CN105349563A - 重组质粒pNZ8048-plnC的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种重组质粒pNZ8048-plnC的构建方法，以植物乳杆菌ZJQ基因组为模板，PCR扩增<i>pln</i>C目的基因，将扩增得到的基因片段用PCR产物纯化试剂盒纯化特异性扩增条带，将纯化后的PCR产物和质粒pNZ8048经<i>Nco</i>I和<i>Hind</i>？III双酶切后纯化，16℃连接过夜，得到重组质粒pNZ8048-plnC。本发明构建的重组质粒pNZ8048-PlnC，能在植物乳杆菌ZJ316（缺乏调控蛋白PlnC和PlnD）中表达。该体系有助于研究和探讨PlnC在植物乳杆菌ZJ316中的转录调节机制，进而有助于揭示PlnC对植物乳杆菌ZJ316细菌素合成代谢调节机制，为植物乳杆菌ZJ316群体感应模式研究提供理论依据，也为植物乳杆菌ZJ316细菌素高产研究提供一种创新思路，在植物乳杆菌ZJ316细菌素的开发和商业运用上也具有十分重要的意义。

Description

重组质粒pNZ8048-plnC的构建方法

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种重组质粒pNZ8048-plnC的构建方法。

背景技术

植物乳杆菌广泛存在于人体和动物肠道内、腌制果蔬、腌制肉制品中，能利用葡萄糖发酵代谢生产大量乳酸。除此之外，植物乳杆菌还能在胞外分泌一些具有抗菌活性的细菌素。细菌素能被吸附在指示菌细胞膜上，引起指示菌细胞膜结构改变形成空洞，导致指示菌胞内K+、ATP、氨基酸和磷酸盐等物质外泄而死亡。细菌素具有热稳定、无毒、高效和安全等特点。

植物乳杆菌ZJ316是从健康婴儿粪便中分离筛选得到的一株植物乳杆菌，对该菌的上清发酵液过膜除菌，经排酸、过氧化物以及胰蛋白酶和蛋白酶K等酶处理之后进行抑菌试验，试验结果表明经过一系列处理后的发酵上清仍然对指示菌具有较强的抑菌效果，并经过全基因组测序，确认植物乳杆菌ZJ316在发酵过程中产细菌素。相比较乳酸链球菌所产的Nisin细菌素对革兰氏阳性菌呈广谱抑菌而言，植物乳杆菌ZJ316所产的细菌素对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、李斯特、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌和副溶血性弧菌等革兰氏阴性和阳性致病菌具有明显的抗菌作用，具有抗菌广谱性。综上所述，植物乳杆菌ZJ316细菌素在食品、工业、农业和医药等领域具有较大的开发价值。

植物乳杆菌ZJ316细菌素合成基因簇的5个启动子序列非常相似，具有高度保守的-35和-10区(5’-TACGTTAAT-3’)，-35区和-10区之间间隔着12bp的距离，研究表明这两个区域的间隔长度对转录效果具有很大的影响。通过对植物乳杆菌细菌素生物合成的群体感应调节操纵子plnABCD分析，植物乳杆菌ZJ316存在群体感应调控的信号肽基因基因plnc8IF和组氨酸蛋白激膜蛋白酶基因plnB，但是胞内缺乏调控蛋白基因plnC和plnD，因此，我们猜测三种可能性：一是植物乳杆菌ZJ316胞内缺乏调控蛋白，群体感应信号通路中断；二是除文献已报道的调控蛋白基因plnC和plnD外，还存在类似调控功能的未知蛋白PlnX；三是植物乳杆菌ZJ316还存在另外一套细菌素生物合成群体感应调节机制。

本课题针对第一种猜测，通过将克隆有调控基因的重组质粒转化至植物乳杆菌ZJ316胞内，利用载体质粒上的信号肽强转录启动子Pnc8IF表达调控蛋白以弥补群体感应调控蛋白的缺失，搭建完善群体感应调节通路，研究和探讨调控蛋白PlnC和PlnD在植物乳杆菌ZJ316细菌素代谢合成作用调节机制。通过调控蛋白在植物乳杆菌ZJ316胞内表达可以为植物乳杆菌ZJ316细菌素群体感应模式研究提供理论依据；为群体感应系统的开发奠定基础；为植物乳杆菌ZJ316细菌素高产研究提供一种创新思路，在植物乳杆菌ZJ316细菌素的开发和商业运用上也具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组质粒pNZ8048-plnC的构建方法，以便更好的研究调控蛋白PlnC对植物乳杆菌细菌素的生物代谢的调控机制。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

重组质粒pNZ8048-plnC的构建方法，以植物乳杆菌ZJQ(分类命名：植物乳杆菌，拉丁文学名Lactobacillusplantarum，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2013年03月29日，保藏编号7391。)基因组为模板，PCR扩增plnC目的基因，将扩增得到的基因片段用PCR产物纯化试剂盒纯化特异性扩增条带，将纯化后的PCR产物和质粒pNZ8048经NcoI和HindIII双酶切后纯化，16℃连接过夜，得到重组质粒pNZ8048-plnC。

所述PCR扩增所用引物为：

上游引物：5'-CATGCCATGGCTGTGTTTCCAATTTATTTATTAGA-3'

下游引物：5'-CCCAAGCTTCTATTTCTTTTTCAATATTTTGT-3'。

所述PCR扩增反应体系为：10×buffer(Mg²⁺)2μL，2.5mmol/LdNTPMixture1.6μL，10μmol/L上游引物0.8μL，10μmol/L下游引物0.8μL，DNA模板1μL，rTaqDNAPolymerase0.2μL，其余为灭菌超纯水，总体积为20μL；所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min；进入循环，95℃变性30s，49℃退火50s，72℃延伸50s，31个循环；反应结束后72℃延伸10min，降温至4℃保存。

PCR产物的双酶切反应体系为：10×KBuffer4μL，plnCPCR产物30μL，NcoI2μL，HindIII2μL，ddH₂O2μL，总体积为40μL；pNZ8048的双酶切反应体系为：10×KBuffer4μL，pNZ8048质粒30μL，NcoI2μL，HindIII2μL，ddH₂O2μL，总体积为40μL。

plnC酶切目的片段6μL，酶切质粒pNZ80482μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNAligase1μL，总体积10μL。

植物乳杆菌存在群体感应效应，其中plnABCD是群体感应调控操纵子，plnCD编码调控蛋白PlnC和PlnD。有报道表明，PlnC可能起促进转录作用，PlnD可能起抑制转录作用，但目前关于两者究竟如何调节转录及其作用机制尚不明确。本发明构建的重组质粒pNZ8048-PlnC，能在植物乳杆菌ZJ316(缺乏调控蛋白PlnC和PlnD)中表达。该体系有助于研究和探讨PlnC在植物乳杆菌ZJ316中的转录调节机制，进而有助于揭示PlnC对植物乳杆菌ZJ316细菌素合成代谢调节机制，为植物乳杆菌ZJ316群体感应模式研究提供理论依据，也为植物乳杆菌ZJ316细菌素高产研究提供一种创新思路，在植物乳杆菌ZJ316细菌素的开发和商业运用上也具有十分重要的意义。同时，该体系也适用于研究PlnC对除ZJ316外的其他植物乳杆菌细菌素合成调节机制，为植物乳杆菌群体感应系统的开发奠定基础。

本发明中涉及的植物乳杆菌ZJQ已于2013年03月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，分类命名：植物乳杆菌，拉丁文学名Lactobacillusplantarum，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2013年03月29日，保藏编号7391。

附图说明

图1植物乳杆菌ZJ9基因组；注：M：Marker，上样量3μL；L₁-L₂：植物乳杆菌ZJ9基因组，上样量5μL。

图2PCR扩增plnC目的基因；注：M：Marker，上样量3μL；L₁-L₉：植物乳杆菌ZJ9号plnC基因PCR基因电泳条带，上样量3μL；L₁₀：不加DNA模板的阴性对照，上样量3μL。

图3PCR扩增plnD目的基因；注：M：Marker，上样量3μL；L₁-L₉：植物乳杆菌9号plnD基因PCR基因电泳条带,L₁-L₈，上样量3μL，L₉：上样量5μL；L₁₀：不加DNA模板的阴性对照，上样量5μL。

图4pNZ8048质粒粘性末端片段的获取；注：M：Marker，上样量3μL；L₁：NcoI和HindIII双酶切后的DNA片段，上样量5μL；L₂：NcoI单酶切后的片段，上样量5μL；L₃：HindIII单酶切后的片段，上样量5μL；L₅：pNZ8048环状质粒，上样量5μL。

图5目的基因片段粘性末端片段的获取；注：M：Marker，上样量3μL；L₁：NcoI和HindIII双酶切后的plnC片段，上样量5μL；L₂：NcoI和HindIII双酶切后的plnD片段，上样量3μL。

图6重组质粒pNZ8048-plnC图谱；将酶切后的pNZ8048质粒和plnCPCR片段进行连接，后转化大肠杆菌，并将其涂布在含有30μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37℃培养箱中培养16-18小时；图中为获得的重组质粒pNZ8048-plnC图谱。

图7转化子E.coliMC1061(pNZ8048-plnC)的鉴定，注：M：Marker，L₁–L₃：plnC片段的菌液PCR产物；L₄：加1μLE.coliMC1061菌液作为对照。

具体实施方式

1试验材料和仪器

1.1菌种

植物乳杆菌ZJQ，由本试验室从健康婴儿粪便中筛选得到，并于2013年03月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，分类命名：植物乳杆菌，拉丁文学名Lactobacillusplantarum，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2013年03月29日，保藏编号7391。

大肠杆菌E.coliMC1061，购自中国工业微生物保藏中心。

1.2质粒

植物乳杆菌表达载体pNZ8048(Novagen)，质粒保存于大肠杆菌E.coliMC1061。

1.3引物

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)植物乳杆菌C11和SWF1关于植物乳杆菌plnABCD操纵子的信息，以及质粒pNZ8048的多克隆位点，选取两个酶切位点，目的片段两端添加酶切位点NcoI和HindIII，序列分别为5’-CCATGG-3’和5’-AAGCTT-3’，其中由于酶切位点NcoI的特殊性，为防止移码突变加入两个碱基CT，用软件PrimePrimer5.0，结合引物设计原则设计plnC的引物(表1)，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1plnC/D引物

注：下划线为酶切位点(NcoI，HindIII)酶切位点左边为保护碱基序列，加粗部分为保护碱基。

1.4主要试剂和药品

氯霉素(chloramphenicol)、Tris-HCl、氢氧化钠、无水乙醇、冰乙酸、EDTA、CaCl₂、甘油、SDS、琼脂糖、gelred^TM、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒以上均购自生工生物工程(上海)有限公司，DNA割胶回收试剂盒购自AxyPrep公司。

内切性限制酶(NcoI，HindIII)、蛋白酶K、rTaqDNAPolymerase、DNAmark、T4DNAligase，以上均购自TaKaRa；其他主要化学试剂购自杭州常青化工仪器有限公司，均为分析纯。

1.5培养基

LB液体培养基：10g蛋白胨，5g酵母膏，10gNaCl，ddH₂0定容至1000mL，调pH至7.2，121℃灭菌15min。

LB固体培养基：10g蛋白胨，5g酵母膏，10gNaCl，15g琼脂，ddH₂O定容至1000ml，调pH至7.2，121℃灭菌15min。

2试验方法

2.1菌种的活化

从-80℃冰箱中取出保存的植物乳杆菌ZJQ，平板划线于MRS固体培养基，37℃倒置培养至有明显单菌落，挑取单菌落于10mL液体MRS培养基中，37℃静置培养16h。

从-80℃冰箱中取出有pNZ8048质粒拷贝的大肠杆菌E.coliMC1061，平板划线于LB固体培养基，37℃倒置培养至有明显单菌落，挑取单菌落于10mL的LB液体培养基中，37℃，200rpm/min培养18h。

2.2植物乳杆菌ZJQ基因组提取

植物乳杆菌为革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，肽聚糖网状结构致密，难以提取植物乳杆菌ZJQ的基因组。该方法在革兰氏阴性菌基因组小量DNA提取方法的基础上进行改良，有效的提取了植物乳杆菌ZJQ的小量的基因组DNA，具体步骤如下：

(1)从平板培养基上挑选单菌落接种至5mL的液体MRS培养基中，在37℃的培养箱中静置培养至对数生长期。

(2)取植物乳杆菌菌液1mL于Eppendorf管中，12000/min离心1min弃上清。

(3)加入1mL超纯水，移液枪缓慢悬吸打浮菌体，12000/min离心1min弃上清。

(4)加入100μLGTE溶液，在漩涡混合器上振荡混匀至沉淀彻底分散。

(5)加入500μLGTE溶液，振荡混匀。

(6)向悬液中加入10μL的100mg/mL溶菌酶至终浓度为1mg/mL，37℃处理4h，期间每隔10min轻缓颠倒微量离心管。

(7)向悬液中加入6μL的蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为0.1mg/mL，混匀，55℃继续温浴直至澄清为止，期间每隔10min轻缓颠倒微量离心管。

(8)温浴结束后向溶液中加入等体积(600μL)的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1，V/V/V)，上下颠倒充分混匀，12000r/min离心5min，上清液移到新的离心管中，然后再用酚/氯仿/异戊醇溶液抽提一次。

(9)取上清液用等体积的氯仿/异戊醇抽提一次。

(10)取上清液(约500μL)至新的离心管中，向上清中加入1/10体积(约50μL)的3mol/L醋酸钠(pH5.2)，混匀加入2倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，-20℃静置30min沉淀DNA，取出4℃，12000r/min离心10min。

(11)小心弃取上清液，用1mL的70％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000r/min离心5min。自然干燥或放入55℃烘箱中数分钟除去乙醇(乙醇残留影响后续试验)。

(12)用60μL含有RNaseA(终质量浓度20ug/mL)的TE溶解，37℃温浴30min，除去RNA。

(13)取5μL样品进行电泳确定DNA的含量。

2.3调控基因PCR扩增

以提取植物乳杆菌ZJQ基因组DNA为模板，经梯度PCR扩增条件优化试验确定后的条件进行调控基因plnC/D扩增反应体系与条件(表2)和(表3)如下：

表2普通DNA聚合酶PCR扩增反应体系

表3PCR扩增反应条件

2.4PCR产物纯化

PCR扩增产物中除了目的基因片段还存在少量仍具有活性的酶、引物、dNTP、盐离子等，对后续试验有较大的影响，使用生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒除去这些物质，具体步骤为：

(1)在WashSolution中加入无水乙醇，使无水乙醇含量为80％；在结合液BufferB3中加入异丙醇，使异丙醇含量为20％。

(2)将PCR反应液转移至1.5mL离心管，加入超纯水补齐100μL，加入5倍体积的BufferB3，充分混匀。

(3)将混合液全部吸入吸附柱，8000×g，离心30sec，倒掉收集管的液体，将吸附柱放置在同一个收集管中。

(4)向吸附柱中加入500μLWashSolution，9000×g，离心30sec。

(5)重复步骤4一次。

(6)将空吸附柱放置在收集管中放入离心机，9000×g，离心1min。在金属浴上30℃，350rpm放置6min。

(7)待乙醇挥发后，在吸附中央膜加入30μL的ElutionBuffer(60℃预热)，室温静置5min，9000×g，离心1min。

(8)1％琼脂糖凝胶电泳检验后放置-20℃保存。

2.5目的片段和质粒载体双酶切

2.5.1质粒pNZ8048提取

从LB固体培养基平皿上挑选单菌落，接种于10mL含氯霉素(30μg/mL)LB液体培养基，恒温摇床37℃，200rpm培养过夜。使用生工SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，具体步骤如下：

(1)取3mL过夜培养菌液，8000×g离心2分钟收集菌体。

(2)在菌体沉淀中加入250μLBufferP1吸打或振荡至充分悬浮菌体。

(3)加入250μL的BufferP2，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min。

(4)加入350μLBufferP3，立即温和颠倒离心管5-10次充分混匀，然后室温静置2min。

(5)于离心机中室温12000×g离心12min，将上清全部小心移入吸附柱，9000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

(6)在吸附柱中加入500μl去蛋白液BufferDW1，9000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

(7)向吸附柱中加入500μlWashSolution，9000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

(8)重复步骤7。

(9)将空吸附柱和收集管放入离心机，9000×g离心1min。

(10)在吸附膜中加入60μLElutionBuffer，静置2min，9000×g离心1min。将所得的质粒DNA溶液置于-20℃保存。

2.5.2目的片段和质粒载体的双酶切

将纯化后的plnC和plnD基因片段和pNZ8048质粒进行40μL体系双酶切，如下表4所示。

表4双酶切反应体系

注：plnC、plnD和pNZ8048双酶切体系

在37℃水浴中酶切3小时后，取2μL产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检验酶切是否完全。

2.6PCR产物和表达载体酶切回收

2.6.1目的片段双酶切回收

使用生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒除去反应液中少量的限制性内切酶和金属盐离子，方法2.4。

2.6.2质粒双酶切回收

载体质粒pNZ8048的酶切产物用AxyPrep公司的DNA凝胶回收试剂盒

进行琼脂糖凝胶割胶回收，具体步骤如下。

(1)称取0.2g琼脂糖溶解于20mL1×TAE缓冲液，加热溶解，加2μLgelred^TM染料，倾倒制胶，插11孔梳子；按10:1的比例混合样品和LoadingBuffer，上样，进行110V恒压琼脂糖凝胶电泳35min。

(2)在紫外灯下切割出含有目的基因条带的琼脂糖凝胶，尽量切除不含目的基因的琼脂糖凝胶。将切下的琼脂糖凝胶块称重，切碎，放入1.5mL的离心管中。

(3)将琼脂糖凝胶重量换算为凝胶体积(100μg＝100μL体积)。加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后75℃加热，间断混匀，直至胶块完全熔化。

(4)加入0.5个BufferDE-A体积的Buffer-DE-B，混合均匀。

(5)将上步骤的溶液转移到试剂盒提供的2mLDNA制备管，置于2mL离心管上，12000×g离心1min，弃滤液。

(6)将制备管重新放回2mL离心管，加500μLBufferW112000×g离心30sec，弃滤液。

(7)将制备管重新放回2mL离心管，加700μLBufferW2，12000×g离心30sec，弃滤液。

(8)重复步骤7，将制备管重新放回2mL离心管，12000×g离心1min。

(9)制备管放到新1.5mL离心管，室温静置待乙醇挥发干净，向制备膜中央加入35μLElutionBuffer(60℃预热)，室温静置2min。室温12000×g离心1min，洗脱DNA。1％琼脂糖凝胶电泳检验，-20℃保存。

2.7目的片段和质粒载体连接

将纯化后的酶切片段即目的片段plnC和plnD分别与酶切质粒酶切质粒pNZ8048按比例混合，16℃过夜连接，连接体系如下5：

表5DNA连接体系

2.8连接产物的转化

2.8.1E.coliMC1061感受态的制备

根据《分子克隆试验指南》中CaCl₂法制备E.coliMC1061感受态。步骤如下：

(1)配制0.05MCaCl₂溶液和0.05M含15％甘油的CaCl₂，121℃，灭菌15min。

(2)取-20℃冰箱保存的E.coliMC1061菌株保藏管，在LB固体培养基上划线接种，37℃倒置培养过夜。待长成菌落，挑选一个单菌落接种至10mLLB液体培养基，37℃振荡过夜。

(3)接种2mL菌液至100mLLB液体培养基的三角瓶中，接种量为2％，37℃振荡培养，待OD₆₀₀达到0.3-0.4，将80mL菌液转移进灭过菌的100mL离心管，置于冰上预冷30min。

(4)在4℃，4000rpm的条件下离心15min，弃上清，加入4mL预冷的0.05MCaCl₂4mL，用枪头小心吹散，冰上放置30min。

(5)在4℃，4000rpm的条件下离心15min。弃上清，加入2mL预冷的0.05M含15％甘油的CaCl₂，用枪头小心吹散，用灭过菌的1.5mL离心管每管分装为100μL，-80℃保藏。

2.8.2转化E.coliMC1061感受态

(1)从-80℃冰箱取出E.coliMC1061感受态(100μL/管)，冰上化冻。

(2)各加入10μL连接产物pNZ8048-plnC和pNZ8048-plnD，缓慢吸打混匀，在冰浴静置30min。

(3)移入42℃水浴锅，热击90s，立即取出至冰浴5min。

(4)加入800μLLB液体培养基，放置摇床，37℃，200rpm培养2小时。

(5)取200μL菌液，涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB固体培养基。

(6)放入37℃培养箱，待培养基上的液体被吸收，倒置培养16-18h。

2.9阳性转化子的筛选

挑取长得粗壮的菌落接种至含有10mLLB液体(含30μg/mL氯霉素)试管中培养16h，从各试管种各取1μL菌液，以1μL菌液为DNA模板进行菌液PCR，方法如2.3节。

2.10调控基因测序及比对

将鉴定为阳性的菌种抽提质粒送至生工生物工程(上海)有限公司测序，测序结果利用NCBI网站和软件DNAMAN7.0比对。

3试验结果与分析

3.1植物乳杆菌ZJQ基因组提取

如图1所示，图中泳道1、2均出现一条较明亮的条带。分子量比Marker最大分子量10000bp大很多，初步断定为植物乳杆菌ZJQ基因组。

3.2植物乳杆菌ZJQ目的基因PCR扩增

如图2所示，从泳道1到泳道9为以植物乳杆菌ZJQ基因组为DNA模板的plnC的PCR扩增产物，泳道10为不加基因组模板的PCR阴性对照，阴性对照没有出现像1-9号泳道一样的特异性DNA亮条带，且1-9号泳道特异性条带位置均在700-800bp之间，大小符合plnC基因理论值744bp，初步断定1-9号泳道中的片段为plnC。

如图3所示，从泳道1到泳道9为以植物乳杆菌ZJQ基因组为DNA模板的plnD的PCR扩增产物，泳道10为不加基因组模板的PCR阴性对照，阴性对照没有出现像1-9号泳道一样的特异性DNA亮条带，且1-9号泳道特异性条带位置均在700-800bp之间，大小符合plnD基因理论值744bp，初步断定1-9号泳道中的片段为plnD。

3.3质粒和目的片段双酶切

如图4所示，1号泳道为NcoI和HindIII双酶切后片段，2号泳道为NcoI单酶切后片段，3号泳道为HindIII单酶切后片段，4号泳道为pNZ8048环状质粒。酶切开后的线性质粒条带明显大于未酶切的环状质粒，这是因为超螺旋质粒切开后会变成开链线性DNA链，开链的DNA在琼脂糖凝胶电泳中泳动的空间阻力大，速度慢于超螺旋质粒，pNZ8048质粒大小为3349bp，因此环状质粒未酶切小于3349bp，酶切后的条带大小在3349bp左右。由于NcoI和HindIII双酶切切下的小片段小于100bp难以看到切下的小片段，双酶切大片段质粒与单酶切质粒的位置区别不大。

如图5所示，1号泳道为plnC目的基因PCR产物NcoI和HindIII双酶切后割胶回收的特异性明亮条带。2号泳道为plnD目的基因PCR产物NcoI和HindIII双酶切后割胶回收的特异性条带。plnC和plnD目的条带的长度均为744bp，由于NcoI和HindIII双酶切切下的小片段小于11bp，在图上难以看到小片段条带。

3.4阳性转化子的筛选

3.4.1单菌落的挑取

植物乳杆菌表达质粒pNZ8048上具有抗氯霉素基因，能编码氯霉素乙酰转移酶(ChloramphenicolAcetyltransferase,CAT)，该酶能使氯霉素失活，因此只有胞内有pNZ8048质粒拷贝的大肠杆菌E.coliMC1061能在含氯霉素的培养基中存活下来。酶切后的质粒和PCR片段经连接后转化大肠杆菌，并将其涂布在含有30μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37℃培养箱中培养16-18小时。如图6所示，A为重组质粒pNZ8048-plnC热击转化后涂布的平板；B为重组质粒pNZ8048-plnD热击转化后涂布的平板；C为E.coliMC1061感受态做的对照热击后涂布的平板。

3.4.2菌液PCR验证

挑取单菌落接种至含有10mLLB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)的试管中扩大培养。从各试管中各取1μL菌液，以1μL菌液为DNA模板进行菌液PCR验证。菌液PCR结果如图7所示，A为E.coliMC1061(pNZ8048-plnC)菌液PCR，泳道1、2、3均出现特异性条带，条带位置与plnC目的基因片段744bp位置相符合，泳道1特异性条带较泳道2，3条带亮，提取泳道1的试管中大肠杆菌的质粒送生工测序。

3.5重组载体测序及序列比对

3.5.1重组载体测序

测序用的引物是plnC-Sense和plnC-Anti-sense，plnD-Sense和plnD-Anti-sense引物，送生工双向测序，测序结果进行拼接。plnC序列长744bp，测序结果plnC中含269A，占比例36.2％；87C，占11.7％；156G，占比例21.0％；232T，占比例31.2％。plnD序列长744bp，测序结果plnD中含247A，占比例33.2％；114C，占15.3％；164G，占比例22.0％；219T，占比例29.4％。

3.5.2序列比对

经Blast比对显示，E.coliMC1061(pNZ8048-plnC)和(pNZ8048-plnD)中的plnC和plnD基因，分别与植物乳杆菌ZJQ中的plnC和plnD基因相似度为100％，表明本实验的大肠杆菌重组子构建成功。plnC和plnD属于植物乳杆菌的调控细菌素合成的调控蛋白。在植物乳杆菌ZJQ中，plnC基因和植物乳杆菌ST-III、WCFS1、B21和C11同源相似度100％。plnD基因和植物乳杆菌ST-III和WCFS1同源相似度100％，与植物乳杆菌B21和C11有一个碱基不一样，相似度99.87％，翻译成氨基酸序列同源相似度100％。

3.6pNZ8048-plnC在植物乳杆菌ZJ316中转录研究

表6L.plantarumZJ316-C菌株中plnC转录结果

将重组质粒pNZ8048-plnC及空载质粒pNZ8048分别电击转化植物乳杆菌L.plantarumZJ316，获得重组菌株L.plantarumZJ316-C和对照菌株L.plantarumZJ316-P。通过Real-timeqPCR技术，定量分析重组L.plantarumZJ316-C菌株中plnC转录的mRNA拷贝数，进而确定调控基因plnC的转录水平，以L.plantarumZJ316-P的中plnC转录水平为对照。结果表明，L.plantarumZJ316-C菌株中plnC大量转录，见表6。

Claims (5)

1.一种重组质粒pNZ8048-plnC的构建方法，其特征在于以植物乳杆菌ZJQ基因组为模板，PCR扩增plnC目的基因，将扩增得到的基因片段用PCR产物纯化试剂盒纯化特异性扩增条带，将纯化后的PCR产物和质粒pNZ8048经NcoI和HindIII双酶切后纯化，16℃连接过夜，得到重组质粒pNZ8048-plnC。

2.根据权利要求1所述的重组质粒pNZ8048-plnC的构建方法，其特征在于：所述PCR扩增所用引物为：

上游引物：5'-CATGCCATGGCTGTGTTTCCAATTTATTTATTAGA-3'；

下游引物：5'-CCCAAGCTTCTATTTCTTTTTCAATATTTTGT-3'。

3.根据权利要求1所述的重组质粒pNZ8048-plnC的构建方法，其特征在于：所述PCR扩增反应体系为：10×buffer(Mg²⁺)2μL，2.5mmol/LdNTPMixture1.6μL，10μmol/L上游引物0.8μL，10μmol/L下游引物0.8μL，DNA模板1μL，rTaqDNAPolymerase0.2μL，其余为灭菌超纯水，总体积为20μL；所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min；进入循环，95℃变性30s，49℃退火50s，72℃延伸50s，31个循环；反应结束后72℃延伸10min，降温至4℃保存。

4.根据权利要求1所述的重组质粒pNZ8048-plnC的构建方法，其特征在于：PCR产物的双酶切反应体系为：10×KBuffer4μL，plnCPCR产物30μL，NcoI2μL，HindIII2μL，ddH₂O2μL，总体积为40μL；pNZ8048的双酶切反应体系为：10×KBuffer4μL，pNZ8048质粒30μL，NcoI2μL，HindIII2μL，ddH₂O2μL，总体积为40μL。

5.根据权利要求1所述的重组质粒pNZ8048-plnC的构建方法，其特征在于：所述过夜连接的连接体系为：plnC酶切目的片段6μL，酶切质粒pNZ80482μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNAligase1μL，总体积10μL。