CN105358679A - 干细胞培养基和增加细胞存活的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了制备用于移植的造血细胞的改进方法以及所得的改进的造血细胞组合物。本发明还涉及改进的培养基以及培养、处理、调控和扩增用于造血移植的血细胞产品的方法。本发明总体上涉及调控细胞群，尤其是包含造血干细胞的细胞群的改善的培养基，它们的组合物以及使用这些培养基和组合物的方法。

Description

干细胞培养基和增加细胞存活的方法
相关申请的引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求于2013年3月15日提交的美国临时专利申请No.61/792,818的权益，该专利以其全部内容作为参考并入本文。
背景技术
技术领域
本发明总体上涉及用于操纵细胞群，尤其是包含造血干细胞的细胞群的改进的培养基，其组合物以及使用这些培养基和组合物的方法。
相关领域的说明
干细胞应用于多种临床和研究应用。例如，可以在细胞测定、药物筛选以及毒性测定中使用干细胞及其分化的子代。干细胞还有希望用于细胞基疗法，如在用于受损组织治疗的再生医学中。再生医学所追求的一个方面是使用造血干细胞移植来治疗不断增多的癌症和退行性病症。根据国家骨髓捐献(theNationalMarrowDonorNMDP)，每年全世界将实施估计45,000至50,000次造血细胞移植(骨髓、外周血干细胞(PBSC)或脐血移植)来治疗危急生命的恶性和非恶性疾病患者(HorowitzMM.UsesandGrowthofHematopoieticCellTransplantation.In:BlumeKG,FormanSJ,AppelbaumFR主编.Thomas'HematopoieticCellTransplantation.第3版.Malden,Mass:Blackwell；2004:9-15)。此外，每年约4800位患者通过NMDP使用独立的供体或脐血单位进行移植。
对于所有这些应用，需要可复现的干细胞培养法以提供足够数目的具有适合于其使用目的质量的细胞。然而，本领域目前缺少可以在细胞经历处理活动(如细胞群的冷冻保存、解冻、再悬浮、扩增、培养和维持，这些处理可以导致一定程度的细胞死亡)时保持细胞生物活性的任何细胞培养基。因此，本领域需要出于研究和治疗目的，用于处理、维持、调控和扩增细胞群的有效细胞培养基。
发明概述
本发明总体上提供了用于制备细胞群的改善的培养基，它的组合物以及使用这些培养基和组合物的方法。
在多个实施方式中，提供了培养基，其包含：(a)约1％至约20％的多糖；和(b)化学成分确定的细胞培养基。
在具体的实施方式中，所述多糖是右旋糖酐。
在一种实施方式中，所述多糖是右旋糖酐，其选自由右旋糖酐-1、右旋糖酐-10、右旋糖酐-20、右旋糖酐-30和右旋糖酐-40组成的组。
在某一实施方式中，所述多糖是右旋糖酐-40。
在其他实施方式中，所述多糖是羟乙基淀粉(HES)。
在某一实施方式中，所述多糖是HES，其选自由羟乙基淀粉(hetastarch)、六聚淀粉(hexastarch)、五聚淀粉(pentastarch)和四聚淀粉(tetrastarch)组成的组。
在一种实施方式中，所述多糖是羟乙基淀粉。
在另一种实施方式中，所述培养基包含约1％至约5％的多糖。
在另一种实施方式中，所述培养基包含约6％的多糖。
在一个具体的实施方式中，所述培养基包含约7％的多糖。
在某一实施方式中，所述培养基包含约8％的多糖。
在一种其他的实施方式中，所述培养基包含约9％的多糖。
在一种其他的实施方式中，所述培养基包含约10％的多糖。
在具体的实施方式中，所述培养基包含约1％至约5％的HSA。
在其他的实施方式中，所述培养基包含约2％的HSA。
在另一种实施方式中，所述培养基包含约3％的HSA。
在其他的实施方式中，所述培养基包含约4％的HSA。
在一种实施方式中，所述培养基包含约5％的HSA。
在其他实施方式中，其中所述化学成分确定的细胞培养基选自：StemSpan-ACF、StemSpan-H3000、StemSpan-SFEM、StemlineII、StemPro34、StemXVivo、伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基(IMDM)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、RoswellParkMemorialInstitute培养基(RPMI)1640培养基、McCoy's5A培养基、α最低必需培养基(α-MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、Fischer培养基、medium199、F-12K营养混合物培养基(Kaighn改良，F-12K)和X-vivo20。
在具体的实施方式中，所述化学成分确定的细胞培养基选自由StemSpan-ACF、StemSpan-H3000和StemSpan-SFEM组成的组。
在某一实施方式中，所述化学成分确定的细胞培养基是StemSpan。
在另一特定实施方式中，所述培养基还包含一种或多种生长因子或细胞因子。
在某一实施方式中，所述化学成分确定的培养基包含一种或多种生长因子或细胞因子，所述细胞因子选自由flt3-配体(FLT3)；促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白介素-3(IL3)、白介素-6(IL6)和白介素-9(IL9)组成的组。
在一种实施方式中，所述培养基还包含选自由cAMP类似物或增强剂、Gα-s活化剂和前列腺素途径激动剂组成的组中的试剂。
在具体的实施方式中，所述前列腺素途径激动剂选择性结合PGE2EP2或PGE2EP4受体。
在其他实施方式中，所述前列腺素途径激动剂包括PGE2或PGE2的类似物或衍生物。
在其他实施方式中，所述前列腺素途径激动剂选自由PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-甲基PGE2、20-乙基PGE2和8-异-16-环己基-四降PGE2(8-iso-16-cyclohexyl-tetranorPGE2)组成的组。
在其他具体的实施方式中，所述前列腺素途径激动剂包括16,16-dmPGE2。
在多种实施方式中，提供了组合物，其包含：(a)细胞群；(b)约1％至约20％的多糖；和(c)化学成分确定的细胞组合物。
在一种实施方式中，所述细胞群选自由骨髓细胞(BMC)、脐带血细胞(UCBC)、胎盘血细胞、动员外周血细胞(mPBC)、造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)和CD34+细胞组成的组。
在具体的实施方式中，所述细胞群选自由骨髓、脐带血、胎盘血或动员的外周血组成的组。
在另一种具体的实施方式中，所述细胞群包含由造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)和CD34+细胞组成的组中的至少一种。
在某一实施方式中，所述细胞群包括纯化的CD34+细胞群。
在其他实施方式中，所述多糖是右旋糖酐。
在另一种实施方式中，所述多糖是右旋糖酐，其选自由右旋糖酐-1、右旋糖酐-10、右旋糖酐-20、右旋糖酐-30和右旋糖酐-40组成的组。
在一种实施方式中，所述多糖是右旋糖酐-40。
在某一实施方式中，所述多糖是HES。
在其他实施方式中，所述多糖是HES，其选自由羟乙基淀粉、六聚淀粉、五聚淀粉和四聚淀粉组成的组。
在具体的实施方式中，所述多糖是羟乙基淀粉。
在其他实施方式中，所述组合物包含约1％至约5％的多糖。
在另一种实施方式中，所述组合物包含约6％的多糖。
在其他某一实施方式中，所述组合物包含约7％的多糖。
在一种实施方式中，所述组合物包含约8％的多糖。
在具体的实施方式中，所述组合物包含约9％的多糖。
在某一具体的实施方式中，所述组合物包含约10％的多糖。
在其他具体的实施方式中，所述组合物包含约1％至约5％的HSA。
在其他具体的实施方式中，所述组合物包含约2％的HSA。
在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含约3％的HSA。
在一个具体的实施方式中，所述组合物包含约4％的HSA。
在一种实施方式中，所述组合物包含约5％的HSA。
在其他实施方式中，所述化学成分确定的细胞培养基选自：StemSpan-ACF、StemSpan-H3000、StemSpan-SFEM、StemlineII、StemPro34、StemXVivo、伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基(IMDM)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、RoswellParkMemorialInstitute培养基(RPMI)1640培养基、McCoy's5A培养基、α最低必需培养基(α-MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、Fischer培养基、medium199、F-12K营养混合物培养基(Kaighn改良，F-12K)和X-vivo20。
在一种实施方式中，所述化学成分确定的细胞培养基选自由StemSpan-ACF、StemSpan-H3000和StemSpan-SFEM组成的组。
在另一种实施方式中，所述化学成分确定的细胞培养基是StemSpan。
在另一种实施方式中，所述组合物还包含一种或多种生长因子或细胞因子。
在具体的实施方式中，所述化学成分确定的培养基包含一种或多种生长因子或细胞因子，其选自由flt3-配体(FLT3)；促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、白介素-3(IL3)、白介素-6(IL6)和白介素-9(IL9)组成的组。
在某一实施方式中，所述组合物还包含选自由cAMP类似物或增强剂、Gα-s活化剂和前列腺素途径激动剂组成的组中的试剂。
在其他实施方式中，所述前列腺素途径激动剂选择性结合PGE2EP2或PGE2EP4受体。
在具体的实施方式中，所述前列腺素途径激动剂包括PGE2或PGE2的类似物或衍生物。
在其他实施方式中，所述前列腺素途径激动剂选自由PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-甲基PGE2、20-乙基PGE2和8-异-16-环己基-四降PGE2组成的组。
在一种实施方式中，所述前列腺素途径激动剂包括16,16-dmPGE2。
在多个实施方式中，提供了制备细胞群的方法，其包括使所述细胞群与根据上述实施方式中任一项的培养基接触。
在一种实施方式中，所述细胞群包含造血细胞群。
在另一种实施方式中，所述造血细胞群选自由骨髓细胞(BMC)、脐带血细胞(UCBC)、胎盘血细胞、动员外周血细胞(mPBC)、造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)和CD34+细胞组成的组。
在其他实施方式中，所述造血细胞群选自：骨髓、脐带血、胎盘血或动员的外周血。
在另一种实施方式中，所述造血细胞群包含造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)和CD34+细胞中的至少一种。
在具体的实施方式中，所述造血细胞群是纯化的CD34+细胞群。
在另一种实施方式中，所述细胞群包括冷冻保存的细胞，并且接触包括将所述冷冻保存的细胞在所述培养基中解冻。
在一种实施方式中，所述细胞群包括在将所述细胞群与所述培养基接触前已解冻的冷冻保存的细胞。
在其他实施方式中，所述细胞群在约20℃至约37℃的温度下解冻。
在另一种实施方式中，所述细胞群在约25℃、约30℃或约37℃的温度下解冻。
在另一种实施方式中，与已与对照培养基接触的对照细胞群相比，所述接触的细胞群的细胞溶解减少了约10％、约20％、约30％、约40％或约50％。
在其他实施方式中，与已与对照培养基接触的对照细胞群相比，所述接触的细胞群的细胞溶解减少了约2倍、3倍或5倍。
在另一种实施方式中，与从已与对照培养基接触的对照造血细胞群的TNC回收相比，从所述接触的造血细胞群的TNC回收提高了约10％、约20％、约30％或约50％。
在另一种实施方式中，与从已与对照培养基接触的对照造血细胞群的TNC回收相比，从所述接触的造血细胞群的TNC回收提高了约2倍、约3倍或约5倍。
在具体的实施方式中，与已与对照培养基接触的对照细胞群的CD34+细胞活力相比，所述接触的CD34+细胞的活力提高了约10％、约20％、约30％、约40％或约50％。
在另一种实施方式中，与已与对照培养基接触的对照细胞群的CD34+细胞活力相比，所述接触的CD34+细胞的活力提高了约2倍、约3倍或约5倍。
在另一种实施方式中，所述细胞群是离体调控的。
在具体的实施方式中，所述调控包括将所述细胞群与至少一种试剂接触，所述试剂选自由cAMP类似物或增强剂、Gα-s活化剂和前列腺素途径激动剂组成的组。
在一种实施方式中，所述前列腺素途径激动剂选择性结合PGE2EP2或PGE2EP4受体。
在另一种实施方式中，所述前列腺素途径激动剂包含PGE2或PGE2的类似物或衍生物。
在另一种实施方式中，所述前列腺素途径激动剂选自由PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-甲基PGE2、20-乙基PGE2和8-异-16-环己基-四降PGE2组成的组。
在另一种实施方式中，所述前列腺素途径激动剂包含16,16-dmPGE2。
在具体的实施方式中，将所述细胞群与至少一种试剂接触约1小时至约4小时的时间。
在另一种实施方式中，将所述细胞群与至少一种试剂接触约1小时或约2小时的时间。
在另一种实施方式中，将所述细胞群与至少一种试剂在约25℃至约37℃的温度下接触。
在另一种实施方式中，将所述细胞群与至少一种试剂在约30℃或约37℃的温度下接触。
在另一种实施方式中，所述细胞群包括造血细胞，并且接触包括在约37℃，将所述造血细胞与10μM16,16-dmPGE2接触约2小时。
在具体的实施方式中，与未调控的细胞群相比，所述细胞群的移植、重建、归巢和/或增殖体内增加。
在另一种实施方式中，与对照未调控细胞群中的至少两个基因的表达相比，所述细胞群中选自CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2的至少两个基因的表达提高了约20倍。
在一种实施方式中，与对照未调控细胞群中的至少五种基因的表达相比，所述细胞群中选自CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2的至少五种基因的表达提高了约10倍、约3倍或约2倍。
在另一种实施方式中，与对照未调控细胞群中的基因表达相比，所述细胞群中基因CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HAS1、CXCL2、CXCL3和CXCR4的表达提高了约3倍或约2倍。
在一种实施方式中，将所述细胞群施用于受试者。
在其他实施方式中，所述细胞群对受试者是同种异体的。
在另一种实施方式中，所述细胞群对受试者是自体同源的。
在具体的实施方式中，所述受试者选自以下的患有疾病、病症或病况：缺血、非恶性血液病症、免疫缺陷、严重联合免疫缺陷(SCID)、淋巴细胞减少、血小板减少、中性白细胞减少、贫血症、范可尼贫血、重型再生障碍性贫血、先天性血红蛋白病、镰刀形红细胞病、β-地中海贫血、镰刀形红胞病、维-奥二氏综合症、代谢贮积病、赫尔勒氏症、Hunter症、甘露糖苷过多症、癌症、血液恶性肿瘤、急性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良综合征、非血液学癌症、乳腺癌、卵巢癌、脑癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、皮肤癌、肝癌和胰癌。
在多种实施方式中，根据上述实施方式中任一项提供了培养基，其中通过在约25℃至约37℃的温度下将样品与至少一种调控前列腺素途径的试剂接触约1至约24小时的持续时间的调控，所述培养基在解冻的全脐血样品中维持至少70％的TNC。
在具体的实施方式中，所述培养基在解冻的全脐血样品中维持至少75％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的TNC。
在某些其他实施方式中，所述至少一种试剂选自：cAMP类似物或增强剂、Gα-s活化剂和前列腺素途径激动剂。
在一种具体的实施方式中，所述至少一种试剂选择性结合PGE2EP2或PGE2EP4受体。
在具体的实施方式中，所述至少一种试剂包括PGE2或PGE2的类似物或衍生物。
在一种实施方式中，所述至少一种试剂选自由PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-甲基PGE2、20-乙基PGE2和8-异-16-环己基-四降PGE2组成的组。
在其他实施方式中，所述至少一种试剂包括16,16-dmPGE2。
在其他实施方式中，将样品与至少一种试剂接触约1小时至约4小时的时间。
在某一实施方式中，将样品与至少一种试剂接触约1小时或约2小时的时间。
在一种实施方式中，将样品与至少一种试剂在约25℃至约37℃的温度下接触。
在某一实施方式中，将全脐血样品与至少一种试剂在约30℃或约37℃的温度下接触。
在另一种实施方式中，将样品在约37℃与10μM16,16-dmPGE2接触约2小时。
在具体的实施方式中，与对照全脐血样品中至少两个基因的表达相比，所述接触的样品中选自CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2的至少两个基因的表达提高了约20倍。
在一个具体的实施方式中，与对照全脐血样品中至少五种基因的表达相比，所述接触的样品中选自CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2的至少五种基因的表达提高了约10倍、约3倍或约2倍。
在其他具体的实施方式中，与对照全脐血样品中的基因表达相比，所述接触的样品中基因CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2的表达提高了约10倍、约5倍、约3倍或约2倍。
在多个实施方式中，提供了与根据上述实施方式中任一项的培养基接触的全脐血样品，其中通过在约25℃至约37℃的温度下，将所述样品与调控前列腺素途径的至少一种试剂接触约1至约24小时的一段时间，在培养基中调控所述脐血样品，其中所述样品包含至少70％的TNC并且所述样品不进行富集。
在某一实施方式中，所述TNC为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
在其他实施方式中，所述至少一种试剂选自：cAMP类似物或增强剂、Gα-s活化剂和前列腺素途径激动剂。
在一种实施方式中，所述至少一种试剂选择性结合PGE2EP2或PGE2EP4受体。
在具体的实施方式中，所述至少一种试剂包括PGE2或PGE2的类似物或衍生物。
在某一实施方式中，所述至少一种试剂选自：PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-甲基PGE2、20-乙基PGE2和8-异-16-环己基-四降PGE2。
在另一种实施方式中，所述至少一种试剂包括16,16-dmPGE2。
在其他实施方式中，将全脐血样品与至少一种试剂接触约1小时至约4小时的时间。
在其他实施方式中，将全脐血样品与至少一种试剂接触约1小时或约2小时的时间。
在另一种具体的实施方式中，将全脐血样品在约25℃至约37℃的温度下与至少一种试剂接触。
在一种实施方式中，将全脐血样品在约30℃或约37℃的温度下与至少一种试剂接触。
在一种实施方式中，在约37℃，将全脐血样品与10μM16,16-dmPGE2接触约2小时。
在其他实施方式中，与对照全脐血样品中的至少两个基因的表达相比，所述接触的样品中选自CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2的至少两个基因的表达提高了约20倍。
在某一实施方式中，与对照全脐血样品中至少五种基因的表达相比，所述接触的样品中选自CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2的至少五种基因的表达提高了约10倍、约3倍或约2倍。
在其他实施方式中，与对照全脐血样品中的基因表达相比，所述接触的样品中基因CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2的表达提高了约10倍、约5倍、约3倍或约2倍。
附图说明
图1A示出了在解冻后、清洗后、在37℃孵育1小时后和在37℃孵育2小时后，与单独的StemSpan-ACF相比，在具有8％右旋糖酐-40的StemSpan-ACF中孵育的样品中活CD34+细胞的数目。
图1B示出了在解冻后、清洗后、在37℃孵育1小时后和在37℃孵育2小时后，与单独的StemSpan相比，在具有8％右旋糖酐的StemSpan-ACF中孵育的样品中的CD45+细胞组分中的完整粒性白细胞的百分比。
图2示出了在解冻后、清洗后和在37℃孵育2小时后，用10μMdmPGE2处理并在StemSpan-ACF、StemSpan-ACF+2.1％HSA、StemSpan+4.2％HSA、IMDM+4.2％HSA或StemSpan-ACF+8％右旋糖酐-40中处理的脐血单位的TNC计数。
图3示出了在37℃与10μMdmPGE2孵育2小时后，显示出提高的CXCR4表达的CD34+细胞的百分比。样品用StemSpan-ACF、StemSpan-ACF+5％右旋糖酐-40或StemSpan+10％右旋糖酐-40处理。
发明详述
A.概述
本发明提供了用于处理和调控细胞群，具体地，造血干细胞组合物的改善的细胞培养基。本发明还提供了制备用于多种用途(包括体外和体内研究和再生干细胞疗法，如制备用于移植疗法的造血细胞组合物)的细胞的方法。不希望受任何特定理论的束缚，考虑在细胞处理期间(包括解冻细胞群的准备期间)并且在细胞后续离体操作期间，在细胞群(例如，白细胞，包括粒性白细胞)中培养基改善细胞活力并且降低多种细胞类型的细胞溶解。细胞培养基可以通过稳定凋亡细胞的膜来减少细胞溶解。
除了在细胞处理期间，由于细胞稳定性提高和细胞溶解减少而导致的总有核细胞计数(TNC)回收率的增加(通过防止由于细胞溶解所造成的胞内成分的释放)外，细胞培养基防止可能导致细胞产物内“凝集”的血细胞产物中细胞碎片的聚集。血细胞产物中的凝集可能妨碍进一步的细胞处理操作，并且还可能抑制细胞过程，包括细胞的调控。因此，通过在处理和调控期间抑制细胞(例如，白血球，包括粒性白细胞)的凋亡和溶解，本发明所述的培养基改善了细胞群处理、调控和/或扩增期间的TNC回收。所述培养基还使得能够通过小分子调控细胞，包括细胞激活，如可以通过基因和/或蛋白质表达变化所显示的，其中这些调控在其他细胞培养或浸液培养基中可能被损害或削弱。
可以在所有细胞处理步骤中使用所述培养基，包括细胞群(具体地，包含造血干细胞的细胞群)的解离、冷冻保存、解冻、再悬浮、调控、扩增或维持。具体地，所述培养基可以在处理和调控全血细胞产物，包括全脐血和动员的外周血中使用，以防止细胞群中(例如)粒性白细胞和单核细胞的细胞溶解并借此减少处理期间这些血液产物中凝集的发生。
本发明还提供了包含具有较高生物活性的造血干细胞的组合物，其提供了用于移植疗法的造血细胞的改善来源。所述改善的细胞组合物具有提高的治疗性质，其导致体内移植提高、造血重建提高、对骨髓的归巢提高和增殖提高。因此，本文所考虑的改善的方法和组合物可以使得能够在脐血移植中使用部分或单一的脐血单位(cordunit)。
在多个实施方式中，提供了制备用于移植疗法的包含造血细胞的细胞群的方法。改善的方法包括使用使造血细胞群稳定的新型培养基，其使得能够调控和增加造血细胞，借此提高成功移植和造血重建的可能性。
除非明确相反指出，否则本发明的实践将使用本领域技术范围内的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的常规方法，以下将出于说明的目的描述多种所述方法。在文献中充分说明了这些技术。参见，例如，Sambrook,等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual(第3版,2001)；Sambrook,等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版,1989)；Maniatis等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual(1982)；Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley和Sons,2008年7月更新)；ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePub.AssociatesandWiley-Interscience；Glover,DNACloning:APracticalApproach,第I&II卷(IRLPress,Oxford,1985)；Anand,TechniquesfortheAnalysisofComplexGenomes,(AcademicPress,NewYork,1992)；TranscriptionandTranslation(B.Hames&S.Higgins编著,1984)；Perbal,APracticalGuidetoMolecularCloning(1984)；andHarlowandLane,Antibodies,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1998)。
本文引用的所有专利公开、专利和专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
B.定义
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学名词的含义与本发明所属领域中那些技术人员通常理解的含义相同。尽管可以在本发明的实践或测试中使用与本文所述的那些类似或等价的任何方法和材料，但是本文描述了组合物、方法和材料的优选实施方式。出于本发明的目的，以下定义了下列术语。
在本文中，使用冠词“一个”和“所述”表示一个或多于一个(即，至少一个)语法上的制品对象。举例来说，“一个元素”表示一个元素或多于一个元素。
如本文所使用的，术语“约”或“大约”是指相比于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，改变多至30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在具体的实施方式中，当置于数值之前时，术语“约”或“大约”表示数值加或减15％、10％、5％或1％的范围。
应理解在一些实施方式中，术语“至少”可以被术语“至少约”代替。
在整个说明书中，除非上下文需要，否则单词“包含”将被理解为表示包括所指明的步骤或元素或者步骤或元素的组，但是不排除任何其他步骤或元素或者步骤或元素的组。“由……组成”表示包括并且限于短语“由……组成”中所列的任何内容。因此，短语“由……组成”表示所列元素是所需的或强制的，并且不可以出现其他元素。“基本由……组成”表示包括该短语中所列的任何元素，并且限于不防碍或者有助于发明公开中对所列元素指定的活动或动作的其他元素。因此，短语“基本由……组成”表示所列元素是所需的或强制的，但是没有其他元素是可选的并且基于它们是否会影响所列元素的活动或动作，其他元素可以或可以不出现。
在整个说明书中，对“一种实施方式”、“具体实施方式”、“相关实施方式”、“某一实施方式”、“其他实施方式”或“另外的实施方式”或它们的组合的提及是指结合实施方式所述的具体特征、结构或特性包含在本发明的至少一种实施方式中。因此，在整个说明书的不同位置出现上述短语不一定全部表示相同的实施方式。此外，具体特征、结构或特性可以以任何适合的方式合并在一种或多种实施方式中。
在具体的实施方式中，术语“再悬浮”或“稀释”是指将解冻细胞转移到如本文所考虑的培养基中。可以将解冻细胞转移到相同体积的培养基中或更大体积的培养基中。解冻细胞可以在如本文所考虑的培养基中稀释1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
术语“离体”通常是指发生在生物之外的活动，如在生物之外的人工环境中在活组织中或上进行的实验或测量，优选地，以最小的自然条件变化进行。在具体的实施方式中，“离体”程序包括通常在无菌条件下，从在实验仪器中培养或调控几小时或长达约24小时，但是根据情况，包括长达48或72小时的生物中采取的活细胞或组织。在某些实施方式中，可以收集和冷冻这些组织或细胞，并且随后解冻用于离体处理。通常将使用活细胞或组织进行的持续长于几天的组织培养实验或程序认为是“体外的”，尽管在某些实施方式中，该术语可以与离体互换使用。
“离体施用”、“离体处理”或“离体调控”的列举通常涉及其中一个或多个器官、细胞或组织得自活受试者或近期死亡的受试者，任选地纯化/富集、暴露于处理或程序(例如，包括将细胞与本发明的组合物或试剂一起孵育以提高特定细胞(如造血干细胞或祖细胞)的扩增的离体施用步骤)的医学程序。可以将离体处理的细胞施用于供体或不同活受试者。
这些离体治疗应用还可以包括任选的体内处理或程序步骤，如通过向活的受试者施用一次或多次具有治疗潜能的细胞。根据本领域中熟知的技术并且如在本文其他地方所述的，对这些实施方式考虑了局部和全身施用两者。施用于受试者的治疗细胞的量将取决于受试者的特征，如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性以及对药物和/或细胞移植的反应程度、严重性和类型。
术语“体内”一般是指发生在生物内部的活动，如细胞移植、重建、细胞归巢、细胞自更新和细胞扩增。在一种实施方式中，术语“体内扩增”是指细胞群体内数目增加的能力。在具体的实施方式中，体内扩增包括干细胞的自更新和/或增殖。
如本文所使用的，术语“移植”是指将细胞整合至某一位置(如组织或损伤位点)并成为所述组织中或该位点处的驻留细胞(residentcell)的过程。例如，可以将细胞移植到骨髓中，或者另一位置中，如损伤或缺血组织位点。
在具体的实施方式中，术语“移植”是指造血细胞定位至骨髓并在此成为驻留细胞的过程。在某些实施方式中，移植基本独立于细胞增殖并且独立于重建。当相对于移植到另一样品(如对照样品)中的细胞数目，在样品中移植更多细胞时，发生“移植增加”。在一些实施方式中，当与未处理或对照样品中的细胞数目相比，细胞移植物的处理样品中细胞更多时，发生移植增加。
“移植潜能”是指造血细胞的移植能力，并且可以通过(例如)显示细胞具有增加移植的潜能的基因表达进行评价。
如本文所使用的，术语“重建”是指一种或多种移植造血细胞通过导致产生更多的祖细胞和更多的分化的造血细胞类型来重新构成或再生受试者造血系统的能力。在具体的实施方式中，重建是指移植的造血干细胞和/或祖细胞重新构成造血系统的过程。长期重建需要移植。当与不同的样品中的细胞相比，使用样品中的细胞重建的造血系统更多时(如处理样品相对于未处理样品，其可以仅部分或优选地重建某些造血系)，发生“造血重建增加”。“重建潜能”是指造血细胞重建造血系统的能力，并且可以通过(例如)显示细胞具有增加重建的潜能的基因表达进行评价。
“归巢”是指HSPC定位(即移动)至特定区域或组织的能力。归巢可以包括将施用的HSPC定位至骨髓或另一位置，如损伤或缺血组织位点。当与不同的样品中移动至靶组织的细胞数目相比，样品中移动至靶组织的细胞更多时(如与未处理样品相比，在处理样品中所观察到的移动)，发生“归巢增加”。“归巢潜能”是指造血细胞移动至靶组织的能力，并且可以通过(例如)显示细胞具有增加的归巢的潜能的基因表达进行评价。
如本文所使用的，术语“增殖”是指细胞分裂的增加，无论是细胞的对称分裂还是不对称分裂。在具体的实施方式中，“增殖”是指干细胞和/或祖细胞的对称分裂或不对称分裂。当与未处理样品中的细胞相比，处理样品中细胞数目增加时，发生“增殖增加”。“增殖潜能”是指显示细胞具有增殖增加潜能的造血细胞的基因表达特征。
如本文所使用的，术语“治疗”是指获得所需的药理学和/或生理学作用，其无限制地包括实现疾病症状的改善或去除。就完全或部分预防疾病或其症状而言，所述作用可以是预防性的，和/或就实现症状的改善或去除或者提供疾病和/或可归因于该疾病的不利作用的部分或完全治愈而言，所述作用可以是治疗性的。如本文所使用的，“治疗”涵盖了哺乳动物，具体地人中的任何疾病治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能对该疾病易感但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即，终止其发生；(c)缓解疾病，例如，导致疾病消退，例如，完全或部分消除疾病症状；和(d)使个体恢复至疾病前状态，例如，重建造血系统。
“提高”或“促进”或者“增加”或“激活”一般是指与媒介物或对照分子/组合物所引起的反应相比，试剂或组合物产生或导致细胞中更大生理反应(即，下游作用)的能力，例如，提高的造血干细胞和祖细胞的移植或重建和体内干细胞扩增的提高。可测量的生理反应可以包括造血干细胞和祖细胞移植、重建、活力、归巢、自更新和/或扩增的提高，其中根据本领域中的理解和本文的描述是显而易见的。在一种实施方式中，可测量的生理反应包括与参考样品(例如，对照或未处理细胞)中基因表达相比，作为造血细胞治疗潜能的标志物的多种基因的表达的提高。“提高”或“增加”量通常是“统计学显著的”量，并且可以包括媒介物(没有试剂)或者对照组合物所产生的反应的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍)(包括它们之间并且大于1的所有整数和小数的点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)的提高。
“减少”或“降低”一般是指与媒介物或对照分子/组合物所引起的反应相比，试剂或组合物产生或导致细胞中较低生理反应(即下游效应)的能力，例如，基因表达的减少。在一种实施方式中，减少可以是基因表达的减少或者是通常与细胞活力降低有关的细胞信号的减少。“减少”或“降低”量通常是“统计学显著的”量，并且可以包括媒介物(没有试剂)或者对照组合物所产生的反应的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍)(包括它们之间并且大于1的所有整数和小数的点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)的减少。
“维持”或“保持”或者“无变化”或“无显著变化”、“无显著提高”或“无显著降低”一般是指与媒介物或对照分子/组合物所引起的反应(参考反应)相比，试剂产生或导致细胞中相当的生理反应(即下游效应)的能力。相当的反应是与参考反应无显著不同或者无可测量不同的反应。
细胞的“治疗潜能”是指细胞的治疗质量，当施用于受试者时，细胞提供治疗益处的能力。在具体的实施方式中，可以通过多种基因表达的提高和/或通过显示细胞治疗潜能的特定基因表达特征的存在来测量、定量、确定、鉴别或验证细胞的治疗潜能。在一种实施方式中，治疗潜能是指细胞归巢和移植至特定组织、器官或损伤位点的能力。在具体的实施方式中，治疗潜能是指细胞重建受试者造血系统的能力。在某一实施方式中，治疗潜能是指一旦施用于受试者，细胞经历体内自更新的能力。在具体的实施方式中，术语“治疗性细胞”和“具有治疗潜能的细胞”是可互换使用的。
在具体的实施方式中，具有多种基因表达提高和/或特定基因表达特征的细胞具有“显著治疗潜能”。当施用于受试者时，它们具有移植的能力、重建细胞系的能力和/或增殖的能力，则细胞的治疗潜能是足够的。
在某些实施方式中，具有治疗潜能的细胞包含唯一或基本唯一的基因和/或蛋白质表达。包含唯一或基本唯一的表达的细胞被认为具有治疗潜能。在具体的实施方式中，短语“多种基因的表达”是指基因表达、mRNA的表达。在其他实施方式中，短语“多种基因的表达”是指蛋白质表达水平。
“多个”基因是指2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500或更多个基因，包括任何中间数目的基因。
如本文所使用的，术语“基因表达谱”、“基因表达特征”、“基因表达群组(geneexpressionpanel)”、“基因群组(genepanel)”或“基因特征”是指对相同样品(即细胞群)测量的多个(即不止一个)基因的表达水平。可以定义基因表达特征，从而从本领域中已有的细胞和/或对照、媒介物或未处理细胞中鉴别出用于分辨治疗性细胞或具有治疗潜能的细胞的一组基因“标签基因”或“多个基因”。
如本文所使用的，“标签基因”表示一组标签基因或多个基因中的任何基因。为清楚起见，标签基因不包括管家基因。
如本文所使用的“基因表达”是指生物样品(如干细胞和祖细胞或包含干细胞或祖细胞的细胞群)中基因的相对表达水平和/或表达类型。在具体的实施方式中，所述干细胞或祖细胞是造血干细胞和祖细胞。
“基因修饰”是指细胞基因组的暂时或永久修饰，例如，通过在病毒或质粒载体中插入多核苷酸序列，或者通过同源重组或非同源末端连接。
如本文所使用的，术语“基因疗法”是指将多核苷酸引入细胞以恢复、修复或修饰基因和/或基因表达。在具体的实施方式中，基因疗法修饰了基因组，并且在其他实施方式中，基因疗法是游离基因。
如本文所使用的，短语“检测表达”、“确定表达”和“测量表达”表示确定基因的RNA转录本或其表达产物的量或存在性。用于检测基因表达的方法(即基因表达谱的绘制)包括基于多核苷酸的杂交分析的方法、基于多核苷酸测序的方法、免疫组织化学方法和基于蛋白质组学的方法。这些方法通常检测所关心的基因的表达产物(例如，mRNA)。在一些实施方式中，使用基于PCR的方法，如反转录PCR(RT-PCR)(Weis等人,TIG8:263-64,1992)和基于阵列的方法，如微阵列(Schena等人,Science270:467-70,1995)。
用于RNA提取的一般方法在本领域中是熟知的并且在分子生物学的标准教科书中是公开的，包括Ausubel等人主编,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork1987-1999。具体地，可以根据生产商的说明，使用来自商品化生产商(如Qiagen(Valencia,Calif.))的纯化试剂盒、缓冲液组和蛋白酶进行RNA分离。例如，可以使用QiagenRNeasy小柱从培养细胞中分离总RNA。可以在杂交或扩增测定中使用分离的RNA，其包括(但不限于)PCR分析和探针阵列。用于RNA水平检测的一个方法包括将分离的RNA与可以杂交至待检测基因所编码的mRNA的核酸分子(探针)接触。核酸探针可以是(例如)全长cDNA或其部分，如长度为至少7、15、30、60、100、250或500个核苷酸并且在严格条件下足以特异性杂交至本发明的固有基因的寡核苷酸，或者任何衍生的DNA或RNA。mRNA与探针的杂交表明所讨论的固有基因被表达。
用于确定样品中基因表达水平的替代方法包括核酸扩增方法，例如，通过RT-PCR(美国专利No.4,683,202)、连接酶链式反应(Barany,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189-93,1991)、自主序列复制(Guatelli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874-78,1990)、转录扩增系统(Kwoh等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173-77,1989)、Q-β复制酶(Lizardi等人,Bio/Technology6:1197,1988)、基圆复制(美国专利No.5,854,033)，或者任何其他核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增分子。
在本领域中已知并且在下文中列举了多个不同的PCR或qPCR规程，这些规程可以直接应用于或调整以应用于使用本文所考虑的细胞效力测定确定治疗潜能的用途。由于不但提供了定量测量，而且还减少了时间和污染，因此在一些情况下，定量PCR(qPCR)(还称为实时PCR)是优选的。在一些情况下，由于需要新鲜的冷冻组织和专业的实验室设备，因此全基因表达谱绘制技术的可用性受到限制，从而使这些技术在临床环境中的常规使用存在困难。如本文所使用的，由于进行时无需对反应产物重复取样，因此“定量PCR(或者“实时qPCR”)是指对PCR扩增进行过程的直接监控。在定量PCR中，可以通过信号机制(例如，荧光)监控反应产物，这是因为它们是在信号高于背景水平之后但在反应达到平台期之前产生并被追踪的。达到可检测或“阈值”荧光水平所需的循环次数与PCR过程开始时可扩增靶标的浓度成正比，从而能够测量信号强度以实时提供对样品中靶标核酸的量的测量。
C.培养基
在多种实施方式中，考虑了用于细胞组合物(包括血细胞产物)操作的改善的培养基。通过提高血细胞产物处理期间有核细胞的回收，所述培养基提高了血细胞产物中总有核细胞(TNC)计数。不受任何具体理论限制，本发明的培养基通过减少有核细胞的溶解，借此提高使用本发明的培养基生产的血细胞产物中有核与无核细胞的比例来提高血细胞产物的TNC。所述改善的培养基还改善了处理期间，包括冷冻保存、解冻、再悬浮、培养或调控期间，包含在已通过一种或多种试剂体外或离体解冻和/或调控或扩增的血细胞产物中的血细胞产物的细胞活力。所述细胞培养基还通过稳定凋亡细胞的膜，借此降低细胞溶解、防止细胞碎片聚集和防止可以抑制细胞过程的胞内组分的释放来提高血细胞产物的稳定性。所述细胞培养基还改善了如本文所公开的一种或多种调控剂的离体细胞调控效率。在一种实施方式中，所述细胞培养基包括补充有多糖的用于培养干细胞的细胞培养基母液。在一些实施方式中，所述细胞培养基包括补充有多糖的化学成分确定的基础培养基母液，如适合于支持干细胞维持、生长和/或分化的任何确定的基础培养基，如常规人胚胎干细胞培养基。在具体的实施方式中，培养基包含多糖、人血清白蛋白(HSA)和化学成分确定的培养基。
在一些实施方式中，所述培养基适合于造血细胞(例如，HSPC)的冷冻、解冻、再悬浮、处理或纯化、使用一种或多种试剂的调控或扩增中的一个或多个。在某些实施方式中，所述培养基适合于造血细胞的解冻、再悬浮、处理或纯化、调控、扩增和向受试者的施用。在其他实施方式中，所述培养基适合于造血细胞的解冻、再悬浮、处理或纯化、调控和扩增，并且随后用药物可用的细胞培养基清洗所述造血细胞以用于向受试者施用。
1.多糖
在一种实施方式中，细胞培养基或组合物包含一种或多种低分子量多糖。“多糖”是指由单糖组成的长链糖的任何大类。由于所述链可以是无支链的或支链的，并且所述单糖可以是一类、两类或有时是多类，因此多糖可以以多种方式分类。在具体的实施方式中，细胞培养基和组合物包含约1％至约20％的多糖、约1％至约15％的多糖、约1％至约10％的多糖或约5％至约10％的多糖。在某些实施方式中，培养基和组合物可以包含至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％或至少约20％的多糖。
不希望受任何具体理论束缚，考虑提高细胞培养基中的多糖含量来稳定解冻后的细胞膜并防止凋亡细胞中的细胞溶解，借此提高血细胞产物的TNC计数和造血干细胞和祖细胞(HSPC)的活力。在某些优选实施方式中，培养基或组合物包含选自右旋糖酐和淀粉的多糖。
a.右旋糖酐
在多个实施方式中，细胞培养基或组合物包含一种或多种低分子量葡聚糖。右旋糖酐是由具有与右旋糖酐生物聚合物的主链单元1-3连接的侧链的α-D-1,6-葡萄糖-连接的葡聚糖组成的多糖。支化度为约5％。支链大部分为1-2个葡萄糖单元长。右旋糖酐可以获自肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)B512F对含蔗糖培养基的发酵。右旋糖酐是等张的并且可以在室温下存储。
低分子量葡聚糖的说明性实例包括分子量约1,000Da的右旋糖酐(右旋糖酐-1)、约10,000Da的右旋糖酐(右旋糖酐-10)、约20,000Da的右旋糖酐(右旋糖酐-20)、约30,000Da的右旋糖酐(右旋糖酐-30)、约40,000Da的右旋糖酐(右旋糖酐-40)或约50,000Da的右旋糖酐(右旋糖酐-50)。
在具体的实施方式中，细胞培养基或组合物包含至少1.0％、至少2.0％、至少3.0％、至少4.0％、至少5.0％、至少6.0％、至少7.0％、至少8.0％、至少9.0％、至少10.0％、至少11.0％、至少12.0％、至少13.0％、至少14.0％、至少15.0％、至少16.0％、至少17.0％、至少18.0％、至少19.0％或至少20.0％的右旋糖酐。在某些实施方式中，细胞培养基或组合物包含约1％至约20％的右旋糖酐、约2.5％至约15％的右旋糖酐、约5％至约12.5％的右旋糖酐或约5％至约10％的右旋糖酐。在一种实施方式中，所述右旋糖酐是右旋糖酐-1、右旋糖酐-10、右旋糖酐-20、右旋糖酐-30、右旋糖酐-40或右旋糖酐-50中的一种或多种。在具体的实施方式中，所述右旋糖酐是右旋糖酐-40。
b.羟乙基淀粉(HES)
在多个实施方式中，细胞培养基或组合物包含一种或多种低分子量淀粉。“淀粉”是指作为白色、无嗅、无味的颗粒状或粉末状复合碳水化合物(C6H10O5)x的多糖，它是植物中碳水化合物的主要储存形式。在具体的实施方式中，细胞培养基包含羟乙基淀粉(HES)。
HES是由玉米或高粱的蜡状物质制成的聚合物分子的母体名，并且主要由支链淀粉(98％)组成。它是与糖原非常类似的多分支多糖，是在存在碱性催化剂的情况下通过环氧乙烷和支链淀粉之间的反应形成的。可以通过葡萄糖分子上C2、C3和C6位的羟基被羟乙基取代的程度来调节分子量和摩尔取代度。C2位相对于C6位(C2:C6比)的取代越大，则半衰期越长。
数均分子量(Mn)是溶液中聚合物分子量的算术平均值。重均分子量(Mw)是每个数的分子数目之和除以总分子数。当溶液中存在较大的聚合物时，该重量通常较大。不同HES产品的分类包括Mw的比值和取代度。
HES产品的说明性实例包括，但不限于，羟乙基淀粉(0.7取代度)、六聚淀粉(0.6取代度)、五聚淀粉(0.5取代度)和四聚淀粉(0.4取代度)。
在具体的实施方式中，细胞培养基或组合物包含约1.0％、至少2.0％、至少3.0％、至少4.0％、至少5.0％、至少6.0％、至少7.0％、至少8.0％、至少9.0％、至少10.0％、至少11.0％、至少12.0％、至少13.0％、至少14.0％、至少15.0％、至少16.0％、至少17.0％、至少18.0％、至少19.0％或至少20.0％的HES。在某些实施方式中，HES选自：羟乙基淀粉、六聚淀粉、五聚淀粉和四聚淀粉。在具体的培养基制剂中，细胞培养基包含一种或多种淀粉，其选自由羟乙基淀粉、六聚淀粉、五聚淀粉和四聚淀粉组成的组。在一种实施方式中，细胞培养基或组合物包含约2.5％至约12.5％的HES、约2.5％至约10％的HES、约5％至约12.5％的HES或约5％至约10％的HES。
在一个具体的实施方式中，细胞培养基包含总淀粉浓度为1.0％、至少2.0％、至少3.0％、至少4.0％、至少5.0％、至少6.0％、至少7.0％、至少8.0％、至少9.0％、至少10.0％、至少11.0％、至少12.0％、至少13.0％、至少14.0％、至少15.0％、至少16.0％、至少17.0％、至少18.0％、至少19.0％或至少20.0％的右旋糖酐和HES两者。
2.人血清白蛋白(HSA)
人血清白蛋白(HSA)是人血浆中最丰富的蛋白质，其分子量为66,437Da(基于氨基酸组成)。商品化制剂含有不同程度的翻译后修饰和遗传变型，其分子量组成主要在66,437至66,600Da的范围内。
在多个实施方式中，细胞培养基或组合物包含HSA。在具体的实施方式中，细胞培养基或组合物包含约1.0％、约1.25％、约1.5％、约1.75％、约2.0％、约2.25％、约2.5％、约2.75％、约3.0％、约3.25％、约3.5％、约3.75％、约4.0％、约4.25％、约4.5％、约4.75％、约5.0％、约5.25％、约5.5％、约5.75％、约6.0％、约6.25％、约6.5％、约6.75％、约7.0％、约7.25％或约7.5％的HSA。
在另一种实施方式中，细胞培养基或组合物包含约2.0％至约7.5％、约2.5％至约6％、或约4.0％至约6％，或约4％至约5％的HSA。
3.化学成分确定的细胞培养基
“化学成分确定的培养基”是指其中所有化学成分已知的适合于人或动物细胞体外或离体细胞培养的生长培养基。在具体的实施方式中，化学成分确定的培养基是完全不含动物来源组分的并且由于胎牛血清、牛血清白蛋白或人血清白蛋白来源于牛或人源并且含有白蛋白和脂肪的复杂混合物，因此是不含这些产品的。然而，在某些实施方式中，组合物可以包含化学成分确定的培养基和一种或多种上述类型的血清或其他试剂，例如，细胞因子、生长因子、前列腺素途径激动剂和糖皮质激素。
用于人造血细胞的培养和增殖和/或维持的成分确定的和人源化培养基通常包含盐、维生素、葡萄糖源、矿物质和氨基酸。在具体的实施方式中，成分确定的培养基可以补充有人血清或血清替代物。血清替代物可以是出于该目的出售的可商购产品或者可以是配制的蛋白质混合物，如血清白蛋白、维生素、盐、矿物质、转铁蛋白或转铁蛋白替代物和胰岛素或胰岛素替代物。这种血清替代物组分还可以添加硒。在一种实施方式中，培养基包括补充有人血清白蛋白、维生素、抗氧化剂、微量矿物质、特定脂肪和克隆的生长因子的成分确定的培养基。
在具体的实施方式中，成分确定的培养基还是药物可用的细胞培养基。这些组合物适合于向人受试者施用。一般地，支持本发明的造血细胞的维持、生长和/或健康的任何培养基适合于用作药物细胞培养基。在具体的实施方式中，药物可用的细胞培养基是无血清培养基或化学成分确定的培养基。
药物可用的细胞培养基的一个说明性实例包括无水氯化钙CaCl3(158.695mg/L)；硫酸铜CuSO45H2O(0.000654mg/l)；硝酸铁Fe(NO3)9H2O(0.0751mg/L)；硫酸铁FeSO47H2O(0.0209mg/L)；氯化钾KCl(306.969mg/L)；氯化镁MgCl2(14.418mg/L)；硫酸镁MgSO4(63.237mg/L)；氯化钠NaCl(5021.73mg/L)；碳酸氢钠NaHCO4(1100mg/L)；磷酸二氢钠NaH2PO4H2O(93.964mg/L)；磷酸氢二钠Na2HPO4(35.753mg/L)；硫酸锌ZnSO47H2O(0.217mg/L)；D-葡萄糖(右旋葡萄糖)(3836.3mg/L)；酚红(8.127mg/L)；HEPES(3099.505mg/L)；次黄嘌呤钠(1.203mg/L)；亚油酸(0.0211mg/L)；DL-68-硫辛酸(0.0528mg/L)；腐胺钠2HCl(0.0407mg/L)；腐胺8亚硒酸钠(2.5×10-6mg/L)；丙酮酸钠(40.1885mg/L)；丙氨酸(3.24mg/L)；精氨酸HCl(116.255mg/L)；天门冬酰胺(4.19mg/L)；门冬氨酸(3.347mg/L)；半胱氨酸H2O(9.445mg/L)；半胱氨酸2HCl(15.752mg/L)；谷氨酸(3.7谷氨酰胺(293.55mg/L)；甘氨酸(24.439mg/L)；组氨酸HClH2O(36.847mg/L)；异亮氨酸(79.921mg/L)；亮氨酸(82.227mg/L)；赖氨酸HCl(118.937mg/L)；蛋氨酸(23.679mg/L)；苯丙氨酸(50.861mg/L)；脯氨酸(12.564mg/L)；丝氨酸(34.214mg/L)；苏氨酸(74.408mg/L)；色氨酸(12.54mg/L)；酪氨酸2Na+2H2O(64.086mg/L)；缬氨酸(73.606mg/L)；生物素(0.00176mg/L)；D-泛酸钙(3.127mg/L)；氯化胆碱(6.52mg/L)；叶酸(3.334mg/L)；i-肌醇(9.904mg/L)；烟酰胺(3.079mg/L)；吡哆醇HCl(3.022mg/L)；核黄素(0.31mg/L)；硫胺素HCl(3.092mg/L)；胸苷(0.183mg/L)；和维生素B12(0.512mg/L)。
适合在具体实施方式中使用的化学成分确定的细胞培养基的说明性实例包括，但不限于，StemSpan-ACF、StemSpan-H3000、StemSpan-SFEM、StemlineII、StemPro34、StemXVivo、伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基(IMDM)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、RoswellParkMemorialInstitute培养基(RPMI)1640培养基、McCoy's5A培养基、α最低必需培养基(α-MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、Fischer培养基、medium199、F-12K营养混合物培养基(Kaighn改良，F-12K)和X-vivo20。
细胞因子和/或造血细胞生长因子的说明性实例包括，但不限于，flt3-配体(FLT3)、促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白介素-3(IL3)、白介素-6(IL6)和白介素-9(IL9)。
D.组合物
在多个实施方式中，考虑了包含血细胞产物或部分分离或纯化的造血细胞的组合物和用于血细胞产物操纵的改善的培养基。组合物的细胞具有提高的细胞活力并且可以耐受冷冻/解冻处理，以及通过一种或多种试剂的体外或离体调控或扩增。所述组合物还包含稳定性提高的凋亡细胞，借此降低细胞溶解、防止细胞碎片聚集和防止可以抑制后续细胞过程的胞内组分的释放。
在具体的实施方式中，所述组合物包含血细胞产物或者分离或纯化的造血细胞群。在一些实施方式中，所述组合物适合于冷冻、解冻、再悬浮、处理或纯化、使用一种或多种试剂的调控或扩增中的一个或多个。在某些实施方式中，所述组合物适合于解冻、再悬浮、处理或纯化、调控、扩增和向受试者施用。在其他实施方式中，所述组合物适合于解冻、再悬浮、处理或纯化、调控和扩增，并且随后用药物可用的细胞培养基清洗所述组合物以用于向受试者施用。
在具体的实施方式中，组合物包含血细胞产物或者HLA型造血细胞群，并且组合物可以与特定患者匹配或部分匹配以用于移植。
至少，在(例如)低分辨/分裂抗原水平，对六个HLA位点、HLA-A-B和-DR进行造血细胞群的HLA分型。
在多种实施方式中，所述血细胞产物或造血细胞群包含单倍体造血干细胞或祖细胞。在一些实施方式中，基于HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1，包含治疗组合物的细胞群是HLA分型的。在具体的实施方式中，基于HLA-DRB3/4/5、HLA-DQB1和DPB1，所述细胞群是HLA分型的。在一些实施方式中，包含治疗组合物的细胞群与特定人患者匹配。在一些实施方式中，在6个HLA匹配中，HLA单倍体细胞群与特定人受试者具有4个HLA匹配。HLA匹配可以基于等位基因或抗原以及它们的组合。在一些实施方式中，HLA单倍体细胞群与特定人受试者(如施用治疗组合物的受试者)部分不匹配。
1.血细胞产物
在具体的实施方式中，组合物可以包含血细胞产物或其部分。适合的血细胞产物可以得自血库或直接得自供体或患者。在具体的实施方式中，组合物包含一个或多个单位的血细胞产物。适合的血细胞产物来源包括(但不限于)骨髓、脐带、脐带血、胎盘血、胎盘、胎儿血、胎儿肝、胎儿脾、华通氏胶和动员的外周血。
在一种实施方式中，血细胞产物是脐带血。如本文所使用的，术语“脐血”、“全脐血”、“全脐带血”或“脐带血”一般是指如果不过早夹紧脐带，则将回到新生儿循环的得自新生婴儿的相对少量的血液(多至约180mL)。脐血富含HSPC，并且根据本领域中已知的技术可以收获并储存脐血以用于随后的使用(参见，例如，美国专利No.7147626和7131958，其作为这些方法的参考并入本文)。在一种实施方式中，全脐血不包含红细胞和/或血浆。
在具体的实施方式中，血细胞产物需要足够量的造血细胞以用于在治疗应用中使用。提高血细胞产物中造血细胞的量可以包括在受试者中动员造血干细胞和祖细胞的步骤。考虑在具体实施方式中使用的血细胞产物中的足够量的造血干细胞和祖细胞包括至少约1×103个HSPC、至少约1×104个HSPC、至少约1×105个HSPC、至少约1×106个HSPC、至少约1×107个HSPC、至少约1×108个HSPC、至少约1×109个HSPC、至少约1×1010个HSPC、至少约1×1011个HSPC、至少约1×1012个HSPC、至少约1×1013个HSPC、至少约1×1014个HSPC或至少约1×1015个HSPC。
“造血干细胞动员”是指在干细胞移植之前，出于去除白细胞的目的，从包含造血干细胞和祖细胞的骨髓或另一种组织中将干细胞释放至外周血循环。通过提高收获自供体的干细胞的数目，可以显著改善对治疗应用可用的干细胞数目。造血生长因子(例如，粒细胞集落刺激因子(G-CSF))或化疗剂通常用于刺激动员。存在商品化干细胞动员药物并且所述药物可以结合G-CSF使用以动员足够量的用于向受试者移植的造血干细胞和祖细胞。例如，可以向供体施用G-CSF和MozobilTM(GenzymeCorporation)以收获足够数目的用于移植的造血细胞。动员造血干细胞和祖细胞的其他方法对于本领域技术人员将是显而易见的。
2.造血细胞
在多个实施方式中，本文所考虑的组合物包括包含造血细胞的纯化或分离的细胞群。如本文所使用的，术语“分离的”是指从其原始环境中除去的材料。例如，本文所使用的，“分离的细胞群”、“分离的细胞源”或“分离的HSPC”等是指一种或多种细胞从其天然细胞环境中以及与组织或器官的其他组分的结合的体外或离体分离，即它不与体内物质明显结合。在具体的实施方式中，组合物包括造血干细胞或祖细胞群。
在具体的实施方式中，组合物包含细胞，所述细胞是自体同源/自体(“自”)或非自体同源(“非自”，例如，同种异体、同基因或异基因)细胞。如本文所使用的，“自体同源”是指来自相同受试者的细胞。如本文所使用的，“同种异体”是指与相比较的细胞在遗传上不同的相同种的细胞。如本文所使用的，“同基因”是指与相比较的细胞在遗传上相同的不同受试者的细胞。如本文所使用的，“异基因”是指与相比较的细胞不同种的细胞。在优选的实施方式中，本发明所述的细胞是同种异体的。
在多个实施方式中，干细胞的使用是优选的，这是因为当体内施用于特定生境时，它们具有分化为适当细胞类型的能力。术语“干细胞”是指具有以下能力的未分化细胞：(1)能够长期自更新，或者能够产生原始细胞的至少一种相同复制，(2)能够在单细胞水平分化为多种，并且在一些情况下，仅一种特化细胞类型和(3)能够使组织体内功能性再生。如本文所使用的，术语“祖细胞”是指具有自更新和分化为更多成熟细胞的能力的细胞。与多潜能干细胞和多能干细胞相比，祖细胞具有降低的效力。
如本文所使用的，术语“造血干细胞和祖细胞”或“HSPC”是指通过抗原标志物CD34(CD34+)的存在所鉴别的并因此表现出CD34+细胞特性的细胞，以及这些细胞的群体。在具体的实施方式中，术语“HSPC”是指通过抗原标志物CD34(CD34+)的存在和系(Lin)标志物的不存在所鉴别的并因此表现出CD34+/Lin(-)细胞特性的细胞，以及这些细胞的群体。已认识到包含CD34+和/或Lin(-)细胞的细胞群还包含造血祖细胞。在一种实施方式中，组合物包含分离的CD34+细胞群。
造血干细胞是导致产生所有生物血细胞类型的多能干细胞，其包括髓系(例如，单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱细胞、嗜曙红细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞)和淋巴系(例如，T细胞、B细胞、自然杀伤细胞)和本领域中已知的其他细胞(参见Fei,R.等人,美国专利No.5,635,387；McGlave等人,美国专利No.5,460,964；Simmons,P.等人,美国专利No.5,677,136；Tsukamoto等人,美国专利No.5,750,397；Schwartz等人,美国专利No.5,759,793；DiGuisto等人,美国专利No.5,681,599；Tsukamoto等人,美国专利No.5,716,827)。造血祖细胞(HSC)导致产生了能够在生物寿命内产生全部成熟血细胞库(repertoireofmaturebloodcells)的定向造血祖细胞(HPC)。
如本文所使用的，术语“粒性白细胞”是指其特征为在它们的细胞质中存在颗粒的白血球种类。由于核的不同形状(其通常分裂成三个部分)，粒性白细胞通常被称为多形核白细胞(PMN或PML)。尽管粒性白细胞最丰富的类型是嗜中性粒性白细胞，但是术语“粒性白细胞”包括嗜中性粒性白细胞、嗜曙红粒性白细胞和嗜碱粒性白细胞。
在具体的实施方式中，可以作为高度纯化的HSPC群体(均一群体)或者作为包含.01％至约100％的HSPC的组合物(非均一群体)提供HPSC。包含造血干细胞和祖细胞的细胞群包括骨髓细胞、脐带血细胞、胎盘血细胞、动员外周血细胞、造血干细胞或造血祖细胞。在具体的实施方式中，可以通过动员供体中的干细胞和祖细胞来提高造血细胞群中HSPC的数目，如以上所讨论的。
在一种实施方式中，组合物包含部分或单一的脐血中HSPC的量，或者为至少0.1×105个细胞/kg体重、至少0.5×105个细胞/kg体重、至少1×105个细胞/kg体重、至少5×105个细胞/kg体重、至少10×105个细胞/kg体重、至少0.5×106个细胞/kg体重、至少0.75×106个细胞/kg体重、至少1×106个细胞/kg体重、至少1.25×106个细胞/kg体重、至少1.5×106个细胞/kg体重、至少1.75×106个细胞/kg体重、至少2×106个细胞/kg体重、至少2.5×106个细胞/kg体重、至少3×106个细胞/kg体重、至少4×106个细胞/kg体重、至少5×106个细胞/kg体重、至少10×106个细胞/kg体重、至少15×106个细胞/kg体重、至少20×106个细胞/kg体重、至少25×106个细胞/kg体重或至少30×106个细胞/kg体重。
在具体的实施方式中，组合物包含约1×103个HSPC、至少约1×104个HSPC、至少约1×105个HSPC、至少约1×106个HSPC、至少约1×107个HSPC、至少约1×108个HSPC、至少约1×109个HSPC、至少约1×1010个HSPC、至少约1×1011个HSPC、至少约1×1012个HSPC、至少约1×1013个HSPC、至少约1×1014个HSPC或至少约1×1015个HSPC。在一种实施方式中，HSPC是CD34+。
在具体的实施方式中，组合物包含作为约95％至约100％HSPC的细胞群。在一些实施方式中，细胞群包含小于约0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％或30％的HSPC。在一些实施方式中，细胞群包含小于约0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％或30％的HSPC。在其他实施方式中，细胞群为约0.1％至约1％、约1％至约3％、约3％至约5％、约10％-约15％、约15％-20％、约20％-25％、约25％-30％、约30％-35％、约35％-40％、约40％-45％、约45％-50％、约60％-70％、约70％-80％、约80％-90％、约90％-95％或约95％至约100％的HSPC。
在具体的实施方式中，细胞群为约0.1％至约1％、约1％至约3％、约3％至约5％、约10％-约15％、约15％-20％、约20％-25％、约25％-30％、约30％-35％、约35％-40％、约40％-45％、约45％-50％、约60％-70％、约70％-80％、约80％-90％、约90％-95％或约95％至约100％的HSPC。
在多个实施方式中，所述细胞不是遗传修饰的细胞。在其他实施方式中，所述细胞是遗传修饰的，如通过引入多核苷酸，如(例如)包含蛋白质编码基因序列的反转录病毒或慢病毒载体。在一些实施方式中，遗传修饰所述细胞以纠正遗传缺陷，而在其他实施方式中，遗传修饰所述细胞以增加或减少野生型或突变型蛋白质的产生。用于提高细胞中蛋白质表达的多核苷酸可以包括指导细胞中适当表达的多核苷酸序列和编码所述多肽序列的多核苷酸。用于减少细胞中蛋白质表达的多核苷酸可以包括靶向编码野生型多肽序列的多核苷酸以用于降解的多核苷酸序列。
3.增加的造血细胞
在具体的实施方式中，组合物包含人造血干细胞和祖细胞，其中所述干细胞已与能够提高细胞治疗性质的一种或多种试剂离体接触。在一种实施方式中，人造血干细胞和祖细胞已与提高细胞中CXCR4基因表达的一种或多种试剂离体接触。在一个优选的实施方式中，与未接触的造血干细胞和祖细胞或者用媒介物对照处理的细胞相比，处理的人造血干细胞中CXCR4的基因表达提高了至少约2、3、4、5、10、15、20或30倍。“提高的造血干细胞和祖细胞”或“提高的HSPC”是指用一种或多种试剂离体处理的HSPC，与对照、媒介物或未处理的细胞相比，所述试剂在细胞中将CXCR4基因表达提高了至少约2、3、4、5、10、15、20或30倍。
如本文所使用的，“未接触”、“未处理”或“对照”细胞是指未用对照试剂之外的试剂处理，例如，培养、接触或孵育的细胞。与DMSO(对照试剂)接触或者与另一种媒介物(10％右旋糖酐、5％HSA和.9％盐水)接触的血细胞产物或者造血细胞是对照细胞。
鉴别了本发明的HSPC，并且其特征在于显示出高CXCR4表达水平的基因表达谱。还可以基于CXCR4基因表达的提高以及细胞表面CXCR4多肽表达的提高来表征HSPC。在某些实施方式中，与未接触细胞中CXCR4的表达相比，本发明的HSPC中CXCR4基因表达提高了至少2、3、4、5、10、15、20或30倍。在某些实施方式中，与未接触细胞中CXCR4的表达相比，本发明的HSPC中CXCR4基因表达提高了至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。
在具体的实施方式中，与未处理的HSPC相比，HSPC中CXCR4基因表达提高了约30至约80倍。在其他实施方式中，与未处理的HSPC相比，HSPC中的CXCR4基因表达提高了约40至约80倍、约50至约80倍、约60至约80倍或约50至约70倍。
可以在用一种或多种试剂处理细胞后确定处理的HSPC或其等份的CXCR4基因表达或基因表达特征。例如，可以用一种或多种试剂离体处理HSPC，清洗以除去试剂，并对一部分细胞分析基因表达而无需进一步孵育细胞。
在具体实施方式中使用的说明性基因组(例如，“标签基因”)包括，但不限于：YRPW基序相关多毛/增强子断裂1(HEY1)、UL16结合蛋白2(ULBP2)、透明质酸酯合酶1(HAS1)、GTP-结合蛋白GEM(GEM)、肾素(REN)、I型胶原蛋白α1(COL1A1)、环加氧酶2(COX-2)、血管生成素1(ANGPT1)、趋化因子(C-X-C基序)配体6(CXCL6)、凸素(prominin)1(PROM1)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、血管生成素2(ANGPT2)、κB激酶β抑制剂(IKBKB)、血小板/内皮细胞粘附分子1(PECAM1)、具有免疫球蛋白样和EGF样结构域1的酪氨酸激酶(TIE1)、双性调节素(Amphiregulin)(AREG)、半胱天冬氨酸酶3(CASP3)、jagged1(JAG1)、芳烃受体核转位蛋白(ARNT)、cAMP-应答元件调节子(CREM)、结缔组织生长因子(CTGF)、CD40配体(CD40L)、BCL2-相关X蛋白(BAX)、肝细胞生长因子(HGF)、超氧化物歧化酶2(SOD2)、血小板源生长因子B(PDGFB)、血小板反应蛋白1(THBS1)、双重特异性蛋白磷酸酶4(DUSP4)、富含半胱氨酸蛋白61(CYR61)、趋化因子(C-X-C基序)配体1(CXCL1)、内皮酪氨酸激酶(TEK)、CASP8和FADD样细胞凋亡调节子(CFLAR)、胰岛素生长因子2(IGF2)、趋化因子(C-X-C基序)受体4(CXCR4)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、前列腺素-内过氧化物合酶2(PTGS2)、RAS相关C3肉毒杆菌毒素底物2(RAC2)、血小板源生长因子受体(PDGFR)、核受体亚家族4，A组，成员2(NR4A2)、核受体亚家族4，A组，成员3(NR4A3)、端粒酶反转录酶(TERT)、转化生长因子β1(TGFB1)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、CD40抗原(CD40)、CD44抗原(CD44)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)、氮氧化物合酶3(NOS3)、激酶插入区域受体(KDR)、整合素β1(ITGB1)、联蛋白(钙粘素相关蛋白)β1(CTNNB1)、集落刺激因子3(CSF3)、白介素8(IL8)、纤维蛋白溶酶原活化因子、尿激酶受体(PLAUR)、B细胞CLL/淋巴瘤2(BCL2)、骨形态发生蛋白2(BMP2)、集落刺激因子1(CSF1)、V-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同系物1(AKT1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、细胞间粘附分子1(ICAM1)，趋化因子(C-X-C基序)配体3(CXCL3)、半胱天冬氨酸酶8(CASP8)、CD34抗原(CD34)、白介素1A(IL1A)、CD47抗原(CD47)、趋化因子(C-C基序)配体7(CCL7)、低氧诱导因子1A(HIF1A)、EDN1(内皮素1)、鞘氨醇-1-磷酸酯受体1(S1PR1)、趋化因子(C-C基序)受体1(CCR1)、SMAD家族成员4(SMAD4)、fms相关酪氨酸激酶1(FLT1)、CD151抗原(CD151)、胎盘生长因子(PGF)、B细胞中核因子κ轻链多肽基因增强子1(NFKB1)、SMAD家族成员2(SMAD2)、CXC趋化因子受体7(CXCR7)、转化生长因子β3(TGFB3)、趋化因子(C-X-C基序)配体5(CXCL5)、细胞周期蛋白D1(CCND1)、肝素-结合EGF样生长因子(HBEGF)、核受体亚家族3，组C，成员1(NR3C1)、肿瘤坏死因子(TNF)、整合素αL(ITGAL)、CXC趋化因子受体2(CXCR2)、信号转导和转录激活因子1(STAT1)、整合素α4(ITGA4)、白血病抑制因子(LIF)、RASp21蛋白激活子1(RASA1)、钙粘素5(CDH5)、ephrinB2(EFNB2)、G-蛋白信号调节子16(RGS16)、趋化因子(C-X-C基序)配体2(CXCL2)、整合素α5(ITGA5)、趋化因子(C-X-C基序)配体12(CXCL12)、金属蛋白酶的组织抑制剂1(TIMP1)、Fos相关抗原2(FOSL2)、整合素β2(ITGB2)和金属蛋白酶的组织抑制剂2(TIMP2)。
适合在具体实施方式中使用的另一说明性标签基因组包括，但不限于：YRPW基序相关多毛/增强子断裂1(HEY1)、GTP-结合蛋白GEM(GEM)、双重特异性蛋白磷酸酶4(DUSP4)、双性调节素(Amphiregulin)(AREG)、核受体相关1蛋白(NR4A2)、肾素(REN)、cAMP-应答元件调节子(CREM)、I型胶原蛋白α1(COL1A1)、Fos相关抗原2(FOSL2)和UL16结合蛋白2(ULBP2)。
适合在具体实施方式中使用的另一说明性标签基因组包括，但不限于：透明质酸酯合酶1(HAS1)、GTP-结合蛋白GEM(GEM)、双重特异性蛋白磷酸酶4(DUSP4)、双性调节素(Amphiregulin)(AREG)、核受体相关1蛋白(NR4A2)、肾素(REN)、cAMP-应答元件调节子(CREM)、I型胶原蛋白α1(COL1A1)、Fos相关抗原2(FOSL2)和CXC趋化因子受体4(CXCR4)。
其他说明性标签基因组包括，但不限于：CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2。
与一种或多种试剂接触并且具有提高的治疗性质的人HSPC还包括提高的胞内cAMP信号水平，例如，CREB磷酸化或如通过生物化学测定所确定的；显示涉及PGE2R2/R4细胞信号通路的基因上调的基因表达标签，例如，CREM，和提高干细胞和祖细胞归巢和移植的基因，例如，CXCR4，如通过基因表达测定(例如，微阵列)确定的；干细胞和祖细胞活力无可测量的降低，如通过细胞活力测定确定的，例如，7-氨基放线菌素D(7-AAD)染色；和/或提高的干细胞自更新能力，例如，如通过体外集落形成单位(CFU-C)测定所确定的。
E.试剂
在多个实施方式中，组合物包含已与提高细胞一种或多种治疗性质的一种或多种试剂接触或用所述试剂处理的血细胞产物或者造血干细胞或祖细胞。不希望受任何具体理论束缚，考虑在本文其他处公开的用于制备移植用造血细胞的组合物和方法还包括造血细胞的短期处理。在包含多糖和任选地HSA的培养基中造血细胞的冷冻、解冻和重建或再悬浮使细胞活力稳定，从而可以用一种或多种试剂处理它们以在移植前提高它们的治疗性质。
在一种实施方式中，在本文所考虑的培养基中解冻和再悬浮冷冻保存的细胞群，然后通过将细胞与试剂接触或培养来调控造血细胞群。可以在本发明的含有多糖的细胞培养基中解冻、再悬浮或调控细胞。如本文所使用的，“试剂”是指能够提高一种或多种基因的基因表达的化合物或分子，所述基因显示出试剂处理的造血细胞的治疗性质的提高。具体试剂包括(例如)能够刺激前列腺素途径的化合物，例如，cAMP类似物或增强剂、Gα-s活化剂和列腺素途径激动剂。在具体的实施方式中，可以在细胞与刺激前列腺素途径的一种或多种试剂接触之前和/或之后，或除此之外，或者代替造血细胞与刺激前列腺素途径的一种或多种试剂的接触，将造血细胞用一种或多种细胞因子、生长因子和/或糖皮质激素处理、培养或接触。
可以在足以提高细胞治疗性质的条件下处理造血细胞。如本文所使用的，术语“足够的条件”或“在足够的条件下”是指用一种或多种试剂处理造血细胞以提高显示出细胞治疗性质提高的一种或多种基因的基因表达的条件。条件包括，但不限于，细胞来源、用于处理细胞的试剂和试剂浓度、细胞暴露于试剂的时间和处理温度。通过与本文所考虑的一种或多种试剂接触提高的治疗性质包括，但不限于：移植、重建、归巢、存活和增殖。
在具体的实施方式中，组合物包含一种或多种试剂，其分别处于约1μM至约100μM的最终浓度。在某些实施方式中，组合物包含一种或多种试剂，其分别处于以下最终浓度：约1×10-14M至约1×10-3M、约1×10-13M至约1×10-4M、约1×10-12M至约1×10-5M、约1×10-11M至约1×10-4M、约1×10-11M至约1×10-5M、约1×10-10M至约1×10-4M、约1×10-10M至约1×10-5M、约1×10-9M至约1×10-4M、约1×10-9M至约1×10-5M、约1×10-8M至约1×10-4M、约1×10-7M至约1×10-4M、约1×10-6M至约1×10-4M或最终浓度的任何中间范围。
在另一种具体的实施方式中，组合物包含用一种或多种试剂处理的血细胞产物或造血细胞，所述试剂分别处于以下最终浓度：约1×10-14M、约1×10-13M、约1×10-12M、约1×10-10M、约1×10-9M、约1×10-8M、约1×10-7M至约1×10-6M、约1×10-5M、约1×10-4M、约1×10-3M或任何中间最终浓度。在包含一种或多种试剂的处理中，所述试剂可以处于彼此不同的浓度或者处于相同浓度。
在具体的实施方式中，组合物包含在相同容器内间歇、偶然或顺序与一种或多种试剂接触的造血细胞(例如，将细胞群与一种药物接触一段时间，更换培养基和/或清洗细胞群，然后以相同或不同的药物试剂组合重复该循环相同的预定时间段或不同的预定时间段)。
1.前列腺素途径激动剂
如本文所使用的，术语“前列腺素途径激动剂”是指刺激前列腺素细胞信号通路的试剂，包括在细胞中刺激PGE2R2和/或PGE2R4细胞信号通路和提高CXCR4基因表达的试剂。适合在制备本发明的细胞中使用的前列腺素途径激动剂的说明性实例包括，但不限于，PGE2、dmPGE2、15(S)-15-甲基PGE2、20-乙基PGE2、8-异-16-环己基-四降PGE2和PGE2类似物。在某些实施方式中，PGE2R2和PGE2R4激动剂及其类似物是特别关心的，并且在一些实施方式中，所述试剂优选地结合并激活PGE2EP2或PGE2EP4受体。
如本文所使用的，术语“前列腺素E2”或“PGE2”无限制地包括任何天然存在的或化学合成的PGE2分子及其“类似物”。如本文所使用的，术语“类似物”涉及在结构和功能上与另一种化学物质类似的化学分子，例如，PGE2，通常其在结构上存在单个元素或基团的差异，但是如果保留了与母体化合物相同的功能，则可以相差不止一个基团(例如，2、3或4个基团)的修饰。这些修饰对本领域技术人员来说是常规的，并且包括(例如)额外的或取代的化学部分，如酸的酯或酰胺，保护基，如对于醇或硫醇的苯甲基和对于胺的叔丁氧羰基。还包括对烷基侧链的修饰，如烷基取代(例如，甲基、二甲基、乙基等)，对侧链饱和或不饱和水平的修饰以及修饰基团(如取代的苯基和苯氧基)的添加。类似物还可以包括缀合物，如生物素或抗生物素蛋白部分，酶如辣根过氧化物酶等，并且包括放射性标记部分、生物发光部分、化学发光部分或荧光部分。另外，可以将部分加入到本文所述的试剂中以改变它们的药物动力学性质，从而除了所期望的性质外，提高体内或离体半衰期或者提高它们的细胞穿透性。还包括前体药物，已知所述前体药物能够提高药物的多种所期望的质量(例如，溶解度、生物利用率、生产等)(有关示例性EP激动剂前体药物，参见，例如，WO/2006/047476，其作为对这些激动剂公开的参考并入本文)。
PGE2“类似物”的说明性实例无限制地包括16,16-二甲基PGE2(“dmPGE2”)、16,16-二甲基PGE2p-(p-乙酰胺基苯甲酰胺基)苯酯、11-脱氧-16,16-二甲基PGE2、9-脱氧-9-亚甲基-16,16-二甲基PGE2、9-脱氧-9-亚甲基PGE2、9-酮氟前列醇、5-反式PGE2、17-苯基-ω-三去甲PGE2、PGE2丝氨醇酰胺、PGE2甲酯、16-苯基四降PGE2、15(S)-15-甲基PGE2、15(R)-15-甲基PGE2、8-异-15-酮PGE2、8-异PGE2异丙酯、8-异-16-环己基-四降PGE2、20-羟基PGE2、20-乙基PGE2、11-脱氧PGE1、诺氯前列素、硫前列酮、布他前列素、15-酮PGE2和19(R)羟基PGE2。还包括具有与PGE2类似的结构并且在9-位被卤素取代的PG类似物或衍生物(参见，例如，WO2001/12596，其以其全部内容作为参考并入本文)和2-脱羧-2-磷酸亚基前列腺素衍生物，如美国专利公开No.2006/0247214中所述的那些，其以其全部内容作为参考并入本文)。
考虑PGE2R2(EP2)和PGE2R4(EP4)细胞信号通路的刺激/激活是HSPC中提高移植、维持细胞活力和提高细胞归巢和增殖的生理学反应的基础。因此，在一种实施方式中，考虑了结合至并且刺激PGE2R2和PGE2R4受体的“非PGE2基配基”(即PGE2R2/PGE2R4激动剂)在本发明所述的方法中的使用。
非PGE2基EP2受体激动剂的说明性实例包括CAY10399、ONO_8815Ly、ONO-AE1-259、CP-533,536和在WO2007/071456中公开的咔唑和芴。
非PGE2基EP4激动剂的说明性实例包括ONO-4819、APS-999Na、AH23848、ONO-AE1-329以及在WO/2000/038663；美国专利No.6747037；和美国专利No.6610719中公开的其他非PGE2基EP4激动剂)。
对PGE2EP4受体具有选择性的试剂优选地结合至并且激活PGE2EP4受体。这些试剂对EP4受体的亲合力高于对任何其他三种EP受体(即EP1、EP2和EP3)的亲合力。选择性结合PGEEP4受体的试剂包括，但不限于，选自下列的试剂：5-[(lE,3R)-4,4-二氟-3-羟基-4-苯基-1-丁烯-1-基]-1-[6-(2H-四唑-5R-基)己基]-2-吡咯烷酮；2-[3-[(lR,2S,3R)-3-羟基-2-[(E,3S)-3-羟基-5-[2-(甲氧基甲基)苯基]戊-1-烯基]-5-氧环戊基磺酰基丙基磺酰基]乙酸；甲基4-[2-[(lR,2R,3R)-3-羟基-2-[(E,3S)-3-羟基-4-[3-(甲氧基甲基)苯基]丁-1-烯基]-5-氧环戊基]乙基磺酰基]丁酸酯；16-(3-甲氧基甲基)苯基-ro-四降-5-thiaPGE；5-{3-[(2s)-2-{(3R)-3-羟基-4-[3-(三氟甲基)苯基]丁基}-5-氧吡咯烷-1-基]丙基]噻吩-2-羧酸酯；[4'-[3-丁基-5-氧-1-(2-三氟甲基-苯基)-l,5-二氢-[1,2,4]三三唑-4-基甲基]-二苯基-2-磺酸(3-甲基-噻吩-2-羰基)-酰胺]；和((Z)-7-{(lR,4S,5R)-5-[(E)-5-(3-氯-苯并[b]噻吩-2-基)-3-羟基-戊-1-烯基]-4-羟基-3,3-二甲基-2-氧-环戊基}-庚-5-烯酸)，以及任何这些试剂的药物可用的盐。
在具体的实施方式中，前列腺素途径激动剂为PGE2、dmPGE2、15(S)-15-甲基PGE2、20-乙基PGE2或8-异-16-环己基-四降PGE2。
2.cAMP增强子
“环AMP(cAMP)增强子”是指这样的分子：与无试剂或对照分子/组合物相比，在细胞中产生或导致更大量的cAMP，或在细胞中产生或导致更大量的cAMP活性，或产生或导致cAMP相关信号转导通路的任何其他相关组分，或产生或导致cAMP信号通路的可测量的下游生理反应或作用。
cAMP增强子的说明性实例包括，但不限于，佛波酯、毛喉素、sclareline、8-溴-cAMP、霍乱毒素(CTx)、氨茶碱、2,4-二硝基苯酚(DNP)、去甲肾上腺素、肾上腺素、异丙肾上腺素、异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)、咖啡因、茶碱(二甲基黄嘌呤)、多巴胺、咯利普兰、伊洛前列素、前列腺素E1、前列腺素E2、垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)和肠血管活性肽(VIP)，以及本领域中已知的其他cAMP增强子。cAMP增强子的其他实例包括cAMP和cAMP的类似物，如sp-5,6-DCl-BIMPS(BIMPS)和二丁酰cAMP(dbcAMP)等。
3.Gα-s活化剂
“Gα-s活化剂或活性剂”或“G-蛋白α-s活化剂或活性剂”包括能够激活刺激性G-蛋白(“Gα-s”)或Gα-s变体的α亚单位的任何分子。
Gα-s活化剂的说明性实例包括PGE2和激动剂及其衍生物，和霍乱毒素。
4.糖皮质激素
适用于在本发明所述的方法中使用的糖皮质激素和糖皮质激素受体的说明性实例包括，但不限于，甲羟松、阿氯米松、二丙酸阿氯米松、安西奈德、倍氯米松、二丙酸氯地米松、倍他米松、苯甲酸倍他米松、戊酸倍他米松、布地奈德、环索奈德、氯倍他索、丁酸氯倍他索、丙酸氯氟美松、氯倍他松、氯可托龙、氯泼尼醇、皮质醇、可的松、可的伐唑、地夫可特、地奈德、去羟米松、去氧皮质酮、去氧米松(desoxymethasone)、地塞米松、二氟拉松、双乙酸二氟拉松、二氟可龙、戊酸二氟可龙、二氟可龙(difluorocortolone)、二氟泼尼酯、氟氯缩松、氟氯奈德、氟氢缩松、氟米松、氟米松、新戊酸氟米松、氟尼缩松、氟尼缩松半水化合物、肤轻松、氟轻松、醋酸氟轻松、氟可丁、丁基氟可丁、氟可龙、氟可的松、氟米龙、氟培龙、氟泼尼定、乙酸氟泼尼定、氟泼尼龙、氟替卡松、氟替卡松丙酸酯、福莫可他、哈西奈德、卤米松、氢化可的松、醋酸氢化可的松、醋丙氢可的松、丙丁酸氢化可的松(hydrocortisonebuteprate)、丁酸氢化可的松、氯替泼诺、甲泼尼松、6a-甲泼尼龙、甲泼尼龙、乙酸甲泼尼龙、醋丙甲泼尼龙、莫米松、莫米松糠酸酯、莫米松糠酸酯一水合物、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、泼尼松、泼尼立定、利美索龙、替可的松、曲安西龙、曲安奈德和乌倍他索以及它们的组合物。
在具体的实施方式中，糖皮质激素包括甲羟松、氢化可的松、曲安西龙、阿氯米松或地塞米松。在更具体的实施方式中，糖皮质激素是甲羟松。
F.造血细胞的制备方法
本文所考虑的方法提供了用于移植的血细胞产物和/或造血细胞的改善的制备。本发明的培养基还可以在体外和体内研究用途中用于制备细胞。在本发明的一些方面，通过将新鲜或冷冻细胞(例如，造血细胞)群体与本发明的培养基接触制备了用于本文所公开的用途的细胞。所述接触包括，但不限于，细胞处理活动，如清洗细胞、解冻冷冻保存的细胞、用一种或多种调控试剂(例如，前列腺素途径激动剂)离体调控细胞、维持或扩增培养中的细胞、分离细胞或诱导细胞分化。
在具体的实施方式中，方法包括血细胞产物或造血细胞的冷冻保存和解冻中的任一步或两步，和将解冻的细胞向本文所考虑的培养基中的转移。在另一种实施方式中，在本发明的培养基中解冻冷冻保存的造血干细胞。在另一种实施方式中，在细胞冷冻保存之前，将造血细胞与本发明的培养基接触。可以在冷冻保存前或者在先前冷冻保存或未冷冻保存(新鲜)的血细胞产物解冻后，分离、调控和/或扩增造血细胞。不希望受任何具体理论的束缚，考虑在新鲜或冷冻的血细胞产物的再悬浮、处理、分离、调控、清洗和/或扩增中使用所述培养基。在一种实施方式中，所述培养基改善了细胞活力、减少了细胞溶解并且提高了新鲜血细胞产物的生物活性和治疗性质。因此，还可以在本文所考虑的培养基中分离、调控或扩增冷冻保存或解冻的细胞或者新鲜细胞。
在一种实施方式中，提供了使用于移植的造血细胞群稳定的方法。在具体的实施方式中，所述方法包括解冻冷冻保存的血细胞产物或造血细胞群并将它们转移至本文所考虑的培养基中。在另一种实施方式中，省略造血细胞群的转移，并且直接在本发明的培养基中解冻细胞。与已转移至对照溶液(例如，10％右旋糖酐、5％HSA和.9％NaCl，或单独的成分确定的培养基)中的解冻的对照细胞群相比，稳定的细胞群具有降低的细胞溶解和提高的CD34+细胞活力。
在具体的实施方式中，提供了降低用于移植的细胞群中造血细胞溶解的方法。在具体的实施方式中，所述方法包括解冻冷冻保存的血细胞产物或造血细胞群并将它们转移至本文所考虑的培养基中。在一些实施方式中，这些方法省略了血细胞产物或造血细胞群向本发明的培养基的转移，并且作为替代包括在本发明的培养基中直接解冻保存的血细胞产物或造血细胞。在这些实施方式中，与已转移至对照溶液的解冻的对照细胞群相比，细胞溶解降低了约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约2倍、约3倍或约5倍。
在一种实施方式中，提供了提高用于移植的细胞群中造血细胞活力的方法。在具体的实施方式中，所述方法包括解冻冷冻保存的血细胞产物或造血细胞群并将其转移至本文所考虑的培养基中。作为另外一种选择，可以直接在本发明的培养基中解冻冷冻保存的血细胞产物或造血细胞群。在这些实施方式中，与已转移至对照溶液的解冻的对照细胞群相比，CD34+细胞活力提高了约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约2倍、约3倍或约5倍。
在某一实施方式中，提供了提高从细胞样品中对总有核细胞(TNC)的回收的方法。如本文所使用的，对“提高总有核细胞计数”或“提高TNC回收”的提及将表示相对于使用对照培养基的有核细胞的回收，使用本发明所述的培养基回收的有核细胞的数目的任何可测量的增加。例如，与使用对照培养基从样品中回收的TNC与无核细胞的比值相比，当本发明的培养基允许从样品中回收较高的TNC与无核细胞的比值时，观察到TNC提高。
在具体的实施方式中，所述方法包括解冻冷冻保存的血细胞产物或造血细胞群并将其转移至本文所考虑的培养基中。作为另外一种选择，该方法可以省略冷冻保存的血细胞产物或造血细胞群向本发明的培养基的转移，并且作为替代在本发明的培养基中直接解冻冷冻保存的血细胞产物或造血细胞群。在这些实施方式中，与已转移至对照溶液的解冻的对照细胞群相比，TNC提高了约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约2倍、约3倍或约5倍。
1.冷冻保存
在一种实施方式中，可以划分血细胞产物或造血细胞群并在一个或多个袋(或单元)中冷冻。在另一种实施方式中，可以将两种或更多种细胞群混合、划分成单独的等份，并冷冻每个等份。如本文所使用的，术语“冷冻”和“冷冻保存”是可互换使用的。在具体的实施方式中，冷冻保存包括以活细胞形式冷冻细胞的已知方法。冷冻保存导致通过细胞膜上的渗透效应、细胞脱水、溶质浓缩和冰晶形成的细胞损伤。由于在细胞外形成冰，因此从溶液中移除并从细胞中提取有效水，从而导致渗透脱水和溶质浓度提高，这最终可以破坏细胞。有关讨论，参见Mazur,P.,1977,Cryobiology14:251-272。
可以通过以下方法降低这些损伤作用：使用冷冻保护剂，如二甲基亚砜(DMSO)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、乙二醇、i-赤藓醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨糖醇、i-肌醇、D-乳糖、氯化胆碱、氨基酸、甲醇、乙酰胺、单乙酸甘油酯和无机盐，(b)控制冷冻速度，和(c)在足够低以最大程度降低降解反应的温度存储。
在优选的实施方式中，使用DMSO，它是低浓度下对细胞无毒的液体。作为小分子，DMSO自由渗透细胞并通过与水结合来改变其耐冻力和防止结冰损害从而保护胞内细胞器。血浆(例如，浓度20-25％)或血浆代用品(Plasmalyte)的加入可以提高DMSO的保护作用。加入DMSO后，细胞应保持在0℃直至冷冻，这是因为约1％的DMSO浓度在4℃以上的温度是有毒的。
可以使用控制的缓慢冷却速率来降低冷冻引起的细胞损害。不同的冷冻保护剂具有不同的最佳冷却速率。通过利用(例如)可编程冷冻装置或甲醇浴程序进行冷却过程。
在彻底冷冻后，可以将血细胞产物或造血细胞快速转移到长期深冷储藏容器。在一种实施方式中，样品可以深冷储存在液氮(-196℃)或其蒸汽(-165℃)中。通过高效液氮冰箱的可用性极大地辅助了这种存储，高效液氮冰箱类似于具有极低真空度和内部超高隔热的大Thermos容器，从而使漏热损失和氮气损失保持在绝对极低值。适合的托架系统是可商购的并且可以用于编目、储存和检索单个样品。
2.解冻
在多个实施方式中，本文所考虑的组合物和方法在先前冷冻的血细胞产物和造血细胞的解冻中提供了诸多优势。根据本发明的多个方面，可以在血细胞产物和造血细胞解冻之前、期间或之后，将先前冷冻的血细胞产物和造血细胞与本发明的培养基接触。不希望受任何具体理论束缚，考虑在本发明的培养基中解冻冷冻的血细胞产物和造血细胞或者将解冻细胞转移至本发明的培养基中会提高总有核细胞(TNC)计数和造血细胞活力并且使得能够后续处理、调控和/或扩增所述细胞。还考虑在本发明的培养基中解冻血细胞产物或者将解冻的细胞转移至本发明的培养基中会稳定凋亡细胞的膜，借此降低细胞溶解、防止细胞碎片聚集和防止可以抑制细胞过程的胞内成分的释放。因此，在本发明的培养基中解冻血细胞产物或将解冻细胞转移至本发明的培养基中提供了用于移植疗法的高质量造血细胞群。
在一种实施方式中，在本文所考虑的培养基中将包含DMSO或其他冷冻保护剂的冷冻保存的细胞群解冻并稀释约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍或更多倍，并在制备用于移植的细胞的后续步骤中使用。然后，可以在本文所考虑的培养基中将稀释的细胞组合物清洗并再悬浮，或者在制备用于移植的细胞的后续步骤中使用。在具体的实施方式中，然后可以进一步处理、调控或扩增解冻的细胞。在某一实施方式中，可以将解冻的细胞直接输注到对其有需要的人受试者中。
在一种实施方式中，提供了制备用于移植的冷冻保存的血细胞产物的方法。在具体的实施方式中，所述方法包括在本发明的培养基中解冻冷冻保存的血细胞产物或造血细胞群，例如，造血干细胞和祖细胞。在其他实施方式中，将解冻的细胞转移至本文所考虑的培养基中，并且立即或在处理、调控或扩增步骤中的一个或多个之后，任选地准备用于向受试者输注。
在具体的实施方式中，在约20℃至约37℃，约25℃至约37℃，约30℃约37℃或约35℃至约37℃的温度下解冻血细胞产物或造血细胞。在某一实施方式中，在约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃或约37℃的温度下解冻血细胞产物或造血细胞。
3.处理造血细胞
在多种实施方式中，本文所考虑的方法提供了用于移植的血细胞产物和/或造血细胞的改善的制备，其包括处理血细胞产物或细胞的步骤。如本文所使用的，术语“处理”是指清洗、纯化或另外调控血细胞产物的步骤。
可以在其他分离、冷冻、解冻、再悬浮、调控和扩增步骤之间清洗血细胞产物任意次数。例如，可以在血细胞产物的每一个调控或处理步骤之间清洗血细胞产物1、2、3、4、5次或更多次。用于清洗血细胞产物的说明性清洗溶液包括生理盐水、林格氏溶液、低分子量右旋糖酐和.9％NaCl中的HSA。在具体的实施方式中，还可以用化学成分确定的培养基清洗血细胞产物一次或多次。还考虑可以在本文所考虑的本发明的培养基中清洗血细胞产物。
在其他实施方式中，可以处理血细胞产物从而除去部分产物以改善下游调控。例如，可以处理全脐血、胎盘血或动员的外周血以除去红细胞和血浆。在具体的实施方式中，除去红细胞以最大程度降低供体和受体之间的血型不相容性反应。
在一种实施方式中，处理血细胞产物或造血细胞，从而使所述细胞群为约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％的造血细胞或CD34+细胞。在一些实施方式中，细胞群为小于约0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％或30％的造血细胞或CD34+细胞。
在具体的实施方式中，处理的细胞群包含造血干细胞或祖细胞或者CD34+细胞群，并且其基本不含间质干细胞和/或内皮祖细胞。在某些实施方式中，所述细胞群包含造血干细胞或祖细胞或者CD34+细胞，和小于约30％、25％、20％、15％、10％或5％的间质干细胞和小于约30％、25％、20％、15％、10％或5％的内皮祖细胞。
作为另外一种选择，可以使用本领域中已知的方法从细胞群中除去间质干细胞和/或内皮祖细胞，例如，使用免疫磁珠选择技术、荧光激活细胞分选术或者其中的组合，可以从本文所公开的和适合在本发明中使用的多个细胞来源纯化CD34+细胞。
4.调控造血细胞
在多个实施方式中，本文所考虑的培养基的使用提供了比调控血细胞产物的现有方法特别的优势。除提高细胞活力之外，所述培养基允许操纵细胞以保留或提高生物活性和治疗性质。在本文所考虑的培养基中培养的产物(如全脐血)包括基因表达的变化，其包括代表治疗性基因表达特征的基因表达的提高，所述基因表达在不存在本文所考虑的培养基的情况下处理的相同产物中通常较低或不存在。例如，如在本文其他地方所述的，用一种或多种试剂(例如，前列腺素途径激动剂)处理的全脐血显示出标签基因提高的基因表达，所述标签基因显示与对照溶液中操纵的全脐血相比，细胞具有治疗性质，如在本文其他地方所述的。因此，在用如本文所公开的一种或多种试剂处理细胞和血液制品之前、期间和/或之后，细胞(例如，造血细胞)和血液制品可以与本发明的培养基接触。
在一种实施方式中，组合物包含在与未接触细胞相比，足以在接触的细胞中将CXCR4基因表达提高至少约2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70或80倍的条件下用能够提高CXCR4基因表达的一种或多种试剂离体处理的血细胞产物或造血细胞。在具体的实施方式中，在解冻冷冻的血细胞产物或造血细胞之后，将造血细胞与一种或多种试剂接触。在另一种实施方式中，在本文所考虑的培养基中将造血细胞冷冻保存；解冻、再悬浮和/或纯化，并在本文所考虑的培养基中通过将所述细胞与一种或多种试剂接触来调控和/或扩增所述造血细胞。
在具体的实施方式中，以有效量的一种或多种试剂处理HSPC足够的时间(即在足够的条件下)，从而与未接触细胞相比，在接触的细胞中将CXCR4基因表达提高至少约2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70或80倍。
在某些实施方式中，足够的温度条件包括在生理学相关温度，用一种或多种试剂孵育血细胞产物或造血细胞，如约22℃至约39℃的温度范围(约室温至约体温)，其包括(但不限于)约22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃和39℃。在具体的实施方式中，所述足够的温度条件在约35℃至39℃之间。在一种实施方式中，所述足够的温度条件为约37℃。
在具体的实施方式中，试剂足够的浓度为以下最终浓度：约10nM至约100μM、约100nM、约500nM、约1μM、约10μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM、约60μM、约70μM、约80μM、约90μM、约100μM、约110μM、或约120μM或试剂的任何其他中间浓度(例如，0.1μM、1μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM)。在具体的实施方式中，每种试剂足够的浓度为最终浓度约10μM至约25μM。在一种实施方式中，试剂足够的浓度为最终浓度约10μM。
在其他实施方式中，用一种或多种试剂处理血细胞产物或造血细胞群的足够的时间段为以下孵育期：约60分钟至约24小时、约60分钟至约12小时、约60分钟至约6小时、约2小时至约6小时、约2小时至约4小时，并且包括但不限于，处理约60分钟、约70分钟、约80分钟、约90分钟、约100分钟、约110分钟、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时或约4小时或者任何其他中间的持续时间。在具体的实施方式中，足够的孵育期为约2小时至约4小时。在一种实施方式中，处理HSPC的足够的孵育期为约4小时。
在多个实施方式中，与未接触细胞相比，在接触的细胞中足以将CXCR4基因表达提高至少约2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70或80倍的条件包括在约22℃至约39℃的温度范围；以最终浓度约10μM至约25μM的前列腺素途径激动剂和最终浓度约10μM至约25μM的糖皮质激素离体处理HSPC；并且用所述试剂孵育约1小时至约4小时、约2小时至约3小时、约2小时至约4小时或约3小时至约4小时。
在具体的实施方式中，与未接触细胞相比，在接触的细胞中足以将CXCR4基因表达提高至少约2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70或80倍的条件包括在约22℃至约39℃的温度范围；以最终浓度约10μM至约25μM的PGE2或dmPGE2和最终浓度约10μM至约25μM的糖皮质激素离体处理HSPC；并且用所述试剂孵育约1小时至约4小时、约2小时至约3小时、约2小时至约4小时或约3小时至约4小时。
在多个实施方式中，与未接触细胞相比，在接触的细胞中足以将CXCR4基因表达提高至少约2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70或80倍的条件包括在约37℃的温度范围，以最终浓度约10μM的16,16-dmPGE2离体处理HSPC约2小时的持续时间。
在具体的实施方式中，本文所考虑的方法包括调控血细胞产物或造血细胞以提高基因表达特征或组中两种或更多种基因的基因表达。
适合的基因表达组的一个说明性实例包括HEY1、COX2、ULBP2、HAS1、GEM1、REN、COL1A1、ANGPT1、CXCL6、PROM1、BMP4、ANGPT2、IKBKB、PECAM1、TIE1、AREG、CASP3、JAG1、ARNT、CREM、CTGF、CD40L、BAX、HGF、SOD2、PDGFB、THBS1、DUSP4、CYR61、CXCL1、TEK、CFLAR、IGF2、CXCR4、MMP2、FGF2、PTGS2、RAC2、PDGFR、NR4A2、NR4A3、TERT、TGFB1、MMP9、CD40、CD44、HMGB1、NOS3、KDR、ITGB1、CTNNB1、CSF3、IL8、PLAUR、BCL2、BMP2、CSF1、AKT1、VEGFA、ICAM1、CXCL3、CASP8、CD34、IL1A、CD47、CCL7、HIF1A、EDN1、S1PR1、CCR1、SMAD4、FLT1、CD151、PGF、NFKB1、SMAD2、CXCR7、TGFB3、CXCL5、CCND1、HBEGF、NR3C1、TNF、ITGAL、CXCR2、STAT1、ITGA4、LIF、RASA1、CDH5、EFNB2、RGS16、CXCL2、ITGA5、CXCL12、TIMP1、FOSL2、ITGB2和TIMP2.
在另一种实施方式中，调控血细胞产物或造血细胞群以提高多种标签基因的基因表达，所述标签基因选自：CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2。与对照或未处理的细胞中的表达水平相比，调控细胞可以具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个标签基因的提高的表达。
在具体的实施方式中，调控血细胞产物或造血细胞群以提高至少2个基因、至少5个基因、至少10个基因、至少25个基因、至少50个基因或至少100个或更多个基因或任何中间数目的标签基因的基因表达。在优选的实施方式中，调控血细胞产物或造血细胞群以提高约2至约25个基因，约2至约10个基因或约5至约10个基因或任何中间基因范围的基因表达。
在某些实施方式中，当与对照细胞群中基因的表达相比，至少2、3、4或5个标签基因的表达提高约80倍、约70倍、约60倍、约50倍、约40倍、约30倍、约20倍、约10倍、约5倍、约3倍或约2倍时，认为血细胞产物或造血细胞群被充分调控。在其他实施方式中，当与对照群体细胞中基因的表达相比，至少10、20、30、40、50、60、70、80或90个标签基因或任何中间数目的基因的表达提高约80倍、约70倍、约60倍、约50倍、约40倍、约30倍、约20倍、约10倍、约5倍、约3倍或约2倍时，血细胞产物或造血细胞群被充分调控。
在多个实施方式中，调控的造血细胞包含提高的治疗性质，其包括提高的移植、提高的移植潜能、提高的造血重建、提高的造血重建潜能、提高的归巢、提高的归巢潜能、提高的增殖和提高的增殖潜能。在具体的实施方式中，与和对照或媒介物组合物(10％右旋糖酐、5％HSA、.9％NaCl或者单独的成分确定的培养基)接触的血细胞产物或造血细胞相比，这些提高的治疗性质是提高的。
5.扩增造血细胞
在一种实施方式中，组合物包含血细胞产物或含有造血细胞的细胞群，所述造血细胞被一种或多种试剂离体处理以扩增造血干细胞和祖细胞。在具体的实施方式中，在离体处理期间，如在移植程序之前、期间和/或之后，将细胞与促进造血干细胞和祖细胞的生长和扩增的一种或多种试剂接触(参见，例如，WO2008/073748，该专利以其全部内容作为参考并入本文)。同样地，还根据本文所提供的方法，在造血细胞移植之前，在存在前列腺素途径激动剂或其类似物的情况下，HSPC的离体扩增可以改善移植和移植后造血和免疫功能的重建(参见，例如，Lord等人，CellCycle6:3054-7,2007，该文献以其全部内容作为参考并入本文)。
因此，在具体的实施方式中，本文所考虑的制备用于移植的细胞的方法包括刺激造血干细胞(HSC)的生长或扩增以及其他干细胞类细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞等)的生长或扩增，其包括将血细胞产物或造血细胞群转移至本文所考虑的培养基，将所述细胞与一种或多种前列腺素途径激动剂接触，和将所述细胞孵育足够的时间以刺激HSPC的生长或扩增，并借此刺激HPSC的生长或扩增。
G.治疗方法或疗法
本文所考虑的制备细胞的组合物和方法在多种临床背景中是有用的，其包括细胞移植、血液学病症、疾病和病况的治疗、缺血治疗和基因疗法。在具体的实施方式中，包含血细胞产物或造血细胞的组合物在提高对其有需要的受试者中移植的细胞的移植、重建、归巢和增殖是有用的。
“对其有需要的受试者”包括，但不限于，需要造血移植、重建、归巢、增殖或基因疗法的受试者。包括已诊断患有如本文其他处所讨论的多种类型的白血病、贫血症、淋巴瘤、骨髓瘤、免疫缺陷病症和实体瘤的受试者。“受试者”还包括如在恶性疾病的治疗过程中或作为基因疗法的组分，作为干细胞移植或骨髓移植候选的人。在具体的实施方式中，作为细胞基基因疗法，受试者接受遗传修饰的HSPC。受试者还可以包括捐赠干细胞或骨髓用于同种移植的个体或动物。在某些实施方式中，受试者可以经历清髓性放射疗法或化疗，或者可以经受导致脊髓抑制的急性辐射或化学损害。在某些实施方式中，受试者可以经历放射疗法或化疗，如在多种癌症治疗期间。典型的受试者包括显示出可以通过试剂或者干细胞或骨髓移植调控的一种或多种生理学活动的异常的量(比“正常”或“健康”受试者更低或更高的量)的动物。
需要造血移植或重建的受试者包括经历癌症化疗或放疗的受试者以及患有以下病症(例如，为以下病症所折磨)的受试者：非恶性血液病症，具体地，免疫缺陷病(例如，SCID、范可尼贫血、重型再生障碍性贫血或先天性血红蛋白病，或者代谢蓄积性疾病，如赫尔勒氏症、亨特氏病(Hunter'sdisease)、甘露糖苷过多症等)，或者癌症，具体地，血液学恶性肿瘤，如急性白血病、慢性白血病(脊髓或淋巴)、淋巴瘤(霍奇金氏病或非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良综合征或者非血液学癌症，如实体瘤(包括乳腺癌、卵巢癌、脑癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、皮肤癌、肝癌或胰癌)。
受试者还包括患有以下病症的受试者：再生障碍性贫血、免疫病症(重症联合免疫缺陷综合征或狼疮)、脊髓发育不良、地中海贫血、镰刀形红胞病或威斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrichsyndrome)。在一些实施方式中，受试者患有由另一种初步治疗(如放疗、化疗或使用骨髓抑制性药物的治疗，如齐多夫定、氯霉素或更昔洛韦)的不期望的副作用或并发症所引起的病症。这些病症包括中性白细胞减少、贫血症、血小板减少和免疫功能障碍。
其他受试者可以患有由导致骨髓的干细胞或祖细胞损害的感染(例如，病毒感染，细菌感染或真菌感染)所引起的病症。
另外，患有以下病况的受试者也可以受益于使用本发明的细胞基组合物的治疗：淋巴细胞减少、淋巴溢、淋巴郁滞、红细胞减少、红细胞退行性病症(erthrodegenerativedisorder)、红细胞增生减低症(erythroblastopenia)、骨髓病性贫血；红细胞破碎、地中海贫血、骨髓纤维化、血小板减少、弥漫性血管内凝血(DIC)、免疫性(自身免疫性)血小板减少性紫癜(ITP)、HIV引起的ITP、脊髓发育不良；血小板增多性疾病(thrombocytoticdisease)、血小板增多、先天性中性白细胞减少(如kostmann氏综合征和舒-戴二氏综合征(Schwachman-Diamondsyndrome))、肿瘤相关中性白细胞减少、儿童和成人周期性嗜中性白细胞减少症；传染病后嗜中性白细胞减少症；骨髓增生异常综合征(myelo-dysplasticsyndrome)；化疗和放疗相关性嗜中性白细胞减少症；慢性肉芽肿病；黏多糖贮积症；DiamondBlackfan病；镰刀形红细胞病；β-重型地中海贫血；戈谢病；克拉伯病(Krabbe'sdisease)；异染性脑白质营养不良；Tay-Sachs病；NiemanPick病；糖蛋白沉积症(glycoproteinoses)(例如，岩藻糖沉积症、a-甘露糖苷过多症)；和MPS-III(Sanfillipo)。
在具体的实施方式中，所述受试者是捐献骨髓的骨髓供体，是有待捐献骨髓的骨髓供体，是骨髓供体移植受体，在环境压力下具有造血祖细胞，患有贫血症，与正常受试者相比免疫细胞功能水平降低或者具有免疫系统缺陷。
在某一实施方式中，所述受试者患有骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性粒细胞性白血病、慢性粒性白血病、慢性粒细胞白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性非淋巴母细胞性白血病或白血病前期。
受试者还包括需要治疗缺血组织或与组织缺血有关的一种或多种症状的那些受试者，所述缺血组织或症状包括(但不限于)器官功能损害或丧失(无限制地包括脑、肾或心脏功能的损害)、痉挛、跛行、麻痹、麻刺感、虚弱、疼痛、伤口愈合降低、炎症、皮肤变色和坏疽。如本文所使用的，术语“缺血”、“缺血病况”或者“缺血事件”表示由脉管系统的任何收缩、损害或阻塞所引起的对任何细胞、组织、器官或身体部分的血液供应的任何减少或停止。有时，缺血是由血管收缩或血栓形成或栓塞所引起的。缺血可以导致直接缺血性损伤，由氧气(低氧、缺氧)、葡萄糖和营养物供给减少所引起的细胞死亡所造成的组织损伤。“低氧”或“低氧条件”表示细胞、器官或组织接收的氧气供给不足的条件。“缺氧”是指在器官或组织中实际上完全缺少氧气，如果延长，其可以导致细胞、器官或组织死亡。
在具体的实施方式中，受试者需要基因疗法，如(例如)血红蛋白病。如本文所使用的，术语“血红蛋白病”或“血红蛋白病状况”包括在血液中涉及异常血红蛋白分子的存在的任何病症。血红蛋白病的实例包括(但不限于)血红蛋白C疾病、血红蛋白镰刀形红细胞病(SCD)、镰刀形红细胞贫血症和地中海贫血。还包括其中在血液中存在异常血红蛋白的组合的血红蛋白病(例如，镰刀形细胞/Hb-C疾病)。
在本文中定义术语“镰刀形细胞贫血症”或“镰刀形细胞病”以包括由红细胞镰刀化所引起的任何有症状的贫血病况。镰刀形红细胞病的表现包括：贫血症；疼痛；和/或器官功能障碍，如肾衰竭、视网膜病、急性胸部综合征、缺血、阴茎异常勃起和中风。如本文所使用的，术语“镰刀形红细胞病”是指伴随镰刀形红细胞贫血症的多种临床问题，特别是在对于HbS中镰刀形红细胞取代是纯和体的那些受试者中。如本文所使用的，术语“地中海贫血症”涵盖了由于影响血红蛋白合成的突变而发生的遗传性贫血症。因此，术语包括由地中海贫血病况(如重型地中海贫血或β-地中海贫血、重型地中海贫血、中间型地中海贫血、α-地中海贫血，如血红蛋白H病)所引起的任何症状性贫血。
在一种实施方式中，细胞基疗法的方法包括向对其有需要的受试者施用解冻并转移至本文所考虑的培养基中的血细胞产物或造血细胞群，任选地其中已在该培养基中处理、调控或扩增了所述细胞。在多个实施方式中，所述细胞是造血细胞，如(例如)造血干细胞或祖细胞(例如，分离自脐带血或动员的外周血)，所述造血细胞任选地被一种或多种试剂处理以提高所述细胞的一种或多种治疗性质。在某一实施方式中，任选地以10μM的浓度用前列腺素途径激动剂(例如，16,16-dmPGE2)在37℃处理细胞约2小时。
向受试者施用“一定量”的本文所制备的细胞是指施用对实现所需治疗或预防结果(其无限制地包括受试者的治疗)“有效的量”。因此，出于本文的目的，通过本领域中已知的这些考虑确定了细胞的“治疗有效量”，并且所述有效量可以根据以下因素，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及细胞在个体中引起所需反应的能力而改变。术语“治疗有效量”包括对“治疗”受试者(例如，患者)有效的量。治疗有效量还是其中与治疗有益作用相比，细胞的任何毒性或不利作用是微不足道的量。
“预防有效量”是指具有对实现所需预防结果有效的治疗潜能的细胞的量。通常，但是不必需的，由于在疾病之前或疾病早期在受试者中使用了预防剂量，因此预防有效量将小于治疗有效量。
施用在本文所述的方法中使用的细胞群的适合的方法包括肠胃外施用，其包括(但不限于)血管内施用方法，如静脉内和动脉内施用。施用本发明的细胞的其他说明性方法包括肌内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。
在多个实施方式中，施用于受试者的血细胞产物或造血细胞是非均一细胞群，其包括全骨髓、脐带血、动员的外周血、造血干细胞、造血祖细胞和造血干细胞和祖细胞的子代，其包括粒性白细胞(例如，前髓细胞、髓细胞、晚幼粒细胞、嗜中性白细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、血小板(例如，成巨核细胞、血小板产生巨核细胞、血小板)和单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)。
现将通过以下实施例更充分地描述本发明的具体实施方式。然而，本发明可以以多种不同形式体现并且不应将其视为受限于本文所说明的实施方式；相反，提供这些实施方式从而使本发明公开更深入和完整，并且将向本领域技术人员充分展示本发明的范围。
实施例
实施例1
在全脐血短期孵育期间，StemSpan-ACF+右旋糖酐-40最大程度降低活CD34+细胞的损失并改善TNC回收
短期孵育期间，脐血CD34计数
脐血单位得自CarolinasCordBloodBank(CBB)。在37℃，在StemSpan-ACF(StemCellTechnologies,Vancouver,BC,Canada)或者具有8％右旋糖酐-40(Sigma-Aldrich,StLouis,MO)的StemSpan-ACF中解冻得自这些脐血单位的样品。将每种样品以400×g离心10分钟，并在每种样品初始解冻的相同培养基中再悬浮。在37℃，将两样品孵育2小时。在整个处理和孵育过程中，从两条件中取出100uL的样品。使用用于脐血单位的BDStemCellEnumeration试剂盒(BDBiosciences,SanJose,CA)标准无裂解、无清洗规程，将细胞对CD34-PE、CD45-FITC和7AAD染色。在BDFACSCantoII(BDBiosciences,SanJose,CA)上分析样品并使用ISHAGE门控策略(ISHAGEgatingstrategy)门控。使用围绕具有特征高侧向散射和低CD45表面表达的粒性白细胞群设置的门(gate)估计粒性白细胞的百分比。
结果
在37℃，在1小时和孵育2小时后(孵育后)，与单独的StemSpan-ACF相比，在具有8％右旋糖酐-40的StemSpan-ACF中孵育的样品中活CD34+细胞的计数更多(图1a)。孵育后，与在具有右旋糖酐-40的StemSpan中孵育的样品相比，在StemSpan-ACF中孵育的样品中，活CD34+细胞数目少36％。
在37℃，在1小时和在孵育2小时后(孵育后)，与单独的StemSpan相比，在具有8％右旋糖酐的StemSpan-ACF中孵育的样品中，CD45+细胞组分中完整粒性白细胞的百分比提高约20％。该结果表明孵育期间裂解的粒性白细胞的部分更少。
实施例2
StemSpan-ACF+右旋糖酐-40降低了用dmPGE2处理的全脐血中TNC的损失
用dmPGE2离体调控全脐血
脐血单位得自CarolinasCBB并保存在液氮(LN2)蒸汽相中。在冷冻保存之前，脐血单位是RBC减少的和血浆减少的，并将其以25mL体积保存。在37℃水浴中解冻脐血单位，并在StemSpan-ACF、StemSpan-ACF+2.1％HSA、StemSpan+4.2％HSA、IMDM+4.2％HSA或具有8％右旋糖酐-40的StemSpan-ACF中使体积达到45mL。使用Sepax2细胞处理系统(Biosafe,Geneva,Switzerland)，用脐血单位初始解冻的相同培养基清洗脐血单位。清洗的脐血单位的总体积为95mL。将dmPGE2加入至脐血单位中至最终浓度10μM。在37℃，将脐血单位置于Plasmatherm装置(Barkey,Leopoldshoehe,Germany)上恒定搅拌桨混合2小时。在解冻、清洗和孵育步骤后，使用SysmexKX-21N(SysmexAmerica,IncLincolnshire,IL)确定总有核细胞(TNC)计数。
结果
与具有8％右旋糖酐-40的StemSpan-ACF中的8％的TNC损失相比，从解冻至孵育后，在StemSpan-ACF或IMDM中处理的脐血单位的TNC计数导致了65.4％的平均TNC损失(图2)。这些单位之间的一个可观察的差异是在无右旋糖酐-40的培养基中细胞碎片凝集。大部分TNC损失发生在孵育期间，但一些损失还发生在脐血单位清洗期间。
实施例3
用dmPGE2处理的全脐血维持了StemSpan-ACF+右旋糖酐-40中的生物活性
StemSpan-ACF中右旋糖酐-40的加入不会抑制生物活性
在37℃水浴中解冻脐血单核细胞(AllCells,Emeryville,CA)，并立即用10mL预热的具有10％胎牛血清和5uLDNA酶(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)的IMDM稀释。将细胞分成三份，并以300×g离心10分钟。将细胞在StemSpan-ACF(培养基1)、StemSpan-ACF加5％右旋糖酐-40(培养基2)和StemSpan-ACF加10％右旋糖酐-40(培养基3)中再悬浮。将来自培养基1的亚组(1×106个细胞)保存在4℃并立即用来自BDBiosciences的LineageMix-FITC、CXCR4-PE、CD34-APC和CD45-V450抗体染色。将所有3个培养基条件分成媒介物处理组和10μMdmPGE2处理组，并在37℃孵育2小时。将细胞用相同培养基清洗，并在37℃再孵育1小时。用如上所示的相同抗体对每个组染色。分析Lin-CD45低CD34+7AAD-细胞内的CXCR4表面蛋白水平。
结果
在37℃，用10μMdmPGE2孵育2小时后，观察到CXCR4基因表达的提高，并且在无dmPGE2的情况下，再孵育1小时后，CXCR4表面蛋白提高。向StemSpan-ACF加入5％或10％的右旋糖酐-40不会降低CD34+细胞对dmPGE2的反应，如通过CXCR4表面蛋白表达水平的提高所显示的(图3)。
可以将如上所述的多个实施方式合并以提供其他实施方式。在本说明书中提及的和/或在专利申请数据页中所列的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物以其全部内容作为参考并入本文。如有必要，可以修改实施方式的方面以使用多个专利、专利申请和专利公开的概念以提供其他实施方式。
可以根据上述详细说明，对实施方式做出这些及其他改变。一般地，在以下权利要求中，所使用的术语不应视为对说明书和权利要求中公开的具体实施方式的主张的限制，而应视为包括了所有可能的实施方式以及与这些权利要求所赋予的权利等价的全部范围。因此，本发明公开未限制权利要求。

Claims (125)

1.一种培养基，包含：
(a)约1％至约20％的多糖；和
(b)化学成分确定的细胞培养基。
2.根据权利要求1所述的培养基，其中，所述多糖是右旋糖酐。
3.根据权利要求1所述的培养基，其中，所述多糖是右旋糖酐，其选自由右旋糖酐-1、右旋糖酐-10、右旋糖酐-20、右旋糖酐-30和右旋糖酐-40组成的组。
4.根据权利要求1所述的培养基，其中，所述多糖是右旋糖酐-40。
5.根据权利要求1所述的培养基，其中，所述多糖是羟乙基淀粉(HES)。
6.根据权利要求1所述的培养基，其中，所述多糖是HES，其选自由羟乙基淀粉、六聚淀粉、五聚淀粉和四聚淀粉组成的组。
7.根据权利要求1所述的培养基，其中，所述多糖是羟乙基淀粉。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的培养基，其中，所述培养基包含约1％至约5％的多糖。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的培养基，其中，所述培养基包含约6％的多糖。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的培养基，其中，所述培养基包含约7％的多糖。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的培养基，其中，所述培养基包含约8％的多糖。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的培养基，其中，所述培养基包含约9％的多糖。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的培养基，其中，所述培养基包含约10％的多糖。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的培养基，其中，所述培养基包含约1％至约5％的HSA。
15.根据权利要求14所述的培养基，其中，所述培养基包含约2％的HSA。
16.根据权利要求14所述的培养基，其中，所述培养基包含约3％的HSA。
17.根据权利要求14所述的培养基，其中，所述培养基包含约4％的HSA。
18.根据权利要求14所述的培养基，其中，所述培养基包含约5％的HSA。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的培养基，其中，所述化学成分确定的细胞培养基选自由StemSpan-ACF、StemSpan-H3000、StemSpan-SFEM、StemlineII、StemPro34、StemXVivo、伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基(IMDM)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、RoswellParkMemorialInstitute培养基(RPMI)1640培养基、McCoy's5A培养基、α最低必需培养基(α-MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、Fischer培养基、medium199、F-12K营养混合物培养基(Kaighn改良，F-12K)和X-vivo20组成的组。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的培养基，其中，所述化学成分确定的细胞培养基选自由StemSpan-ACF、StemSpan-H3000和StemSpan-SFEM组成的组。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的培养基，其中，所述化学成分确定的细胞培养基是StemSpan。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的培养基，还包含一种或多种生长因子或细胞因子。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的培养基，其中，所述化学成分确定的培养基包含一种或多种生长因子或细胞因子，其选自由flt3-配体(FLT3)；促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白介素-3(IL3)、白介素-6(IL6)和白介素-9(IL9)租车功能的组。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的培养基，还包含选自由cAMP类似物或增强剂、Gα-s活化剂和前列腺素途径激动剂组成的组中的试剂。
25.根据权利要求24所述的培养基，其中，所述前列腺素途径激动剂选择性结合PGE2EP2或PGE2EP4受体。
26.根据权利要求24所述的培养基，其中，所述前列腺素途径激动剂包含PGE2或PGE2的类似物或衍生物。
27.根据权利要求24所述的培养基，其中，所述前列腺素途径激动剂选自由PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-甲基PGE2、20-乙基PGE2和8-异-16-环己基-四降PGE2组成的组。
28.根据权利要求24所述的培养基，其中，所述前列腺素途径激动剂包含16,16-dmPGE2。
29.一种组合物，包含：
(a)细胞群；
(b)约1％至约20％的多糖；和
(c)化学成分确定的细胞培养基。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述细胞群选自由骨髓细胞(BMC)、脐带血细胞(UCBC)、胎盘血细胞、动员外周血细胞(mPBC)、造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)和CD34+细胞组成的组。
31.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述细胞群选自由骨髓、脐带血、胎盘血或动员的外周血组成的组。
32.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述细胞群包含造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)和CD34+细胞中的至少一种。
33.根据权利要求29-32中任一项所述的组合物，其中，所述细胞群包含纯化的CD34+细胞群。
34.根据权利要求29-32中任一项所述的组合物，其中，所述多糖是右旋糖酐。
35.根据权利要求29-32中任一项所述的组合物，其中，所述多糖是右旋糖酐，其选自由右旋糖酐-1、右旋糖酐-10、右旋糖酐-20、右旋糖酐-30和右旋糖酐-40组成的组。
36.根据权利要求29-32中任一项所述的组合物，其中，所述多糖是右旋糖酐-40。
37.根据权利要求29-32中任一项所述的组合物，其中，所述多糖是HES。
38.根据权利要求29-32中任一项所述的组合物，其中，所述多糖是HES，其选自由羟乙基淀粉、六聚淀粉、五聚淀粉和四聚淀粉组成的组。
39.根据权利要求29-32中任一项所述的组合物，其中，所述多糖是羟乙基淀粉。
40.根据权利要求29-39中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含约1％至约5％的多糖。
41.根据权利要求29-39中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含约6％的多糖。
42.根据权利要求29-39中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含约7％的多糖。
43.根据权利要求29-39中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含约8％的多糖。
44.根据权利要求29-39中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含约9％的多糖。
45.根据权利要求29-39中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含约10％的多糖。
46.根据权利要求29-45中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含约1％至约5％的HSA。
47.根据权利要求29-45中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含约2％的HSA。
48.根据权利要求29-45中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含约3％的HSA。
49.根据权利要求29-45中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含约4％的HSA。
50.根据权利要求29-45中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含约5％的HSA。
51.根据权利要求29-50中任一项所述的组合物，其中，所述化学成分确定的细胞培养基选自由StemSpan-ACF、StemSpan-H3000、StemSpan-SFEM、StemlineII、StemPro34、StemXVivo、伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基(IMDM)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、RoswellParkMemorialInstitute培养基(RPMI)1640培养基、McCoy's5A培养基、α最低必需培养基(α-MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、Fischer培养基、medium199、F-12K营养混合物培养基(Kaighn改良，F-12K)和X-vivo20组成的组。
52.根据权利要求29-51中任一项所述的组合物，其中，所述化学成分确定的细胞培养基选自由StemSpan-ACF、StemSpan-H3000和StemSpan-SFEM组成的组。
53.根据权利要求29-52中任一项所述的组合物，其中，所述化学成分确定的细胞培养基是StemSpan。
54.根据权利要求29-53中任一项所述的组合物，还包含一种或多种生长因子或细胞因子。
55.根据权利要求29-53中任一项所述的组合物，其中，所述化学成分确定的培养基包含一种或多种生长因子或细胞因子，其选自由flt3-配体(FLT3)；促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、白介素-3(IL3)、白介素-6(IL6)和白介素-9(IL9)组成的组。
56.根据权利要求29-55中任一项所述的组合物，还包含选自由cAMP类似物或增强剂、Gα-s活化剂和前列腺素途径激动剂组成的组中的试剂。
57.根据权利要求56所述的组合物，其中，所述前列腺素途径激动剂选择性结合PGE2EP2或PGE2EP4受体。
58.根据权利要求56所述的组合物，其中，所述前列腺素途径激动剂包含PGE2或PGE2的类似物或衍生物。
59.根据权利要求56所述的组合物，其中，所述前列腺素途径激动剂选自由PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-甲基PGE2、20-乙基PGE2和8-异-16-环己基-四降PGE2组成的组。
60.根据权利要求56所述的组合物，其中，所述前列腺素途径激动剂包括16,16-dmPGE2。
61.一种制备细胞群的方法，包括使所述细胞群与根据权利要求1至28所述的培养基中的任一种接触。
62.根据权利要求61所述的方法，其中，所述细胞群包含造血细胞群。
63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述造血细胞群选自由骨髓细胞(BMC)、脐带血细胞(UCBC)、胎盘血细胞、动员外周血细胞(mPBC)、造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)和CD34+细胞组成的组。
64.根据权利要求62所述的方法，其中，所述造血细胞群选自由骨髓、脐带血、胎盘血或动员的外周血组成的组。
65.根据权利要求62所述的方法，其中，所述造血细胞群包含造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)和CD34+细胞中的至少一种。
66.根据权利要求62所述的方法，其中，所述造血细胞群是纯化的CD34+细胞群。
67.根据权利要求61-66中任一项所述的方法，其中，所述细胞群包含冷冻保存的细胞，并且接触包括使所述冷冻保存的细胞在所述培养基中解冻。
68.根据权利要求61-66中任一项所述的方法，其中，所述细胞群包含在将所述细胞群与所述培养基接触前已解冻的冷冻保存的细胞。
69.根据权利要求67-68中任一项所述的方法，其中，所述细胞群在约20℃至约37℃的温度下解冻。
70.根据权利要求67-68所述的方法，其中，所述细胞群在约25℃、约30℃或约37℃的温度下解冻。
71.根据权利要求61-70所述的方法，其中，与已与对照培养基接触的对照细胞群的细胞溶解相比，所述接触的细胞群的细胞溶解减少了约10％、约20％、约30％、约40％或约50％。
72.根据权利要求61-70所述的方法，其中，与已与对照培养基接触的对照细胞群的细胞溶解相比，所述接触的细胞群的细胞溶解减少了约2倍、3倍或5倍。
73.根据权利要求62-70中任一项所述的方法，其中，与从已与对照培养基接触的对照造血细胞群的TNC回收相比，从所述接触的造血细胞群的TNC回收提高了约10％、约20％、约30％或约50％。
74.根据权利要求62-70中任一项所述的方法，其中，与从已与对照培养基接触的对照造血细胞群的TNC回收相比，从所述接触的造血细胞群的TNC回收提高了约2倍、约3倍或约5倍。
75.根据权利要求66所述的方法，其中，与已与对照培养基接触的对照细胞群的CD34+细胞活力相比，所述接触的CD34+细胞的活力提高了约10％、约20％、约30％、约40％或约50％。
76.根据权利要求66所述的方法，其中，与已与对照培养基接触的对照细胞群的CD34+细胞活力相比，所述接触的CD34+细胞的活力提高了约2倍、约3倍或约5倍。
77.根据权利要求61至76中任一项所述的方法，其中，所述细胞群是离体调控的。
78.根据权利要求77所述的方法，其中，所述调控包括使所述细胞群选自由cAMP类似物或增强剂、Gα-s活化剂和前列腺素途径激动剂组成的组中的至少一种试剂接触。
79.根据权利要求78所述的方法，其中，所述前列腺素途径激动剂选择性结合PGE2EP2或PGE2EP4受体。
80.根据权利要求78所述的方法，其中，所述前列腺素途径激动剂包含PGE2或PGE2的类似物或衍生物。
81.根据权利要求78所述的方法，其中，所述前列腺素途径激动剂选自由PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-甲基PGE2、20-乙基PGE2和8-异-16-环己基-四降PGE2组成的组。
82.根据权利要求78所述的方法，其中，所述前列腺素途径激动剂包括16,16-dmPGE2。
83.根据权利要求78-82中任一项所述的方法，其中，将所述细胞群与所述至少一种试剂接触约1小时至约4小时的时间。
84.根据权利要求78-82中任一项所述的方法，其中，将所述细胞群与所述至少一种试剂接触约1小时或约2小时的时间。
85.根据权利要求78-82中任一项所述的方法，其中，将所述细胞群在约25℃至约37℃的温度下与所述至少一种试剂接触。
86.根据权利要求78-82中任一项所述的方法，其中，将所述细胞群在约30℃或约37℃的温度下与所述至少一种试剂接触。
87.根据权利要求78-82中任一项所述的方法，其中，所述细胞群包括造血细胞，并且触点包括在约37℃将所述造血细胞与10μM16,16-dmPGE2接触约2小时。
88.根据权利要求77-87中任一项所述的方法，其中，与未调控细胞群相比，所述细胞群的移植、重建、归巢和/或增殖体内增加。
89.根据权利要求77-87中任一项所述的方法，其中，与对照未调控细胞群中的至少两个基因的表达相比，所述细胞群中选自CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2的至少两个基因的表达提高了约20倍。
90.根据权利要求77-87中任一项所述的方法，其中，与对照未调控细胞群中的至少五种基因的表达相比，所述细胞群中选自CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2的至少五种基因的表达提高了约10倍、约3倍或约2倍。
91.根据权利要求77-87中任一项所述的方法，与对照未调控细胞群中的基因表达相比，所述细胞群中基因CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HAS1、CXCL2、CXCL3和CXCR4的表达提高了约3倍或约2倍。
92.根据权利要求61-81中任一项所述的方法，其中，将所述细胞群施用于受试者。
93.根据权利要求92所述的方法，其中，所述细胞群对所述受试者是同种异体的。
94.根据权利要求92所述的方法，其中，所述细胞群对所述受试者是自体同源的。
95.根据权利要求92所述的方法，其中，所述受试者患有选自以下的疾病、病症或病况：缺血、非恶性血液病症、免疫缺陷、严重联合免疫缺陷(SCID)、淋巴细胞减少、血小板减少、中性白细胞减少、贫血症、范可尼贫血、重型再生障碍性贫血、先天性血红蛋白病、镰刀形红细胞病、β-地中海贫血、镰刀形红胞病、维-奥二氏综合症、代谢贮积病、赫尔勒氏症、Hunter症、甘露糖苷过多症、癌症、血液恶性肿瘤、急性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良综合征、非血液学癌症、乳腺癌、卵巢癌、脑癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、皮肤癌、肝癌和胰癌。
96.根据权利要求1至21中任一项所述的培养基，其中，所述培养基通过在约25℃至约37℃的温度下，将所述样品与调控前列腺素途径的至少一种试剂接触约1至约24小时的持续时间来维持所调控的解冻的全脐血样品中至少70％的TNC。
97.根据权利要求96所述的培养基，其中，在所述解冻的全脐血样品中，所述培养基维持了至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的TNC。
98.根据权利要求96或97所述的培养基，其中，所述至少一种试剂选自：cAMP类似物或增强剂、Gα-s活化剂和前列腺素途径激动剂。
99.根据权利要求96或97所述的培养基，其中，所述至少一种试剂选择性结合PGE2EP2或PGE2EP4受体。
100.根据权利要求96或97所述的培养基，其中，所述至少一种试剂包括PGE2或者PGE2的类似物或衍生物。
101.根据权利要求96或97所述的培养基，其中，所述至少一种试剂选自：PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-甲基PGE2、20-乙基PGE2和8-异-16-环己基-四降PGE2。
102.根据权利要求96或97所述的培养基，其中，所述至少一种试剂包括16,16-dmPGE2。
103.根据权利要求96或97所述的培养基，其中，将所述样品与所述至少一种试剂接触约1小时至约4小时的时间。
104.根据权利要求96或97所述的培养基，其中，将所述样品与所述至少一种试剂接触约1小时或约2小时的时间。
105.根据权利要求96或97所述的培养基，其中，将所述样品在约25℃至约37℃的温度下与所述至少一种试剂接触。
106.根据权利要求96或97所述的培养基，其中，将所述样品在约30℃或约37℃的温度下与所述至少一种试剂接触。
107.根据权利要求96或97所述的培养基，其中，在约37℃，将所述样品与10μM16,16-dmPGE2接触约2小时。
108.根据权利要求96-107中任一项所述的培养基，其中，与对照全脐血样品中的至少两个基因的表达相比，所述接触的样品中选自CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2的至少两个基因的表达提高了约20倍。
109.根据权利要求96-107中任一项所述的培养基，其中，与对照全脐血样品中的至少五种基因的表达相比，所述接触的样品中选自CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2的至少五种基因的表达提高了约10倍、约3倍或约2倍。
110.根据权利要求96-107中任一项所述的培养基，其中，与对照全脐血样品中的基因表达相比，所述接触的样品中基因CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2的表达提高了约10倍、约5倍、约3倍或约2倍。
111.与根据权利要求1-21中任一项所述的培养基接触的全脐血样品，其中，在所述培养基中，通过在约25℃至约37℃的温度下，将所述样品与调控前列腺素途径的至少一种试剂接触约1至约24小时的持续时间来调控所述全脐血样品，其中所述样品包括至少70％的TNC并且所述样品不进行富集。
112.根据权利要求111所述的全脐血样品，其中，所述TNC为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
113.根据权利要求111或112所述的全脐血样品，其中，所述至少一种试剂选自由cAMP类似物或增强剂、Gα-s活化剂和前列腺素途径激动剂组成的组。
114.根据权利要求111或112所述的脐血样品，其中，所述至少一种试剂选择性结合PGE2EP2或PGE2EP4受体。
115.根据权利要求111或112所述的全脐血样品，其中，所述至少一种试剂包括PGE2或者PGE2的类似物或衍生物。
116.根据权利要求111或112所述的全脐血样品，其中所述至少一种试剂选自由PGE2、16,16-dmPGE2、15(S)-15-甲基PGE2、20-乙基PGE2和8-异-16-环己基-四降PGE2组成的组。
117.根据权利要求111或112所述的全脐血样品，其中，所述至少一种试剂包含16,16-dmPGE2。
118.根据权利要求111或112所述的全脐血样品，其中，将所述全脐血样品与所述至少一种试剂接触约1小时至约4小时的时间。
119.根据权利要求111或112所述的全脐血样品，其中，将所述全脐血样品与所述至少一种试剂接触约1小时或约2小时的时间。
120.根据权利要求111或112所述的全脐血样品，其中，将所述全脐血样品在约25℃至约37℃的温度下与所述至少一种试剂接触。
121.根据权利要求111或112所述的全脐血样品，其中，将所述全脐血样品在约30℃或约37℃的温度下与所述至少一种试剂接触。
122.根据权利要求111或112所述的全脐血样品，其中，在约37℃，将所述全脐血样品与10μM16,16-dmPGE2接触约2小时。
123.根据权利要求111-122中任一项所述的全脐血样品，其中，与对照全脐血样品中的至少两个基因的表达相比，所述接触的样品中选自CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2的至少两个基因的表达提高了约20倍。
124.根据权利要求111-122中任一项所述的全脐血样品，其中，与对照全脐血样品中的至少五种基因的表达相比，所述接触的样品中选自CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2的至少五种基因的表达提高了约10倍、约3倍或约2倍。
125.根据权利要求111-122中任一项所述的全脐血样品，其中，与对照全脐血样品中的基因表达相比，所述接触的样品中基因CREM、GEM、NR4A2、NR4A3、IL1A、COX2、HEY1、CXCL2、CXCL3和ULBP2的表达提高了约10倍、约5倍、约3倍或约2倍。
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105713880A (zh) * 2016-04-20 2016-06-29 广东艾时代生物科技有限责任公司 一种造血干细胞体外扩增培养的无血清培养基及其应用
CN105749252A (zh) * 2016-04-29 2016-07-13 南方医科大学 Il-9作为治疗血小板缺少症的药物的应用
CN106434549A (zh) * 2016-12-20 2017-02-22 江西宜信堂医疗科技有限公司 一种无血清干细胞培养基及其制备方法
CN108220246A (zh) * 2011-09-30 2018-06-29 蓝鸟生物公司 用于改善病毒转导的化合物
CN110317782A (zh) * 2019-07-18 2019-10-11 天津博雅秀岩生物技术有限公司 提高间充质干细胞复苏后存活的方法和所用的冻存液
CN110894490A (zh) * 2018-09-13 2020-03-20 李陶 一种脐带造血干细胞体外扩增培养体系和脐带造血干细胞体外扩增方法
CN110923194A (zh) * 2019-12-23 2020-03-27 广东依浦赛生物科技有限公司 一种用于原代细胞培养的试剂盒及其应用
CN111741735A (zh) * 2017-12-29 2020-10-02 细胞治疗神经科学有限公司 视网膜色素上皮细胞组合物
CN112779209A (zh) * 2019-11-08 2021-05-11 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 原代乳腺上皮细胞培养基、培养方法及其应用
US11891622B2 (en) 2014-12-30 2024-02-06 Cell Cure Neurosciences Ltd. RPE cell populations and methods of generating same

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016123100A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 Fate Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation
US10233210B2 (en) * 2015-01-30 2019-03-19 Coral Drugs Pvt. Ltd. Process for preparation of glucocorticoid steroids
MX2018000897A (es) 2015-07-21 2018-11-09 The Children´S Medical Center Corp Celulas madre hematopoyeticas que expresan pd-l1 y usos.
KR20180066263A (ko) 2015-11-04 2018-06-18 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 조혈 세포 분화를 유도하기 위한 방법 및 조성물
EP4249074A3 (en) 2015-11-04 2024-01-10 Fate Therapeutics, Inc. Genomic engineering of pluripotent cells
US10426796B2 (en) 2016-06-13 2019-10-01 SMART SURGICAL, Inc. Compositions for biological systems and methods for preparing and using the same
US10456423B2 (en) 2016-06-13 2019-10-29 SMART SURGICAL, Inc. Compositions for biological systems and methods for preparing and using the same
KR102018609B1 (ko) * 2017-04-26 2019-09-06 이장호 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물
US11879137B2 (en) 2017-09-22 2024-01-23 The Children's Medical Center Corporation Treatment of type 1 diabetes and autoimmune diseases or disorders
JP7036670B2 (ja) * 2018-05-31 2022-03-15 アークレイ株式会社 血液中の稀少細胞検査、該検査ための血液処理方法及び採血管
JP2022512810A (ja) * 2018-10-24 2022-02-07 ヒービセル コーポレイション 造血系統細胞を製造するための方法およびシステム
TW202315940A (zh) * 2021-10-13 2023-04-16 芯芮生技開發股份有限公司 幹細胞條件培養基於製備抑制癌症組成物的用途
WO2023235132A1 (en) * 2022-06-03 2023-12-07 Bluerock Therapeutics Lp Cell delivery vehicle and methods of using the same

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008034803A1 (en) * 2006-09-18 2008-03-27 Medizinische Universität Graz Plasma-free platelet lysate for use as a supplement in cell cultures and for the preparation of cell therapeutics

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5061620A (en) 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
US5635387A (en) 1990-04-23 1997-06-03 Cellpro, Inc. Methods and device for culturing human hematopoietic cells and their precursors
US5460964A (en) 1992-04-03 1995-10-24 Regents Of The University Of Minnesota Method for culturing hematopoietic cells
US5405772A (en) 1993-06-18 1995-04-11 Amgen Inc. Medium for long-term proliferation and development of cells
US5677136A (en) 1994-11-14 1997-10-14 Systemix, Inc. Methods of obtaining compositions enriched for hematopoietic stem cells, compositions derived therefrom and methods of use thereof
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
CA2248142A1 (en) 1996-03-12 1997-09-18 Life Technologies, Inc. Hematopoietic cell culture nutrient supplement
EP1690945A3 (en) * 1997-02-20 2009-06-03 DSM IP Assets B.V. Fermentative production of valuable compounds on an industrial scale using chemically defined media
US6177545B1 (en) 1997-09-02 2001-01-23 Insight Strategy & Marketing Ltd. Heparanase specific molecular probes and their use in research and medical applications
WO2000038663A2 (en) 1998-12-24 2000-07-06 Alcon Laboratories, Inc. Ep4 receptor agonists for treatment of dry eye
JP2000201672A (ja) * 1999-01-11 2000-07-25 Asahi Medical Co Ltd 有核細胞の凍結保存用組成物
KR20020022798A (ko) 1999-08-13 2002-03-27 후미에 사토 프로스타글란딘 유도체
IL141120A0 (en) 2000-01-31 2002-02-10 Pfizer Prod Inc Use of prostaglandin (pge2) receptor 4 (epa) selective agonists for the treatment of acute and chronic renal failure
US20020013294A1 (en) 2000-03-31 2002-01-31 Delong Mitchell Anthony Cosmetic and pharmaceutical compositions and methods using 2-decarboxy-2-phosphinico derivatives
US7968329B2 (en) 2000-10-06 2011-06-28 Michael Dancu Method of conditioning a hybrid synthetic tubular structure to yield a functional human hybrid coronary bypass graft
JP2003225084A (ja) 2000-12-28 2003-08-12 Japan Science & Technology Corp 凍結細胞保存剤
FR2825261B1 (fr) 2001-06-01 2003-09-12 Maco Pharma Sa Ligne de prelevement du sang placentaire comprenant une poche de rincage
US7625752B2 (en) 2001-12-21 2009-12-01 Mount Sinai Hospital Cellular compositions and methods of making and using them
US7176022B2 (en) * 2002-12-20 2007-02-13 Cell Genesys, Inc. Directly injectable formulations which provide enhanced cryoprotection of cell products
US6747037B1 (en) 2003-06-06 2004-06-08 Allergan, Inc. Piperidinyl prostaglandin E analogs
US7147626B2 (en) 2004-09-23 2006-12-12 Celgene Corporation Cord blood and placenta collection kit
EP1805139A2 (en) 2004-10-26 2007-07-11 Allergan, Inc. Therapeutic and delivery methods of prostaglandin ep4 agonists
JP2008531051A (ja) * 2005-02-28 2008-08-14 リジェネテック，インコーポレイテッド すぐに利用できる末梢血由来の細胞物質を提供する方法およびその組成
AU2006252363A1 (en) 2005-06-02 2006-12-07 Stemcyte, Inc. Plasma-depleted, non-red blood cell-depleted cord blood compositions and methods of use
DE102005062741A1 (de) 2005-12-22 2007-06-28 Bayer Schering Pharma Ag Fluorene und Carbazole als Liganden des EP2 Rezeptors
CN101495623B (zh) 2006-03-24 2013-09-11 儿童医疗中心有限公司 调节造血干细胞生长的方法
AU2007329725B2 (en) 2006-10-20 2013-05-23 Children's Medical Center Corporation Method to enhance tissue regeneration
US9394520B2 (en) 2006-12-08 2016-07-19 University Of Rochester Expansion of hematopoietic stem cells
KR20200011604A (ko) 2008-08-20 2020-02-03 안트로제네시스 코포레이션 개선된 세포 조성물 및 그의 제조 방법
CN107523587A (zh) 2008-11-06 2017-12-29 印第安纳大学研究与技术公司 增强造血干细胞植入过程的材料和方法
EP3533445A1 (en) 2009-03-19 2019-09-04 Fate Therapeutics, Inc. Compositions comprising cyclic amp enhancers and/or ep ligands, and methods of preparing and using the same
JP6029468B2 (ja) 2009-05-20 2016-11-24 カーディオ３ バイオサイエンシズ エスエイＣａｒｄｉｏ３ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓａ 心臓病治療用医薬組成物
ES2727787T3 (es) 2009-11-15 2019-10-18 Univ Indiana Res & Tech Corp Métodos para mejorar el suministro y el injerto de células madre incluida la identificación de receptores específicos de prostaglandina E2
JP5773347B2 (ja) * 2009-11-27 2015-09-02 国立大学法人 千葉大学 血液細胞の凍結保存剤
WO2012021845A2 (en) 2010-08-12 2012-02-16 Fate Therapeutics, Inc. Improved hematopoietic stem and progenitor cell therapy
TWI535377B (zh) * 2011-09-01 2016-06-01 Storage, culture and application of umbilical cord tissue and its derived cells
US9925221B2 (en) * 2011-09-09 2018-03-27 Celularity, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using placental stem cells
CA2857640C (en) 2011-12-02 2021-11-16 Fate Therapeutics, Inc. Enhanced stem cell composition
WO2013082241A2 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Fate Therapeutics, Inc. Improved methods of treating ischemia
EP2968416A4 (en) 2013-03-15 2016-08-17 Fate Therapeutics Inc BIOLOGICAL ACTIVITY TESTING OF CELLS FOR A THERAPEUTIC POTENTIAL

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008034803A1 (en) * 2006-09-18 2008-03-27 Medizinische Universität Graz Plasma-free platelet lysate for use as a supplement in cell cultures and for the preparation of cell therapeutics

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FABIENNE DUPUIS ET AL.: "Prostaglandin E2 Stimulates the Growth of Human Blood CD34+ Progenitors", 《PROSTAGLANDINS & OTHER LIPID MEDIATORS》 *
刘佳佳、曹福祥: "《生物技术原理与方法》", 31 July 2004, 化学工业出版社 *
朱森等: "前列腺素E2受体亚型EP2和EP4的最新研究进展", 《临床医学工程》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108220246B (zh) * 2011-09-30 2022-07-12 蓝鸟生物公司 用于改善病毒转导的化合物
CN108220246A (zh) * 2011-09-30 2018-06-29 蓝鸟生物公司 用于改善病毒转导的化合物
US11891622B2 (en) 2014-12-30 2024-02-06 Cell Cure Neurosciences Ltd. RPE cell populations and methods of generating same
US11987810B2 (en) 2014-12-30 2024-05-21 Cell Cure Neurosciences Ltd. RPE cell populations and methods of generating same
CN105713880A (zh) * 2016-04-20 2016-06-29 广东艾时代生物科技有限责任公司 一种造血干细胞体外扩增培养的无血清培养基及其应用
CN105749252A (zh) * 2016-04-29 2016-07-13 南方医科大学 Il-9作为治疗血小板缺少症的药物的应用
CN106434549A (zh) * 2016-12-20 2017-02-22 江西宜信堂医疗科技有限公司 一种无血清干细胞培养基及其制备方法
CN111741735A (zh) * 2017-12-29 2020-10-02 细胞治疗神经科学有限公司 视网膜色素上皮细胞组合物
CN110894490A (zh) * 2018-09-13 2020-03-20 李陶 一种脐带造血干细胞体外扩增培养体系和脐带造血干细胞体外扩增方法
CN110317782A (zh) * 2019-07-18 2019-10-11 天津博雅秀岩生物技术有限公司 提高间充质干细胞复苏后存活的方法和所用的冻存液
CN110317782B (zh) * 2019-07-18 2023-06-13 天津瑞博斯生物技术有限公司 提高间充质干细胞复苏后存活的方法和所用的冻存液
CN112779209A (zh) * 2019-11-08 2021-05-11 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 原代乳腺上皮细胞培养基、培养方法及其应用
CN110923194A (zh) * 2019-12-23 2020-03-27 广东依浦赛生物科技有限公司 一种用于原代细胞培养的试剂盒及其应用

Also Published As

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EP2970894A1 (en) 2016-01-20

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