CN115814090A - 烟草引发炎症的药物新靶点 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及GADD153/CHOP、c‑FOS或c‑JUN作为靶点在CSE引起炎症中的应用,涉及医药领域。本发明提供了一种GADD153/CHOP、c‑FOS或c‑JUN作为靶点在CSE引起炎症中的应用,为开发能够消除烟草引发炎症的药物提供新作用靶点。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,特别是涉及烟草引发炎症的药物新靶点。
背景技术
慢性阻塞性肺病(COPD)是一种以持续气流受限为特征的肺病,烟雾暴露是该疾病的主要危险因素。在中国及世界范围内,COPD已超越心脑血管及肺部感染疾病,高居十大死因第3名。
目前,COPD治疗手段包括支气管扩张剂以及糖皮质激素的使用,但上述2种传统治疗方法仍未能有效改善慢阻肺患者肺功能的年递减率,而且激素具有显著的副作用。因此,新型的能够消除烟雾暴露引发炎症的药物,在治疗COPD药物的开发中日益受到重视。
发明内容
针对上述问题,本发明提供一种烟草引发炎症的药物新靶点,为开发能够消除烟草引发炎症的药物提供新作用靶点。
为了达到上述目的,本发明提供了GADD153/CHOP,c-FOS,或c-JUN作为靶点在制备用于治疗烟草引发炎症的药物中的应用。
本发明人在研究实验过程中,通过在细胞中加入香烟提取物(CSE)和不同浓度的DDEA(即(2Z,4E)-2,4-癸二烯酸),采用免疫印迹法进行分析,发现DDEA对GADD153/CHOP(生长阻滞和DNA损伤诱导基因)、c-FOS(转录因子)和c-JUN(转录因子)的蛋白表达量显示出显著抑制作用,同时,DDEA对CSE刺激细胞引起的IL-1β、IL-6、IL-8和IL-18的表达也具有显著抑制作用,据此,实验证实,可通过下调GADD153/CHOP,c-FOS,或c-JUN的蛋白表达量,实现消除烟草引发的炎症,即可将GADD153/CHOP,c-FOS,或c-JUN作为靶点,设计针对该靶点的新型治疗烟草引发炎症的药物或治疗方法。
在其中一个实施例中,所述应用包括在制备用于治疗烟草引发炎症导致疾病的药物中的应用,所述疾病包括慢性阻塞性肺病。
本发明还提供了GADD153/CHOP,c-FOS,或c-JUN的抑制剂在制备用于治疗烟草引发炎症的药物中的应用。
在其中一个实施例中,所述应用包括在制备用于治疗烟草引发炎症导致疾病的药物中的应用,所述疾病包括慢性阻塞性肺病。
在其中一个实施例中,所述药物下调IL-1β、IL-6、IL-8和IL-18的表达量。
在其中一个实施例中,所述药物下调GADD153/CHOP,c-FOS,或c-JUN的蛋白表达量。
在其中一个实施例中,所述抑制剂为(2Z,4E)-2,4-癸二烯酸。
本发明还提供了(2Z,4E)-2,4-癸二烯酸在制备用于治疗烟草引发炎症的药物中的应用。
DDEA(即(2Z,4E)-2,4-癸二烯酸)对CSE刺激细胞引起的IL-1β、IL-6、IL-8和IL-18的表达具有显著抑制作用,可见,DDEA可用于制备用于治疗烟草引发炎症的药物。
本发明还提供了(2Z,4E)-2,4-癸二烯酸在制备用于治疗烟草引发炎症导致疾病的药物中的应用,所述疾病包括慢性阻塞性肺病。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种GADD153/CHOP,c-FOS,或c-JUN作为靶点在制备用于治疗烟草引发炎症的药物中的应用,为开发能够消除烟草引发炎症的药物提供新作用靶点。
附图说明
图1为DDEA对CSE刺激16HBE细胞引起IL-1β表达的影响图;
图2为DDEA对CSE刺激16HBE细胞引起IL-6表达的影响图;
图3为DDEA对CSE刺激16HBE细胞引起IL-8表达的影响图;
图4为DDEA对CSE刺激16HBE细胞引起IL-18表达的影响图;
图5为DDEA对CSE刺激NCI-H292细胞引起IL-6表达的影响图;
图6为DDEA对CSE刺激NCI-H292细胞引起IL-8表达的影响图;
图7为DDEA对CSE刺激16HBE细胞引起GADD153/CHOP、c-FOS和c-JUN表达的抑制作用图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
本发明所述的GADD153/CHOP:指生长阻滞和DNA损伤诱导基因。
c-FOS:一种转录因子,主要作用是调节细胞核中因受外界刺激影响而开启或抑制的基因。
c-JUN:一种转录因子。
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明,均为市售来源;实验方法如无特殊说明,均为本领域的常规实验方法。
实施例1
制备(2Z,4E)-2,4-癸二烯酸(DDEA)。
从冬虫夏草中分离得到蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌株,经人工深层发酵培养得到蝙蝠蛾拟青霉菌丝体。蝙蝠蛾拟青霉菌干粉166.6g用氯仿在超声波浴中提取3次,合并浓缩,得浓缩液30mL。浓缩液开口硅胶柱层析分离,先用正己烷-乙酸乙酯(体积比为95:5至0:100),然后用氯仿-甲醇-水(体积比为9:1:0.1至8:2:0.2)进行洗脱,产生38个组分。
组分5(1.9g)进一步用石油醚-乙酸乙酯(体积比为95:5至0:100)正向硅胶柱分离得到12个亚组分。
组分5-5(0.9g)用正己烷-乙酸乙酯(体积比从94:6到50:50)分离得组分5-5-4(100mg)。
组分5-5-4继续用石油醚-乙酸乙酯(体积比从94:6到50:50)得到5-5-4-1(57mg)。
然后5-5-4-1用反向柱纯化(甲醇:水体积比从70:30到100:0)得到目标脂肪酸((2Z,4E)-2,4-癸二烯酸)9mg。(2Z,4E)-2,4-癸二烯酸的表征数据如下所示。
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.35(1H,ddd,J=11.3,15.0,1.0Hz,H-4),6.66(1H,t,J=11.3Hz,H-3),6.11(1H,dt,J=15.0,7.5Hz,H-5),5.57(1H,d,J=11.3Hz,H-2),2.17(q,2H),1.40-1.45(m,2H),1.28-1.32(m,4H),0.88(t,J=6.9Hz,3H);13C NMR(150MHz,CDCl3):δ171.6,144.3,143.9,127.5,118.4,33.1,31.6,28.8,22.6,14.1。HRMS-ESI(m/z):[M+H]+calcd for[C10H17O2]+,169.1223found,169.1217。
本实施例的(2Z,4E)-2,4-癸二烯酸(DDEA)根据专利申请号为202010547591.X,专利名称为(2Z,4E)-2,4-癸二烯酸在制备用于治疗流感病毒引起的炎症的药物方面的应用的专利制备得到。
实施例2
制备香烟提取物(CSE)。
将香烟的滤嘴剪去,连接在两个串联包氏采样管,包氏管另一端连接真空泵。包氏管各装有5mL不含血清的DMEM培养基作为香烟烟雾吸收液。点燃香烟后,打开真空泵抽吸包氏管内空气,使香烟烟雾溶于培养基中。前后完成8根香烟烟雾的吸收,再合并两个包氏管的培养基,用0.45μM滤膜过滤除菌后即为100%香烟提取物溶液(Cigarettesmokeextract,CSE),分装后保存在-80℃。
实施例3
细胞上清液的炎症因子检测。
一、构建药物干预的模型。
用8%CSE刺激12孔板单层的16HBE细胞(人支气管上皮细胞)和NCI-H292细胞(人肺癌细胞),同时加入含有不同浓度DDEA(50、10和2μM)的DMEM培养基。37℃、24小时后,收集细胞上清液,用于Bioplex检测炎症因子表达水平。
二、Bioplex检测炎症因子表达水平。
1、将分析缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液放置至室温,其他放置冰上。样品溶解后,样品离心以去除上清液中的细胞碎片,离心条件为3000rpm,15min 4℃。配制0.5%BSA:50mg(BSA)+10mL(DMEM)、50mg(BSA)+5mL(DMEM)0.22μm过滤;稀释标准品。
2、50μL稀释的(1×)磁珠/孔;加孔之前涡旋10-20s,每排均需涡旋。
3、加入磁珠后1-2min,1×Bio-Plex洗涤缓冲液洗两次;在自动洗板机上进行洗板。
4、样品、标准品、空白用前涡旋,50μL/孔,标准品50μL/孔,样品25μL/孔DMEM+25μL/孔样品;两倍稀释,空白50μL/孔DMEM。
5、薄膜贴紧,锡纸避光,振荡(850rpm±50rpm,30min);提前10min配制检测抗体。
6、1×Bio-Plex洗涤缓冲液洗3次(磁力架上)。
7、25μL检测抗体/孔;加孔之前涡旋10-20s,每排均需涡旋。
8、薄膜贴紧,锡纸避光,振荡(850rpm±50rpm,30min);提前10min配制1×SA-PE,涡旋100×SA-PE 5s,避光稀释至1×SA-PE。
9、1×Bio-Plex洗涤缓冲液洗3次(磁力架上)。
10、50μL 1×SA-PE/孔;加孔之前涡旋10-20s,每排均需涡旋。
11、薄膜贴紧,锡纸避光,振荡(850rpm±50rpm,10min)。
12、1×Bio-Plex洗涤缓冲液洗3次。
13、125μL/孔分析缓冲液维持96孔板。
14、上机检测,数据整理、统计。
三、炎症因子表达水平检测结果。
DDEA对CSE刺激16HBE细胞引起的炎症因子的影响如图1、图2、图3、图4所示。其中,根据图1可见,DDEA对CSE刺激16HBE细胞引起的IL-1β(10和50μM)的表达有显著抑制作用(p<0.05;p<0.01;p<0.001);根据图2可见,DDEA对CSE刺激16HBE细胞引起的IL-6(50μM)的表达有显著抑制作用(p<0.05;p<0.01;p<0.001);根据图3可见,DDEA对CSE刺激16HBE细胞引起的IL-8(50μM)的表达有显著抑制作用(p<0.05;p<0.01;p<0.001);根据图4见,DDEA对CSE刺激16HBE细胞引起的IL-18(50μM)的表达有显著抑制作用(p<0.05;p<0.01;p<0.001)。
DDEA对CSE刺激NCI-H292细胞引起的炎症因子的影响如图5、图6所示。其中,根据图5可见,DDEA对CSE刺激NCI-H292细胞引起的IL-6(50μM)的表达有显著抑制作用(p<0.001);根据图6可见,DDEA对CSE刺激NCI-H292细胞引起的IL-8(50μM)的表达有显著抑制作用(p<0.001)。
实施例4
(2Z,4E)-2,4-癸二烯酸作用机制的检测。
一、收集对数生长期的16HBE细胞,在六孔板中每孔加入2mL(1×106个细胞/孔),待细胞单层长至汇合度90%后弃去培养液,PBS清洗两遍,然后加入8%CSE和不同浓度的DDEA(浓度分别为2μM、10μM、50μM),另设1组未加入CSE和DDEA,1组加入8%CSE且未加入DDEA,1组未加入8%CSE且加入50μM DDEA,37℃孵育24小时,弃去病毒上清,PBS清洗两遍,提取细胞蛋白。细胞用预冷PBS洗2遍,然后加入适量RIPA裂解液(约1×106个细胞可用100-150μL裂解液)。冰置5分钟后,用细胞刮将细胞刮下来,吹打并收集细胞裂解液。蛋白样品于4℃离心机中13000rpm离心10min,吸取上清分装保存,通过BCA法测定蛋白浓度,对根据所测蛋白浓度,将样品浓度调整至相同,加入5×上样缓冲液,混匀后煮沸10分钟。
二、以GAPDH(约37kD)为内参,免疫印迹分析的具体操作步骤如下:
1、SDS-PAGE电泳:首先制胶,安装电泳板,先后灌注适当浓度和体积的分离胶(8%-12%)、浓缩胶(5%),倒入适量电泳缓冲液;将处理好的样品与蛋白Marker依次加入上样孔,每个样品上样20μg;随后在浓缩胶以恒压80V开始电泳,电泳15分钟进入分离胶后,将电压提高到120V,继续电泳直至溴酚兰到达分离胶底部,关闭电源。
2、蛋白质转移:预先为每块胶剪裁4张滤纸和一张PVDF膜,其大小比凝胶稍大即可;将PVDF膜浸泡到甲醇中1分钟使其活化,拿出后将其与滤纸和海绵置于转膜缓冲液中,至完全湿润,再从电泳槽中取下凝胶;在转膜仪中,从下到上依次按海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、海绵的顺序放好并对齐,形成“三明治”结构,并在上层厚滤纸上赶出气泡;将转膜仪组装好,连接电源,低温,380mA恒压120分钟。
3、封闭:将PVDF膜取出,用5%BSA/TBST溶液在室温下摇床振荡封闭1h,用TBST洗3遍,每次5分钟。
4、抗体孵育:将一抗按1:1000的比例稀释,加入抗体孵育盒中,把PVDF膜放入其中,4℃摇床孵育过夜,TBST洗3遍;加入二抗(1:5000)室温避光孵育1h。TBST洗3遍。
5、扫膜:用(Tanon-5200)系统进行扫膜分析,并保存图像记录。
三、检测结果。
结果如图7所示,DDEA对CSE刺激16HBE细胞引起炎症信号通路中GADD153/CHOP(生长阻滞和DNA损伤诱导基因)、c-FOS(转录因子)和c-JUN(转录因子)的蛋白表达显示出显著抑制作用。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.GADD153/CHOP,c-FOS,或c-JUN作为靶点在制备用于治疗烟草引发炎症的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述应用包括在制备用于治疗烟草引发炎症导致疾病的药物中的应用,所述疾病包括慢性阻塞性肺病。
3.GADD153/CHOP,c-FOS,或c-JUN的抑制剂在制备用于治疗烟草引发炎症的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述应用包括在制备用于治疗烟草引发炎症导致疾病的药物中的应用,所述疾病包括慢性阻塞性肺病。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述药物下调IL-1β、IL-6、IL-8和IL-18的表达量。
6.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述药物下调GADD153/CHOP,c-FOS,或c-JUN的蛋白表达量。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的应用,其特征在于,所述抑制剂为(2Z,4E)-2,4-癸二烯酸。
8.(2Z,4E)-2,4-癸二烯酸在制备用于治疗烟草引发炎症的药物中的应用。
9.(2Z,4E)-2,4-癸二烯酸在制备用于治疗烟草引发炎症导致疾病的药物中的应用,所述疾病包括慢性阻塞性肺病。
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