CN105345025B - 一种绿色荧光银纳米团簇探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种绿色荧光银纳米团簇探针及其制备方法和应用，属于荧光纳米材料制备技术领域。所述的探针是以丝素蛋白作为模板和保护剂，在碱性环境中，利用“一锅法”制得大小均匀、稳定性好、绿色荧光的银纳米团簇。该探针制备方法简单，成本较低，原料广泛易得，具有良好的重复性；而且制得的绿色荧光银纳米团簇探针水溶性好、稳定性强，可应用于尿液中生物硫醇的检测。

Description

一种绿色荧光银纳米团簇探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及荧光纳米材料制备技术领域，具体涉及一种绿色荧光银纳米团簇探针及其制备方法和应用。
背景技术
金属纳米团簇，是一种金属核心尺寸小于2nm的超小纳米粒子。最近几年，高荧光强度，高稳定性的金属纳米簇被密集的报道作为新型荧光纳米簇探针，用于检测很多种类的目标物。金属纳米簇的一个明显特征是它强的光致发光，并且具有良好的光稳定性，大的斯托克斯位移和高的发射效率，因而引起了研究者广泛的兴趣。银纳米团簇逐渐成为金属纳米材料中的重要组成部分，并广泛应用于化学分析、生物传感、生物成像、催化等研究领域。
目前，大多数合成的银纳米团簇在紫外光激发下发射蓝光。在分析检测以及生物方面，绿色荧光银纳米团簇更有吸引力，这样就可以避免一些生物体自身荧光的干扰。
生物大分子如多肽和蛋白质，具有良好的生物相容性，自身具备多种生物功能，易于实现银纳米团簇的功能化，也常用作合成荧光银纳米团簇探针的优良模板。文献(Afifteen atom silver cluster confined in bovine serum albumin,A.Mathew,P.R.Sajanlal and T.Pradeep,J.Mater.Chem.,2011,21,11205-11212)，用一种商业化的常见蛋白质----牛血清白蛋白，简单地一步合成了高发光的银纳米团簇(红色荧光)，其中牛血清白蛋白既作保护剂又具有还原作用，在碱性环境中能将银离子还原成银原子。受此工作的启发，用蛋白质作为模板合成银纳米团簇也得到了研究生的关注。文献(Glutathione-Protected Silver Nanoclusters as Cysteine-Selective Fluorometricand Colorimetric Probe,X.Yuan,Y.Q.Tay,X.Y.Dou,Z.T.Luo,D.T.Leong and J.P.Xie,Anal.Chem.2013,85,1913-1919),用谷胱甘肽保护合成银纳米团簇，检测半胱氨酸；文献(Functionalized-tryptophan stabilized fluorescent Ag nanoclusters:Synthesisand its application as Hg2+ions sensor,P.P.Bian,L.W.Xing,Z.M.Liu and Z.F.Ma,Sensor.Actuat.B Chem.,2014,203,252-257)，合成硝化后的色氨酸保护的银纳米团簇，发蓝色荧光并用于汞离子的检测。这些方法固然好，然而，合成过程有些繁琐，成本较高，发蓝色荧光的银纳米团簇用于生物检测存在一定的干扰性。
发明内容
本发明目的在于提供一种绿色荧光银纳米团簇探针及其制备方法，该方法简单，一步合成，反应条件温和，所得绿色荧光银纳米团簇探针可以避免生物体自身荧光的干扰，能用于 尿液中生物硫醇的检测。
为实现上述目的，本发明提供的一种绿色荧光银纳米团簇探针，是以丝素蛋白作为模板和保护剂，在碱性环境中，通过“一锅法”制备得到。
本发明提供的一种绿色荧光银纳米团簇探针的制备方法，步骤包括：
(1)蚕茧脱胶制备丝素蛋白：将原始蚕茧剪成1-2cm2的小片，将蚕茧小片置于0.01-0.03mol/L碳酸钠溶液中，在90-110℃下加热0.5-2h；
(2)将步骤(1)得到的脱胶后的丝素蛋白用去离子水清洗2-4次，在CaCl2:水：乙醇＝1:8:2的混合溶液中，在70-90℃下加热1-3h,使其溶解；
(3)向步骤(2)得到的丝素蛋白溶液冷却至室温，过滤，透析48h，置于4℃冰箱中备用；
(4)量取步骤(3)得到的丝素蛋白溶液，不断搅拌下，向丝素蛋白溶液中加入8-15mmol/L硝酸银，继续搅拌使两者充分混匀，丝素蛋白溶液与硝酸银溶液的体积比为1-4:1；
(5)向步骤(4)得到的混合溶液中加入50μL氢氧化钠，在室温下继续搅拌5-15min,静置6-10h；
(6)将步骤(5)得到的溶液经过离心，最终得到绿色荧光银纳米团簇探针溶液。
步骤(1)中碳酸钠溶液的浓度为0.02mol/L。
步骤(1)中蚕茧小片与碳酸钠溶液在100℃下加热1h。
步骤(2)中得到的脱胶后的丝素蛋白用去离子水清洗3次，在CaCl2:水：乙醇＝1:8:2的混合溶液中，在80℃下加热2h,使其溶解。
步骤(3)中透析是用截留分子量为8000-14000Da的透析袋透析48h。
步骤(4)中的硝酸银溶液的浓度为10mmol/L。
步骤(4)中的丝素蛋白溶液与硝酸银溶液的体积比为3:1。
步骤(5)中的氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L。
步骤(5)中，在室温下继续搅拌10min，静置8h。
步骤(6)中离心是以13000r/min转速离心10min。
本发明方法制备的绿色荧光银纳米团簇探针可在生物硫醇检测中应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)以丝素蛋白为模板，原料广泛易得，绿色环保，制备方法简单，成本低廉。
(2)制得的绿色荧光银纳米团簇探针具有良好的绿色发光性能，将其用于构建尿液中检测生物硫醇的传感体系，可以避免生物体自身荧光的干扰。本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针可在生物硫醇检测中应用。
(3)制得的绿色荧光银纳米团簇探针尺寸小、光稳定性强、毒副作用小、水溶性好，荧 光强度高，在生物成像、生物标记等领域有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针的作用机理示意图
图2为本发明制备绿色荧光银纳米团簇探针溶液分别在日光灯(1)和波长为365nm紫外灯(2)照射下的照片
图3为本发明制备绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光-紫外图，图中a为紫外-可见吸收光谱图，b为荧光光谱图
图4为本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液加入不同氨基酸时荧光峰强度的变化
图5本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液在不同pH值下荧光峰强度的变化
图6本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度随时间的变化
图7本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液随离子强度(氯化钠的浓度)的变化其荧光峰强度的变化
图8a为绿色荧光银纳米团簇探针溶液随半胱氨酸浓度的变化其荧光峰强度的变化
图8b为绿色荧光银纳米团簇探针溶液随谷胱甘肽浓度的变化其荧光峰强度的变化
图8c为绿色荧光银纳米团簇探针溶液随高半胱氨酸浓度的变化其荧光峰强度的变化
图9a为绿色荧光银纳米团簇探针溶液与半胱氨酸浓度之间的线性关系
图9b为绿色荧光银纳米团簇探针溶液与谷胱甘肽浓度之间的线性关系
图9c为绿色荧光银纳米团簇探针溶液与高半胱氨酸浓度之间的线性关系
具体实施方式
本发明是以丝素蛋白为模板，在碱性环境中，通过“一锅法”制备绿色荧光银纳米团簇探针溶液，并用于尿液中生物硫醇的检测。下面通过实例对本发明作进一步说明。
实施例1
以丝素蛋白为模板的绿色荧光银纳米团簇探针的制备：
(1)蚕茧脱胶制备丝素蛋白：将原始蚕茧剪成1-2cm2的小片，将蚕茧小片与0.02mol/L碳酸钠溶液(2.4g:1000mL)在100℃下加热1h；
(2)将步骤(1)得到的脱胶后的丝素蛋白用去离子水清洗3次，在CaCl2:水：乙醇＝1:8:2的混合溶液中，在80℃下加热2h,使其溶解；
(3)向步骤(2)得到的丝素蛋白溶液冷却至室温，过滤，透析48h，置于4℃冰箱中备用；
(4)量取步骤(3)得到的丝素蛋白溶液3mL，不断搅拌下，向丝素蛋白溶液中加入10mmol/L硝酸银1mL，继续搅拌使两者充分混匀；
(5)向步骤(4)得到的混合溶液中加入50μL1mol/L氢氧化钠，在室温下继续搅拌10min， 静置8h；
(6)将步骤(5)得到的溶液经过离心，最终得到绿色荧光银纳米团簇探针溶液。
步骤(1)～(6)过程中，均是在室温条件下操作完成的。
制备的绿色荧光银纳米团簇探针的作用机理示意图见图1。
制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液分别在日光灯和波长为365nm紫外灯照射下的照片见图2，图中1为绿色荧光银纳米团簇探针溶液在日光灯照射下的图片，颜色为黄色，2为波长为365nm紫外灯照射下的图片，颜色为绿色。
此外，制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光-紫外图见图3，其中荧光图(b)表明制备的绿色荧光银纳米团簇探针在固定激发波长为325nm条件下，发射峰位置在420nm左右。
实施例2
生物硫醇对实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响实验：
将组氨酸(His)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asn)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)、谷氨酰胺(Gln)、色氨酸(Trp)、异亮氨酸(Ile)和赖氨酸(Lys)配制成浓度为400nmol/L的溶液，半胱氨酸、谷胱甘肽和高半胱氨酸配制成40nmol/L的溶液，将实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液稀释10倍，取稀释后的绿色荧光银纳米团簇探针溶液100μL加入到900μL上述含不同氨基酸的溶液中，固定激发波长为325nm，在室温下进行荧光光谱检测，根据420nm左右的荧光峰强度，检测不同氨基酸对绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响。
氨基酸对绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图4：在325nm激发下，从含氨基酸的绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光强度F与绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度F0的比值得出：半胱氨酸变化最大，其次是谷胱甘肽和高半胱氨酸，其他氨基酸变化相对较小，说明本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液能够定性检测生物硫醇。
实施例3
pH值对实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响实验：
分别将100μL实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液加入到900μL不同pH值的BR缓冲溶液中，固定激发波长为325nm，在室温下进行荧光光谱检测，根据420nm左右的荧光峰强度，检测pH值对绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响。
pH值对绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图5：在325nm激发下，绿色荧光银纳米团簇探针溶液在pH为1-7的范围内，荧光峰强度变化较大，因而本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液选择pH＝7。
实施例4
时间对实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液：
将100μL实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液加入到50μL BR缓冲溶液(pH＝7.0)中，再加850μL去离子水，固定激发波长为325nm，在室温下0-10min内进行荧光光谱检测，根据420nm左右的荧光峰强度，检测时间对绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响。时间对绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图6：在10min内，绿色荧光银纳米团簇探针的荧光强度基本保持不变。
实施例5
离子强度对实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响实验：
将100μL实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液加入到50μL BR缓冲溶液(pH＝7.0)中，再加850μL去离子水，固定激发波长为325nm，加入不同浓度的氯化钠溶液(0～150mmol/L)，根据420nm左右的荧光峰强度，检测离子强度对绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响。
离子强度对绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图7：在325nm激发下，绿色荧光银纳米团簇探针溶液在不同浓度的氯化钠溶液(0～150mmol/L)范围内，荧光峰强度基本不变，说明本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液抗离子干扰性强。
实施例6
实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液对生物硫醇检测的实验：
将实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液稀释10倍，取稀释后的绿色荧光银纳米团簇探针溶液100μL加入到900μL含生物硫醇的溶液中，固定激发波长为325nm，在室温下进行荧光光谱检测，根据420nm左右的荧光峰强度，检测生物硫醇对银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响。
半胱氨酸对荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图8a：在325nm激发下，绿色荧光银纳米团簇探针溶液在加入不同浓度的半胱氨酸后，荧光峰强度逐渐减小，最后荧光峰基本趋于平滑；其中1～16分别是0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,40nmol/L的半胱氨酸对绿色荧光银纳米团簇探针溶液荧光峰强度影响的荧光光谱图，说明本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液能够实现对半胱氨酸的检测。
谷胱甘肽对荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图8b：在325nm激发下，绿色荧光银纳米团簇探针溶液在加入不同浓度的谷胱甘肽后，荧光峰强度逐渐减小，最后荧光峰基本趋于平滑；其中1～14分别是0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,50nmol/L的谷胱甘肽对绿色荧光银纳米团簇探针溶液荧光峰强度影响的荧光光谱图，说明本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液能够实现对谷胱甘肽的检测。
高半胱氨酸对荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图8c：在325nm激发下，绿色荧光银纳米团簇探针溶液在加入不同浓度的高半胱氨酸后，荧光峰强度逐渐减小，最后荧光峰基本趋于平滑；其中1～17分别是0,1,2,4,10,15,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,100nmol/L的高半胱氨酸对绿色荧光银纳米团簇探针溶液荧光峰强度影响的荧光光谱图，说明本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液能够实现对高半胱氨酸的检测
此外，本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的变化与生物硫醇的浓度呈线性关系，如图9a所示，半胱氨酸的线性方程为F0-F＝-86.972+134.016C(R2＝0.995)，检出限能达到6.93×10-5nmol/L；图9b所示，谷胱甘肽的线性方程为F0-F＝311.41+172.95C(R2＝0.995)，检出限能达到5.37×10-5nmol/L；图9c所示，高半胱氨酸的线性方程为F0-F＝2.478+30.810C(R2＝0.993)，检出限能达到3.01×10-4nmol/L；
实施例7
实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液在尿液中生物硫醇检测应用的实验：
采用标准加入法用于实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液在尿液中生物硫醇检测应用的实验。如表1所示，用稀释过的尿样配制浓度分别为4,6,8nmol/L的半胱氨酸溶液，将实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液稀释10倍，取稀释后的绿色荧光银纳米团簇探针溶液100μL分别加入到900μL含半胱氨酸的溶液中，固定激发波长为325nm，在室温下进行荧光光谱检测，并记录相应的荧光强度。
如表2所示，用稀释过的尿样配制浓度分别为2,4,6nmol/L的谷胱甘肽溶液，将实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液稀释10倍，取稀释后的绿色荧光银纳米团簇探针溶液100μL分别加入到900μL含谷胱甘肽的溶液中，固定激发波长为325nm，在室温下进行荧光光谱检测，并记录相应的荧光强度。
如表3所示，用稀释过的尿样配制浓度分别为15,25,35nmol/L的高半胱氨酸溶液，将实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液稀释10倍，取稀释后的绿色荧光银纳米团簇探针溶液100μL分别加入到900μL含高半胱氨酸的溶液中，固定激发波长为325nm，在室温下进行荧光光谱检测，并记录相应的荧光强度。
利用图9a中的线性方程计算出实际样品中半胱氨酸的回收率。本实验中多组平行测定并计算半胱氨酸的回收率，如表1所示，说明实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液能够用于尿样中半胱氨酸的检测。
利用图9b中的线性方程计算出实际样品中谷胱甘肽的回收率。本实验中多组平行测定并计算谷胱甘肽的回收率，如表2所示，说明实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液能够用于尿样中谷胱甘肽的检测。
利用图9c中的线性方程计算出实际样品中高半胱氨酸的回收率。本实验中多组平行测定并计算高半胱氨酸的回收率，如表3所示，说明实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液能够用于尿样中高半胱氨酸的检测。
表1为本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液用于尿样中半胱氨酸的检测
表2为本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液用于尿样中谷胱甘肽的检测
表3为本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液用于尿样中高半胱氨酸的检测
RSD:相对标准偏差。

Claims (8)

1.绿色荧光银纳米团簇探针在生物硫醇检测中的应用，所述的绿色荧光银纳米团簇探针通过如下步骤的方法制备得到：
(1)蚕茧脱胶制备丝素蛋白：将蚕茧剪成1-2cm2的小片，将蚕茧小片置于0.01-0.03mol/L碳酸钠溶液中，在90-110℃下加热0.5-2h；
(2)将步骤(1)得到的脱胶后的丝素蛋白用去离子水清洗2-4次，在CaCl2:水:乙醇＝1:8:2的混合溶液中，在70-90℃下加热1-3h,使其溶解；
(3)向步骤(2)得到的丝素蛋白溶液冷却至室温，过滤，透析48h，置于4℃冰箱中备用；
(4)量取步骤(3)得到的丝素蛋白溶液，不断搅拌下，向丝素蛋白溶液中加入8-15mmol/L硝酸银，继续搅拌使两者充分混匀，丝素蛋白溶液与硝酸银溶液的体积比为1-4:1；
(5)向步骤(4)得到的混合溶液中加入50μL氢氧化钠溶液，在室温下继续搅拌5-15min,静置6-10h；
(6)将步骤(5)得到的溶液经过离心，最终得到绿色荧光银纳米团簇探针溶液。
2.如权利要求1所述的绿色荧光银纳米团簇探针在生物硫醇检测中的应用，其特征在于，所述步骤(1)中碳酸钠溶液的浓度为0.02mol/L。
3.如权利要求1所述的绿色荧光银纳米团簇探针在生物硫醇检测中的应用，其特征在于，所述步骤(1)中蚕茧小片与碳酸钠溶液在100℃下加热1h。
4.如权利要求1所述的绿色荧光银纳米团簇探针在生物硫醇检测中的应用，其特征在于，所述步骤(2)中得到的脱胶后的丝素蛋白用去离子水清洗3次，在CaCl2:水：乙醇＝1:8:2的混合溶液中，在80℃下加热2h。
5.如权利要求1所述的绿色荧光银纳米团簇探针在生物硫醇检测中的应用，其特征在于，所述步骤(3)中透析是用截留分子量为8000-14000Da的透析袋透析48h。
6.如权利要求1所述的绿色荧光银纳米团簇探针在生物硫醇检测中的应用，其特征在于，所述步骤(4)中的硝酸银溶液的浓度为10mmol/L；丝素蛋白溶液与硝酸银溶液的体积比为3:1。
7.如权利要求1所述的绿色荧光银纳米团簇探针在生物硫醇检测中的应用，其特征在于，所述步骤(5)中的氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L；室温下搅拌10min，静置8h。
8.如权利要求1所述的绿色荧光银纳米团簇探针在生物硫醇检测中的应用，其特征在于，所述步骤(6)中离心是以13000r/min转速离心10min。
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