(2.06g，12.5mmol)的混合物在160℃下搅拌1小时后，室温下用乙酸乙酯(200ml)稀释，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤后，干燥。减压馏去溶剂，将残渣用硅胶柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝8～4)精制，得到为黄色结晶的[2－(2－萘基)－噁唑－4－基]乙酸乙酯(459mg，13％)。
m.p.：61.5～64℃、IR(Nujol)1737，1591cm－1、1HNMR(CDCl3)：δ1.31(3H，t，J＝7.1Hz)，3.73(2H，d，J＝1.1Hz)，4.24(2H，q，J＝7.1Hz)，7.49－7.57(2H，m)，7.76(1H，t，J＝1.1Hz)，7.82－7.95(3H，m)，8.11(1H，dd，J＝1.7，8.7Hz)，8.58(1H，brd，J＝1.1Hz)、APCI－MSm/z：282[M+H]+
3)在氢化铝锂(66mg，1.74mmol)的四氢呋喃(15ml)悬浊液中，在冰冷却、搅拌下滴加[2－(2－萘基)－噁唑－4－基]乙酸乙酯(434mg，1.54mmol)的四氢呋喃(20ml)溶液，在相同温度下搅拌2.5小时。在反应液中在相同温度下依次加入水(0.1ml)、15％氢氧化钠水溶液(0.1ml)、水(0.3ml)、硫酸钠(3g)，滤除不溶物，从滤液减压馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝2～1)精制，得到为淡黄色结晶的2－[2－(2－萘基)－噁唑－4－基]乙醇(323mg，88％)。
m.p.：96～98℃、IR(Nujol)3466，1591，1543cm－1、1HNMR(CDCl3)：δ2.85－2.90(2H，m)，2.93(1H，t，J＝6.0Hz)，3.99(2H，q，J＝6.0Hz)，7.50－7.57(2H，m)，7.58(1H，t，J＝1.0Hz)，7.82－7.96(3H，m)，8.10(1H，dd，J＝1.7，8.6Hz)，8.52(1H，br)、APCI－MSm/z：240[M+H]+
(制造例2)
1)在3－氨基－2－羟基苯甲酸甲酯盐酸盐(2.0g，12.0mmol)、N,N’－二甲基苯胺(3.04ml，24.0mmol)、及四氢呋喃(20ml)的混合物中，在冰冷却、搅拌下滴加异烟酰氯盐酸盐(2.34g，13.2mmol)、三乙胺(1.83ml，13.2mmol)、及四氢呋喃(10ml)的混合物，在相同温度下搅拌2小时。将反应液用二氯甲烷(200ml)稀释，依次用水、饱和食盐水洗涤后，干燥，减压馏去溶剂。将残渣用胺硅胶柱色谱(Chromatolex(注册商标)NH)(正己烷/乙酸乙酯＝4及氯仿/乙酸乙酯＝1)精制，得到为淡黄色结晶的2－羟基－3－异烟酰氨基苯甲酸甲酯(2.37g，73％)。
m.p.：157～158℃、IR(Nujol)3423，1669，1555，15
42cm－1、APCI－MSm/z：273[M+H]+
2)将2－羟基－3－异烟酰氨基苯甲酸甲酯(500mg，1.84mmol)、对甲苯磺酸一水合物(349mg，1.84mmol)及二甲苯(20ml)的混合物加热回流14小时后，追加对甲苯磺酸一水合物(349mg，1.84mmol)，加热回流2小时。将反应液用冰冷却，加入乙酸乙酯、10％碳酸钾水溶液，分液，将有机相依次用水、饱和食盐水洗涤后，干燥。减压馏去溶剂，将残渣在正己烷/二异丙基醚(4/1)混合液中粉碎，滤出后干燥，得到为淡黄色结晶的[2－(4－吡啶基)－苯并噁唑－7－基]羧酸甲酯(382mg，82％)。
m.p.：149～151℃、IR(Nujol)1725cm－1、APCI－MS
m/z：255[M+H]+
3)在[2－(4－吡啶基)－苯并噁唑－7－基]羧酸甲酯(360mg，1.42mmol)的四氢呋喃(15ml)溶液中，在冰冷却、搅拌下用10分钟加入氢化铝锂(53mg，1.42mmol)，在相同温度下搅拌0.5小时。在反应液中在相同温度下依次滴加10％含水四氢呋喃(2ml)、30％氢氧化钠水溶液(0.5ml)，室温下搅拌2小时。将产生的不溶物滤除，减压馏去滤液的溶剂。将残渣用乙酸乙酯稀释，依次用水、饱和食盐水洗涤后，干燥，减压馏去溶剂。将获得的结晶在正己烷/二异丙基醚(1/1)混合液中粉碎，滤出后干燥，得到为无色结晶的[2－(4－吡啶基)－苯并噁唑－7－基]甲醇(216mg，67％)。
m.p.：146～147℃、IR(Nujol)3221，1595，1541cm－1、1HNMR(CDCl3)：δ2.35(1H，t，J＝5.9Hz)，5.08(2H，d，J＝5.9Hz)，7.38－7.51(2H，m)，7.76(1H，dd，J＝1.4，7.8Hz)，8.07－8.09(2H，m)，8.78－8.81(2H，m)、APCI－MSm/z：227[M+H]+
(制造例3)
1)在3－羟基苯甲醛(1.72g，14.1mmol)、4－甲氧基苯基硼酸(3.16g，20.8mmol)、分子筛4A粉末(1.95g)及乙酸铜(2.96g，16.3mmol)的二氯甲烷(100ml)悬浊液中，在室温下滴加三乙胺(7.1ml，51mmol)，搅拌27.5小时。将反应液用乙酸乙酯(200ml)稀释，滤除不溶物，用乙酸乙酯洗涤。将滤液和洗液依次用10％盐酸、饱和食盐水洗涤后，干燥，减压馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝7)精制，获得为淡褐色油状物的3－[(4－甲氧基)苯氧基]苯甲醛(596mg，19％)。
IR(Neat)2835，1699，1584，1504cm－1、GCEI－MSm/z：228(M+)
2)在3－[(4－甲氧基)苯氧基]苯甲醛(573mg，2.51mmol)的乙醇(10ml)溶液中，在冰冷却、搅拌下加入硼氢化钠(158mg，4.18mmol)，室温下搅拌25分钟。减压馏去反应液的溶剂，将残渣用乙酸乙酯稀释，依次用水、饱和食盐水洗涤后干燥。减压馏去溶剂，将残渣用硅胶柱色谱(氯仿/乙酸乙酯＝20)精制，得到为无色油状物的3－[(4－甲氧基)苯氧基]苄醇(469mg，81％)。
IR(Neat)3356，1611，1586，1504cm－1、1HNMR(CDCl3)：δ1.67(1H，t，J＝5.3Hz)，3.81(3H，s)，4.65(2H，brd，J＝4.6Hz)，6.84－6.91(3H，m)，6.93－7.06(4H，m)，7.28(1H，t，J＝7.9Hz)、GCEI－MSm/z：230(M+)
(制造例4)
将制造例3中获得的3－[(4－甲氧基)苯氧基]苄醇通过常规方法脱甲基，获得为淡黄色油状物的3－[(4－羟基)苯氧基]苄醇。
IR(Neat)3350，1603，1585，1505cm－1、1HNMR(CDCl3+DMSO－d6)：δ3.57(1H，t，J＝5.9Hz)，4.60(2H，d，J＝5.5Hz)，6.79－6.90(5H，m)，6.92－6.96(1H，m)，6.98－7.04(1H，m)，7.24(1H，t，J＝7.8Hz)，8.49(1H，s)、ESI－MSm/z：215[M－H]－
(制造例5)
在2－溴－6－甲氧基萘(3.0g，12.7mmol)的四氢呋喃(45ml)溶液中，在氩气气氛、－60℃下滴加正丁基锂的己烷溶液(1.5M；8.9ml，13.4mmol)，在相同温度下搅拌70分钟后，加入硼酸三正丁酯(5.2ml，19.0mmol)，在相同温度下搅拌1小时、在5℃下搅拌1.5小时。在反应液中，在5℃下滴加20％盐酸(13ml)后，加入水，室温下用乙酸乙酯萃取。将有机层依次用水、饱和食盐水洗涤后干燥，减压馏去溶剂。将残渣在乙酸乙酯及乙醚中粉碎后，滤出，干燥，获得为无色固体的(2－甲氧基)－6－萘硼酸(1.50g，59％)。
m.p.：301～311℃、IR(Nujol)3290，1625cm－1、1HNMR(DMSO－d6)：δ3.87(3H，s)，7.14(1H，dd，J＝2.6，9.0Hz)，7.28(1H，d，J＝2.6Hz)，7.74(1H，d，J＝8.2Hz)，7.79－7.84(2H，m)，8.06(2H，s)，8.28(1H，s).
(制造例6)
在[2－(3－甲氧基苯基)－苯并噁唑－7－基]甲醇(457mg，1.79mmol)的二氯甲烷(10ml)悬浊液中，在－78℃下滴加三溴化硼的二氯甲烷溶液(1.0M；7ml，7mmol)，在相同温度下搅拌1小时后，去掉冷却槽，室温下搅拌2.5小时。将反应液注入冰水(50ml)中，分离出有机层后，用乙酸乙酯对水层进行萃取。合并有机层并干燥后，减压馏去溶剂。将残渣用硅胶快速柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝3～1)精制，得到为褐色固体的7－溴甲基－2－(3－羟基苯基)－苯并噁唑(535mg，98％)。
m.p.：225～228℃、IR(Nujol)3147，1602，1559cm－1、1HNMR(DMSO－d6)：δ5.02(2H，s)，7.04(1H，ddd，J＝0.9，2.4，8.0Hz)，7.36－7.54(3H，m)，7.62－7.71(2H，m)，7.78(1H，dd，J＝1.2，8.0Hz)，10.0(1H，s)、APCI－MSm/z：304/306[M+H]+
(制造例7)
在5－溴苯并[b]呋喃(1.0g，5.0mmol)的四氢呋喃(10ml)溶液中，在氩气气氛、－60℃下滴加正丁基锂的己烷溶液(1.5M；3.72ml，5.6mmol)，在相同温度下搅拌30分钟后，加入硼酸三甲酯(0.69ml，6.0mmol)，经4小时升温至室温。在反应液中，在5℃下加入水(5ml)，减压馏去四氢呋喃，在残渣中加入1N盐酸将pH调节为1，用乙酸乙酯萃取。将有机层用饱和食盐水洗涤后干燥，减压馏去溶剂。将残渣在正己烷/乙醚混合液中粉碎后，滤出，干燥，得到为淡褐色固体的5－苯并[b]呋喃硼酸(551mg)。
(制造例8)
1)将2－溴苯并噻唑－7－羧酸乙酯(572mg，2.00mmol)、哌啶(5ml)及乙醇(1ml)的混合物在70～75℃下搅拌2.5小时。将反应液降温至室温，加入乙醚(15ml)，滤除析出物，用乙醚洗涤。将滤液和洗液合并后减压馏去溶剂，将残渣用硅胶柱色谱(氯仿)精制，获得为浅橙色结晶的2－哌啶基苯并噻唑－7－羧酸乙酯(526mg，90％)。
m.p.：88～89℃、IR(Nujol)1791，1595，1541cm－1、APCI－MSm/z：291[M+H]+
2)将2－哌啶基苯并噻唑－7－羧酸乙酯(475mg，1.64mmol)与制造例2的3)同样地用氢化铝锂还原，得到为浅黄色结晶的2－哌啶基苯并噻唑－7－甲醇(375mg，91％)。
m.p.：107～108℃、IR(Nujol)3261，3200，1595，1541cm－1、APCI－MSm/z：249[M+H]+
(制造例9)
1)在2－溴苯并噻唑－7－羧酸乙酯(715mg，2.50mmol)及苯基硼酸(341mg，2.8mmol)的脱气后的二甲氧基乙烷(20ml)溶液中，依次加入四(三苯基膦)钯(144mg，0.125mmol)、碳酸氢钠(630mg，7.50mmol)的脱气水溶液(10ml)，50℃下搅拌10分钟后降温至室温，加入碘化亚铜(24mg，0.125mmol)，加热回流4小时。减压馏去二甲氧基乙烷，用乙酸乙酯萃取，将有机层用饱和食盐水洗涤后干燥，减压馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝10)精制，获得为无色结晶的2－苯基苯并噻唑－7－羧酸乙酯(500mg，70％)。
m.p.：86.5～87.5℃、IR(Nujol)1716cm－1、APCI－MSm/z：284[M+H]+
2)将2－苯基苯并噻唑－7－羧酸乙酯(425mg，1.50mmol)与制造例2的3)同样地用氢化铝锂还原，获得为无色结晶的2－苯基苯并噻唑－7－甲醇(340mg，94％)。
m.p.：101～102℃、IR(Nujol)3241，1572，1507cm－1、APCI－MSm/z：242[M+H]+
(制造例10)
1)在5－氯－3－硝基水杨酸甲酯(2.32g，10.0mmol)的二氯甲烷(25ml)溶液中，在冰冷却、搅拌下依次滴加2,6－二甲基吡啶(1.83ml，15.7mmol)、三氟甲磺酸酐(3.67g，13mmol)，在冰冷却下搅拌0.5小时。在反应液中加入二氯甲烷(20ml)－冰水(30ml)，分液，用二氯甲烷对水层进行萃取。合并有机层并水洗后，干燥，减压馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝10)精制，获得为淡黄色油状物质的5－氯－2－三氟甲磺酰氧基－3－硝基苯甲酸甲酯(3.33g，91％)。
IR(Neat)3088，2961，1742，1603，1552cm－1、APCI－MSm/z：381[M+NH4]+
2)在5－氯－2－三氟甲磺酰氧基－3－硝基苯甲酸甲酯(820mg，2.25mmol)的二甲基亚砜(5ml)溶液中，依次加入三乙胺(0.33ml，2.37mmol)及异吲哚啉(0.27ml，2.38mmol)，室温下搅拌1小时。将反应液用冰冷却，加入冰水(50ml)并搅拌后，滤出析出物，水洗，干燥。将获得的黄色结晶用硅胶柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝15)精制，得到为黄色结晶的5－氯－2－(1,2,3,4－四氢异喹啉基)－3－硝基苯甲酸甲酯(608mg，81％)。
m.p.：114～115℃、IR(Nujol)1743，1705，1603，1589，1529，1503cm－1、APCI－MSm/z：333[M+H]+
3)在5－氯－2－(1,2,3,4－四氢异喹啉基)－3－硝基苯甲酸甲酯(590mg，1.77mmol)的甲醇(6ml)－四氢呋喃(9ml)溶液中，加入10％钯碳(水分51.7％，190mg)，在氢气气氛下、室温下搅拌24小时。滤除催化剂，将滤液的溶剂浓缩至约5ml，将析出结晶滤出。在滤出的结晶中加入乙酸乙酯(50ml)－水(30ml)，用饱和碳酸氢钠水溶液将pH调整为8～9，用乙酸乙酯萃取。萃取得到的有机层在用饱和食盐水洗涤后干燥，减压馏去溶剂，由此得到为浅黄色结晶的1,2,3,4－四氢萘[1,2－a]苯并咪唑－7－羧酸甲酯(96mg，20％)。
m.p.：152～153℃、IR(Nujol)1710，1627，1611，1589，1579，1551cm－1、APCI－MSm/z：265[M+H]+
4)将1,2,3,4－四氢萘[1,2－a]苯并咪唑－7－羧酸甲酯(80mg，0.30mmol)与制造例2的3)同样地用氢化铝锂还原，得到为淡灰白色固体的1,2,3,4－四氢萘[1,2－a]苯并咪唑－7－甲醇(67mg，crude94％)。
IR(Nujol)3170，1615，1547cm－1、APCI－MSm/z：237[M+H]+
(制造例11)
1)在2－氯烟酸乙酯(928mg，5.00mmol)的脱气后的1,4－二噁烷(25ml)溶液中，依次加入3－联苯基苯基硼酸(1089mg，5.50mmol)、四(三苯基膦)钯(578mg，0.50mmol)、碳酸钾(2.07g，15.0mmol)，加热回流18小时。加入水，用乙酸乙酯萃取，将有机层依次用水、饱和食盐水洗涤后干燥，减压馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝5)精制，获得为无色油状物质的2－(3－联苯基)烟酸乙酯(1.411g，93％)。
IR(Neat)2981，1722，1716cm－1、APCI－MSm/z：304[M+H]+
2)将2－(3－联苯基)烟酸乙酯(1.38g，4.55mmol)与制造例2的3)同样地用氢化铝锂还原，获得为无色结晶的2－(3－联苯基)吡啶－3－甲醇(1.115g，94％)。
m.p：91～93℃、IR(Nujol)3265，1579，1566cm－1、APCI－MSm/z：262[M+H]+
(制造例12)
1)在2－氯烟酸乙酯(557mg，3.0mmol)的四氢呋喃(17ml)溶液中，依次加入1,2,3,4－四氢异喹啉(0，49ml，3.9mmol)及三乙胺(0.47ml，3.34mmol)，加热回流18小时。将反应液降温至室温，滤除析出物，减压馏去滤液的溶剂。将残渣溶解于乙酸乙酯，依次用水、饱和食盐水洗涤后干燥，减压馏去溶剂。将残渣用胺硅胶柱色谱(Chromatolex(注册商标)NH)(正己烷/乙酸乙酯＝19)精制，获得为无色油状物质的2－(1,2,3,4－四氢异喹啉基)烟酸乙酯(529mg，62％)。
IR(Neat)2979，1711，1584，1555cm－1、APCI－MSm/z：283[M+H]+
2)将2－(1,2,3,4－四氢异喹啉基)烟酸乙酯(511mg，1.81mmol)与制造例2的3)同样地用氢化铝锂还原，获得为无色结晶的2－(1,2,3,4－四氢异喹啉基)吡啶－3－甲醇(386mg，89％)。
m.p.：95～97℃、IR(Nujol)3184，1595，1575cm－1、APCI－MSm/z：241[M+H]+
(制造例13)
1)以3－氨基水杨酸甲酯盐酸盐及2－甲基硫代嘧啶－5－羧酰氯盐酸盐为原料，基于制造例2获得为浅黄色结晶的2－(2－甲基硫代嘧啶－5－基)苯并噁唑－7－羧酸甲酯。
m.p.：190～191℃、IR(Nujol)1719cm－1、APCI－MSm/z：302[M+H]+
2)在2－(2－甲基硫代嘧啶－5－基)苯并噁唑－7－羧酸甲酯(400mg，1.33mmol)的四氢呋喃(10ml)的悬浊液中，在冰冷却下加入77％间氯过苯甲酸(476mg，2.12mmol)，搅拌15分钟后，再在室温下搅拌3小时。在本反应液中，在室温下滴加50％二甲胺水溶液，室温下搅拌1小时。将反应液用冰冷却，加入水(25ml)，搅拌15分钟后用乙酸乙酯萃取。将有机层依次用水、饱和食盐水洗涤后，干燥，减压馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(氯仿/乙酸乙酯＝4)精制，获得为无色结晶的2－(2－二甲基氨基嘧啶－5－基)苯并噁唑－7－羧酸甲酯(328mg，83％)。
m.p.：199～201℃、IR(Nujol)1719，1628，1605cm－1、APCI－MSm/z：299[M+H]+
3)将2－(2－二甲基氨基嘧啶－5－基)苯并噁唑－7－羧酸甲酯(480mg，1.61mmol)与制造例2的3)同样地用氢化铝锂还原，得到为黄色结晶的2－(2－二甲基氨基嘧啶－5－基)苯并噁唑－7－甲醇(234mg，54％)。
m.p.：212～215℃、IR(Nujol)3283，1617cm－1、APCI－MSm/z：271[M+H]+
(制造例14)
1)以2－(2－甲基硫代嘧啶－5－基)苯并噁唑－7－羧酸甲酯(400mg，1.33mmol)为原料，基于制造例13的2)合成为无色结晶的2－[2－[N－2－(羟基)乙基－N－甲基]氨基嘧啶－5－基]苯并噁唑－7－羧酸甲酯(322mg，74％)。
m.p.：157～159℃、IR(Nujol)3529，1713，1626，1601cm－1、APCI－MSm/z：329[M+H]+
2)将2－[2－[N－2－(羟基)乙基－N－甲基]氨基嘧啶－5－基]苯并噁唑－7－羧酸甲酯(300mg，0.914mmol)的羟基通过常规方法四氢吡喃化，得到为无色结晶的2－[2－[N－2－(四氢吡喃－2－氧基)乙基－N－甲基]氨基嘧啶－5－基]苯并噁唑－7－羧酸甲酯(286mg，69％)。
m.p.：126～128℃、IR(Nujol)1717，1625，1601cm－1、APCI－MSm/z：413[M+H]+
3)将2－[2－[N－2－(四氢吡喃－2－氧基)乙基－N－甲基]氨基嘧啶－5－基]苯并噁唑－7－羧酸甲酯(275mg，0.667mmol)与制造例2的3)同样地用氢化铝锂还原，得到为无色结晶的2－[2－[N－2－(四氢吡喃－2－氧基)乙基－N－甲基]氨基嘧啶－5－基]苯并噁唑－7－甲醇(128mg，50％)。
m.p.：110～112℃、IR(Nujol)3287，1622，1603cm－1、APCI－MSm/z：385[M+H]+
(制造例15)
1)在硼氢化钠(422mg，11.14mmol)的四氢呋喃(30ml)悬浊液中，在冰冷却、搅拌下用10分钟滴加三氟化硼醚络合物(1.83ml，14.86mmol)，在本反应液中加入(±)－2－苯基－1,4－苯并噁嗪－3－酮－8－羧酸(500mg，1.86mmol)的四氢呋喃(6ml)溶液，在相同温度下搅拌5分钟，在室温下搅拌1.5小时。将反应液用冰冷却，滴加水(20ml)，用饱和碳酸氢钠水溶液中和，用乙酸乙酯萃取。萃取的有机层依次用水、饱和食盐水洗涤后干燥，减压馏去溶剂，由此获得为浅橙色油状物质的(±)－2－苯基－1,4－苯并噁嗪－8－甲醇(397mg，89％)。
IR(Neat)3375，1607cm－1
2)在(±)－2－苯基－1,4－苯并噁嗪－8－甲醇(600mg，2.49mmol)的乙醚(22ml)溶液中，在冰冷却、搅拌下加入碳酸钠(2.90g，27.35mmol)后，滴加三氟乙酸酐(3.86ml，27.35mmol)，在相同温度下搅拌15分钟，在室温下搅拌15分钟。将反应液用冰冷却后注入冰水中，用乙酸乙酯萃取，将有机层依次用水、饱和食盐水洗涤后干燥，减压馏去溶剂。在残渣中加入二异丙基醚，粉碎，过滤，干燥，由此获得为无色结晶的(±)－4－三氟乙酰基－8－三氟乙酰氧基甲基－2－苯基－1,4－苯并噁嗪(973mg，90％)。
m.p.：91～92℃、IR(Nujol)1781，1705cm－1
3)在(±)－4－三氟乙酰基－8－三氟乙酰氧基甲基－2－苯基－1,4－苯并噁嗪(953mg，2.20mmol)的甲醇(19ml)溶液中，在室温下滴加甘氨酸缓冲液(pH10，6.33ml)，搅拌30分钟。在本反应液中加入水(70ml)，室温下搅拌20分钟后，用乙酸乙酯萃取。萃取的有机层依次用水、饱和食盐水洗涤后，干燥，减压馏去溶剂，由此获得为浅橙色油状物质的(±)－4－三氟乙酰基－2－苯基－1,4－苯并噁嗪－8－甲醇(793mg，收率是定量的)。
IR(Neat)3400，1704cm－1
(制造例16)
将(5－甲氧基－2－苯基)苯并[b]呋喃－7－羧酸通过常规方法用氢化铝锂还原，合成了(5－甲氧基－2－苯基)苯并[b]呋喃－7－甲醇。
m.p.：150～151℃
(制造例17)
将3－羟甲基黄酮－8－羧酸的羟基通过常规方法乙酰化后将羧基还原，合成了3－乙酰氧基甲基黄酮－8－甲醇。
m.p.：204～206℃、IR(Nujol)1739，1616cm－1、ESI－MSm/z：337[M－H]－.
(制造例18)
通过常规方法使二甲胺与3－溴甲基黄酮－8－羧酸乙酯反应后进行还原，合成了3－二甲基氨基甲基黄酮－8－甲醇。
m.p.：149.5～150.5℃、IR(Nujol)3448，1627cm－1、APCI－MSm/z：310[M+H]+
(制造例19)
1)将制造例17中合成的3－乙酰氧基甲基黄酮－8－甲醇的羟基通过常规方法甲氧基甲基化并除去乙酰基，将所生成的醇氧化，合成了8－甲氧基甲氧基甲基黄酮－3－羧酸。
m.p.：142～143℃、IR(Nujol)1731，1621，1606cm－1、ESI－MSm/z：339[M－H]－
2)使叠氮磷酸二苯酯、叔丁醇依次与8－甲氧基甲氧基甲基黄酮－3－羧酸依次反应后，用盐酸水溶液－二噁烷水解，合成了3－氨基黄酮－8－甲醇。
m.p.：191.5～192.5℃、IR(Nujol)3391，3302，1606cm－1、APCI－MSm/z：268[M+H]+
(制造制20)
将(5－氨基－2－苯基)苯并[b]呋喃－7－羧酸甲酯的氨基通过常规方法二甲基化后，将酯基用氢化铝锂还原，合成了(5－二甲基氨基－2－苯基)苯并[b]呋喃－7－甲醇。
m.p.：115～116℃、IR(Nujol)3243，1734，1703cm－1、APCI－MSm/z：268[M+H]+
(制造制21)
1)将2－乙酰氨基－3－硝基苯甲酸甲酯(1.444g，6.06mmol)及6N盐酸(30ml)的混合物加热回流15分钟。将反应液用冰冷却，用10％碳酸钾水溶液将pH调节至8，用乙酸乙酯萃取。萃取的有机层依次用水、饱和食盐水洗涤后，干燥，减压馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝1)精制，获得为黄色结晶的2－氨基－3－硝基苯甲酸甲酯(987mg，83％)。
m.p.：94～96℃、APCI－MSm/z：197[M+H]+
2)在2－氨基－3－硝基苯甲酸甲酯(980mg，5.00mmol)的甲醇(20ml)－四氢呋喃(10ml)溶液中，加入10％钯炭(水分51.7％，250mg)，在氢气气流、室温下搅拌3小时。滤除催化剂后用四氢呋喃洗涤。将滤液、洗液合并后，减压馏去溶剂，由此获得为黄绿色固体的2,3－二氨基苯甲酸甲酯(814mg，98％)。
m.p.：65～67℃、IR(Nujol)3451，3314，1701，1619cm－1、APCI－MSm/z：167[M+H]+
3)将2,3－二氨基苯甲酸甲酯(4.00g，24.07mmol)及苯甲醛(2.56g，24.07mmol)的硝基苯(60ml)溶液在155～160℃下加热搅拌3小时。将反应液降温至室温，在该状态下用硅胶柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝20及4)精制，获得为淡黄色结晶的2－苯基苯并咪唑－4－羧酸甲酯(3.89g，64％)。
m.p.：125～127℃、IR(Nujol)3364，1709cm－1、APCI－MSm/z：253[M+H]+
4)将60％氢化钠(32mg，0.793mmol)用正己烷洗涤后，在室温下滴加2－苯基苯并咪唑－4－羧酸甲酯(200mg，0.793mmol)的DMF(1.2ml)溶液，室温搅拌1.5小时。在本反应液中滴加2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基氯(0.15ml，0.841mmol)，室温下搅拌2小时后，用冰冷却，加入水，用乙酸乙酯萃取。萃取的有机层依次用水、饱和食盐水洗涤后，干燥，减压馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝7及2.5)精制，(按照洗脱的顺序)依次获得为无色油状物质的1－[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基]－2－苯基苯并咪唑－4或7－羧酸甲酯(113mg，37％)及1－[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基]－2－苯基苯并咪唑－4或7－羧酸甲酯(133mg，44％)。洗脱的化合物的物性按照洗脱顺序来表示。
IR(Neat)2952，1722cm－1、APCI－MSm/z：383[M+H]+、IR(Neat)2951，1723cm－1、APCI－MSm/z：383[M+H]+
5)将1－[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基]－2－苯基苯并咪唑－4或7－羧酸甲酯(120mg，0.314mmol)(后洗脱的化合物)用氢化铝锂还原，获得为无色结晶的1－[2－(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基]－2－苯基苯并咪唑－4或7－甲醇(94mg，85％)。
m.p.：96～100℃、IR(Nujol)3181cm－1、APCI－MSm/z：355[M+H]+
(制造例22)
将制造例19的1)中获得的8－甲氧基甲氧基甲基黄酮－3－羧酸通过常规方法酰胺化，用盐酸水－甲醇除去甲氧基甲基后，用亚硫酰氯处理，合成了8－氯甲基－3－二甲基氨基甲酰基黄酮。
m.p.：202～203℃、IR(Nujol)1638，1630，1616cm－1、APCI－MSm/z：324[M+H]+
(制造例23)
将制造例19的1)中获得的8－甲氧基甲氧基甲基黄酮－3－羧酸通过常规方法甲酯化，用盐酸水－甲醇除去甲氧基甲基后，用亚硫酰氯处理，合成了8－氯甲基－3－甲氧基羰基黄酮。
m.p.：149.5～150.5℃、IR(Nujol)1732，1637cm－1、APCI－MSm/z：311[M+H]+
(制造例24)
将制造例19的1)中获得的8－甲氧基甲氧基甲基黄酮－3－羧酸通过常规方法除去甲氧基甲基，将羧基变换为二苯基甲酯后，用亚硫酰氯处理，合成了8－氯甲基－3－二苯基甲氧基羰基黄酮。
m.p.：185.5～186℃、IR(Nujol)1731，1629cm－1、ESI－MSm/z：485[M+Na]+
(制造例25)
将8－羟甲基－3－甲基黄酮用亚硫酰氯处理，合成了8－氯甲基－3－甲基黄酮。
m.p.：112.5～113.5℃、IR(Nujol)1622，1601cm－1、APCI－MSm/z：285[M+H]+
(制造例26)
1)以2,6－二溴萘(2.20g，7.70mmol)为原料，利用使用钯催化剂的氨基化反应获得为黄色油状物质的2－[双－2－(苄氧基)乙基]氨基－6－溴萘(2.29g，61％)。
IR(Neat)1625，1585cm－1、APCI－MSm/z：490/492[M+H]+
2)以2－[双－2－(苄氧基)乙基]氨基－6－溴萘(205mg，0.42mmol)为原料，基于制造例5获得为黄色油状物质的2－[双－2－(苄氧基)乙基]氨基－萘－6－硼酸(124mg，65％)。
(制造例27)
1)在2－氨基－5－溴吡啶(2.0g，11.56mmol)的甲醇(465ml)溶液中，在室温下滴加37％甲醛水溶液(13.55ml，180.3mmol)后，滴加氯化锌(3.94g，28.90mmol)及氰基硼氢化钠(3.63g，57.80mmol)的甲醇(155ml)溶液，室温下搅拌4小时。在反应液中在5℃下加入冰水(300ml)后，减压馏去甲醇，用乙酸乙酯－四氢呋喃(1/1)萃取。将有机层依次用水、饱和食盐水洗涤后，干燥，减压馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝24及5)精制，获得为无色结晶的5－溴－2－二甲基氨基－吡啶(1.00g，43％)。
m.p.：39～41℃、IR(Nujol)1588cm－1、APCI－MSm/z：201/203[M+H]+
2)以5－溴－2－二甲基氨基吡啶(402mg，2.00mmol)为原料，基于制造例5获得为浅褐色粉末的2－二甲基氨基吡啶－5－硼酸(321mg，crude97％)。
(制造例28)
1)将5－溴－2－氯吡啶(600mg，3.12mmol)及硫代吗啉(1.60g，15.59mmol)的混合物在100℃下搅拌16小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠，用乙酸乙酯萃取。将有机层依次用水、饱和食盐水洗涤后干燥，减压馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝50)精制，获得为无色油状物质的5－溴－2－硫代吗啉基吡啶(465mg，58％)。
IR(Neat)1581，1481cm－1、APCI－MSm/z：259/261[M+H]+
2)在5－溴－2－硫代吗啉基吡啶(706mg，2.72mmol)的脱气后的甲苯(30ml)－1,4－二噁烷(30ml)溶液中，在室温下依次加入三乙胺(30ml)、双(三丁基锡)(3.05ml，6.04mmol)及四(三苯基膦)钯(315mg，0.272mmol)，脱气，进行氩气置换后，在95－100℃下加热搅拌14小时。将反应液降温至室温，减压馏去溶剂。将残渣用胺硅胶柱色谱(Chromatolex(注册商标)NH)(正己烷/乙酸乙酯＝100)精制，获得为无色油状物质的5－三正丁基甲锡烷基－2－硫代吗啉基吡啶(467mg，37％)。
IR(Neat)1575，1535，1483cm－1、APCI－MSm/z：467/469/471[M+H]+
(制造例29)
1)在5－溴－2－氯嘧啶(1.79g，10mmol)中加入50％二甲基胺水溶液(30ml)，在氩气气氛、室温下搅拌5小时。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液(15ml)，用乙酸乙酯萃取。萃取层用饱和食盐水洗涤、干燥后，减压馏去溶剂。将残渣在40℃下减压干燥2小时，获得为无色结晶的5－溴－2－二甲基氨基嘧啶(1.83g，90％)。
m.p.：81～82℃、IR(Nujol)1586，1527cm－1、APCIMSm/z：202/204[M+H]+
2)在5－溴－2－二甲基氨基嘧啶(1.75g，8.66mmol)的四氢呋喃(18ml)溶液中，在氩气气氛、－78℃下用15分钟滴加正丁基锂(1.5M正己烷溶液；6.06ml，9.09mmol)，在相同温度下搅拌2小时后，滴加氯化三正丁基锡(2.5ml)，在相同温度下搅拌0.5小时、在室温下搅拌1小时。在反应液中依次加入10％氟化钾水溶液(50ml)、乙酸乙酯(50ml)，在室温下搅拌0.5小时后，分离出有机层。有机层为依次用水、饱和食盐水洗涤后干燥，然后减压馏去溶剂。将残渣用胺硅胶柱色谱(Chromatolex(注册商标)NH)(正己烷)精制，获得为无色油状物质的5－三正丁基甲锡烷基－2－二甲基氨基嘧啶(2.65g，74％)。
IR(Neat)2955，2925，2870，2853，1569，1519cm－1、APCI－MSm/z：410/412/414[M+H]+
(制造例30)
在N－叔丁氧基羰基－3,5－二碘－L－酪氨酸甲酯(700mg，1.28mmol)的脱气后的N－甲基吡咯烷酮(2.1ml)溶液中，在氩气气氛下依次加入三(二亚苄基丙酮)二钯(37mg，0.04mmol)、三苯基膦(69mg，0.261mmol)，在50℃下加热搅拌10分钟后，降温至室温后加入碘化亚铜(24mg，0.125mmol)。将反应液在50℃下加热搅拌10分钟后，降温至室温后滴加四甲基锡(0.39ml，2.82mmol)，在密封管中、65℃下搅拌18小时。将反应液用冰冷却，依次加入水(10ml)、饱和氟化钠水溶液，用乙酸乙酯萃取。萃取层依次用水、饱和食盐水洗涤后，干燥，减压馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝5)精制，获得为褐色油状物质的N－叔丁氧基羰基－3,5－二甲基－L－酪氨酸甲酯(230mg，56％)。
IR(Neat)3389，1739，1695cm－1、APCI－MSm/z：324[M+H]+
(制造例31)
在4－氨基－N－三氟乙酰基－L－苯丙氨酸乙酯(9.30g，30.6mmol)的二甲基甲酰胺(305ml)溶液中加入N－氯琥珀酰亚胺(9.79g，73.32mmol)，在氩气气氛、55℃下搅拌2.5小时。在反应液中，在冰冷下加入乙酸乙酯及水，用饱和碳酸氢钠水溶液将pH调节至8后用乙酸乙酯萃取。萃取层依次用水、饱和食盐水洗涤后，干燥，减压馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝6)精制，获得为无色结晶的4－氨基－3,5－二氯－N－三氟乙酰基－L－苯基丙氨酸乙酯(8.49g，74％)。
m.p.：124～125℃、IR(Nujol)3300，1742，1707cm－1、ESI－MSm/z：371/373[M－H]－
(制造例32)
按照图9－1、2的反应流程，制备本发明的O－(5－氨基－2－苯基苯并噁唑－7－基)甲基－3,5－二氯－L－酪氨酸·二盐酸盐的β－环糊精包接物。该盐为淡黄色结晶或结晶性的粉末，熔点为180～200℃(分解)。
1)苯并噁唑衍生物的合成
(2)的合成
在3－硝基水杨酸(1)(201g、1.09mol)的甲醇(1600ml)溶液中，在室温下滴加96％硫酸(60.6ml)，然后回流23小时。将反应液减压浓缩至约1/3，然后用冰浴冷却。滤取所生成的固体，用冷甲醇(600ml)、冷水(600ml)洗涤，在减压、40℃下干燥，由此获得209.7g(97％)为黄色固体的3－硝基水杨酸甲酯(2)。
(3)的合成
在3－硝基水杨酸甲酯(2)(108.2g、0.549mol)的THF(1140ml)/MeOH(810ml)溶液中加入10％Pd－C(15.2g)，在氢气1气压、室温下进行2小时催化还原。滤除催化剂，用THF洗涤后馏去溶剂。将残渣用二异丙基醚洗涤，由此获得166.7g(95％)为褐色固体的3－氨基水杨酸甲酯(3)。
(4)的合成
在3－氨基水杨酸甲酯(3)(74.8g、0.447mol)的THF(1130ml)溶液中，在5℃下用40分钟滴加N,N－二甲基苯胺(108.7g、0.897mol)。将反应液搅拌15分钟后用1小时滴加苯甲酰氯(75.7g、0.538mol)的THF(570ml)溶液。在相同温度下搅拌1小时后加入水(100ml)，馏去THF。在残渣中加入水(900ml)，用乙酸乙酯萃取，将有机层用10％盐酸、水、饱和食盐水洗涤，用芒硝干燥，馏去溶剂。将获得的粗结晶与由氨基体(3)(90.16g)通过同样的操作获得的结晶合并，用乙酸乙酯重结晶，由此得到247.1g(92％)为无色固体的3－苯甲酰氨基水杨酸甲酯(4)。
(5)的合成
在3－苯甲酰氨基水杨酸甲酯(4)(83.2g、0.296mol)的乙酸(1480ml)溶液中，在内温15℃下滴加69％硝酸(d＝1.42)(95ml、1.458mol)。将反应液在室温下搅拌3小时后，注入冰水(300ml)中，搅拌10分钟。滤取所生成的固体，用水(3次)、醚洗涤后风干，由此获得93.4g(96％)为黄色固体的3－苯甲酰氨基－5－硝基水杨酸甲酯(5)。
(6)的合成
将3－苯甲酰氨基－5－硝基水杨酸甲酯(5)(72.2g、0.260mol)和PPSE的1,2－二氯苯溶液(780ml)的混合物在150℃下搅拌4小时。将反应液用冰冷却，滤取析出的结晶，用正己烷、冷甲醇洗涤，减压干燥，由此获得61.2g(90％)为淡黄色固体的5－硝基－2－苯基苯并噁唑－7－羧酸甲酯(6)。
(7)的合成
在5－硝基－2－苯基苯并噁唑－7－羧酸甲酯(6)(59.2g、0.198mol)的甲醇(990ml)悬浊液中滴加1M氢氧化钠水溶液(297ml、0.297mol)，然后在室温下搅拌19小时。在冰冷下用10％盐酸将反应液调节为酸性，搅拌数分钟。滤取所生成的固体，用水、甲醇洗涤后，减压干燥，由此获得54.2g(96％)为无色固体的5－硝基－2－苯基苯并噁唑－7－羧酸(7)。
(9)的合成
在5－硝基－2－苯基苯并噁唑－7－羧酸(7)(26.4g、0.0931mol)的THF(470ml)悬浊液中加入三乙胺(15.57ml、0.112mol)，在室温下搅拌30分钟。将反应液冷却至－10℃，加入氯代碳酸乙酯(10.68ml、0.112mol)，在相同温度下搅拌30分钟。加入硼氢化钠(8.84g、233.7mmol)搅拌30分钟后，在－10～－6℃下用3小时滴加THF/水(317ml/64ml)。再将反应液搅拌2小时，然后注入冰水，滤取析出的固体，用水洗涤。将由5－硝基－2－苯基苯并噁唑－7－羧酸(7)(14.6g)通过同样的操作获得的固体合并，悬浊在THF(600ml)/甲醇(600ml)中，加入1M氢氧化钠水溶液(115ml)后在室温下搅拌4.5小时。将反应液加入冰水中，滤过析出的固体后，风干，由此获得24.4g(63％)为几乎无色的固体的7－羟甲基－5－硝基－2－苯基苯并噁唑(9)。
(10)的合成
在7－羟甲基－5－硝基－2－苯基苯并噁唑(9)(46.2g、0.171mol)的THF(1150ml)悬浊液中，在冰冷下加入三乙胺(34.9ml、0.250mol)。滴加甲磺酰氯(23.1g、0.200mol)，在冰冷下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌3小时。追加三乙胺(4.55ml、0.033mol)、甲磺酰氯(1.29ml、0.017mol)，再搅拌30分钟。将反应液注入冰水中，滤过析出的固体。将获得的固体用水、二异丙基醚洗涤后，在40℃下减压干燥，由此获得59.1g(99％)为淡黄色固体的5－硝基－2－苯基苯并噁唑－7－基甲基甲磺酸酯(10)。
2)二氯酪氨酸衍生物的合成
(12)的合成
在(S)－酪氨酸甲酯盐酸盐(11)(60.15g、0.26mol)的乙酸(294ml)悬浊液中，在室温下滴加磺酰氯(52.22ml、0.65mol)，然后搅拌3.5小时。浓缩反应液，将残渣用醚充分洗涤、干燥，由此获得72.70g(93％)为无色固体的(S)－二氯酪氨酸甲酯盐酸盐(12)。
(13)的合成
在(S)－二氯酪氨酸甲酯盐酸盐(12)(72.42g、0.24mol)的水(1.4l)悬浊液中，在冰冷下滴加2M碳酸钾水溶液(120.5ml)。加入二叔丁基二碳酸酯(58.1ml、0.25mol)的二氯甲烷(1.4l)溶液，在冰冷却下搅拌1.5小时，在室温下搅拌40小时。将反应液用硅藻土(Celite)过滤后，用氯仿对滤液进行萃取。将有机层用水、饱和食盐水洗涤，用芒硝干燥，馏出溶剂。将残渣用正己烷洗涤，由此获得76.95g(88％)为无色固体的(S)－N－Boc－二氯酪氨酸甲酯(13)。
3)本发明的化合物盐的合成
(14)的合成
将5－硝基－2－苯基苯并噁唑－7－基甲基甲磺酸酯(10)(29.11g、83.6mmol)溶解于THF(820ml)中，加入丙酮(820ml)。加入(S)－N－Boc－二氯酪氨酸甲酯(13)(36.54g、100mmol)、碘化钠(12.53g、83.6mmol)、碳酸钾(17.37g、125mmol)，在室温下搅拌21小时。过滤反应液，将滤液浓缩至约1/2。加入乙酸乙酯、水，分液后将有机层用水、5％硫代硫酸钠水溶液、饱和食盐水洗涤，用芒硝干燥，馏去溶剂。将加上由5－硝基－2－苯基苯并噁唑－7－基甲基甲磺酸酯(10)(30.06g)、(S)－N－Boc－二氯酪氨酸甲酯(13)(37.66g)通过同样的操作获得的生成物在内的、共计116.2g粗生成物用二异丙基醚洗涤后干燥，由此获得98.43g(94％)为淡黄色固体的硝基体(14)。
(15)的合成
将硝基体(14)(57.04g、92.5mmol)溶解于THF(1340ml)中，加入异丙醇(1340ml)，加热至内温为60℃。加入5M氯化铵水溶液(278ml、1.39mol)，然后加入铁粉(103.32g、1.85mol)，在60℃下搅拌3小时。将反应液用硅藻土过滤，将滤液浓缩至约1/3。硅藻土上的废弃物用热乙酸乙酯洗涤3次，将滤液合并，用水、饱和食盐水洗涤后，用芒硝干燥。馏去溶剂，将获得的固体用二异丙基醚洗涤、干燥，由此获得53.03g(98％)为黄色固体的氨基体(15)。
(16)的合成
将氨基体(15)(86.91g、0.148mol)溶解于THF(1430ml)中，边用冰浴冷却至内温为约10℃边滴加0.5M氢氧化锂水溶液(444ml、0.222mol)，再在冰浴中搅拌1小时。将反应液浓缩至约1/2，加入水(600ml)，再用10％柠檬酸水溶液将pH调整为约4，然后用乙酸乙酯－THF(10：1)萃取。将萃取液用水、饱和食盐水洗涤，用芒硝干燥，馏去溶剂。将获得的残渣用乙酸乙酯－THF(10：1)重结晶，获得几乎无色的固体(72.94g、粗收率86％)。将该固体(10.03g)用氯仿－甲醇(10：1)重结晶，获得了8.63g(回收率86％)为几乎无色的固体的羧酸(16)。
(17)本发明的化合物盐的合成
在冰冷下，在5～10℃下在羧酸(16)(85.23g、0.149mol)的THF(750ml)溶液中用2小时滴加4M氯化氢－二噁烷(1117ml、4.47mol)。将反应液在相同温度下搅拌1小时后，缓慢升温并在室温下搅拌20小时。加入二异丙基醚并滤取固体，用二异丙基醚洗涤。将获得的固体分成3批，溶解于乙醇(共计2300ml)中，滤除不溶物。将滤液在室温、减压下浓缩至约1000ml，将获得的溶液在室温下搅拌。滤取所生成的结晶，干燥，由此获得66.11g(81％)为淡黄色固体的本发明的化合物盐(17)。
4)环糊精包接物的合成
(1)称量1000g磺丁基-β-环糊精(简称为SBE-CD，商品名Captisol)，在细胞培养用的无菌罩内装入5L的容器中，加入HPLC用级别的纯水1800ml，搅拌一晚，获得澄清的溶液(约36重量％)。
(2)次日早晨在水槽中加热至32-36℃，保持该温度并加入本发明的化合物的HCl盐45.5g(以freebase计相当于35.5g)、100ml的乙醇、200ml的纯水、然后添加300ml的上述SBE-CD溶液，获得化合物溶液。确认该溶液的pH为3～4。
(3)将3.4g苛性钠溶解于200ml纯水中，边搅拌上述溶液边加入该苛性钠水溶液将pH调整至6.5。
(4)在该温热状态下，使用真空泵用0.4μm的过滤器对溶液进行过滤灭菌。滤液装入灭菌后的5L容器中，用(1)中制备的SBE-CD溶液稀释从而将最终体积调整至2800ml。
(5)再搅拌5分钟后测定pH，确认pH为～6.5。使用灭菌分注器在30ml管形瓶中各分注15ml。最终化合物浓度为10mg/ml。各管形瓶用冷冻干燥机(Lyostar3,FTSSystemsSPScientific)处理1周。
(6)冷冻干燥后的管形瓶用橡胶塞密封，压上金属盖，在冰箱中保存。
(7)为了再次溶液化而加入14.1ml的注射用蒸馏水，通过5～10分钟的涡旋混合器处理形成15ml淡黄色的溶液。
《试验例》
利用以下的材料及方法进行试验。
(Pten缺失小鼠(tPTEN－/－))
动物实验遵循赫尔辛基宣言而进行，此外，协议得到设施内的伦理委员会(2011～73)及CIEPAL(NCE/2011～33)批准。小鼠在C3M的动物饲育室设施内在除去特定病原体条件下维持。Pten缺失小鼠(tPTEN－/－)是使带有2个Ptenflox等位基因的小鼠与近端lck启动子－cre转基因小鼠杂交而产生的(参考文献53)。动物按照前述方式(参考文献53)利用PCR进行了鉴定。
(转录组分析)
在观察到淋巴瘤形成的临床症候时(例如毛倒竖(furruffling)、蜷曲的姿态、颜面浮肿、和/或浅呼吸(shallowbreathing))，通过注射致命性戊巴比妥使小鼠安乐死。解剖肿瘤，将肿瘤在70μm滤网(BDBiosciences)上在PBS中均质化，分离全RNA，按照前述方式(参考文献54)转录成cDNA。对彼此无关4个肿瘤进行分析，此外还对2个来自野生型小鼠的胸腺细胞进行处理。使cDNA在AffymetrixDNA芯片(Affymetrix－MoGene－1＿0－st－v1)中杂交，将基因表达数据标准化(GSE39591)，使用25％的假表达率，实施了监督下的(supervised)SAM(微阵列的显著性分析(SignificanceAnalysisofMicroarrays))分析。然后，为了鉴定异化表达的探针，在p值＜104下使用关于微阵列分析的线形模型(LIMMA)。由此带来具有abs(log倍数变化(logFoldChange))＞0.5的基因选择。除去在表现型及未被标记的序列之间具有更小的p值的复制物后，通过分析的组合在肿瘤中鉴定出498个上调基因及279个下调基因。
(细胞培养物)
使由彼此无关的tPTEN－/－肿瘤建立的以KO99L、KO1081L、及KO631L表示的小鼠细胞株以及人Ke37、DND41、Sil－ALL、Peer、Molt－16、Jurkat(T－ALL)、及SupT1(T－LL)均在补充了10或20％(Sil－ALL及小鼠细胞株)胎牛血清、以及50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、及1.0mM丙酮酸钠(Sigma－Aldrich))的RPMI1640培养基(Invitrogen)中增殖。细胞培养物在5％CO2、37℃条件下维持。
(试剂)
本研究中使用的化学化合物：2－氨基双环－(2,2,1)－庚烷－2－羧酸(BCH)、地塞米松、盐酸阿霉素、必需氨基酸(EAA；50×溶液)、非必需氨基酸(NEAA；100×溶液)、D－亮氨酸、及Wortmannin(Sigma－Aldrich)；KU0063794(rel－5－[2－[(2R,6S)－2,6－二甲基－4－吗啉基]－4－(4－吗啉基)吡啶并[2,3－d]嘧啶－7－基]－2－甲氧基苯甲醇)、PI－103盐酸盐(3－[4－(4－吗啉基吡啶并[3’,2’：4,5]呋喃并[3,2－d]嘧啶－2－基]苯酚盐酸盐)、及雷帕霉素(TocrisBioscience)；L－天冬酰胺酶、Erwinase(注册商标)(Crisantaspase)(EUSA－PHARMA)。Salubrinal(N-(2,2,2-三氯-1-(3-(喹啉-8-基)硫脲)乙基)肉桂酰胺)(EnzoLifeScience)；Q－VD－OHP(MPBiomedicals)。
(患者)
按照设施内的准则获得知情同意。经肝素处理的血液由3名T－ALL患者及2名健康供体获得。患者淋巴母细胞是按照销售方推荐的步骤使用Ficoll－PaquePLUS密度梯度在收集后24小时以内分离(GEHealthcareLifeSciences)。
(细胞生存能力、增殖、及细胞毒性检测)
使用两种不同的检测：i)在96孔板形式中，将细胞(每孔4.0±0.1×104；100μL)与效应物一起孵育(48小时、37℃；每个实验n＝4)，然后在96孔板的各孔中追加WST－1试剂(10μL；RocheDiagnostics)，孵育，在490nm下测定甲赞生成；及ii)将细胞(每孔2.0±0.1×104；100μL)与效应物一起孵育(48小时、37℃；每个实验n＝4)，然后在各孔中追加溴脱氧尿苷试剂(10μL/孔；RocheDiagnostics)，孵育(8小时、37℃)。然后，将细胞固定，变性，与和过氧化物酶(POD)抗体偶联的抗BrdU一起孵育(100μL/孔)。追加比色定量底物(TMB：四甲基联苯胺；100μL/孔)，通过测定与DNA合成及增殖相应的细胞光学浓度(450nm)对BrdU的摄入进行定量。
(蛋白质印迹分析)
使用细胞溶解缓冲液(加入了蛋白酶抑制剂混合物的50mMHEPES、pH7.4、150mMNaCl、20mMEDTA、100mMNaF、10mMNa3VO4、0.5％壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP40))制备细胞提取物。在利用SDS－PAGE进行分离及向硝基纤维素转录后，使用以下的抗体进行免疫印迹：Akt(CellSignalingTechnologies、#9272)、CHOP(#2895)、切断的半胱天冬酶3(#9664)、c－Myc(#9402)、eIF2α(#9721)、4EBP1(#9644)、LC3A/B(#12741)、PARP(#9542)、pJnk(T183/Y185)(#9251)、pSer235－236－S6RP(#4856)、pSer473－Akt(#9271)、pSer65－4EBP1(#9451)、及S6RP(#2217)；Bax(Sigma－Aldrich、B8429)；PUMA(Abcam、ab54288)；Bak(Millipore、06536)；ATF4(SantaCruzBiotechnologies、sc200)、GADD34(sc8327)、Hsp60(sc－1722)、Hsp90(sc－13119)、及XBP1(sc－7160)；ATF6(Imgenex、IMG－273)。
(膜联蛋白V/PI染色检测)
细胞凋亡评价通过利用膜联蛋白－V－FITC(Invitrogen)测定磷脂酰－丝氨酸膜的再分布来进行。将细胞(每孔5.0±0.1×105；2.0mL)与效应物一起孵育，再悬浊于染色溶液(110μL；膜联蛋白－V(1/10))中，在暗处(15分钟、RT)孵育。将细胞用PBS洗涤，再悬浊于碘化丙啶染色溶液(1.0μg/ml；2.0mL)中，立即在MacsQuantAnalyser(MiltenyiBiotech)中通过流式细胞术进行分析。相对于作为参照的未处理细胞来确定基底的细胞凋亡及坏死。
(CD98表面表达的分析)
收集细胞，用PBS洗涤。旋转后将细胞(106；PBS、EDTA5.0mM、0.1％BSA中1.0mL)在暗处、4℃下、30分钟条件下与大鼠抗CD98抗体(H202－141、5.0μg/ml、BDPharmingen)一起孵育。洗涤细胞，在4℃、30分钟条件下与山羊抗大鼠AlexaFluor(注册商标)－488第二抗体(A11006、2μg/ml、LifeTechnologies)一起孵育。对细胞进行离心沉淀，洗涤2次，用1％PFA固定直至MacsQuantAnalyser(MiltenyiBiotech)分析为止。
(线粒体膜内外电位差的确定)
使用四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐检测(TMRE；MolecularProbes)，对与细胞凋亡事件相关的线粒体膜内外电位差(ψm)的变化进行测定。将小鼠或人细胞(每孔5.0±0.1×105；2.0mL)曝露在各种浓度的COMPOUND-JP到24小时为止，然后与TMRE一起孵育(1.0μM；30分钟、37℃)。然后将细胞用PBS洗涤2次，然后用DAPI(Sigma－Aldrich、1.0μg/ml)染色，利用MACSQuantAnalyser(MiltenyiBiotech)检查，用FlowJo软件对数据进行评价。
(活性半胱天冬酶3染色)
对细胞(每孔1.0±0.1×106；1.0mL)在半胱天冬酶3抑制剂Qvd－OH(20μM)存在或不存在下通过各种COMPOUND-JP用量进行刺激。然后，用半胱天冬酶3抑制剂偶联物(RED－DEVD－FMK；Biovision)对细胞进行染色，孵育(1.0小时、5％CO2、37℃)。将细胞用洗涤缓冲液洗涤，然后离心分离(3000rpm、5.0分钟)，用膜联蛋白V－FITC(10μL/ml；MiltenyiBiotech)染色30分钟，在利用MacsQuantAnalyser进行检查前追加DAPI(1.0μg/ml)。
(细胞内流式细胞术分析(phospho流式))
将细胞(每孔1.0±0.1×106；1mL)与各种效应物(24小时、37℃)一起孵育，然后用Cytofix/Cytoperm缓冲液(100μL、30分钟、4℃)进行透过处理，然后用PermWash(BDBiosciences)洗涤，用phospho－Ser235/236－S6RP抗体染色(30分钟、4℃)。进一步的PermWash后，接着将细胞用第二抗体抗兔alexaF488(20μg/ml；LifeTechnologies)染色(30分钟、4℃)。然后，在PermWash中洗涤细胞，再悬浊于染色缓冲液(PBS+0.1％牛血清白蛋白+1.0％多聚甲醛)中，用MacsQuantAnalyser(MiltenyiBiotech)通过流式细胞术进行分析。
(体内肿瘤增殖的监控)
对各实验组中的全部小鼠皮下注射稳定表达荧光素酶报告基因的99KOL－LUCT淋巴瘤细胞(200μL；5.0±0.1×106)。注射起2天后，对小鼠腹腔给药在食盐水(NaCl0.9％)中溶解、混合药粉而制备的COMPOUND-JP(50mg/kg/天/每周5天)。每隔5天测定体重及肿瘤体积。肿瘤体积按照下述数学式算出：V＝(L×W2)/2(L：长度；W：宽度)。为了进行生物发光成像，对小鼠腹腔注射D－荧光素(CaliperLifeScience)(150μL、30mg/mL)，通过吸入异氟烷(2.0％)实施麻醉。使用安装有高灵敏度冷CCD相机的Photonimager(BiospaceLab)监视生物发光信号，图像均在D－荧光素注射10分钟后收集。数据集中在覆盖肿瘤区域的感兴趣区域(ROI)，使用全光束发射(totalphotonfluxemission)(光子/秒(photons/second))进行分析。
(免疫组织化学检查)
利用一次抗体兔phosphoS6RP抗体(#4858、CellSignalingTechnology)对解剖出的肿瘤的石蜡块中的切片(4μm)进行标记。对于切片，在利用二氨基联苯胺(DAB)显色前，按照厂商推荐的方式追加与过氧化物酶(HRP)偶联的第二抗体即抗兔抗体(SignalStain(注册商标)、#8114、CellSignalingTechnology)。为了对坏死进行评价，将切片用苏木精/伊红/番红(HES)染色。对图像进行分析，使用ImageJ软件(NIH)对坏死面积进行定量。
(统计分析)
关于体外实验的统计分析，在95％的置信水平下使用双侧studentt检验来进行；或使用方差分析(ANOVA)后接着进行Dunnett多重比较检验而计算。关于组合，为了确定实验组之间的显著性，通过方差分析、然后接着Tukey多重比较检验来进行分析。药剂之间的协同作用使用Chou－Talalay法进行分析。关于体内实验，统计分析使用双侧Mann－Whitney秩和检验来进行。P值＜0.05视为统计学上有显著性(＊：p＜0.05；＊＊：p＜0.01；＊＊＊：p＜0.001)。分析使用GraphPAdPrism3.0软件来进行。
(在来自人的各种癌的建立的培养细胞中表达的中性氨基酸转运蛋白、LAT1及LAT2基因的定量)
由各细胞提取RNA，使用LAT1及LAT2特异性引物通过定量PCR法测定各mRNA。
(LAT1选择性抑制剂COM-JP对来自人硬胃癌的44As3-11细胞和来自人胰腺癌的Panc-1细胞增殖的抑制效果)
在各癌细胞的培养液中，在COM-JP不存在下以及不同浓度的COM-JP存在下继续培养5天。通过MTT法测定经过每天的细胞的增殖活性。
(显示LAT1选择性抑制剂COM-JP和现有药物吉西他滨(GEM)、紫杉醇(Pac)的单独作用以及并用作用的实验步骤)
将来自人硬胃癌的44As3-11细胞和来自人胰腺癌的Panc-1细胞的2种癌细胞在COM-JP存在下、不存在下进行培养，第2天添加GEM及Pac，继续培养2小时，然后更换培养基，在COM-JP存在下、不存在下再培养2天。最后收集细胞，通过MTT法对细胞的生存活性进行定量。各实验对于相同条件的组分别测定3例，将平均值、标准误差以及差异显著性检验的p值示于图中。
(COM-JP和5-FU对来自人大肠癌的HT-29细胞移植裸小鼠模型中的肿瘤增殖的并用效果)
将HT-29细胞移植到小鼠的皮下，从肿瘤的尺寸生长至某一定尺寸以上的状态开始，每天测定COM-JP及5-FU的单独以及并用所致的肿瘤块尺寸的变化。
(COM-JP和CDDP的并用对来自人大肠癌的HT-29细胞的原位移植裸小鼠模型(SOImodel)中的肿瘤增殖的协同效果)
使海萤荧光素在来自人大肠癌的HT-29细胞中表达，将其移植到小鼠的大肠壁，作出MetaMouse。由此，可以利用发光强度每天对肿瘤的尺寸进行定量。图16中在棒状图中示出各处置组中的肿瘤尺寸。组1为参照组，组2～4分别进行将COM-JP分别按照3.1、12.5、50mg/Kg体重/天的量连续4周每天单独腹腔给药给药，组5进行将CDDP按照2.5mg/Kg/天在第0、6、13天3次单独腹腔给药，组6～8进行组2～4和5的组合的并用给药，组9进行将COM－JP按照300mg/Kg/天口服4周连续每天给药。
《结果》
以下示出上述试验的结果。
(tPTEN－/－肿瘤、人T－ALL/T－LL细胞株、及初代细胞中，LAT1/CD98hc(slc7a5/slc3a2)的表达增强)
小鼠(tPTEN－/－)中产生了高恶性度、侵袭性的淋巴瘤。使用全基因组(pan－genomic)Affymetrix小鼠DNA芯片建立了正常胸腺细胞及tPTEN－/－胸腺肿瘤细胞的整体基因表达。将数据标准化后，评价了来自野生型胸腺细胞(n＝3)及tPTEN－/－肿瘤细胞(n＝4)的基因表达谱(GEP)。与野生型相比，tPTEN－/－肿瘤细胞中显示有498个上调的基因。如图1A所示，本发明人等观察到，与正常细胞相比，编码LAT1的SLC7A基因在tPTEN－/－中上调(log2：2.44倍)。作为参照，编码CD98hc的SLC3A2的表达在肿瘤中仅微弱增强(0.874倍)。进而，为了作为基准使用，本发明人除此之外还示出了在tPTEN－/－细胞中高度表达的c－myc基因(2.22倍)的结果，作为看家基因的marks在两个种类间没有显著性差异。通过定量PCR分析，可以确认在恶性细胞中未观察到SLC3A2的表达增强、但观察到LAT1及c－myc的表达增强。在2个初代tPTEN－/－肿瘤(KO小鼠#99、#631)中观察到LAT1的高度表达，将其分别用于建立表示为KO99L及KO631L的细胞株。如序论中所述，为了具有运载活性，LAT1中以二硫键相连的CD98hc是必不可少的。因此，本发明人还使用抗CD98hc抗体进行流式细胞术分析，由此对CD98hc的表面表达进行了分析。与正常(WT)胸腺细胞相比(图1B)，5个tPTEN－/－肿瘤表现出更高度的CD98表达。细胞活化：(PMA+离子霉素)与肿瘤胸腺细胞中的17倍相比，带来了2.8倍的表达增加(图1D)。
同样地，与来自健康供体的静息及活化末梢血淋巴细胞(PBL)相比，3个初代人T－ALL样品显示出更高度的CD98水平(图1D～E)。概述的话，这些结果表明，CD98的表达在活化小鼠及人T细胞中增强，在转化淋巴细胞中则达到更高的水平。
(药理学上的CD98/LAT1靶向使体外的tPTEN－/－细胞的生存减少)
本发明人等为了调查各种浓度的BCH、D－亮氨酸、及COMPOUND-JP存在下的细胞生存能力，使用了表示为KO99L的建立的tPTEN－/－肿瘤细胞株。BCH虽然是经典的系统L抑制剂，但缺乏LAT1选择性(非专利文献18)。如图2A所示，关于BCH及D－亮氨酸，高用量浓度下，细胞维持高度的细胞生存能力，细胞生存能力在10.0及30.0mM下分别为30％及60％；图2A)。作为参照，LAT1选择性抑制剂COMPOUND-JP很大程度上影响着KO99L细胞生存能力，对于杀死半数细胞而言，显示出更低的药剂浓度，IC50＝2.4μM(图2A)。在10.0μM下，COMPOUND-JP在48小时后使细胞周期(增殖)减少75％(图2B)。在浓度依赖性的方式中，COMPOUND-JP影响着新分离的tPTEN－/－肿瘤细胞的细胞生存能力，但在正常小鼠胸腺细胞中是无毒的(补充资料图S1A)。
(COMPOUND-JP抑制必需氨基酸的流入)
已有足够证据表明，LAT1介导了大的中性氨基酸的摄入(参考文献21)；(参考文献22)。如图2C所示，COMPOUND-JP(2.5～10.0μM)与KO99L细胞一起孵育时，引起细胞生存能力的用量依赖性降低，通过对培养基补充必需氨基酸(EAA)可以获得一些逆转，但非必需氨基酸(NEAA)没有补救的效果。并且，如图2D中归纳那样，COMPOUND-JP诱导的细胞死在不是NEAA、而是追加EAA时减少2.5倍。这些数据进一步验证了COMPOUND-JP通过改变EAA的摄入而发挥作用的观点。
(COMPOUND-JP在体内干扰tPTEN－/－肿瘤增殖)
将稳定地转染了荧光素酶表达载体的KO99L细胞注射到裸小鼠皮下，然后(第2天)用COMPOUND-JP(50mg/kg/天＝1.5mg/小鼠/天)对动物进行治疗。每5天收集肿瘤相关的生物发光及肿瘤体积数据。与赋形剂治疗组相比，每天的COMPOUND-JP治疗在第18天使肿瘤平均体积减少了45％(p＜0.05)(图2E)。肿瘤发光(图2F)也由于COMPOUND-JP治疗而在统计学上显著减少(59％；p＜0.05)(图2G)。肿瘤的免疫组织学分析表明，JPH206治疗在肿瘤内带来了坏死性响应(10.5+/－0.5％相对于4.6+/－0.5％；图4C)。
(COMPOUND-JP改变了人T－ALL/T－LL细胞株及患者初代细胞)
本发明人等尝试验证了COMPOUND-JP对LAT1的靶向以及T－ALL/T－LL细胞株和初代肿瘤细胞是否有影响。为了证实COMPOUND-JP能够改变细胞生存(图2H)及增殖(图2I)而使用人JurkatT－ALL株。并且还示出由4个不同患者分离的初代T－ALL细胞在浓度依赖性模式下的COMPOUND-JP感受性(细胞生存能力)(图2J)。虽然差异很大，但COMPOUND-JP对于正常的静息人PBL细胞或活化人PBL细胞中并没有诱导细胞死(图S2B)。进而，与强烈影响细胞增殖的细胞凋亡诱导剂十字孢碱(STS：1.0μM)相比，COMPOUND-JP不会显著改变PBL细胞增殖(1.0～50.0μM；图S2C)以及正常的脐带血单核细胞(5.0及10.0μM；图S2D)。与其已知的LAT1/LAT2抑制剂选择性一致，这些实验结果证实了与正常(健康、表达LAT2)T细胞相比，COMPOUND-JP优先作用于白血病性细胞(表达LAT1)。
(COMPOUND-JP引起细胞凋亡及自噬作用)
将KO99L细胞曝露于COMPOUND-JP诱导了细胞凋亡。与参照(无COMPOUND-JP)相比，关于48小时后的膜联蛋白－V+及膜联蛋白－V+/DAPI+细胞分析(图3A)，在10.0及20.0μM下分别显示2.8及3.8倍的高水平的细胞凋亡。在将COMPOUND-JP与显著减少凋亡细胞量、阻碍半胱天冬酶活化的抑制剂QvD－OPH(20.0μM)同时给药时，进一步确认到这些结果。线粒体外膜透过性化(MOMP)是扭曲线粒体膜内外电位差(Δψm)的初期细胞凋亡细胞死事件(参考文献23)。已经明确使用四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐染色检测(TMRE)时，COMPOUND-JP(5.0及10.0μM)在KO99L细胞中引起MOMP(图3B1)。获知在KO99L细胞中观察到的线粒体去极化依赖于COMPOUND-JP浓度(2.5～20.0μM；48小时)，在所试验的最高浓度下达到70％(图3B2)。本发明人等利用蛋白质印迹法在48小时期间检查了半胱天冬酶3的切断，由此监测半胱天冬酶的活化(图3C)。在追加COMPOUND-JP(10.0μM)的4～6小时后能够观察到半胱天冬酶3的切断(图3C的泳道4及5)。截止48小时(泳道8)，本质上全部的细胞半胱天冬酶3均被加工。进而，本发明人还利用已知的半胱天冬酶底物Red－DEVD－fmk调查了COMPOUND-JP使细胞相关性荧光增加的能力，结果在与QvD－OPH(20.0μM；图3D1)预孵育时，恢复至基线。如图3D2所示，COMPOUND-JP的结果具有用量及时间依赖性，能够通过同时给药QvD－OPH而消除(图3D1、2)。在半胱天冬酶3的底物PARP以及COMPOUND-JP(10.0μM；24小时)存在时，观察到完全切断，不存在在细胞的Hsp60水平下能够观察到的变动(图3E的泳道4)。此外，COMPOUND-JP对初代tPTEN－/－细胞也有效，在用量依赖性的(2.5～20.0μM)模式下，诱导细胞死(图3F；数据为5个初代tPTEN－/－肿瘤的平均值)。使用初代KO#732细胞(图3G)，在分子水平确认到细胞凋亡。COMPOUND-JP诱导了半胱天冬酶3的加工及PARP切断(18.0小时；泳道10、11)。我们认为，雷帕霉素没有效果(泳道5、9、13)，但PI103是初期(2.0小时、泳道4)的及有效的细胞死诱导因子(泳道8、12)。作为在营养素不足期间可能发生的保护响应，在细胞凋亡之前可能发生自噬作用。如图3H所示，COMPOUND-JP(10.0μM)的曝露刺激了LC3－II的蓄积，而LC3－II为LC3的自噬形态，与自噬作用的第1步相关(参考文献24)。LC3－II的蓄积在6.0小时达到峰值(图3H的泳道3)，然后下降(泳道4～6)。如图3I所示，QvD－OPH(20.0μM)的存在可以对抗细胞凋亡，能够使LC3－II维持至18.0小时(泳道5与泳道7相比)。与自吞噬体(aotuphagosome)形成相关的Atg5水平逐渐增加，在6.0小时达到最大(泳道6)，在18.0小时恢复至基线(泳道7)。进而，在细胞凋亡被抑制时检测到pJNK应激通路的活化(泳道5与泳道7相比)。总体上看，这些实验结果支持了COMPOUND-JP在最初引起自噬响应、然后迅速进入细胞凋亡的见解。
(COMPOUND-JP引起的LAT1抑制干扰mTORC1的活化)
由KO99L细胞中的pS6RP降低可以确立(图4A)，本发明人等观察到COMPOUND-JP(10.0μM)最快能够在2.0小时影响mTORC1的活化(泳道5)、在6.0小时(泳道6)及24小时(泳道7)均维持了这种影响。COMPOUND-JP的mTOR抑制效果还在对2个初代T－ALL样品的phospho流式细胞术中被观察到(图4B)。进而，pS6RP染色在利用COMPOUND-JP治疗来自小鼠的肿瘤中急剧减少，证实了化合物的体内抑制效果(图4C)。通过测定丝氨酸473的磷酸化获知，COMPOUND-JP在KO99L细胞中还干扰Akt的活化(图4A)。作为参照，COMPOUND-JP不影响4E－BP1的磷酸化，证实了COMPOUND-JP仅部分扰乱mTORC1的活化。明确了Akt抑制剂MK－2206(5.0μM)及Akt/mTOR2重抑制剂KU0063794(5.0μM)最快能够在2.0小时完全抑制S6RP、4EBP1、及Akt的磷酸化(图S2)。雷帕霉素(10.0nM)的作用虽然类似于COMPOUND-JP(10μM)中观察到的作用，但雷帕霉素为mTORC1抑制剂，而非mTORC2抑制剂(参考文献25)，其完全抑制S6RP的磷酸化，但不抑制4EBP1的磷酸化(图S2)。与COMPOUND-JP(图S2)相比，雷帕霉素在更迟的时候影响Akt的磷酸化/活化。已经确认LAT1为与细胞内谷氨酰胺交换的细胞外EAA交换体(参考文献26)，因此本发明人等尝试调查了各种谷氨酰胺水平能够如何干扰EAA流入及mTORC1的活化。为此，本发明人等使用了能够分解细胞外天冬酰胺且具有谷氨酰胺酶活性的两种酶(L－天冬酰胺酶(L－Asp)及Erwinase(Erw))。如图S2所示，L－Asp及Erw(2.5单位/ml)二者均改变了S6RP的磷酸化，但Erw具有更高的谷氨酰胺酶活性，因此比L－Asp更强力。与参照(图S2；泳道15～17)相比，Erw(泳道18～20)及L－Asp(泳道21～23)还改变了4EBP1的磷酸化，与此相对地，它们对于Akt的磷酸化均没有显著影响。据报道，抑制蛋白酶体活性会妨碍氨基酸稳态(参考文献27)。在本发明人的模型中，作为蛋白酶体抑制剂的万珂(Vel；图S2)不是在初期的时点(2.0及6.0小时；分别为泳道24及25)而是在24小时(泳道26)使S6RP、4EBP1、及Akt的磷酸化完全消失。上述全部实验证实了各种药剂不会显著改变S6RP、4EBP1、Akt、及Hsp90的整体水平、对磷酸化观察到的影响并非是蛋白质的量的差异引起的。
(LAT1抑制及c－myc蛋白质水平)
c－myc蛋白质在人淋巴瘤及tPTEN－/－肿瘤中显示出上调(参考文献28)。tPTEN－/－细胞中，观察到c－myc在SDS－PAGE(图4D；泳道1～4)中在60kDa附近以三个组的形式移动。将COMPOUND-JP(10.0μM)与细胞一起孵育时，总c－myc在2.0小时已经减少(泳道5)、并维持到24小时(泳道7)，特别是c－myc的2个下方的移动形态显著减少。与万珂一起孵育时观察到类似结果(8nM；24小时；泳道10)。对由KU0063794(10.0μM)引起的Akt/mTOR抑制也略微影响2个下方的条带(泳道15～17)。MK－2206(10.0μM)介导性的Akt抑制导致3个c－myc异形体在24小时以内全部突然消失(泳道18～20)。与COMPOUND-JP显著不同的是，雷帕霉素(100nM)不影响c－myc水平(泳道12～14)，结果是缺少对细胞凋亡的诱导。通过上述各种实验，支持了以下见解：无法明确观察到Hsp90水平的变动，因此证明了观察到的药剂所引起的各种结果并非是整体的细胞蛋白质含量显著变化导致的。进而，本发明人等并未观察到COMPOUND-JP如何干扰整体的蛋白质合成。综上，实验数据与下述见解一致：COMPOUND-JP引发的c－myc下调也许是其抗白血病性效果的重要特征。
(COMPOUND-JP活化整合应激反应(IntegratedStressResponse)/非折叠蛋白反应)
已知蛋白质和/或氨基酸稳态异常会引发可能导致自噬作用及细胞死的内质网/整合应激反应(ISR)/非折叠蛋白反应(UPR)(参考文献29)。作为“C/EBP同源蛋白”(CHOP)而已知的转录因子的表达在ER应激期间变成诱导性，参与ER介导性的细胞凋亡(参考文献30)。紊乱(无秩序)的CHOP活性会损害细胞生存能力，缺乏CHOP的细胞显著受到保护，不会导致ER应激的致命性结局(参考文献31)。在KO99L细胞中利用免疫印迹评价时，COMPOUND-JP(10.0μM)在2.0小时(图5A、泳道5)之内迅速诱导CHOP表达，其在6.0小时(泳道6)达到最大，在24小时(泳道7)达到稳定状态。虽然与COMPOUND-JP相比为少量，但在6.0小时(泳道9)及24小时(泳道10)也确认到L－Asp(2.5单位/ml)诱导CHOP。Erw(2.5单位/ml)也诱导了一过性响应，其在6.0小时(泳道12)达到最大，在24小时(泳道13)恢复至基本水平。如图5B中已经证实那样，CHOP的诱导显示出显著的COMPOUND-JP用量依赖性(5.0及10.0μM；分别为泳道2及3)，此外，万珂(8.0及15.0μM；分别为泳道7及8)也诱导CHOP，此外，虽然程度稍弱，但L－Asp(2.5单位/ml)及雷帕霉素(10.0nM)、分别为泳道4及9也强烈诱导CHOP。作为参照，作为Akt及Akt/mTOR抑制剂的MK－2206(10.0μM；泳道5)及KU0063794(10.0μM；泳道6)并不诱导CHOP，这暗示该通路并非由PI3K/Akt/mTOR通路引起。
(COMPOUND-JP诱导性的UPR直接关系到必需氨基酸摄入的抑制)
本发明人等此后调查了tPTEN－/－细胞是如何响应培养基氨基酸组成的修饰的。将完全培养基用HBSS稀释至10倍时(图5C；6.0及24小时、泳道4及5)观察到明显的时间依赖性CHOP诱导。即使在营养缺陷培养基中补充NEAA(图5C；泳道6及7)，也没有修饰CHOP诱导，追加EAA(泳道8及9)或NEAA+EAA(泳道10及11)的组合阻碍CHOP的表达。颇有意味的是，S6RP磷酸化与CHOP表达呈负相关，培养基中的EAA的缺乏导致了mTORC1的下调。进而，本发明人等观察了通过细胞外氨基酸含量来调整COMPOUND-JP介导的CHOP的诱导(图5D)。实际上，补充EAA明显阻碍了CHOP的诱导(泳道8及9)。与6.0小时(泳道6)时相比，在24小时(泳道7)时几乎检测不到CHOP蛋白质，因此NEAA缩短了响应，与此相反的是，EAA+NEAA的组合表现为中等响应(泳道10及11)。该实验结果表明COMPOUND-JP引起的应激响应可以通过增加细胞外EAA浓度来抵消，进一步证实了COMPOUND-JP的作用抑制EAA的摄入。
(COMPOUND-JP诱导性的CHOP引起细胞凋亡)
为了调查由COMPOUND-JP(LAT1抑制)观察到的ISR/UPR是否为持续性细胞凋亡的原因，本发明人等使用已经确信阻碍eIF2α的脱磷酸化、作为对ER应激诱导细胞保护的抑制剂确立的salubrinal化合物(参考文献32)。如图5E所示，salubrinal(50.0μM)可以抵消COMPOUND-JP(10.0μM)对CHOP的诱导(泳道8及9与6及7相比)。进而，这些结果中，虽然伴随半胱天冬酶3切断的减少(中央的带(panel))，但Hsp60的水平并未改变(下方的带)。进而，salubrinal(50.0μM)保护KO99L细胞不发生COMPOUND-JP诱导的细胞死(图5F)，且使利用BrdU摄入(图5G)或细胞计数(图5H)评价的细胞增殖得以恢复。这些结果证实COMPOUND-JP在细胞死响应期间进行CHOP的诱导。
(COMPOUND-JP诱导的、UPR通路中的分子事件)
通过包含i)肌醇需求酶1α(IRE1α)；ii)PKR样ER激酶；及iii)活化转录因子(ATF6)((参考文献33)中有概述)在内的多个ER蛋白质的调和性活化，对非折叠蛋白反应(UPR)进行了鉴定。活化后的IRE1α开始对诱导chop的表达的转录因子XBP－1的异形体进行编码的mRNA的非常规剪接((参考文献30)。活化后的PKR样ER激酶使eIF2α(丝氨酸－51A)磷酸化，诱导ATF4的翻译(参考文献34)。ATF6可能在ER应激期间被切断，其胞质溶胶结构域[ATF6(N)]移动到核中而调节转录(参考文献35)。XBP－1、ATF4、及ATF6为已知在ER应激期间诱导chop的3个转录因子(参考文献30)。因此，本发明人等检测了将COMPOUND-JP(10.0μM)与细胞孵育后的ATF4、ATF6、及XBP－1的状况。本发明人等观察到，诱导了ATF4(6.0小时)及ATF6(18.0小时)，但全长XBP1逐渐消失(图6A；泳道3及4)，CHOP及GADD34同时表达(图6B；泳道3及4)。与GADD34磷酸酶的平行表达一起，对eIF2α的脱磷酸化进行24小时的观察(图6C)。p38应激通路在2.0小时被强烈活化(图6C；泳道2)。
(COMPOUND-JP对细胞凋亡促进性及抗细胞凋亡性Bcl2家族成员的调整)
为了从分子水平定义COMPOUND-JP所诱导的细胞凋亡，本发明人等分析了Bcl2家族成员，本发明人等尝试测定了已知在线粒体及ER膜水平控制细胞凋亡起始的成员。从6.0小时开始(图6D)，COMPOUND-JP(10.0μM)使4个细胞凋亡促进性成员：Bak(图6D；泳道2～4)、Bax(泳道4)、PUMA(泳道2～4)、以及Bim(泳道3及4)的蛋白质水平增加。Bax、Bak、PUMA、及Bim的诱导对于salubrinal所致的CHOP抑制为感受性(图6E、泳道3及4)，但对于总Hsp90蛋白质水平没有影响。
(KO99RJ细胞：COMPOUND-JP抵抗性的变异体)
本发明人等通过在增大COMPOUND-JP浓度的同时定期地培养KO99L细胞，从而获得了抵抗COMPOUND-JP的抗增殖及细胞凋亡效果的细胞变异体。约4个月后，本发明人等获得了在COMPOUND-JP(20.0μM)存在下仍能够增殖的以KO99－RJ表示的细胞株。如图7A中归纳那样，细胞生存能力的减少是COMPOUND-JP用量依赖性的，与变异细胞株(即KO99－RJ)相比，亲株(即KO99－S)是相当优异的，例如，在40μMCOMPOUND-JP下，KO99－S的细胞生存能力本质上95～100％，但KO99－RJ的细胞生存能力大约减少40％。如图7B所示，COMPOUND-JP在KO990－S中显示出浓度依赖性细胞死，但KO99－RJ中并不那么高效。进而，颇有意味的是，如利用不存在CHOP诱导而明确的那样(图7C)，观察到COMPOUND-JP在KO99－RJ细胞中并未引起整合应激反应。这些数据进一步强调了该通路的引起COMPOUND-JP所诱导的细胞凋亡的响应的重要作用。最后，未能观察到S6RP磷酸化的减少(图7C)，因此COMPOUND-JP在KO99－RJ中也不能抑制mTOR，KO99－RJ以与亲细胞同等的水平表达CD98。
(COMPOUND-JP对化疗剂及信号转导抑制剂的强化)
如图8所示，将COMPOUND-JP与各种化疗剂或信号转导抑制剂组合进行了试验(在体外)。本发明人等对临床上在白血病治疗的导入期间使用的两种化疗剂地塞米松及阿霉素进行了试验(参考文献36)。这些实验中，化合物均在最适浓度以下使用，这些结果示于作为补充资料的图S3－1、2中。算出的组合指数(CI)值示于图8A。我们认为，COMPOUND-JP与雷帕霉素显示出强协同作用，降低了整体的代谢活性/细胞生存。协同效果或相加效果在所有的化合物中均观察到，特别是COMPOUND-JP与地塞米松及阿霉素显示出协同作用。我们认为，LAT1抑制剂虽然也能够使万珂及L－天冬酰胺酶的效果强化，但并不像PI103及KU－0063794那样高效率。由WST1导出的等效线图解法进而示出所试验的各种组合的可能性(图8B)。整体来看，数据显示在与干扰T－ALL细胞生存的其它分子组合时，COMPOUND-JP能够带来积极效果。
(对在来自人的各种癌的已建立的培养细胞中表达的中性氨基酸转运蛋白LAT1及LAT2基因的定量结果)
图10中，以每单位RNA的mRNA量为纵轴，以使用的癌细胞名为横軸，并将癌种类名记载在表中。除了5个例外以外，LAT1mRNA在46种细胞中均表达，可以称之为癌型的转运蛋白。另一方面，LAT2在癌细胞中的表达或者为零或者为极低的值，可以理解为正常型。
(LAT1选择性抑制剂COM-JP对来自人硬胃癌的44As3-11细胞和来自人胰腺癌的Panc-1细胞增殖产生的抑制效果)
图11中，以COM-JP不存在时的活性为100％，将相同条件下的4例的平均值以相对于该100％的相对值形式来表示各个值。将平均值和标准误差以及差异显著性检验的p值示于图中。虽然也能够看到癌细胞的种类所带来的差异，但两种细胞中都能够明显看到增殖活性呈现COM-JP用量依赖性降低。
(COM-JP与其它药剂的并用对来自人硬胃癌的44As3-11细胞增殖的效果)
Gemstabine以及Paclitaxel单独作用2小时对来自人硬胃癌的44As3-11细胞增殖的效果相当于各组柱的左侧棒图的值之差。各实验对相同条件的组分别测定3例，将平均值和标准误差以及差异显著性检验的p值示于图中。两者均用量依赖性地使细胞的增殖活性降低。与Gemstabine相比，Paclitaxel的抑制效果更强力。与在前2天用COM-JP(15μM)处置的结果(各组正中间的棒状图)相比，COM-JP在整个期间内存在的方式(各组右侧的棒状图)的并用效果更强力。并用所带来的抑制效果为各单独的作用相加的结果，显示所谓的相加效果。
(COM-JP与其它药剂的并用对来自人胰腺癌的Panc-1细胞增殖的效果)
Gemstabine以及Paclitaxel单独作用2小时对来自人胰腺癌的Panc-1细胞的增殖的效果相当于各组柱的左侧棒图的值之差。各实验对相同条件的组分别测定3例，将平均值和标准误差以及差异显著性检验的p值示于图中。两者均用量依赖性地使细胞的增殖活性降低。与Gemstabine相比，Paclitaxel的抑制效果更强力。但是，Gemstabine单独时的效果极小，与对来自于硬胃癌的44As3-11细胞的增殖的作用相比，其作用明显弱。与在前2天用COM-JP(15μM)处置的结果(各组正中间的棒状图)相比，COM-JP在整个期間内存在的方式(各组右侧的棒状图)的并用效果能够看到一些抑制，但其抑制程度与来自于硬胃癌44As3-11细胞的增殖相比明显低。在Panc-1细胞中，各并用所带来的抑制效果为各自单独的作用相加的结果，与44As3-11细胞时同样为所谓的相加效果。
(COM-JP和5-FU的并用对来自人大肠癌的HT-29细胞移植裸小鼠模型中的肿瘤增殖的效果)
单独给药两药物时，与无处置的参照组相比，肿瘤的增大分别显示出显著的减少。通过两者的并用，各单独组的残存肿瘤增大进一步减少。明确了该并用效果是相加性的，是由两药物的作用机理不同带来的。
(COM－JP和CDDP的并用对来自人大肠癌的HT－29细胞的原位移植裸小鼠模型(SOImodel)中的肿瘤增殖的协同效果)
图16的组8和9与参照组相比肿瘤的增大显著减少。由该结果可以确认，在单独给药COM－JP和CDDP时所看不到的各药效是由于两者的并用而出现的。可以说，该并用产生的药效是两者的协同效果。
《考察》
由上述试验结果可以获知以下见解。
本研究证实了通过抑制作为必需氨基酸(EAA)转运蛋白的LAT1/SLC7A5能够改变ALL/T－LL细胞模型中的代谢及生存。本发明人等使用初代细胞及来自使PTEN肿瘤抑制基因的T淋巴细胞特异性失活后获得的T细胞性淋巴瘤(tPTEN－/－)小鼠模型的细胞株。最初，基因表达图谱证明，与静息或活化正常T细胞相比，tPTEN－/－细胞的SLC7A5水平上调。与正常细胞相比，肿瘤细胞还显示出其表面过量表达CD98。这些结果验证了它们不仅LAT1/SLC7A5水平高，转化细胞还过量表达功能性LAT1所必需的、由SLC3A2基因编码的跨膜蛋白CD98hc/4F2，因此是重要的(非专利文献11)。同样地，与来自健康供体的静息及活化末梢血淋巴细胞(PBL)相比，初代人T－ALL样品及T－ALL/T－LL细胞株也显示出CD98水平的增强。通常认为，CD98的表达与腺癌(参考文献37、38)或乳腺癌(参考文献39)等几种类型的癌中的预后不良相关，其表达暗示了可能与急剧增殖及进攻性等重要的疾病特质有关。与增殖速度(Ki－67)积极相关的CD98的高度表达及胃癌中的更加不良的预后(参考文献40)及LAT1/CD98水平上调与原发性肿瘤相比，在转移性部位中观察到(参考文献41)。综上，这些数据使本发明人决定，对抑制LAT1介导性的必需氨基酸摄入的重要性以及其改变T细胞淋巴母细胞性淋巴瘤/T细胞急性淋巴性白血病细胞增殖及生存的能力进行调查。
最初，本发明人的研究是对初代tPTEN－/－细胞及来自tPTEN－/－肿瘤的细胞株进行的。为了与LAT1介导的中性氨基酸移入竞争，本发明人等对BCH(极其经典的系统L抑制剂)及D－亮氨酸进行了试验。两种分子虽然均能够影响tPTEN－/－细胞的生存，但它们仅显示出有限的效率，需要高浓度(＞1.0mM)，已经在头颈部扁平上皮癌细胞株中报道了类似结果(参考文献42)。然后，本发明人等对强LAT1选择性抑制剂COMPOUND-JP进行了研究(参考文献43)。当将其追加到细胞培养基中时，COMPOUND-JP使tPTEN－/－细胞的生存显著减少(IC50＝2.4μM)。进而，COMPOUND-JP对细胞增殖显示出浓度依赖性的统计学上显著的效果。由于对培养基追加EAA会减弱用于逆转细胞生存能力及细胞死的COMPOUND-JP的能力，表明COMPOUND-JP可能是通过与EAA流入竞争性过程而发挥作用的(参考文献21)。然后，本发明人等将稳定表达荧光素酶的KO99L细胞注射到裸小鼠中而进行了体内成像实验。COMPOUND-JP使肿瘤体积显著减小。COMPOUND-JP使移植到裸小鼠中的HT－29结肠癌细胞的增殖降低这一点已经有报道(参考文献43)，本研究进一步公开作为LAT1抑制剂的COMPOUND-JP在体外及体内两种情况下的实用性。
本发明人等若证实了COMPOUND-JP介导tPTEN－/－细胞的体外及体内的效果，则本发明人等尝试证明LAT1的靶向是否能够改变T－ALL/T－LL细胞株及初代白血病性细胞。最初，本发明人等使用已知的、已经公开了COMPOUND-JP在体外影响细胞生存及增殖的人JurkatT－ALL细胞株。然后，本发明人等分离了4个不同的来自人患者的初代T－ALL细胞，它们的细胞生存能力也显示出COMPOUND-JP用量依赖性效果。将Jurkat细胞及来自患者的细胞进行比较，COMPOUND-JP对于正常的静息或活化人PBL细胞不诱导细胞死，支持了LAT1选择性抑制剂与正常(LAT2表达)细胞相比优先作用于白血病(LAT1表达)的见解。
本发明人等观察到，COMPOUND-JP能够在分子水平部分地干扰mTORC1活化。COMPOUND-JP抑制S6RP的磷酸化，不影响4EBP1的磷酸化。利用COMPOUND-JP治疗的小鼠异种移植tPTEN－/－肿瘤中也显示出phosphoS6RP的大幅降低。本发明人还对2个初代T－ALL样品使用phospho流式细胞术，也能够观察到COMPOUND-JP引起的该mTOR抑制效果。
COMPOUND-JP的重要的特异性是在整合应激反应(ISR)/非折叠蛋白反应(UPR)中诱导CHOP转录因子的能力。内质网(ER)中的折叠错误的蛋白质的蓄积或AA的不足引起的该响应能够使细胞在ER中恢复蛋白质恒常性(参考文献44)。该能力衰弱时则引发细胞凋亡所致的清除。进而，当改变培养基中的AA含量时，引起了明显的时间依赖性的CHOP的诱导。CHOP在蛋白酶体抑制剂万珂的作用下强度会进一步降低，但会在影响天冬酰胺及谷氨酰胺的水平的L－天冬酰胺酶及Erwinase、以及雷帕霉素作用下被强烈诱导。PI3K/Akt/mTOR的抑制剂不诱导CHOP。COMPOUND-JP诱导性的CHOP可以通过细胞外EAA的追加而调整。证实了COMPOUND-JP通过抑制EAA摄入而发挥作用。进而作为已经确定阻碍eIF2α的脱磷酸化、对ER应激诱导细胞保护的抑制剂的化合物salubrinal(参考文献32)，能够抵消COMPOUND-JP所引起的CHOP诱导，保护KO99L细胞不发生细胞死，恢复细胞增殖。UPR可能通过由ATF6、IRE－1、及PERK介导的至少3个通路而引起(参考文献44)。颇有意味的是，COMPOUND-JP能够通过ATF6、IRE－1、及PERK动员3个通路，这暗示了其可能干扰共通的上游事件。
分子水平上，COMPOUND-JP诱导4个细胞凋亡促进性Bcl－2家族成员的表达，所述成员为与UPR和CHOP的参与相关的Bax、Bak、Bim、及Puma。唯BH3蛋白质Puma利用对ER应激诱导性的细胞凋亡显示抵抗性的Puma－/－细胞由衣霉素而诱导(参考文献45)。进而，CHOP在Puma启动子区域内与AP－1相互作用(参考文献46)，直接调节Bim启动子(参考文献47)。进而，Bax及Bak对于IRE1α活化是必不可少的，能够与IRE1α的胞质溶胶结构域形成蛋白质复合物(参考文献48)。Bax、Bak、Bim、及Puma的调整可能在线粒体及ER水平参与细胞凋亡的诱导。例如，COMPOUND-JP显示出促进半胱天冬酶活化的、tPTEN－/－细胞中的用量依赖性的线粒体去极化。可知细胞凋亡是作为COMPOUND-JP对mTORC1的抑制效果的结果的初期自噬响应的延续。
本研究的颇有意味的是形成了表示为KO99－RJ的COMPOUND-JP抵抗性细胞株。COMPOUND-JP在KO99－RJ中不仅不能诱导细胞死，也观察不到CHOP的诱导，证实了CHOP在COMPOUND-JP诱导性细胞死中的重要性。COMPOUND-JP的作用方式的暂定模型示于补充图S4中。
COMPOUND-JP虽然不影响整体的蛋白质合成，但COMPOUND-JP能够改变使c－myc对于EAA可利用性的减少非常敏感的、具有很短的半衰期(15分钟)的c－myc的表达，阻碍其后续的再合成。c－myc的该减少对于淋巴瘤细胞的增殖及生存可能导致戏剧性结局。实际上，正常T细胞中，LAT1/SLC7A5处于T细胞抗原受体(TCR)的控制之下，它的诱导对于适时开始免疫响应(mounting)及T细胞代谢的其重编化(reprogrammation)非常重要(参考文献28)。SLC7A5中有缺损的T细胞在TCR触发时无法刺激mTORC1，显示不完全的c－myc表达。当2事件组合时，结果是无法活化代谢也无法重编化，导致CD4+及CD8+效应物细胞的分化的缺损，损害免疫响应。颇有意味的是，COMPOUND-JP对LAT1的抑制表明其干扰T细胞的活化(参考文献49)。
LAT1及4F2/CD98hc分别为杂二聚体CD98复合物的轻链及重链。LAT1运载大的EAA，CD98hc与β整联蛋白相互作用(非专利文献19)。两个特性在功能上是否相关至今尚未阐明。ES细胞中的CD98hc的破坏干扰了整联蛋白的功能，破坏了细胞的扩散及移动但不影响粘附(非专利文献19)。利用并非轻链的与整联蛋白相互作用的CD98hc突变体进行的、Null细胞的重构虽然恢复了整联蛋白的信号转导，但令人惊讶的是并不是Akt活化及不进入细胞凋亡所必需的(非专利文献19)。作为参照，过量表达CD98hc的肾上皮细胞中，LAT1依赖性的氨基酸运载及整联蛋白相互作用二者对于增殖而言都是重要的(参考文献50)。此外公开了，小鼠表皮中CD98hc的缺失影响着皮肤稳态及创伤的治愈，AA摄入障碍对src及RhoA的活化有负面影响(参考文献51)。依赖于细胞的状况及依赖性，与整联蛋白相互作用的功能或AA运载可以发挥重要作用。在本发明人的模型中，本发明人等虽然未调查β整联蛋白的作用，但我们认为LAT1介导的EAA流入对白血病持续是重要的。
最后，本发明人还将各种化疗剂或信号转导抑制剂与COMPOUND-JP组合进行了体外实验，并算出组合指数(CI)值。由进行试验的所有化合物观察协同效果或相加效果。特别是，COMPOUND-JP与雷帕霉素显示出最高程度的协同作用。两药剂均能够抑制S6RP磷酸化，虽然不能影响4EBP1的磷酸化，但它们依然具有如下的作用模式：COMPOUND-JP能够阻止增殖及诱导细胞凋亡，雷帕霉素在tPTEN－/－细胞中仅显示细胞增殖抑制性(参考文献52)。这受到如下事实的支持，即COMPOUND-JP为比雷帕霉素更强的CHOP诱导因子，能够抑制Akt的活化。COMPOUND-JP此外还能够增强地塞米松、阿霉素、及L－天冬酰胺酶的抗白血病性效果。据报道，蛋白酶体抑制剂万珂对癌细胞的毒性作用在于导致细胞内的AA池枯竭(参考文献27)。这一作用很可能被COMPOUND-JP放大，可以解释2种分子中观察到的对细胞生存能力的相加效果。此外，本发明人等明确了COMPOUND-JP还能够稍稍增强作用于PI3K/Akt/mTOR通路的2个抑制剂KU0063794及PI－103的效果。
概括而言，本发明人的结果表明，T－ALL/T－LL癌细胞上的LAT1的过量表达反映了：支持其自身的重编化的代谢的、营养素摄入的增加以及癌细胞对mTORC1及Akt的活化的依赖。进而，本发明人的研究在体外验证了以下观点：在药理学上对通过LAT1进行的EAA摄入进行干扰，可以相当于用于治疗这些致命性造血器官恶性疾病的颇有意味的整体辅助治疗策略。
最后，以下验证了在其它癌中的应用。由各细胞提取RNA，使用LAT1及LAT2特异性引物通过定量PCR法测定各mRNA。将其结果示于图10中。以每单位RNA的mRNA量为纵轴，以使用的癌细胞名为横軸，并将癌种类名记载在表中。上段记载LAT1，下段记载LAT2。由该图可知，LAT1mRNA在46种细胞中均表达，可以称之为癌型的转运蛋白。另一方面，LAT2在癌细胞中的表达或者为零或者为极低的值，可以理解为正常型。因此，上述结果可以用于其它癌症。
然后，实际用于其它癌症的实验结果的考察如下所示。
首先，如图11所示，虽然也能够看到癌细胞的种类所带来的差异，但能够明显看到来自人硬胃癌的44As3-11细胞和来自人胰腺癌的Panc-1细胞这两种细胞的增殖活性呈现COM-JP用量依赖性降低。由图10的结果可以明确，在此外的多种表达LAT1的癌细胞中，也可以期待与其自身的LAT1表达量相应的COM-JP的增殖抑制效果。
然后，如图13所示，Gemstabine以及Paclitaxel的两者均用量依赖性地降低细胞的增殖活性。Paclitaxel的抑制效果比Gemstabine更强力。关于COM-JP与其它药剂的并用对来自人硬胃癌的44As3-11细胞的增殖的效果，与在前2天用COM-JP(15μM)处置的结果(各组正中间的棒状图)相比，COM-JP在整个期间内存在的方式(各组右侧的棒状图)的并用效果更优异。并用所带来的抑制效果为各单独的作用相加的结果，显示所谓的相加效果。
接着，如图14所示，Gemstabine以及Paclitaxel两者均用量依赖性地降低细胞的增殖活性。Paclitaxel的抑制效果比Gemstabine更强力。但是，Gemstabine的单独效果极小，与对来自硬胃癌的44As3-11细胞的增殖的作用相比，作用明显弱。关于COM-JP与其它药剂的并用对来自人胰腺癌的Panc－1细胞的增殖的效果，与在前2天用COM-JP(15μM)处置的结果(各组正中间的棒状图)相比，COM-JP在整个期间内存在的方式(各组右侧的棒状图)的并用效果能够看到一些抑制，但其抑制程度与来自硬胃癌44As3-11细胞的增殖相比明显低。在Panc-1细胞中，各并用所带来的抑制效果为各自单独的作用相加的结果，与44As3-11细胞时同样为所谓的相加效果。
进而，如图15所示，单独给药两药物时，与无处置的参照组相比，肿瘤的增大分别显示出显著的减少。关于COM-JP和5-FU对来自人大肠癌的HT-29细胞移植裸小鼠模型中的肿瘤增殖的并用效果，通过两者的并用，各单独组的残存肿瘤增大进一步减少。明确了该并用效果是相加性的，是由两药物的作用机理不同带来的。这样的并用所带来的、能够进一步增强各自单独时的治疗效果的药效在临床的大肠癌治疗中也能够充分期待。
最后，关于COM－JP和CDDP的并用对来自人大肠癌的HT－29细胞的原位移植裸小鼠模型(SOImodel)中的肿瘤增殖的协同效果，如图16所示，图16的组8和9与参照组相比肿瘤的增大显著减少。由该结果可以确认，在单独给药COM－JP和CDDP时所看不到的各药效是由于两者的并用而出现的。可以说，该并用产生的药效是两者的协同效果。
综上，阐明了LAT1抑制剂和其它药剂的并用带来的相加效果、协同效果，对于其它癌症，本发明的包含LAT1抑制剂与选自烷化剂、铂制剂、代谢拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、微管聚合抑制剂、内分泌疗法药剂、微管解聚抑制剂、抗肿瘤性抗生素及分子靶向药物构成的组中的一种以上药剂作为有效成分的抗恶性肿瘤剂组合物也是有效的。
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Claims (8)

1.一种抗恶性肿瘤剂组合物，其包含LAT1抑制剂和选自由烷化剂、铂制剂、代谢拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、微管聚合抑制剂、内分泌疗法药剂、微管解聚抑制剂、抗肿瘤抗生素及分子靶向药物构成的组中的一种以上药剂作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述抗恶性肿瘤剂组合物为T细胞急性淋巴性白血病/淋巴瘤治疗用医药组合物、胃癌治疗用医药组合物、胰腺癌治疗用医药组合物或大肠癌治疗用医药组合物。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述LAT1抑制剂为O－(5－氨基－2－苯基苯并噁唑－7－基)甲基－3,5－二氯－L－酪氨酸、其类似物或它们的药理学上可接受的盐。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，所述药剂为选自顺铂、5－氟尿嘧啶即5－FU、吉西他滨、L－天冬酰胺酶即左旋天冬酰胺酶、紫杉醇、地塞米松、以阿霉素为首的蒽环类抗生素、万珂即硼替佐米、雷帕霉素、KU0063794及PI－103中的一种以上药剂。
5.一种抗恶性肿瘤剂组合物，其包含LAT1抑制剂和选自mTOR抑制剂、PI3K抑制剂及Akt抑制剂中的一种以上药剂作为有效成分。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述抗恶性肿瘤剂组合物为T细胞急性淋巴性白血病/淋巴瘤治疗用医药组合物、胃癌治疗用医药组合物、胰腺癌治疗用医药组合物或大肠癌治疗用医药组合物。
7.根据权利要求5或6所述的组合物，其中，所述LAT1抑制剂为O－(5－氨基－2－苯基苯并噁唑－7－基)甲基－3,5－二氯－L－酪氨酸、其类似物或它们的药理学上可接受的盐。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的组合物，其中，所述药剂为选自雷帕霉素、KU0063794及PI－103中的一种以上药剂。
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