CN105358144A - 包括给予二十二碳六烯酸和α-硫辛酸的组合的用于促进神经元发育和/或健康的方法 - Google Patents

包括给予二十二碳六烯酸和α-硫辛酸的组合的用于促进神经元发育和/或健康的方法 Download PDF

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Abstract

本公开内容涉及通过提供包含二十二碳六烯酸和α-硫辛酸的营养组合物促进受试者的神经元健康和/或发育的方法。所述营养组合物可进一步包含乳铁蛋白、益生元、益生菌及其混合物。此外本公开内容提供通过向目标受试者提供本文所公开的营养组合物加速神经元活动发展和/或加强电化学突触信号传导的方法。

Description

包括给予二十二碳六烯酸和α - 硫辛酸的组合的用于促进神经元发育和 / 或健康的方法
技术领域
本公开内容涉及用于促进神经元健康和发育，以及加速神经元活动发展和/或改善电化学突触信号传导的方法，其包括提供包含α-硫辛酸(“ALA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)的营养组合物。本文所公开的方法包括适合给予成人和小儿受试者的营养组合物。
背景技术
脑部仅占总体重的2%，但它是消耗高的器官，其使用高达30%的每日热量和营养物。(Harris, J.J.等人, CNS白质的能量学（The Energetics of CNS White Matter）. Jour. of. Neuroscience, Jan. 2012: 32(1): 356-371)。人类脑和神经系统在产前生命极早期开始形成并且两者持续发育，直到约3岁。这种早期发育对整个脑部和神经系统的健康可具有终生的作用。因此，脑营养物在婴儿、儿童和孕妇以及哺乳期妇女的饮食中可以是重要的添加剂，因为它们促进早期脑发育和预防和保护免遭脑和神经系统伤害或疾病的能力。另外，脑营养物对于成人是重要的，因为许多营养物促进神经系统修复和提供神经保护性健康益处。
多种营养素被认为涉及支持健康脑发育。然而，最近本文中发现ALA，通常也称为硫辛酸(“LA”)，可加速神经元活动的发展因此增强神经元发育和认知功能。
考虑到神经系统的早期发育，所需要的为用于促进神经元健康和发育的方法，以便支持脑和神经系统健康。因此，本文提供了通过提供包含ALA的营养组合物加速目标受试者中神经元活动发展和/或改善电化学突触信号传导的方法。此外，这些营养组合物可具有额外和/或协同的神经系统健康益处。
发明公开内容
简言之，在一个实施方案中，本公开内容涉及通过提供包含ALA和DHA的营养组合物促进神经元发育的方法。在一些实施方案中，所述营养组合物还可包含乳铁蛋白、至少一种益生元、至少一种益生菌和其混合物。认为DHA可与ALA协同作用加速受试者的神经元活动和/或促进和加强电化学突触信号传导。
在某些实施方案中所述营养组合物可进一步包含至少一种除DHA外的额外的长链多不饱和脂肪酸(“LCPUFA”)、唾液酸、益生元源、益生菌源、β-葡聚糖、铁源和/或其一种或多种的混合物。
由于生命第一年期间关键的脑发育，在一些实施方案中所提供的营养组合物包括婴儿配方或小儿营养组合物。另外，本文所描述的营养组合物可用作促进具有神经退行性疾病和/或脑损伤的受试者的神经学健康的药剂或营养补充剂。此外，本公开内容的营养组合物可提供神经保护性健康益处和促进整个脑和神经系统健康。
应理解的是前述一般性说明和下文的详述二者均呈现本公开内容的实施方案并且意在提供用于理解如所要求保护的本公开内容的性质和特征的概述或框架。说明书用于解释所要求保护的主题的原理和操作。在阅读下列公开内容时，本公开内容其它和进一步的特征和优点对本领域技术人员将容易地显而易见。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一个以彩色执行的图。含有彩图的本专利或专利申请出版物的拷贝将由官方（the Office）在要求和支付必要的费用时提供。
图 1提供本文所述的一些爆发参数的示例性说明。
图 2说明来自网络中两个不同单元的自相关图。
图 3显示DHA或α-硫辛酸诱导的作用的定性比较，如通过在DHA和ALA二者的所选浓度下，在60秒期间19个神经元的体外峰电位序列(spike trains)说明。
图 4显示DHA、ALA、DHA与ALA的组合、hBDNF和溶媒DMSO以浓度-依赖的方式对体外皮质网络活性诱导的作用的定性比较。
图 5显示具有计算的斜率(Hill系数，nH)DHA的拟合曲线。在DHA的最高检验浓度为100 µM时，活性的下降达到天然活性的63.6%。
图 6显示对于引起10和50%活性变化(EC10和EC50) 和斜率(Hill系数，nH)的α-硫辛酸的有效浓度。在100 µM α-硫辛酸时，活性达到对照(0.1 % DMSO)活性的91.5%，1 mM时83.6%，5 mM时43.9%。
图 7显示DMSO与DHA对体外皮质网络活性的作用的比较。显示在100 pM - 100 μM范围内的9个递增浓度的处理的分为4类的12个活性描述参数(均值±标准误差，学生非配对t-检验： * p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01; *** p ≤ 0.001)。
图 8显示DMSO与DHA对体外皮质网络活性的作用的比较。显示在100 pM - 100 μM范围内的9个递增浓度的处理的分为4类的12个活性描述参数(均值±标准误差，学生非配对t-检验：* p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01; *** p ≤ 0.001)。
图 9显示计算的DHA和ALA的组合的有效浓度，其引起50%的活性变化(EC50)。
图 10显示引起10%和50%活性变化的ALA的有效浓度(EC10和EC50)。
图 11说明DMSO与ALA对体外皮质网络活性的作用的比较。显示在10 nM - 5 mM范围内9个ALA递增浓度的处理的分为4类的12个活性描述参数。
图 12a说明100 µM ALA和20 µM DHA与100 µM ALA的组合的特征图。在一个选定浓度处的60个参数指示单独的ALA和ALA与DHA组合的相似和差异。从该图，可以看出DHA与α-硫辛酸的混合物诱导不同的活性模式，所述活性模式分类为一般活性、爆发结构、振荡和同步性。
图 12b说明10 µM DHA与100 µM ALA和1 mM ALA组合的分阶投影（stepwise projection）。爆发率在10 µM ALA至100 µM ALA的阶段(step)之间显著增加。
图 12c说明比较DHA和硫辛酸的组合与硫辛酸和包含DMSO的溶媒的活性图的概况。参数在四个一般分类中示出：一般活性、爆发结构、振荡性质和同步性。
图 13说明DHA与ALA的组合(A)、ALA (B)、hBDNF (C)和促-认知药物多奈哌齐(D)的活性图的概况。如从图11可见，DHA与ALA的组合、hBDNF和多奈哌齐在某些浓度范围内增加神经元网络活性。
图 14说明hBDNF与0.1 % DMSO溶媒相比对分为4类的12个活性描述参数的作用，并显示hBDNF所诱导的活性变化的简单印象（snapshot）。
图 15说明hBDNF与BDNF的溶媒和水对神经元活动参数峰电位率(spike rate)和爆发率的慢性作用。20 ng/ml 的hBDNF增加每个记录时间点的一般活性，这可转化为约1周的加速的神经元活动发展。
用于实施本发明的最佳模式
现将详细参考本公开内容的实施方案，所述实施方案的一个或多个实施例在下文中阐述。各实施例以举例说明本公开内容的营养组合物和方法的方式提供并且不为限制。事实上，对本领域技术人员将显而易见的是，可对本公开内容的教导作出多种修饰和变更，而并不背离本公开内容的范围。例如，作为一个实施方案的一部分说明或描述的特征可与另一个实施方案一起使用以产生又进一步的实施方案。
因此，本公开内容意欲涵盖在所附权利要求的范围内的这样的修饰和变更及其等同物。本公开内容的其它目标、特征和方面在下列详述中公开或根据下列详述显而易见。本领域普通技术人员应理解的是，本讨论仅为示例性实施方案的描述并且不意在限制本公开内容更广泛的方面。
本公开内容一般地涉及通过提供包含DHA和ALA的营养组合物促进神经元健康和发育的方法。另外，本公开内容涉及通过向目标受试者提供包含ALA的营养组合物加速神经元活动发展和/或加强或改善电化学突触信号传导的方法。进一步公开了支持和促进脑和神经系统健康、神经发生和/或认知发展的方法。
“营养组合物”意指满足至少一部分受试者的营养需求的物质或配方。术语“营养的”、“营养配方”、“肠内营养的”和“营养补充剂”在本公开内容全文中用作营养组合物的非限制性实例。此外，“营养组合物”可指液体、粉末、凝胶、糊、固体、浓缩物、悬液、即用形式的肠内配方、口服配方、婴儿配方、小儿受试者配方、儿童配方、成长乳和/或成人配方。术语“肠内”意指可通过胃肠道或消化道递送或可在胃肠道或消化道内递送。“肠内给予”包括口服给食、胃内给食、经幽门给予或进入消化道的任何其它给予。“给予”比“肠内给予”更广，包括肠胃外的给予或将物质摄入受试者体内的任何其它给予途径。
“α-硫辛酸”，在本文中缩写为“ALA”，是指分子式为C8H14S2O2的源自辛酸的有机硫化合物。通常，ALA含有经由二硫键连接的两个硫原子。如本文所使用的术语“硫辛酸”，缩写为“LA”，和“α-硫辛酸”，缩写为“ALA”，及其各自的缩写可互换使用。
术语“水解程度”是指肽键通过水解方法破坏的程度。例如，在一些实施方案中，本公开内容的蛋白质等同物源可包含具有不超过40%的水解程度的水解蛋白。对于该实施例，这意指总肽键的至少40%已通过水解方法被切开。
术语“广泛水解的”意指具有大于或等于50%的水解程度。
术语“部分水解的”意指具有小于50%的水解程度。
“小儿受试者”意指小于13岁的人类。在一些实施方案中，小儿受试者指出生到8岁的人类受试者。在其它实施方案中，小儿受试者指1-6岁的人类受试者。在又进一步的实施方案中，小儿受试者指6-12岁的人类受试者。术语“小儿受试者”可指如下文所描述的婴儿(早产或足月)和/或儿童。
“婴儿”意指从出生到不超过一岁的年龄范围内的人类受试者，并且包括0-12个月校正年龄的婴儿。短语“校正年龄”意指婴儿的实足年龄减去该婴儿早产的时间量。因此，如果婴儿已经孕育至足月，那么校正年龄就是其年龄。术语婴儿包括低出生体重的婴儿、极低出生体重的婴儿和早产婴儿。“早产”意指婴儿在妊娠第37周结束前出生。“足月”意指婴儿在妊娠第37周结束后出生。
“儿童”意指从12个月-约13岁年龄范围内的受试者。在一些实施方案中，儿童为1-12岁年龄的受试者。在其它实施方案中，术语“儿童们”或“儿童”指1-约6岁，或约7-约12岁的受试者。在其它实施方案中，术语“儿童们”或“儿童”指12个月-约13岁之间的任何年龄范围。
“儿童营养产品”是指满足儿童的至少一部分营养需求的组合物。成长乳为儿童营养产品的一个实例。
“婴儿配方”意指满足婴儿的至少一部分营养需求的组合物。在美国，婴儿配方的含量由21 C.F.R.第 100、106和107部分所阐述的联邦法规规定。这些法规限定了试图模仿人母乳的营养性质和其它性质的大量营养素、维生素、矿物质和其它成分的水平。
术语“成长乳”指意在用作不同饮食的一部分以便支持年龄约1-约6岁的儿童的正常生长和发育的广泛种类的营养组合物。
“营养完全”意指可用作唯一的营养源的组合物，其将供应基本上所有的日常需要量的维生素、矿物质和/或微量元素与蛋白质、碳水化合物和脂质的组合。实际上，“营养完全”描述提供支持受试者正常生长和发育所需要的足量碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白质、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。
因此，对早产儿“营养完全”的营养组合物将，按照定义，提供早产儿生长所需要的质量上和数量上足量的碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白质、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。
对足月婴儿“营养完全”的营养组合物将，按照定义，提供足月婴儿生长所需要的质量上和数量上足量的所有碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白质、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。
对儿童“营养完全”的营养组合物将，按照定义，提供儿童生长所需要的质量上和数量上足量的所有碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白质、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。
当应用于营养素时，术语“必需”指身体不能以对于正常生长和维持健康而言足够的量合成并且，因此，必须通过饮食供应的任何营养素。术语“条件必需”，当应用于营养素时，意指在当身体不可得到对于发生内源性合成而言足够量的前体化合物时的条件下该营养素必须由饮食供应。
“益生菌”意指对宿主健康产生至少一种有益作用的低致病性或无致病性的微生物。
术语“灭活的益生菌”意指其中所提及的益生菌生物体的代谢活性或繁殖能力已被降低或破坏的益生菌。然而，“灭活的益生菌” 在细胞水平确实仍保留至少一部分的其生物学乙二醇-蛋白质（glycol-protein）和DNA/RNA结构。如本文所使用的，术语“灭活的”与“无活力的”同义。更特别地，灭活的益生菌的一个非限制性实例为灭活的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) GG （“LGG”）或“灭活的LGG”。
术语“细胞等同物”指等同于相同数目的活细胞的无活力、不复制的益生菌水平。术语“不复制”应理解为从相同量的复制细菌获得的不复制微生物的量(cfu/g)，其包括灭活的益生菌、DNA片段、细胞壁或细胞质化合物。换言之，无论无生命的、不复制生物体是否是死的、不复制的、灭活的、破碎的等，它们的量以cfu为单位表示，如同所有的微生物是活的一样。
“益生元”意指通过选择性刺激消化道内可改善宿主健康的一种或有限数目的细菌的生长和/或活性有益地影响宿主的不可消化的食物成分。
“β-葡聚糖”是指所有β-葡聚糖，包括特定类型的β-葡聚糖，例如β-1,3-葡聚糖或β-1,3；1,6-葡聚糖。此外，β-1,3；1,6-葡聚糖为β-1,3-葡聚糖的一种。因此，术语“β-1,3-葡聚糖”包括β-1,3；1,6-葡聚糖。
本文使用的“非人乳铁蛋白”是指由不同于人母乳的源产生的或得自不同于人母乳的源的乳铁蛋白。在某些实施方案中，非人乳铁蛋白是氨基酸序列不同于人乳铁蛋白的氨基酸序列的乳铁蛋白。在其它实施方案中，用于本公开内容的非人乳铁蛋白包括由遗传修饰生物体产生的人乳铁蛋白。本文使用的术语“生物体”是指任何连续生命系统，例如动物、植物、真菌或微生物。
本文使用的所有百分比、份和比例均以总配方的重量计，除非另有说明。
本公开内容的营养组合物可基本上不含任何本文描述的任选或选择成分，只要剩余的营养组合物仍包含本文所述的所有所需成分或特征。在本发明上下文中，除非另有说明，术语“基本不含”意指所选组合物可包含小于有功能量的任选成分，通常小于0.1%重量，也包括0%重量的该任选或选择成分。
对本公开内容的单数特性或限制的所有提及应包括相应的复数特性或限制，反之亦然，除非另有说明或在作出该提及的上下文中明确暗示与此相反。
本文使用的方法或过程步骤的所有组合可按任何顺序实施，除非另有说明或在提及该组合的上下文中明确暗示与此相反。
本公开内容的方法和组合物，包括其组分，可包含以下，或由以下组成或基本上由以下组成：本文描述的实施方案的基本要素和限制，以及本文描述的或营养组合物中在其它方面有用的任何额外或任选成分、组分或限制。
本文使用的术语“约”应解释为指作为任何范围的端点而指定的两个数字。对范围的任何提及应被考虑为提供对该范围的任何子集的支持。
脑和神经系统的发育在个体的总体健康和幸福中发挥关键作用。因此，本公开内容的方法促进脑和神经系统健康。在某些实施方案中，本文所公开的方法提供包含ALA和DHA的的营养组合物，与不提供这些营养素时的神经元活动相比，该组合物加速目标受试者中神经元活动发展和/或改善电化学突触信号传导。因此，所述营养组合物包含ALA和DHA，并且可根据本文所描述的方法提供。不受任何具体理论束缚，该DHA和ALA的组合可具有支持脑和神经系统发育和健康的额外和/或协同的有益作用。
适合用于本文所述营养组合物的ALA的实例包括，但不限于，ALA的对映体和外消旋混合物，包括RLA、SLA和R/S-LA。同样合适的是用钠(“Na-RALA”)或钾(钾-R-硫辛酸盐)稳定的R-硫辛酸。如本文所使用的，ALA可包括至少一种其药学上可接受的盐、代谢产物和/或其组合。
在一些实施方案中所述营养组合物可用有效量的ALA配制。如对于该实施方案所使用的有效量意指当给予时对受试者产生有益作用的量。在一些实施方案中，ALA的有效量包括当提供给目标受试者时加速神经元活动的发展和/或改善电化学突触信号传导的量。例如，在一些实施方案中，ALA的有效量为约0.1 mg/100 kcal - 约35 mg/100 kcal。在一些实施方案中，ALA可以以约2.0 mg/100 kcal - 约25 mg/100 kcal的量存在。在又其它的实施方案中，ALA可以以约5.0 mg/100 kcal - 约15 mg/100 kcal的量存在。
在一些实施方案中所述营养组合物可用有效量的DHA配制。如对于该实施方案所使用的有效量意指当给予时对受试者产生有益作用的量。在一些实施方案中，DHA的有效量包括当提供给目标受试者时加速神经元活动的发展和/或改善电化学突触信号传导所必需的量。不受任何具体理论束缚，认为与不提供DHA和ALA时的神经元发育或活性相比，DHA与ALA的组合可协同促进神经元发育，包括加速神经元活动和/或电化学突触信号传导。
本公开内容的营养组合物还可包含至少一种除DHA外的额外的长链多不饱和脂肪酸(“LCPUFA”)。合适的额外的LCPUFAs包括，但不限于二十碳五烯酸(“EPA”)、花生四烯酸(“ARA”)、n-6途径中的亚油酸(18:2 n-6)、γ-亚麻酸(18:3 n-6)、二同型-γ-亚麻酸（dihomo-γ-linolenic acid）(20:3 n-6)、α-亚麻酸(18:3 n-3)、十八碳四烯酸 (18:4 n-3)、二十碳四烯酸(20:4 n-3)、二十碳五烯酸(20:5 n-3)和二十二碳五烯酸(22:6 n-3)。
营养组合物中LCPUFA（其可包括DHA）的量可为约5 mg/100 kcal - 约100 mg/100 kcal。在一些实施方案中，营养组合物的LCPUFA浓度可为约10 10 mg/100 kcal - 约50 mg/100 kcal。又在一些实施方案中，营养组合物的LCPUFA浓度可为约15 mg/100 kcal - 约30 mg/100 kcal。
LCPUFA源包括乳制品如蛋和乳脂；海洋油如鳕鱼、油鲱、沙丁鱼、金枪鱼和许多其它鱼类；某些动物脂肪、猪油、牛油和微生物油类例如真菌和海藻油，或来自从中可获得LCPUFAs并用在营养组合物中的任何其它经强化或未经强化的源。LCPUFA可为通过本领域已知的分离技术而获得的复杂混合物的一部分，所述分离技术旨在在这类混合物中富集LCPUFAs和LCPUFAs的衍生物或前体。
在营养组合物中可以以以下形式提供LCPUFAs：游离脂肪酸的酯；甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯；磷甘油酯，包括卵磷脂；和/或其混合物。另外，LCPUFA可以以磷脂，特别是磷脂酰胆碱的形式提供于营养组合物中。
在一个实施方案中，特别是如果营养组合物为婴儿配方，所述营养组合物用DHA和ARA二者补充。在该实施方案中，ARA:DHA的重量比率可为约1:3-约9:1之间。在具体的实施方案中，ARA:DHA的重量比率约1:2 - 约4:1。
在一些实施方案中，DHA以约5 mg/100 kcal - 约75 mg/100 kcal存在于营养组合物中。在一些实施方案中，DHA以约10 mg/100 kcal - 约50 mg/100 kcal存在。在又一些实施方案中，DHA以约15 mg/100 kcal - 约30 mg/100 kcal存在于营养组合物中。
所述营养组合物可使用本领域已知的标准技术用包含DHA和/或ARA的油类补充。例如，可通过替换组合物中通常存在的相等量的油，例如高油酸葵花油将DHA和ARA加入组合物中。作为另一实例，含有DHA和ARA的油可添加到所述组合物中，即通过替代无DHA和ARA的组合物中正常存在的相等量的总体脂肪混合物的其余部分。
如果使用，DHA和/或ARA源可为本领域已知的任何源，例如海洋油、鱼油、单细胞油、蛋黄脂质和脑脂质。在一些实施方案中，DHA和ARA来源于单细胞Martek油，DHASCO®和ARASCO®，或其变体(variations)。DHA和ARA可呈天然形式，只要剩余的LCPUFA源不对婴儿产生任何实质有害作用。或者，DHA和ARA可以以精制形式使用。
在一个实施方案中，DHA和ARA源为如美国专利号5,374,567、5,550,156和5,397,591中所教导的单细胞油，所述专利的公开内容通过引用以其整体结合到本文中。然而，本公开内容不只限于这样的油。
此外，所述营养组合物的一些实施方案可模仿人母乳的某些特征。然而，为了满足一些受试者的特定营养需求，营养组合物可包含与人乳相比更高量的一些营养组分。例如，营养组合物可包含与人母乳相比更大量的DHA。提高的营养组合物的DHA水平可补偿现存的营养DHA缺乏。
在一些实施方案中，所述营养组合物中还可提供乳铁蛋白。乳铁蛋白为包含1-4个聚糖的约80 kD的单链多肽，这取决于其种类。不同种类的乳铁蛋白的3-D结构相似，但并不相同。每个乳铁蛋白包含两个同源叶，称为N-和C-叶，分别指该分子的N-端和C-端部分。每个叶进一步由两个亚叶或结构域组成，其形成裂缝，其中铁离子(Fe3+)与碳酸(氢)根阴离子以协同合作的方式紧紧结合。这些结构域分别被称为N1、N2、C1和C2。乳铁蛋白的N-端具有对多个重要结合特征负责的强阳离子肽区域。乳铁蛋白具有非常高的等电点(~pI 9)并且其阳离子性质在抵御细菌、病毒和真菌病原体的能力中发挥主要作用。乳铁蛋白的N-端区域内存在若干阳离子氨基酸残基簇，其介导乳铁蛋白抗广泛范围的微生物的生物学活性。
用于本公开内容的乳铁蛋白可以例如分离自非人动物的乳汁或由遗传修饰的生物体产生。更具体地讲，用于本文的乳铁蛋白，在一些实施方案中，可包含非人乳铁蛋白、由遗传修饰的生物体产生的非人乳铁蛋白和/或由遗传修饰的生物体产生的人乳铁蛋白。
用于本公开内容的合适的非人乳铁蛋白包括，但不限于，与人乳铁蛋白的氨基酸序列具有至少48%的同源性的那些。例如，牛乳铁蛋白(“bLF”)具有与人乳铁蛋白约70%序列同源性的氨基酸组成。在一些实施方案中，非人乳铁蛋白与人乳铁蛋白具有至少65%的同源性并且在一些实施方案中，至少75%的同源性。用于本公开内容的可接受的非人乳铁蛋白包括，而不限于，bLF、猪乳铁蛋白、马乳铁蛋白、水牛乳铁蛋白、山羊乳铁蛋白、鼠乳铁蛋白、骆驼乳铁蛋白及其组合。
可以通过本领域已知的任何方法产生适于本公开内容的bLF。例如，在美国专利号4,791,193（其通过引用全部结合到本文中）中，Okonogi等人公开了产生高纯度牛乳铁蛋白的方法。通常，所公开的方法包括3个步骤。原料乳材料首先与弱酸性阳离子交换剂接触以吸附乳铁蛋白，接着是第二步，其中进行洗涤以去除未吸附的物质。接着是解吸步骤，其中将乳铁蛋白取出以产生纯化的牛乳铁蛋白。其它方法可包括以下文献中描述的步骤：美国专利号7,368,141、5,849,885、5,919,913和5,861,491，其公开内容通过引用全部结合到本文中。
在某些实施方案中，可通过用于自乳源分离蛋白的膨胀床吸附(“EBA”)过程提供用于本公开内容的乳铁蛋白。EBA，有时也称为稳定流化床吸附，是用于自乳源分离乳蛋白例如乳铁蛋白的方法，包括建立包含颗粒基质的膨胀床吸附柱，将乳源应用于所述基质，和用包含约0.3-约2.0M氯化钠的洗脱缓冲液自基质洗脱乳铁蛋白。任何哺乳动物乳源都可用于本过程，尽管在具体的实施方案中，所述乳源是牛乳源。在一些实施方案中，所述乳源包含全乳、减脂乳、脱脂乳、乳清、酪蛋白或其混合物。
在具体的实施方案中，目标蛋白是乳铁蛋白，虽然也可分离其它乳蛋白，例如乳过氧化物酶或乳白蛋白。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：建立包含颗粒基质的膨胀床吸附柱，将乳源应用于所述基质，和用约0.3-约2.0 M氯化钠从基质洗脱乳铁蛋白。在其它实施方案中，用约0.5-约1.0 M氯化钠洗脱乳铁蛋白，而在进一步的实施方案中，用约0.7-约0.9 M氯化钠洗脱乳铁蛋白。
膨胀床吸附柱可以是本领域已知的任何一种，例如美国专利号7,812,138、6,620,326、和6,977,046中描述的那些，其公开内容藉此通过引用结合到本文中。在一些实施方案中，以膨胀模式将乳源应用于柱中，以膨胀或填充模式进行洗脱。例如，膨胀模式中的膨胀比率可以是约1-约3、或约1.3-约1.7。EBA技术进一步描述于国际公布申请号WO 92/00799、WO 02/18237、WO 97/17132，其通过引用全部结合到本文中。
乳铁蛋白的等电点为约8.9。分离乳铁蛋白的现有技术EBA方法使用200 mM氢氧化钠作为洗脱缓冲液。因此，系统的pH升至超过12，和乳铁蛋白的结构和生物活性可因不可逆的结构变化而受累（comprised）。现在已经发现氯化钠溶液在自EBA基质分离乳铁蛋白中可以用作洗脱缓冲液。在某些实施方案中，氯化钠浓度为约0.3 M-约2.0 M。在其它实施方案中，乳铁蛋白洗脱缓冲液的氯化钠浓度为约0.3 M-约1.5 M、或约0.5 m-约1.0 M。
本文使用的乳铁蛋白，在一些实施方案中，可以是分离自全乳和/或具有低的体细胞计数的乳的乳铁蛋白，其中“低的体细胞计数”是指体细胞计数小于200,000细胞/mL。举例来说，合适的乳铁蛋白可得自新西兰Morrinsville的Tatua Co-operative Dairy Co. Ltd.，得自荷兰Amersfoort的FrieslandCampina Domo或得自新西兰Auckland的Fonterra Co-Operative Group Limited。
令人吃惊的是，本文包括的乳铁蛋白维持某种杀菌活性，即使暴露于低pH(即低于约7，和甚至低至约4.6或更低)和/或高温(即高于约65℃，和高达约120℃)，这是预计会破坏或严重限制人乳铁蛋白的稳定性或活性的条件。在用于本文所述类型的营养组合物的某些加工方案(例如巴氏消毒)期间，可预期这些低pH和/或高温条件。因此，甚至在加工方案后，乳铁蛋白具有抗人类肠道内存在的不期需的细菌性病原体的杀菌活性。
当为了实施本公开内容的方法将乳铁蛋白掺入营养组合物中时，在一些实施方案中，乳铁蛋白的存在量为约10 mg/100 kcal-约250 mg/100 kcal。又在一些实施方案中，乳铁蛋白的存在量为约50 mg/100 kcal-约175 mg/100 kcal。在一些实施方案中，乳铁蛋白的存在量为约100 mg/100 kcal-约150 mg/100 kcals。
在一些实施方案中，所述营养组合物可包含有效量的ALA和DHA。如该实施方案中所使用的有效量意指当给予时对受试者产生有益作用的量。在一些实施方案中，ALA与DHA的组合的有效量包括与不存在ALA和DHA的组合时发生的神经元活动或电化学突触信号传导相比，当提供给目标受试者时加速神经元活动的发展和/或促进和加强电化学突触信号传导所必需的组合在一起的每种营养素的量。
在本文所述的方法中营养组合物可用其它成分配制以便为目标受试者提供适当的营养素水平。在一些实施方案中，所述营养组合物为适合支持正常生长并且还加速脑发育的营养完全的配方。在某些其它实施方案中，营养素的组合和浓度经设计以模仿对人早期发育健康的水平。
另外，营养素ALA和DHA可通过本领域所熟知的任何方法加入或掺入到营养组合物中。在一些实施方案中，可将它们加入营养组合物中以补充该营养组合物。例如，在一些实施方案中，可将ALA和/或DHA加入市售可得的婴儿配方中。例如，Enfalac、Enfamil®、Enfamil®Premature Formula、含铁的Enfamil®、Enfamil® LIPIL®、Lactofree®、Nutramigen®、Pregestimil®和ProSobee® (其各自可从Mead Johnson Nutrition Company, Glenview, Illinois, U.S.获得)可用合适水平的ALA和DHA补充，并用在本公开内容的实践中。
在其它实施方案中，可选择某些包含ALA和/或DHA的营养源并通过本领域已知的任何方法掺入本文所述的营养组合物中。例如，可选择一定量的包含ALA和/或DHA的脂肪源并掺入营养组合物中或可用不包含ALA和/或DHA的另一种脂肪源置换。在又其它的实施方案中，可改变通常加入营养组合物中的成分的源，使得所选择的源提供通常加入营养组合物中的成分以及ALA和/或DHA二者。
在一些实施方案中，ALA和DHA可通过本领域已知的任何方法包含入产前饮食补充剂中。产前给予ALA和DHA的组合可直接影响胎儿和胚胎的神经学发育。由于脑发育始于产前生命早期，在产前饮食补充剂中包含ALA和DHA可在小儿受试者仍在子宫中时加速神经元网络的发育。
方便地，可使用市售可得的产前饮食补充剂和/或产前营养产品。例如Expecta®Supplement (可从Mead Johnson Nutrition Company, Glenview, Illinois, U.S.获得)可用合适水平的ALA和DHA补充，并用在本公开内容的实践中。
产前饮食补充剂可以以每日一剂或多剂给予。在一些实施方案中，产前饮食补充剂以每日两剂给予。在一个单独的实施方案中，产前饮食补充剂以每日三剂给予。产前饮食补充剂可给予孕妇或哺乳的妇女。
本公开内容考虑任何口服可接受的给药形式。这样的给药形式的实例包括，但不限于丸剂、片剂、胶囊、软凝胶、液体、液体浓缩物、粉剂、酏剂、溶液、悬液、乳液、锭剂、小珠、扁囊剂及其组合。或者，可将本公开内容的产前饮食补充剂加入到更全面的营养组合物中。在此实施方案中，所述营养组合物可包含蛋白质、脂肪和碳水化合物组分并且可用于补充饮食或可用作单独的营养源。
在一些实施方案中，所述营养组合物包含至少一种碳水化合物源。碳水化合物源可以是本领域使用的任何一种，例如，乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糊精、蔗糖、淀粉、大米糖浆固体等。碳水化合物组分在营养组合物中的量通常可以在介于约5 g/100 kcal-约25 g/100 kcal之间变化。在一些实施方案中，碳水化合物的量为约6 g/100 kcal-约22 g/100 kcal。在其它实施方案中，碳水化合物的量为约12 g/100 kcal-约14 g/100 kcal。在一些实施方案中，优选玉米糖浆固体。此外，将水解的、部分水解的和/或广泛水解的碳水化合物包括在营养组合物中可以是合意的，因为它们易于消化。具体地讲，水解的碳水化合物不大可能含变应原性的表位。
适合用于本文的碳水化合物材料的非限制性实例包括水解的或完整的，天然的或化学改性的淀粉，其来自玉米、木薯粉、大米或马铃薯，呈蜡状或非蜡状。合适的碳水化合物的非限制性实例包括多种水解的淀粉，表征为水解的玉米淀粉、麦芽糊精、麦芽糖、玉米糖浆、右旋糖、玉米糖浆固体、葡萄糖、和多种其它葡萄糖聚合物及其组合。其它合适的碳水化合物的非限制性实例包括常被称为蔗糖、乳糖、果糖、高果糖玉米糖浆、难消化的寡糖例如低聚果糖及其组合的那些。
此外，本公开内容的营养组合物可包含至少一种蛋白源。蛋白源可以是本领域使用的任何蛋白源，例如脱脂乳、乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、水解蛋白、氨基酸等。可用于实施本公开内容的牛乳蛋白源包括但不限于乳蛋白粉、乳蛋白浓缩物、乳蛋白分离物、脱脂乳固体、脱脂乳、脱脂乳粉、乳清蛋白、乳清蛋白分离物、乳清蛋白浓缩物、甜乳清、酸乳清、酪蛋白、酸性酪蛋白、酪蛋白酸盐(例如，酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钠钙、酪蛋白酸钙)、大豆蛋白及其任意组合。
在营养组合物的具体的实施方案中，蛋白源的乳清:酪蛋白比例与在人母乳中发现的类似。在一个实施方案中，蛋白源包含约40%-约85%乳清蛋白和约15%-约60%酪蛋白。
在一些实施方案中，所述营养组合物包含约1g-约7g蛋白源/100 kcal。在其它实施方案中，所述营养组合物包含约3.5 g-约4.5 g蛋白/100 kcal。
在一些实施方案中，所述营养组合物的蛋白质作为完整蛋白提供。在其它实施方案中，蛋白质作为完整蛋白和水解蛋白二者的组合提供，水解程度为约4% - 10%。在某些其它实施方案中，蛋白质为水解更多的。在又其它的实施方案中，蛋白质源包含氨基酸。在又一个实施方案中，蛋白质源可用包含谷氨酰胺的肽补充。
在一些实施方案中，所述营养组合物的蛋白质源包括部分或广泛水解的蛋白质，例如来自牛乳的蛋白质。在其中蛋白质源包含广泛水解的蛋白质的一些实施方案中，所述营养组合物可基本上由广泛水解的蛋白质组成以便使食物过敏的发生减到最少。一般地，可用酶处理蛋白以破坏一些或大部分引起不良症状的蛋白，旨在减少过敏反应、不耐和致敏。此外，蛋白质可通过本领域已知的任何方法水解。
在一些实施方案中，本公开内容的营养组合物基本不含完整蛋白。在此背景下，术语“基本不含”是指本文优选的实施方案包含足够低浓度的完整蛋白，因此使配方低变应原性。本公开内容的营养组合物基本不含完整蛋白并因此是低变应原型的程度，通过2000年8月美国儿科学会的政策声明(Policy Statement of the American Academy of Pediatrics)来确定，在该声明中，低变应原性配方被定义为在合适的临床研究中，当在前瞻性的随机、双盲、安慰剂对照试验中给予时，以95%可信度证明在90%经证实对牛乳过敏的婴儿或儿童中不引起反应的配方。
所述营养组合物在一些实施方案中可为无蛋白的并且包含作为蛋白质等同源的游离氨基酸。在一些实施方案中，如本文所使用的术语“蛋白质等同源”包括蛋白质的功能等同物，其对目标受试者产生有益的健康作用而不包含任何完整蛋白。例如，“蛋白质等同源”可包括某些肽和/或肽片段、氨基酸及其组合。在某些实施方案中，掺入营养组合物的一种或多种蛋白质源可包括完整蛋白质源和蛋白质等同源二者。
如果包含，在一些实施方案中蛋白质等同源可包含氨基酸。所包含的氨基酸可包括，但不限于，组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、肉碱、牛磺酸及其混合物。在一些实施方案中，氨基酸可为支链氨基酸。在某些其它实施方案中，小氨基酸肽可作为营养组合物的蛋白质组分包含在内。这样的小氨基酸肽可为天然存在的或合成的。营养组合物中的游离氨基酸的量可从约1 g/100 kcal - 约5 g/100 kcal变动。
所述营养组合物还可包含脂肪源。用于本公开内容的营养组合物的合适的脂肪或脂质源可为本领域已知或使用的任何一种，包括但不限于，动物源(例如乳脂、黄油、黄油脂(butter fat)、蛋黄脂质)、海洋源(例如鱼油、海洋油、单细胞油)、蔬菜和植物油(例如玉米油、低芥酸菜子油、葵花油、大豆油、棕榈油精油、椰子油、高油酸葵花油、月见草油、菜籽油、橄榄油、亚麻子(亚麻籽)油、棉籽油、高油酸红花油、棕榈硬脂、棕榈仁油、小麦胚芽油)、中链甘油三酯油和乳液和脂肪酸的酯，及其任何组合。
在一些实施方案中所述营养组合物包含唾液酸。唾液酸为超过50个成员的9-碳糖家族，其所有均为神经氨酸的衍生物。人中存在的优势唾液酸家族来自N-乙酰神经氨酸亚家族。唾液酸可存在于乳例如牛乳和羊乳中。在哺乳动物中，与其它体细胞膜相比神经元细胞膜具有最高浓度的唾液酸。唾液酸残基也为神经节苷脂的组分。
如果在营养组合物中包含，唾液酸可以以约0.5 mg/100 kcal - 约45 mg/100 kcal的量存在。在一些实施方案中唾液酸可以以约5 mg/100 kcal - 约30 mg/100 kcal的量存在。在又其它的实施方案中，唾液酸可以以约10 mg/100 kcal - 约25 mg/100 kcal的量存在。
在某些实施方案中所述营养组合物还可包含一种或多种益生元(也称为益生元源)。益生元可刺激摄入的益生菌微生物的生长和/或活性，选择性地减少肠中存在的病原体，并有利地影响肠的短链脂肪酸概况。这样的益生元可为天然存在的、合成的或通过生物体和/或植物的基因操作而发展的，无论这样的新源是目前已知的或是日后开发的。可用于本公开内容的益生元可包括寡糖、多糖和包含果糖、木糖、大豆、半乳糖、葡萄糖和甘露糖的其它益生元。
更特别地，可用于本公开内容的益生元可包括聚右旋糖、聚右旋糖粉、乳果糖、乳果寡糖(lactosucrose)、棉子糖、寡聚葡萄糖、菊糖、寡聚果糖、寡聚异麦芽糖、大豆寡糖、乳果寡糖、寡聚木糖、寡聚壳糖、寡聚甘露糖、寡聚阿拉伯糖(aribino-oligosaccharide)、唾液酸寡糖、寡聚岩藻糖(fuco-oligosaccharide)、寡聚半乳糖和龙胆寡糖(gentio-oligosaccharide)。在一些实施方案中，营养组合物中存在的益生元的总量可为约0.1 g/100 kcal - 约1 g/100 kcal。在某些实施方案中，营养组合物中存在的益生元的总量可为约0.3 g/100 kcal - 约0.7 g/100 kcal。此外，所述营养组合物可包含含有聚右旋糖(“PDX”)和/或寡聚半乳糖(“GOS”)的益生元组分。在一些实施方案中，益生元组分包含至少20%的GOX、PDX或其混合物。
如果在益生元组合物中使用PDX，PDX在营养组合物中的量可，在一个实施方案中，在约0.1 g/100 kcal - 约1 g/100 kcal的范围内。在另一个实施方案中，聚右旋糖的量在约0.2 g/100 kcal - 约0.6 g/100 kcal的范围内。在又其它的实施方案中，PDX在营养组合物中的量可为约0.1 mg/100 kcal - 约0.5 mg/100 kcal或约0.3 mg/100 kcal。
如果在益生元组合物中使用GOS，在一个实施方案中，营养组合物中GOS的量可为约0.1 g/100 kcal - 约1 g/100 kcal。在另一个实施方案中，营养组合物中GOS的量可为约0.2 g/100 kcal - 约0.5 g/100 kcal。在其它实施方案中，营养组合物中GOS的量可为约0.1 mg/100 kcal - 约1.0 mg/100 kcal或约0.1 mg/100 kcal - 约0.5 mg/100 kcal。
在所述营养组合物的一个具体实施方案中，PDX与GOX组合给予。在该实施方案中，PDX和GOS可以以约9:1 - 1:9的PDX:GOS比率给予。在另一个实施方案中，PDX:GOS的比率可为约5:1 - 1:5。在又一个实施方案中，PDX:GOS的比率可为约1:3 - 3:1。在一个具体实施方案中，PDX与GOS的比率可为约5:5。在另一个具体实施方案中，PDX与GOS的比率可为约8:2。
在一个具体实施方案中，GOS与PDX以至少约0.2 mg/100 kcal或约0.2 mg/100 kcal - 约1.5 mg/100 kcal的总量补充到营养组合物中。在一些实施方案中，营养组合物可包含总量为约0.6 - 约0.8 mg/100 kcal的GOS和PDX。
在一个实施方案中，所述营养组合物可包含一种或多种益生菌。在该实施方案中本领域已知的任何益生菌均为可接受的。在一个具体实施方案中，益生菌可选自任何乳杆菌属种类、鼠李糖乳杆菌GG (ATCC号53103)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)种类、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum) BB536 (BL999, ATCC: BAA-999)、长双歧杆菌AH1206 (NCIMB: 41382)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve) AH1205 (NCIMB: 41387)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis) 35624 (NCIMB: 41003)和动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp. lactis) BB-12 (DSM No. 10140)或其任何组合。
如果包含在组合物中，益生菌的量可从每100 kcal约1 x 104 - 约1.5 x 1010 cfu益生菌变化。在一些实施方案中，益生菌的量可为每100 kcal约1 x 106 - 约1 x 109 cfu益生菌。在某些其它实施方案中益生菌的量可从每100 kcal约1 x 107 - 约1 x 108 cfu益生菌变化。
如本文所公开的营养组合物中所使用的益生菌可为有活力或无活力的。如本文所使用的，术语“有活力的”指活微生物。术语“无活力的”或“无活力的益生菌”意指无生命的益生菌微生物、其细胞组分和/或其代谢产物。这样的无活力益生菌可以已经被加热杀死或其它方式灭活，但它们保留有利影响宿主健康的能力。可用于本公开内容的益生菌可为天然存在的、合成的或通过生物体的基因操作而发展的，无论这种源是目前已知的还是日后开发的。
在一些实施方案中，所述营养组合物可包含含有益生菌细胞等同物的源。如果（in）在营养组合物中包含，益生菌细胞等同物的量可从每100 kcal约1 x 104 - 约1.5 x 1010益生菌的细胞等同物变化。在一些实施方案中益生菌细胞等同物的量可为每100 kcal营养组合物约1 x 106 - 约1 x 109益生菌的细胞等同物。在某些其它实施方案中益生菌细胞等同物的量可从每100 kcal营养组合物约1 x 107 - 约1 x 108益生菌的细胞等同物变化。
在一些实施方案中，掺入营养组合物中的益生菌源可包含有活力的集落形成单位和无活力的细胞等同物二者。
在一些实施方案中，所述营养组合物包含来自益生菌分批培养过程的指数生长期晚期的培养上清液。不希望受理论束缚，认为培养上清液的活性可归因于组分的混合物(包括蛋白样物质，并且可能包括(外泌)多糖物质)，其如发现在益生菌分批培养的指数期(或“对数期”)晚期释放入培养基中。如本文所使用的术语“培养上清液”，包括培养基中存在的组分的混合物。细菌分批培养的识别阶段为技术人员所已知。这些是“延迟期”、“对数期”(“对数期”或“指数期”)、“稳定期”和“死亡期”(或“对数下降期”)。活细菌存在于其间的所有时期中，细菌代谢来自培养基的营养素，分泌(施加、释放)物质至培养基中。在生长阶段的给定时间点分泌物的组成通常并非是可预测的。
在一个实施方案中，通过包括以下步骤的工艺可得到培养上清液：(a) 使用分批过程，在合适培养基中培养益生菌例如LGG；(b) 在培养步骤的指数生长期晚期收获培养上清液，该时期是参考分批培养过程的延迟期和稳定期之间的时间的后半段而定义；(c) 任选地自上清液中去除低分子量成分，从而保留超过5-6千道尔顿(kDa)的分子量成分；(d) 自培养上清液中去除液体含量，从而得到组合物。
培养上清液可包含自指数期晚期收获的分泌物。指数期晚期发生在指数期中期之后的时间内(所述指数期中期是指数期持续时间的一半时间，因此当提到指数期晚期时是指延迟期和稳定期之间的后半段时间)。具体地讲，本文使用的术语“指数期晚期”是指LGG分批培养过程的延迟期和稳定期之间的后四分之一的时间。在某些实施方案中，在指数期持续时间的75%-85%的时间点收获培养上清液，并且可以在指数期经过的时间的约5/6时进行收获。
注意，所公开的营养组合物可包含ß-葡聚糖源。葡聚糖是多糖，尤其是葡萄糖的聚合物，其可为天然存在的且可存在于细菌、真菌、酵母和植物的细胞壁中。β葡聚糖(β-葡聚糖)本身为葡萄糖聚合物的不同亚类，所述葡萄糖聚合物由葡萄糖单体链组成，其通过β型糖苷键连接在一起以形成复合碳水化合物（complex carbohydrates）。
β-1,3-葡聚糖是从例如酵母、蕈类、细菌、藻类或谷类中纯化得到的碳水化合物聚合物。β-1,3-葡聚糖的化学结构取决于β-1,3-葡聚糖的源。此外，各种生理化学参数，例如溶解度、一级结构、分子量和分支，在β-1,3-葡聚糖的生物活性中发挥作用。(Yadomae T., 真菌β-1,3-葡聚糖的结构和生物活性 (Structure and biological activities of fungal beta-1,3-Glucans). Yakugaku Zasshi. 2000；120:413-431.)
β-1,3-葡聚糖为天然存在的具有或不具有各种植物、酵母、真菌和细菌细胞壁中存在的β-1,6-葡萄糖侧链的多糖。β-1,3；1,6-葡聚糖为包含具有在(1,6)位连接的侧链的以(1,3)连接的葡萄糖单元的那些。β-1,3；1,6葡聚糖为共享结构共性的葡萄糖聚合物的异质组，包括由β-1,3键连接的直链葡萄糖单元主链，和自该主链延伸出的β-1,6连接的葡萄糖分支。虽然这是现在描述的β-葡聚糖类型的基本结构，但可存在一些变更。例如，某些酵母β-葡聚糖具有延伸自β(1,6)分支的β(1,3)分支额外区域，其进一步增加其相应的结构的复杂性。
衍生自面包酵母、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的β-葡聚糖由连接在1和3位的D-葡萄糖分子链组成，其具有连接在1和6位的葡萄糖侧链。酵母-衍生的β-葡聚糖为不溶的、纤维样复合糖，其具有以下通用结构：具有β-1,3主链的直链葡萄糖单元，其散布有长度通常为6-8个葡萄糖单元的β-1,6侧链。更特别地，衍生自面包酵母的β-葡聚糖为聚-(1,6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1,3)-β-D-吡喃葡萄糖。
此外，β-葡聚糖在小儿受试者中耐受良好且不产生或导致过量气体、腹胀、胃气胀或腹泻。将β-葡聚糖加入用于小儿受试者的营养组合物，例如婴儿配方、成长乳或另一儿童营养产品，会通过增加抗入侵病原体的抵抗力改善受试者的免疫应答并因此维持或改善总体健康。
在某些实施方案中，β-葡聚糖在营养组合物中的量为约3 mg/100 kcal-约17 mg/100 kcal。在另一实施方案中，β-葡聚糖的量为约6 mg/100 kcal-约17 mg/100 kcal。
在一些实施方案中所述营养组合物可包含β-1,3；1,6-葡聚糖。β-1,3；1,6-葡聚糖可衍生自面包酵母。营养组合物可包含完整葡聚糖颗粒β-葡聚糖、颗粒状β-葡聚糖、PGG-葡聚糖(聚-(1,6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1,3)-β-D-吡喃葡萄糖)或其任何混合物。
本文所述的公开的营养组合物，在一些实施方案中也可包含有效量的铁。铁可包括包封的铁形式，例如包封的富马酸亚铁或包封的硫酸亚铁或较低反应性的铁形式，例如焦磷酸铁或正磷酸铁。
所公开的营养组合物可以以本领域已知的任何形式来提供，例如粉剂、凝胶剂、混悬剂、糊剂、固体、液体、液体浓缩物、可重构的粉状乳替代物或即用型产品。营养组合物，在某些实施方案中，可包含营养补充剂、儿童营养产品、婴儿配方、人乳强化剂、成长乳或针对婴儿或小儿受试者设计的任何其它营养组合物。本公开内容的营养组合物包括例如，口服可摄取的、健康促进物质，其包括例如食品、饮料、片剂、胶囊剂和粉剂。此外，本公开内容的营养组合物可针对具体卡路里含量进行标准化，其可作为即用型产品提供，或其可以浓缩的形式提供。在一些实施方案中，营养组合物呈粉末形式，其粒径范围为5 μm-1500 μm、更优选范围为10 μm-300 μm。
如果营养组合物呈即用型产品形式，营养组合物的渗透度可以是约100-约1100 mOsm/kg水，更典型地约200-约700 mOsm/kg水。
在某些实施方案中，所述营养组合物是低变应原的。在其它实施方案中，所述营养组合物是犹太教允许的和/或伊斯兰律法合法的。在再进一步的实施方案中，所述营养组合物含有非遗传修饰的成分。在一个实施方案中，所述营养配方是无蔗糖的。所述营养组合物也可以是无乳糖的。在其它实施方案中，所述营养组合物不含任何中链甘油三酯油。在一些实施方案中，组合物中不存在角叉菜胶。在其它实施方案中，所述营养组合物不含所有树胶。
本公开内容的营养组合物不限于包含本文具体列出的营养物的组合物。任何营养物都可以作为组合物的一部分而递送，用于满足受试者的营养需要和/或为了优化受试者的营养状况的目的。
此外，在某些实施方案中，所述营养组合物是营养完全的，其含有作为受试者的唯一营养源的合适种类和含量的脂质、碳水化合物、蛋白、维生素和矿物质。的确，所述营养组合物可以任选地包括任何数量的蛋白、肽、氨基酸、脂肪酸、益生菌和/或它们的代谢副产物、益生元、碳水化合物和可为受试者提供许多营养益处和生理益处的任何其它营养物或其它化合物。此外，本公开内容的营养组合物可包含调味剂、增味剂、甜味剂、色素、维生素、矿物质、治疗用成分、功能食品成分、食品成分、加工成分或其组合。
本公开内容的营养组合物可针对具体卡路里含量进行标准化，其可作为即用型产品提供，或其可以浓缩的形式提供。
在某些实施方案中，本公开内容的营养组合物是成长乳。成长乳是基于强化乳的饮料，其意图用于超过1岁的儿童(一般为1-3岁、4-6岁或1-6岁)。它们不是医用食物并且不意图作为膳食替代或用以解决具体营养缺乏的补充剂。相反，意图用作不同饮食的补充剂，将成长乳设计为提供额外的保障，其使得儿童实现对所有必需维生素和矿物质、大量营养物加上额外功能性饮食组分(例如具有声称的健康-促进性质的非必需营养物)的连续的每日摄入。
本公开内容的营养组合物的准确组成可以因不同市场而变，取决于地方法规和目标人群的饮食摄入信息。在某些实施方案中，本公开内容的营养组合物由以下组成：乳蛋白源，例如全乳或脱脂乳，加上用以达到所期需的感官性质而添加的糖和甜味剂，和添加的维生素和矿物质。脂肪组成通常源自乳原料。可将总蛋白的指标定为匹配人乳、牛乳或较低值。通常将总碳水化合物的指标定为提供尽可能少的添加的糖，例如蔗糖或果糖，以达到可接受的口味。典型地，以匹配地区牛乳的营养贡献的水平添加维生素A、钙和维生素D。另外，在某些实施方案中，可以提供约20%的饮食参考摄取(DRI)或20%的每日值(DV)/份的水平添加维生素和矿物质。此外，营养价值可以因市场不同而变化，取决于预期人群的经鉴定的营养需求、原料的贡献和地区法规。
一种或多种维生素和/或矿物质也可以足以供应受试者的每日营养需求的量加入营养组合物中。本领域普通技术人员应理解，维生素和矿物质需求会例如根据儿童年龄而变化。例如，婴儿可以具有与1-13岁儿童不同的维生素和矿物质需求。因此，实施方案无意将营养组合物限制于特定的年龄组，而是提供了可接受的维生素和矿物质组分的范围。
在为儿童提供营养组合物的实施方案中，所述组合物可以任选地包括但不限于，下列维生素或其衍生物的一种或多种：维生素B1 (硫胺素、焦磷酸硫胺素、TPP、三磷酸硫胺素、TTP、盐酸硫胺素、一硝酸硫胺素)、维生素B2 (核黄素、黄素单核苷酸、FMN、黄素腺嘌呤二核苷酸、FAD、乳黄素、卵黄素)、维生素B3 (尼克酸、烟酸、烟酰胺、尼克酰胺、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、NAD、烟酸单核苷酸、NicMN、吡啶-3-甲酸)、维生素B3-前体色氨酸、维生素B6 (吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、盐酸吡哆醇)、泛酸(泛酸盐、泛醇)、叶酸盐(叶酸、叶酸（folacin）、蝶酰谷氨酸)、维生素B12 (钴胺素、甲基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素、氰钴胺、羟钴胺素、腺苷钴胺素)、生物素、维生素C (抗坏血酸)、维生素A (视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酸酯、具有与其它长链脂肪酸形成的视黄酯、视黄醛、视黄酸、视黄醇酯)、维生素D (钙化醇、胆钙化醇、维生素D3、1,25,-二羟维生素D)、维生素E (α-生育酚、α-生育酚乙酸酯、α-生育酚琥珀酸酯、α-生育酚烟酸酯、γ-生育酚)、维生素K (维生素K1、叶绿醌、萘醌、维生素K2、甲基萘醌-7、维生素K3、甲基萘醌-4、甲萘醌、甲基萘醌-8、甲基萘醌-8H、甲基萘醌-9、甲基萘醌-9H、甲基萘醌-10、甲基萘醌-11、甲基萘醌-12、甲基萘醌-13)、胆碱、肌醇、β-胡萝卜素及其任何组合。
在提供儿童营养产品例如成长乳的实施方案中，所述组合物可以任选地包括但不限于，下列矿物质或其衍生物的一种或几种：硼、钙、醋酸钙、葡萄糖酸钙、氯化钙、乳酸钙、磷酸钙、硫酸钙、氯化物、铬、氯化铬、吡啶甲酸铬(chromium picolonate)、铜、硫酸铜（copper sulfate）、葡萄糖酸铜、硫酸铜(cupric sulfate)、氟化物、铁、羰基铁、三价铁、富马酸亚铁、正磷酸铁、铁研制剂(iron trituration)、多糖铁、碘化物、碘、镁、碳酸镁、氢氧化镁、氧化镁、硬脂酸镁、硫酸镁、锰、钼、磷、钾、磷酸钾、碘化钾、氯化钾、醋酸钾、硒、硫、钠、多库酯钠、氯化钠、硒酸钠、钼酸钠、锌、氧化锌、硫酸锌及其混合物。矿物质化合物的非限制性示例性衍生物包括任何矿物质化合物的盐、碱性盐、酯和螯合物。
矿物质可以以盐例如磷酸钙、甘油磷酸钙、柠檬酸钠、氯化钾、磷酸钾、磷酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸镁和亚硒酸钠的形式添加至成长乳或其它儿童营养组合物中。可添加本领域已知的额外的维生素和矿物质。
在一个实施方案中，儿童营养组合物每份可包含任何给定的国家的最大饮食推荐量的约10-约50%或一组国家的平均饮食推荐量的约10-约50%的维生素A、C和E、锌、铁、碘、硒和胆碱。在另一个实施方案中，儿童营养组合物每份可供给任何给定的国家的最大饮食推荐量的约10-30%或一组国家的平均饮食推荐量的约10-30%的维生素B。在再一个实施方案中，儿童营养产品中的维生素D、钙、镁、磷和钾的水平可与乳中存在的平均水平一致。在其它实施方案中，儿童营养组合物中的其它营养物可以以任何给定国家的最大饮食推荐量的约20%或一组国家的平均饮食推荐量的约20%每份存在。
营养组合物可以任选地包括下列调味剂中的一种或多种，其包括但不限于：调味提取物、挥发油类、可可或巧克力调味剂、花生酱调味剂、饼干屑、香草或任何可市售获得的调味剂。有用的调味剂的实例包括，但不限于，纯茴香提取物、仿香蕉提取物、仿樱桃提取物、巧克力提取物、纯柠檬提取物、纯橙子提取物、纯薄荷提取物、蜂蜜、仿菠萝提取物、仿朗姆酒(imitation rum)提取物、仿草莓提取物、葡萄或葡萄籽提取物、苹果提取物、覆盆子提取物或香草提取物；或挥发油类，例如蜂蜜花油、月桂油、香柠檬油、柏木油、樱桃油、肉桂油、丁香油或薄荷油；花生酱、巧克力调味剂、香草饼干屑、奶油硬糖、太妃糖，及其混合物。调味剂的量可变化很大，这取决于使用的调味剂。可依照本领域已知选择调味剂的类型和量。
营养组合物可以任选地包括一种或多种可添加用于稳定最终产品的乳化剂。合适的乳化剂的实例包括但不限于，卵磷脂(例如来自鸡蛋或大豆或任何其它植物和动物源)、α乳清蛋白和/或甘油单酯和甘油二酯，及其混合物。其它乳化剂对于技术人员是容易地显而易见的，合适乳化剂的选择将部分取决于配方和终产品。
所述营养组合物可以任选地包含一种或多种也可添加以延长产品货架期的防腐剂。合适的防腐剂包括但不限于，山梨酸钾、山梨酸钠、苯甲酸钾、苯甲酸钠、EDTA钙二钠，及其混合物。
营养组合物可以任选地包含一种或多种稳定剂。用于实施本公开内容的营养组合物的合适的稳定剂包括但不限于，阿拉伯树胶、茄替胶、刺梧桐胶、西黄蓍胶、琼脂、帚叉藻聚糖、瓜尔豆胶、结冷胶、槐豆胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶、微晶纤维素、CMC (羧甲基纤维素钠)、甲基纤维素羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、DATEM (甘油单酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯)、葡聚糖、角叉菜胶、CITREM (脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯)及其混合物。
本公开内容进一步提供通过向目标受试者提供包含ALA的营养组合物促进脑和神经系统健康的方法。不受任何具体理论束缚，认为提供包含ALA的营养组合物将促进总体神经元健康和/或发育。在一些实施方案中，所提供的营养组合物进一步包含DHA。
在一些实施方案中目标受试者可为小儿受试者。此外，在一个实施方案中，提供给小儿受试者的营养组合物可为婴儿配方。又在一些实施方案中，加入婴儿配方中的ALA可选自特定的源并且其浓度可经调节而使健康益处最大化。在此方法的另一个实施方案中，提供给小儿受试者的包含ALA的营养组合物为成长乳。
在另一个实施方案中所述营养组合物可提供给曾患有、当前患有或未来可能患有脑和/或神经系统损伤的目标受试者。在又一个实施方案中，所述包含ALA的营养组合物可被提供给任何目标受试者以促进神经保护。在又其它的实施方案中，所述方法涉及通过向怀孕和哺乳母亲提供包含ALA的营养组合物以促进胎儿的神经元活动。另外，如本文所述的包含ALA的营养组合物可向目标受试者提供神经学营养补充源。
本公开内容进一步提供促进神经元健康和/或发育，以及本文列举的其它益处的方法，其包括给予受试者有效量的本公开内容的营养组合物。所述营养组合物可直接排入受试者肠道内。在一些实施方案中，所述营养组合物被直接排入肠内。在一些实施方案中，所述组合物可配制为肠内消耗或给予。
在一些实施方案中，本文的方法包括通过给予目标受试者包含ALA的营养组合物以促进神经元网络活性。在一些实施方案中，所述营养组合物还可包含DHA、乳铁蛋白及其混合物。还提供了加速目标受试者中神经元活动发展的方法，该方法包括提供本文所述的包含ALA的营养组合物。此外，提供给目标受试者的营养组合物可包含DHA、乳铁蛋白及其组合。
又在一些实施方案中，本公开内容提供经由给予目标受试者包含ALA和DHA的营养组合物加强神经学电化学连接的方法。目标受试者可包括婴儿或小儿受试者，并且可进一步包括胎儿。在其中目标受试者为胎儿的实施方案中，母亲可摄入所述营养组合物，包括但不限于如本文所描述的产前营养组合物。另外，在一些实施方案中，胎儿出生后，哺乳母亲可摄入本文所公开的包含ALA的营养组合物，用于加速母乳喂饲的婴儿的神经元活动发展。
本公开内容的方法涉及提供本文所述的营养组合物，向其目标受试者递送增强的神经学营养和健康益处。为了特定的神经学疾病或向特定的目标受试者提供本文所述营养组合物的方法的公开内容不欲为限制性的，相反其进一步用作这样的实例，在其中本文所述营养组合物的给予可以是适当的。
实施例
提供实施例以说明本文所述营养组合物中包含的营养素的神经元作用。简言之，当根据本文所述的程序将神经元干细胞暴露于α-硫辛酸、DHA及其组合时采集神经元活动模式。这些实施例不应解释为对本文所公开营养组合物的任何限制，而是用作本文所述营养组合物加速神经元活动和促进神经元突触活性的说明。说明书，连同实施例一起，意在考虑为仅示例性的，本公开内容的范围和精神由接在实施例之后的权利要求指示。
实施例 1
本实施例描述ALA单独和与DHA协同对神经元网络的急性功能作用。结果表明了ALA调节神经元网络活性的能力，其通过当向培养物施用ALA和/或DHA时神经元活动模式的即时反应显示。
不受任何具体理论束缚，实施例1中描述的体外性质将转化为体内作用，即调节脑功能例如突触强度的能力。此外，ALA和DHA二者的有效浓度的计算及其协同效能可转化为体内情况。
ALA购自Sigma-Aldrich®, St. Louis, Missouri (#T1395, Lot 071M0191V, CAS No. 1077-28-7)。将ALA 100%稀释（diluted in 100%）成100 mM的储存液并储存在-20℃。
DHA购自Sigma-Aldrich®, St. Louis, Missouri (#D2534, Lot SLBB6915V, CAS No. 6217-54-5)。将DHA 100%稀释至100 mM的储存液并储存在-20℃。
人重组脑源性神经营养因子(“hBDNF”)购自PeproTech, (#450-02, Lot 051061)。将hBDNF在水中稀释至100 µg/mL储存液浓度，并储存在-20℃。
实验根据SOP，“SOP制备额皮质小鼠-血清(Rev. 07 2012-03-06 eng)”、“SOP神经元细胞培养溶液(Rev. 04 2009-11-18 eng)”、“SOP MEA清洗和底物制备 (Rev. 03 2009-05-26 eng)”、“SOP 饲喂神经元细胞培养物”、“SOP细胞培养制备MEA”、“SOP Plexon记录”和“SOP Plexon数据分析”进行。
微电极阵列神经芯片(“MEA神经芯片”)由北德克萨斯大学的网络神经科学中心(CNNS)提供。这些5x5 cm2的玻璃芯片具有二元记录矩阵和氧化铟锡导线，每个矩阵32个无源电极（passive electrodes）。疏水绝缘材料表面被通过不锈钢罩(stainless steel mask)的短暂的丁烷焰脉冲活化。因此，确保了细胞附着在以电极阵列为中心的直径5 mm的限定区域上。用25 µg/mL聚-D-赖氨酸(30-70kD)包覆活化面区域并孵育过夜，临制备前在16 µg /mL层粘连蛋白中孵育3小时（The activated face regions were coated with 25 µg/mL poly-D-lysine (30-70kD) and incubated overnight in 16 µg /mL laminin for 3 hours right before the preparation.）。
额皮质组织从胚胎15天的chr:NMRI小鼠采集。根据德国动物保护法第4部分通过颈脱位法处死小鼠。将MEA上的培养物在10% CO2气氛中于37℃孵育直至使用，这通常为接种后4周到三个月。培养基每周用包含10%热灭活的马血清的DMEM添足两次。接种后第5天时用有丝分裂抑制剂5-氟-2’-脱氧尿苷(25 μM)和尿苷(63 μM)处理发展中的共培养物48小时以防止进一步的神经胶质增殖。
4周后建立了稳定的活性模式之后，使用MEA芯片上的神经元网络进行物质检验。对于该实施例，使用25-38天的体外培养物。对于胞外记录，将MEA神经芯片放置入无菌恒槽记录室中并维持在37℃。记录在包含10%热灭活马血清的DMEM中进行。用一股连续的经过滤、增湿的含有10% CO2的气流将pH维持在7.4。将前置放大器装置放置在记录室的任一侧。用多通道采集处理器系统，一种提供微电极信号的可编程放大、过滤、转换和数字信号处理的计算机控制的64-通道放大器系统(Plexon, Inc., Dallas, TX, USA)进行记录。使用的总系统增益为10 K，同步的采样速率为40 kHz。这些神经芯片日常记录的信号位于15-1800 microV的范围内。
多通道信号采集系统递送单个神经元峰电位数据。峰电位鉴定和分离用温度-匹配算法实时完成。这允许同时从最多256个神经元胞外记录动作电位。
动作电位，或峰电位，以峰电位序列的形式记录并且以所谓的爆发的形式簇集。爆发经由使用程序NeuroEXplorer (Plexon Inc., Dallas, TX, USA)和内部程序的直接峰电位序列分析定量描述。爆发由短峰电位事件(invents)的开始和结束界定。界定爆发的开始的最大峰电位间隔为40 ms，结束爆发的最大间隔为200 ms（maximun intervals to end a burst from 200ms）。
在整个实验中所有化合物记录含有0.1%的固定的DMSO浓度。由于α-硫辛酸在约100 μM-5 mM的浓度下进行调查这一事实，溶剂浓度达到0.7%。因此，这些溶媒浓度还在单独实验中进行检验，其用作溶媒对照。对于DHA和hBDNF而言DMSO浓度不超过0.1%。由于在所需的最高DMSO浓度方面α-硫辛酸为限制性化合物，下表1显示了α-硫辛酸的化合物施用方案。
表 1. α-硫辛酸的化合物施用方案
观察到当使用1 M储存浓度时在三个最高浓度发生α-硫辛酸的沉淀。稀释期间其它化合物无一显示如此。所有化合物的工作液均在各实验当日新鲜制备并将0.9-10 μL施用于1 mL实验槽溶液中。
网络活性模式的高内涵分析（high content analysis）提供了多参数描述，其特征是按以下四个活性分类：一般活性、爆发结构、同步性和振荡性质。例如，一般活性包括，但不限于，峰电位率、爆发率、爆发周期、爆发中峰电位的百分比及其组合。爆发结构包括爆发中峰电位的数目、频率和ISI、爆发持续时间、振幅、面积、坪位置和坪持续时间。同步性一般描述为作为同步化强度的指示物的网络内的变分，包括但不限于，单形同步化和同步爆发中的单元的百分比。振荡性质或振荡包括作为振荡强度的指示物的随时间的变分。这包括但不限于适应自相关图的Bagor功能参数。
从峰电位序列确定了这四个分类的总共200个活性描述性峰电位序列参数。将所有化合物诱导的网络活性针对相关的自发性天然活性标准化，对于每个实验将相关的自发性天然活性设置为100%。值来源于取自活性稳定30 min后的30分钟跨度的60 sec仓数据(bin data)。从每个网络，同时记录14-72个分开的神经元。另外基于描述四个分类（一般活性、爆发结构以及振荡和同步性性质）的60个参数的核心集合计算所有的检验化合物和溶媒对照的浓度应答曲线。
对于此实施例，“单元”通常指在单个电极上记录的源自一个神经元的活性单元。通常，单元在记录开始时是分开的。
为了界定各个爆发，在NPWaveX中执行若干算法用于爆发检测。例如，在一些实施例中首先执行在Neuroexplorer Softward中执行的以及应用峰电位间的间隔的Nex ISI方法以用上述参数界定爆发。利用如Guenter Gross和其他人所定义的使用快和慢积分二者的积分方法鉴定快和慢积分曲线的交叉，从而界定爆发的开始和结束。还利用使用临近峰电位序列事件与泊松过程相比的不可信性的爆发意外鉴定爆发的特征（Burst surprise, which uses the unlikelihood of events of a close spike sequence in comparison to a Poisson process, was also utilized to identify the characteristics of a burst）。另外，爆发界定进一步通过和函数计算和鉴定，其将峰电位序列转换为连续函数。
对于Nex ISI方法爆发通过下列参数界定：爆发中的最大峰电位间间隔为0.04 ms，最大结束间隔为200 ms，爆发之间的最小间隔为100 ms，爆发的最小持续时间为0.0001 s，以及爆发中峰电位的最小数目为2。
如本实施例中所使用的“变分系数”或“CV”为标准偏差与平均值的商。
“CVtime”反映每个单元的活性模式的时间规律。CVtime通过参数的标准偏差与均值的比率计算。CVtime是对整个网络平均的。低CVtime值指示更规则的峰电位序列模式，这意味着更强的振荡。
“CVnet”反映网络内神经元之间的同步化。CVnet通过关于网络的参数标准偏差与均值的比率来计算。大CVnet值暗示整个网络活性的广泛范围的变化，这意味着较低的同步化。
图1图解了一些爆发参数。爆发参数在本文中进一步定义。
对于每个单元从峰电位序列数据产生自相关图。参见图2。自相关图通过相关爆发的峰值振幅(在图2中作为Y1示出)和第一个峰与第二个峰之间的最小值(在图2中作为Y2示出)限定，通过大量爆发间峰电位（mumber of interburst）和下一个峰 (在图2中作为Y3显示)限定，通过下一个连续爆发限定。因此，计算了三个不同的角度。例如，低Y2为低爆发间峰电位形成的量度。在图2中示出的左侧的自相关图为显示规则的振荡峰电位序列性质的单元的实例。
一般而言神经元网络表征为一组描述神经元一般活性的参数。尽管下列分类不直接对应神经生物学中已知的分类，然而，其确实提供了内部分类，所述内部分类提供了大体取向（general orientation）。因此，更高的粒度（granularity）是可能的。
包含在一般活性分类中的参数包括，但不限于，以下：峰电位率、爆发率、峰电位衬比度(spike contrast)、爆发周期、和爆发周期、爆发间间隔、和爆发间间隔、爆发意外、爆发内峰电位的百分比、事件率和事件周期。这些参数在本文中进一步定义。
“峰电位率”，缩写为“SpRate”，为关于记录的所有峰电位序列平均的每分钟的峰电位数目。
“爆发率”，缩写为“BrstRate”，为关于记录的所有单元平均的每分钟爆发的数目，每个单元的爆发数目的量度。
“峰电位衬比度”，本文缩写为“SpCont”，描述峰电位序列邻近时间段中峰电位的发生或不发生，反映实验事件内单元爆发(burstiness)的变异性。
爆发周期，本文缩写为“BrstPer”，为连续爆发的开始之间的距离。爆发周期等于爆发持续时间加爆发IBI。
“和爆发周期”，本文缩写为“SummeBrstPer”，为连续爆发之间的距离，包括在和函数上进行的爆发检测。SumBurst为另一个检测爆发的技术。爆发周期一般等于爆发持续时间加爆发IBI。
“爆发间隔”，本文缩写为“BrstIBI”，为从前次爆发的结束至下次爆发开始估计的连续爆发之间的时间。对于此实施例，爆发间隔以毫秒(ms)测量。
“和爆发间隔”，本文缩写为“SumBrstIBI”，为在和函数算法上进行的爆发检测。
“爆发意外”，本文缩写为“BrstSrp”，为峰电位分布的非-随机性的量度。具有高爆发活性和低爆发间峰电位数目的单元显示较高的爆发意外值。爆发意外0反映峰电位间隔的泊松分布(ISI通过指数函数描述)。
“爆发中峰电位的百分比”，本文缩写为“BrstPercSpinBrst”，为爆发内峰电位关于实验事件中记录的所有峰电位的百分比。
“事件率”，缩写为“EvRate”，为每分钟的事件数目。事件被定义为在300 ms的时帧内网络中所有单元的至少50%的同步爆发活性。
“事件周期”，本文中缩写为“EvPrd”，为连续爆发事件之间的距离，包括但不限于，在300 ms的时帧内网络中单元的至少70%同步爆发。
爆发结构分类中包含的参数包括，但不限于，以下：爆发持续时间、爆发振幅、爆发面积、爆发峰电位数目、爆发中的最大峰电位率、爆发峰电位间间隔、爆发峰频率、爆发峰电位密度、爆发峰电位率、爆发坪、爆发形状慢(burst shape slow)、爆发形状快(burst shape fast)、爆发形状多重(burst shape multiple)、爆发形状距离 (burst shape distance) 3、爆发形状三角(burst shape triangle) 3、爆发形状计数(burst shape count) 3、爆发形状Y3/Y1、爆发坪位置和爆发坪分数。这些参数在本文中进一步定义。
爆发持续时间，本文缩写为“BrstDur”，意指基于积分算法检测的爆发的长度。在此实施例中，爆发持续时间以毫秒(ms)测量。
爆发振幅，本文缩写为“BrstAmpl”，为用积分函数在数学上叠加的爆发。积分通过爆发内的峰电位峰密度和峰电位数目定义。爆发振幅为经积分的爆发的峰振幅，其反映具有最高峰电位密度的爆发分数。
爆发面积，本文缩写为“BrstArea”，为将爆发积分之后的曲线下的面积，由爆发持续时间、爆发中的峰电位数目、爆发中的峰电位频率限定。
爆发峰电位数目，本文缩写为“BrstSpNmbr”，为爆发内的峰电位的平均数目。
爆发中的最大峰电位率，本文缩写为“BrstSpMaxRate”，为用装箱法(binning method)计算的爆发内的最大峰电位率。
爆发峰电位间隔，本文缩写为“BrstISI”，为爆发中连续峰电位之间的平均时间。
爆发峰频率，本文缩写为“BrstPeakFrq”，为爆发内的峰峰电位频率(Hz)的均值，通过爆发中两个连续峰电位之间的最短距离(时间)定义。
爆发峰电位密度，本文缩写为“BrstSpDens”，为爆发内的峰电位的平均频率(Hz)，通过爆发中所有峰电位间间隔的平均值定义。若爆发中峰电位的数目增加或爆发持续时间减少爆发峰电位密度增加。
爆发峰电位率，本文缩写为“BrstSpRate”，为爆发内的平均峰电位率。
爆发坪，本文缩写为“BrstPlat”，为爆发坪的持续时间，取决于峰振幅之后的爆发坪期内的峰电位数目和频率。若爆发坪期期间峰电位数目增加爆发坪增加。
爆发形状慢，本文缩写为“ShSlow”，为短、慢、多重和/或快的爆发分类。慢爆发指示具有缓慢的活动开始的爆发，多重爆发具有两个清楚的极大值，快爆发具有快速的活动开始。爆发形状慢为以活动缓慢开始为特征的爆发分数的量度。
爆发形状快，本文缩写为“ShFast”，为以活动快速开始(爆发开始处高峰电位频率)为特征的爆发分数的量度。
爆发形状多重，本文缩写为“ShMult”，为以爆发内一个以上频率峰为特征的爆发分数的量度。
爆发形状距离3，本文缩写为“ShDist3”，为从爆发开始至爆发内第二个频率极大值的距离。
爆发形状三角3，本文缩写为“ShTriangle3”，为映射到连续函数的爆发的峰电位序列。Triangle3为从第一个极大值后的极小值的坐标到第二个极大值的斜率。爆发形状的量度，反映爆发内第二个峰极大值的存在和振幅。
爆发形状计数3，本文缩写为“ShCount3”，为其中通过使用其重心将每个爆发分为三个区间。该计数为这些区间的每个的峰电位与每个爆发中的峰电位总数的比率。因此，该参数描述爆发内峰电位的分布。
爆发形状Y3/Y1，本文缩写为“ShY3/Y1”，描述第二个与第一个峰频率的比率，假如爆发以两个峰为特征。
爆发坪位置，本文缩写为“BrstPlatPos”，指示从爆发开始至爆发坪开始的潜伏时间。
爆发坪分数，本文缩写为“BrstPlatFrac”，为爆发坪关于整个经积分爆发的持续时间的分数百分比，取决于爆发峰振幅、爆发持续时间、爆发中的峰电位频率。若爆发在其结构上变得更规则，该值增加。
振荡或振荡性质分类包含的参数包括，但不限于，以下：峰电位率SD、爆发率SD、爆发振幅SD、爆发面积SD、爆发峰电位率SD、爆发坪SD、爆发中的最大峰电位率(SD)、爆发意外SD、爆发峰频率SD、爆发峰电位数目SD、爆发峰电位密度SD、峰电位衬比度SD、爆发周期SD、爆发IBI SD、爆发持续时间SD、爆发坪位置SD、爆发形状慢SD、爆发形状快SD、爆发形状多重SD、Gabor Y3/Y1和Gabor Y1。这些参数在本文中进一步定义。
峰电位率SD，本文缩写为“SpRate SD”，为每分钟的峰电位数目的标准偏差，指示实验事件内峰电位率的变异性。
爆发率(SD)，本文缩写为“BrstRate SD”，为每分钟的爆发数目的标准偏差，指示实验事件内单元的爆发的变异性。
爆发振幅(SD)，本文缩写为“BrstAmpl SD”，为经积分的爆发的峰振幅的标准偏差。较低的值反映记录事件期间稳定的爆发结构，伴有更规则/振荡的爆发性质。
爆发面积(SD)，本文缩写为“BrstArea SD”，为将爆发积分之后的曲线下的面积的标准偏差，其由爆发持续时间、爆发中的峰电位数目、爆发中的峰电位频率限定。该参数描述实验事件内爆发面积的变异性。较高的值指示较不规则的爆发结构。
爆发峰电位率(SD)，本文缩写为“BrstSpRate SD”，为爆发内峰电位率的标准偏差。较高的值指示较不规则的爆发结构。
爆发坪SD，本文缩写为“BrstPlat SD”为爆发坪振幅的标准偏差。较低的值反映记录事件期间稳定的爆发结构，伴有更规则/振荡的爆发性质。
爆发中最大峰电位率(SD)，本文缩写为“BrstSpMaxRate SD”，为爆发中最大峰电位率的标准偏差。较低的值反映记录事件期间更稳定的峰电位最大发放率分布，伴有更规则/振荡的爆发结构。
爆发意外(SD)，本文缩写为“BrstSrpr SD”，为爆发中或爆发之间峰电位分布的标准偏差。峰电位分布变异性的量度。较低的值反映爆发中或爆发间更稳定的峰电位分布，其通过爆发意外的值反映。
爆发峰频率(SD)，本文缩写为“BrstPeakFrq SD”，为爆发中单一单元峰电位峰频率的标准偏差。较低的值为爆发峰频率的较高规则性的量度，伴有实验事件内较高的爆发结构规则程度。
爆发峰电位数目(SD)，本文缩写为“BrstSpNmbr SD”，为描述实验事件内爆发中单一单元峰电位数目的变异性的爆发中峰电位数目的标准偏差。较低的值为较低的爆发峰电位数目变异度的量度，伴有更规则的爆发结构。
爆发峰电位密度(SD)，本文缩写为“BrstSpDens SD”，为爆发峰电位密度的标准偏差，反映实验事件内网络的所有爆发中的峰电位频率的变异性。
峰电位衬比度(SD)，本文缩写为“SpCont SD”，为峰电位衬比度的标准偏差，反映实验事件内单元的爆发的变异性。
爆发周期(SD)，本文缩写为“BrstPer SD”，为爆发周期的标准偏差，反映实验事件内连续爆发之间的单一单元距离的变异性。较低的值反映爆发结构的较高规则性。
爆发IBI (SD)，本文缩写为“BrstIBI SD”，为爆发间隔的标准偏差，反映实验事件内爆发发生的变异性。
爆发持续时间(SD)，本文缩写为“BrstDur SD”，为爆发持续时间的标准偏差，反映实验事件内爆发持续时间的变异性。
爆发坪位置(SD)，本文缩写为“BrstPlatPos SD”，为爆发坪位置的标准偏差。爆发坪位置指示从爆发开始至爆发坪开始的潜伏时间。较高的SD值反映实验事件内较高的爆发结构变异性。
爆发形状慢(SD)，本文缩写为“ShSlow SD”，为以行为缓慢开始为特征的爆发分数的标准偏差。较高的值指示实验事件内较高的爆发形状变异性。
爆发形状快(SD)，本文缩写为“ShFast SD”，为以行为快速开始为特征的爆发分数的标准偏差。较高的值指示实验事件内较高的爆发形状变异性。
爆发形状多重(SD)，本文缩写为“ShMultSD”，为以爆发中多重频率峰电位为特征的爆发分数的标准偏差。较高的值指示实验事件内较高的爆发形状变异性。
Gabor Y3/Y1，本文缩写为“gabor Y3/Y1”，为自相关图的第二个与第一个极大值振幅的比率，其通过Gabor函数拟合。较低的值指示爆发发生的较高规则性。
Gabor Y1，本文缩写为“gaborY1”，为自相关图的第一个极大振幅，其通过Gabor函数拟合，反映爆发中峰电位的数目和频率。较高的值为爆发中较大的峰电位数目和峰电位频率的量度。
同步性分类通常是指显示细胞培养物中神经元之间的连接性和同步化二者以及在发育和药物治疗二者期间可如何修饰该连接性和同步化的参数。同步性描述参数通过使用关于网络但针对不同爆发描述参数的变异系数指示神经元同步化的变化。同步性分类中包含的参数包括，但不限于，以下：同步性共享、爆发同步性全体(burst synchronicity all)、峰电位单形(spike simplex)、爆发率CVnet、爆发中峰电位的百分比CVnet、爆发峰频率CVnet、爆发面积CVnet、事件周期SD和峰电位率CVnet。这些参数在本文中进一步定义。
同步性共享，本文缩写为“SynShare”，为群体爆发中涉及的单元的平均数目。较高的值反映单元之间较高的同步性程度。
爆发同步性全体，本文缩写为“SynAll”，定义为群体爆发中爆发到群体爆发中心的平均距离。SynAll为网络同步性强度的量度。
峰电位单形，本文缩写为“SimplexSpSimplex”，为其中将峰电位序列分入1 ms箱子-大小的时帧的计算。在那些箱子内网络内的不同单元产生峰电位。定义所有显示峰电位的单元为一个单形。所有单形的数量的输出为峰电位单形。其为神经元网络中连接性和复杂性的量度。较高的值反映神经元之间较高的同步性。
爆发率(CVnet)，本文缩写为“BrstRateCVnet”，为实验事件期间关于网络的爆发率的反映变分。
爆发中峰电位百分比(CVnet)，本文缩写为“BrstPercSpinBrst CVnet”，为爆发中峰电位百分比的CVnet，反映关于于整个网络的实验事件内所有峰电位的爆发间隔内的峰电位分数的变分。该参数的减小反映网络内同步化的增加。
爆发峰频率(CVnet)，本文缩写为“BrstPeakFrqCVnet”，为爆发中峰电位峰频率的CVnet，反映关于整个网络的实验事件内的峰频率的变分。该参数的减小反映网络内同步化的增加。
爆发面积(CVnet)，本文缩写为“BrstArea CVnet”，为将爆发积分之后的曲线下面积的CVnet，由爆发持续时间、爆发中峰电位的数目、爆发中的峰电位频率定义。该参数描述实验事件内爆发面积的网络变异性。较高的值指示网络之中较高的爆发结构变异性。
事件周期(SD)，本文缩写为“EvPrdSD”，为事件周期的标准偏差，反映连续事件(在300 ms的时帧内至少70%的所有单元同步爆发)之间的距离的变异性。较高的值为较高的事件周期长度变异性的量度并且反映较小的同步性。
峰电位率(CVnet)，本文缩写为“SpRateCVnet”，为峰电位率的CVnet，反映实验事件内峰电位率的网络变异性。该参数的减小指示网络内同步化的增加。
本文所述的四个分类：一般活性、爆发结构、同步性和振荡性质的参数，递送与检验剂对总体网络活性的影响相关的大部分信息。此外，这些参数受已知影响神经元网络的化合物的大多数显著影响，并且表现为这四个活性-描述组内对于前瞻性检验化合物最具描述性的参数。为了可视化，将60个活性描述参数的集合的所有显著变化绘制在热点图(heat map)中。本文中热点图包括关于单一参数的变化的百分比的彩色编码信息。仅将统计上显著的活性变化彩色编码(p ≤ 0.05)。
另外，基于来自该60个参数的数据计算了本文所公开的检验化合物的半最大有效浓度。使用on-反曲或多相-反曲回归分析通过拟合到下列等式分析浓度反应数据：y = y开始+ (y结束 – y开始) / (1 + 10[log(EC50)-log(x)] * HC )。测定的值包括引起最大活性的10%、50%和90%的有效浓度(EC10、EC50和EC90)。一般而言有效浓度为已知与最大作用相比影响给定参数的活性的EC50。此处受影响的参数为峰电位率。EC50对应于其中达到50%的作用的浓度。例如，100 µM DHA/ALA处理时的增加使活性增加至天然活性的约107%。在19.4 µM的ALA浓度时达到该作用的50%，因此对于该例子而言EC50是在19.4µM ALA的浓度时。
因此，在某些实施方案中，最大作用在实验在可能比最大浓度低的浓度下停止的事件中外推。相应地用于计算本文EC50值的等式为：y = y开始 + (y结束 – y开始) / (1 + 10[log(EC50)-log(x)] * HC)。另外，计算拟合浓度应答曲线的斜率，即Hill系数，nH。结果，即参数值，表示为独立网络的均值±SEM。检验了绝对参数的分布的正态性。通过配对学生t-检验评估了化合物-诱导的对天然皮质活性的作用的统计显著性，并通过非配对学生t-检验评估了检验化合物的作用与溶媒诱导的作用。对于这些计算而言，认为P < 0.05为统计显著的。
当在浓度应答实验中急性施用时DHA和ALA二者均影响神经元网络模式。这些作用的定性评估在图3中描绘。简言之，ALA在100 μM - 5 mM的实验浓度时降低总体活性。总体活性的降低明确意味着峰电位率和爆发率的降低。为了不依赖物理参数描述该作用我们将总体活性称作一种现象。
图4中所示的60个参数的定量描述支持定性观察。化合物诱导的对皮质培养物活性的作用以及研究中获得的数据通过用热点图、浓度应答曲线和特征图可视化60个主要的活性描述参数及其部分呈现。
DHA在低至100 pM的浓度时降低峰电位率和爆发率，在更高浓度时作用增加。爆发周期和爆发间隔显示增加，这支持爆发发生的减少。
ALA还减少一般活性，但仅在1 mM以及更高的实验浓度时。在这些浓度时高于0.1%的DMSO不诱导一般活性参数例如峰电位率或爆发率的变化。在检验的最高ALA浓度时还影响爆发结构描述参数例如爆发持续时间或爆发面积。
图4的热点图包括关于单一参数的变化的百分比的彩色-编码信息。对于图4，仅将统计显著的活性变化彩色编码(至少p ≤ 0.05)。此外，图4中图解的为具有60个最具代表性的参数对于每个浓度的显著变化的热点图。活性参数以4个主要分类：一般活性、爆发结构、振荡性质和同步化表征对于7个递增浓度的处理的物质-特异性活性变化。活性参数中的彩色编码变化基于百分比变化。
DHA和ALA二者均显示对神经元网络活性的急性作用。然而，神经活性(neuroactive)的范围显著不同。DHA在非常低的浓度时就已经降低一般活性，参见图5，并连续地减少该活性。因此，与ALA相比，DHA的神经活性范围相对广泛，其范围从纳摩尔至微摩尔浓度。
如图6中的峰电位率拟合所示，ALA在100 μM以上的浓度时影响一般活性。该浓度范围的检验用在100% DMSO中1 M的储存浓度进行。当稀释至终浓度时ALA部分沉淀。因此，不能排除沉淀通过未知的机制影响网络。此外，在累积的物质添加期间DMSO浓度达到0.7%的值。因此，尽管直接比较（参见图8）显示了ALA的显著的物质-特异性作用，仍应将弱DMSO作用考虑在内。
比较DHA和ALA，两种脂肪酸在相同方向但不同的浓度范围中诱导变化。DHA具有比ALA更广的活性范围。例如，ALA的活性范围相当被限制在100 μM以上的浓度。然而，ALA诱导的作用比DHA所诱导的作用更强。例如，ALA和DHA不同地影响最大参数效应大小。在ALA和DHA的最高检验浓度，分别为5 mM和100 μM时，ALA在所有四个活性分类中显示与DHA相比数值上更强的作用。
两种脂肪酸之间的功能差异在图7和8中所呈现的多个其它参数中显示。DHA在该项目所检验的整个浓度范围内主要影响一般活性，但仅微弱影响爆发结构、振荡和同步性参数，参见图7。总之，DHA诱导更高的爆发事件规则性(如由减小的爆发参数的标准偏差所显示的)，同时诱导网络内的同步性(如由爆发事件的较小的单形同步性和较高的网络变分所显示的)，并行地显著减少一般活性(峰电位率、爆发率、峰电位衬比度)。
DHA与ALA酸的组合通过向网络中加入20 μM DHA（加入ALA前预处理）并与ALA单独-处理实验相似地渐增地增加ALA浓度进行。意外地，20 µM DHA的早先添加没有如先前对于DHA浓度反应曲线所讨论的(比较图7中10 μM DHA值与图11中20 μM DHA预处理)影响网络活性。此处，DHA的时间-依赖性作用是该现象最有可能的原因。例如，递增浓度/反应实验中观察到的作用常常与单一浓度实验中所观察到的那些不同。很多时候检验化合物的直接加入将导致与其中多次加入检验化合物的累积递增实验相比更弱的作用。对于该实施例，未调查当跟随相同时间段时单一的20 μM DHA浓度是否最终达到与累积/反应实验中相同的效应大小。正因如此，该观察提示较低的DHA浓度可能足以诱导神经活性反应，这可能与不同浓度时不同的分子动力学相联系（liked）。
尽管存在该偏差，但DHA-预处理诱导与ALA的加入不同的双相反应。在该语境中，双相意指一个参数增加然后接着一个降低。该双相性质主要对于一般活性参数被观察到，其包括，但不限于峰电位率、爆发率和峰电位对比度（spike contract）。例如，与DHA组合的10 - 100 µM ALA诱导一般活性的轻微增加，这以约20 μM的EC50导致活性增加(参见图9)。另外，在100 μM以上的浓度时活性的下降远比ALA单独时浅，如由分别为0.54和1.66的计算的Hill系数(该值越高，斜率约陡)所表明。活性下降的EC50值分别与4.68和5.03 mM 相似(参见图9和10)。值得注意的是同样存在的约100 μM时的活性的柔和倾斜，并且在其它参数分类中统计上证实，参见图11。
总之，与DHA共-处理增加α-硫辛酸对爆发规则性、爆发结构和振荡的作用。因此，DHA为α-硫辛酸的作用加入了新组分。对于此实施例，测定能够通过多参数分析检测协同作用但不一定传达体内信息。此处，DHA和ALA实验中观察到的双相曲线显示10-100 μM的ALA的活性-渐增作用。这对于经历降低的单独的DHA和未提供反应的单独的ALA均未观察到。因此，活性的增加可被视作完全新的作用，其可描述为协同作用。
对于如本文所述的多个其它参数也观察到此DHA与ALA组合的协同作用。例如，一般活性参数：峰电位率、爆发率和爆发意外，同步性参数SynAll、爆发率CVnet、爆发中的爆发百分比峰电位CVnet以及振荡参数爆发周期SD、爆发IBI显著不同并且因此指示协同性质。然而，尽管缺乏统计显著性，本文所利用的多参数投影允许评估与各单独的化合物相比被DHA与ALA的组合不同地影响的众多参数。为了强调这点，其不仅为更高的效应大小，因为这将被认为是累加作用，还是一种新作用。
除了当与20 µM DHA共处理时约100 µM ALA的一般活性的轻微增加，在更低浓度时对爆发事件规则性的作用增加，这导致更高的规则性(爆发峰电位最大发放率SD、爆发振幅)。并行地，网络内的同步性降低(爆发内同步的单元%，单形同步性)(参见图11)。这些增加的作用显示当共施加时DHA与ALA的协同性质，因为单独的DHA不与ALA同样程度地影响爆发结构、振荡和同步性参数。
为了更近地阐明ALA与ALA和DHA组合相比的差异，对于100 μM ALA的浓度应答数据集的一个选定浓度图解了60个参数。该选择基于100 μM ALA与DHA的组合的轻微活性-增加作用。该特征图投影允许对数据的多参数视图。在该浓度时ALA与DHA/ALA-处理的活性模式的功能差异变得明显，并且证明了当与ALA组合时DHA的协同作用。例如，图12显示DHA 20 µM、ALA 100 µM与DHA+ALA (20+100 µM)的比较。该图解描绘了与对照活性相比参数变化的方向。对于DHA和LA的组合，参数变化的方向在多个参数中相反(在图12a中通过蓝色星号示出)，表明了该组合诱导的协同作用。一些参数与单独的LA相似地受到影响(在图12a中通过绿色星号示出)，一些与DHA相似地受到影响(在图12a中作为红色星号示出)，这表明了每种化合物影响各个参数的权重。
如已经提到的，尽管与对照水平相比时缺乏统计显著性，但该多参数投影允许评估与各单独的化合物相比被DHA和ALA的组合不同地影响的众多参数。为了强调这点，我们不仅观察到更高的效应大小(这将为累加性的，如部分由绿色星号示出)，还观察到新作用(蓝色星号)。特征图指示20 µM DHA和100 µM ALA的组合与100 µM ALA和 20µM DHA相比的60个参数。参见图12a。
另外，对于某些参数与单独的ALA相比DHA和ALA的组合观察到相反的作用，如图12c中蓝色星号所示。受DHA和ALA组合强烈影响的那些参数由红色星号指示。因此，这些相反作用可解释为由DHA和ALA的组合诱导的完全的协同作用。
DHA和ALA的混合物在10 μM - 100 μM时诱导一般活性参数的轻微增加(参见红色矩形，图13a)，然后减少该活性。该作用相当温和，并且仅对于DHA和ALA的混合物观察到，单独的DHA或ALA未观察到(参见图13b)。然而，逐步统计分析表明爆发数目在10 μM -100 μM ALA时显著增加(参见图12b)。对于1 ng/mL - 20 ng/mL的hBDNF-处理的网络也观察到活性的相似增加(参见红色矩形，图13c)。hBDNF本身仅温和增加网络活性(参见图12)。已知hBDNF影响突触可塑性(1)，这还与促-认知功能有关(参见 Martire, A.等人，BDNF在亨廷顿氏病模型中预防NMDA-诱导的毒性：该作用为基因型特异的并且涉及腺苷A (2A)受体(BDNF prevents NMDA-induced Toxicity in Models of Huntington ’ s disease: The Effects are Genotype Specific and Adenosine A(2A) receptor is involved). J. Neurochem. 2013 Jan. 31. Doi: 10.11111/jnc.12177; 还参见，Pandya, C.D.,等人，精神分裂症中的BDNF-Trkβ信号传导与神经保护(BDNF-Trk β Signaling and Neuroprotection in Schizophrenia). Asian J. Psychiatr. 2013, Feb: 6(1):22-8)。另外，hBDNF对峰电位率的EC50 值(5.28 ng/ml)与体外测定中应用的通常使用的20 ng/ml的浓度范围直接重叠(例4)。
有趣地，对于在100 nM - 1 μM的治疗浓度内的已知的认知增强剂多奈哌齐(来自NeuroProof的内部数据，红色矩形，参见图13d)和hBDNF也观察到对于DHA和ALA的组合所观察到的这种轻微增加。例如，多奈哌齐诱导与益智药物例如加兰他敏和奈非西坦的数据相关的活性刺激，这加强烟碱受体和NMDA受体二者的活性。(Moriguchi等人, 2005. J Pharmacol and Experiment. Theracol. 315: 125-135; Narahashi等人, 2004. Biol. Pharm. Bull. 27(11): 1701-1706)。此处hBDNF和多奈哌齐的急性作用与显示活性增强的慢性作用一致。因此，对于DHA和ALA的组合存在活性增强的关联。该作用在海马培养物中甚至更显著。
因此，尽管DHA/ALA混合物诱导的活性-增强作用相当弱，该发现提示20 µM DHA和100 µM ALA的实验组合诱导对于hBDNF或多奈哌齐同样观察到的作用。
检验了10 pg/mL - 50 µg/mL的重组hBDNF。500 pg/mL浓度以上的hBDNF对一般活性仅显示数字上增加的轻微作用(参加图7)。营养因子，例如hBDNF，通过由需要时间的G蛋白偶联受体系统(“GPCR”)介导的信号传导事件起作用。对于hBDNF已知对突触可塑性的下游作用在数小时至数天内触发(Santos, A.R.,等人，BDNF对突触处局部翻译的调控(Regulation of local translation at the synapse by BDNF). Prog Neurobiol. 2010, Dec: 92(4): 505-516)。因此，预期在所检验的时帧内对神经元信号传递的急性作用低下。然而，该状况支持突触的重新组织需要时间这一事实，其为以慢性方式检验化合物DHA和ALA的原因。
对于神经营养因子例如hBDNF，NeuroProof在MEA系统中检验慢性作用(参见图15)。如图15中所示，该数据提示hBDNF加速神经元活动的发展。
DHA和ALA二者均对皮质培养物的神经元活动概况显示急性作用，如通过MEA神经芯片技术所定量的。DHA和ALA二者均降低总体网络活性和网络的同步性，尽管ALA诱导更规则的活性模式。
已知作为短期作用脂肪酸至细胞膜中的掺入增加膜的变异性，推定其可转化为对于DHA和ALA所见到的急性作用，例如活性、同步性的降低或更高的规则性，这可解释为神经元之间合作的调节。长期来看，已知该脂肪酸掺入细胞膜支持神经元和神经元之间的连接。从本文所述的急性数据，更难评估慢性和推定的有益作用。
DHA比ALA更有效，因为DHA在纳摩尔范围内有活性。这提示DHA可以以与本领域目前已知的相比更低的浓度使用，这最终可降低成本。这受到活性很浅地下降的支持,由于在更低浓度时获得相似的效应大小。ALA在100 μM以上的浓度时为神经-活性的。技术上，1 mM以上的浓度导致0.1%以上的溶媒浓度，这对于在神经元培养物中的检验，特别是在慢性处理中，是常见限制。
用DHA预-/共-处理增加硫辛酸-介导的作用并进一步诱导新作用。ALA诱导的活性的轻微增加仅在加入的DHA的影响下发生。此外，DHA共-施用增加硫辛酸的效能，这降低成本和溶媒-介导的副作用。这意味着DHA与硫辛酸协同作用，约100 μM时的新作用也证明此点，此时活性参数轻微增加。对于BDNF和促-认知药物多奈哌齐也观察到这些作用。然而，该作用很弱，这凸显了作为不需要强作用的营养食品的可用性。
配方实施例
表1提供可掺入或加入本文所述营养组合物中的ALA和DHA的组合的示例性实施方案。该实施例提供每100 kcal份营养组合物中包含的每种成分的量。
表 1. ALA 和 DHA 的示例性配方的营养分布型
表2提供本公开内容的营养组合物的一个示例性实施方案并描述每100 kcal份中包含的每种成分的量。
表 2. 实例营养组合物的营养分布
本说明书中引用的所有参考，包括但不限于，所有文章、出版物、专利、专利申请、演讲稿、课文、报告、手稿、手册、书籍、互联网帖子、期刊论文、期刊等，藉此通过引用以其整体结合到本说明书中。本文对参考的讨论仅意在概述其作者作出的断言并且没有承认任何参考构成现有技术。申请人保留质疑所引用参考的准确度和相关性的权利。
尽管已经使用具体的术语、装置和方法描述了本公开内容的实施方案，这样的描述仅为说明目的。使用的言词为说明性而非限制性的言词。应理解的是本领域普通技术人员可作出改变和变更而不脱离下列权利要求中阐述的本公开内容的精神或范围。另外，应理解不同实施方案的方面可全部或部分互换。例如，尽管用于生产根据那些方法制备的市售无菌液体营养补充剂的方法已经示例性说明，但也考虑其它用法。因此，所附权利要求的精神和范围不应被限制在其中所包含的版本的描述。

Claims (20)

1. 一种加速神经元活动的方法，其包括提供包含碳水化合物源、脂肪源、蛋白质源、二十二碳六烯酸和α-硫辛酸的营养组合物。
2. 权利要求1的方法，其中α-硫辛酸以约0.1 mg/100 kcal - 约35 mg/100 kcal的量存在。
3. 权利要求2的方法，其中α-硫辛酸以约10 mg/100 kcal - 约20 mg/100 kcal的量存在。
4. 权利要求1的方法，其中二十二碳六烯酸以约5 mg/100 kcal - 约75 mg/100 kcal的量存在。
5. 权利要求1的方法，其中所述营养组合物进一步包含唾液酸。
6. 权利要求5的方法，其中唾液酸以约0.5 mg/100 kcal - 约45 mg/100 kcal的量存在。
7. 权利要求1的方法，其中所述营养组合物进一步包含益生元。
8. 权利要求1的方法，其中所述营养组合物，当提供给目标受试者时，急性地影响目标受试者的神经元活动模式和加强电化学突触连接。
9. 权利要求1的方法，其中所述营养组合物进一步包含花生四烯酸。
10. 权利要求1的方法，其中所述营养组合物为婴儿配方。
11. 一种用于加速神经元活动发展的方法，其包括提供每100 kcal含有以下的营养组合物：
(i) 约6 g - 约22 g的碳水化合物源；
(ii) 约1 g - 约7 g的蛋白质源；
(iii) 约1.3 g - 约7.2 g的脂肪源；
(iv) 约5 mg - 约75 mg的二十二碳六烯酸；和
(iv) 约0.1 mg - 约35 mg的α-硫辛酸。
12. 权利要求11的方法，其中所述营养组合物进一步包含每100 kcal约0.3 g - 约1.2 g的益生元。
13. 权利要求11的方法，其中所述营养组合物进一步包含每100 kcal约0.5 mg - 约45 mg的唾液酸。
14. 权利要求11的方法，其中所述营养组合物进一步包含每100 kcal约10 mg - 约250 mg的乳铁蛋白。
15. 权利要求11的方法，其中所述营养组合物进一步包含来自益生菌分批培养过程的指数生长期晚期的培养上清液。
16. 一种促进电化学突触信号传导的方法，其包括向目标受试者提供包含碳水化合物源、蛋白质源、脂肪源、二十二碳六烯酸和α-硫辛酸的营养组合物。
17. 权利要求16的方法，其中所述营养组合物进一步包含花生四烯酸。
18. 权利要求16的方法，其中所述目标受试者为小儿受试者。
19. 权利要求16的方法，其中所述营养组合物为婴儿配方。
20. 权利要求16的方法，其中营养组合物进一步包含乳铁蛋白。
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