CN110927135B - 一种快速可视化区分样品中不同手性青霉胺和外消旋体青霉胺的方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速可视化区分样品中不同手性青霉胺和外消旋体青霉胺的方法,属于氨基酸快速可视化检测的技术领域。本发明首先利用实际样品反应溶液的浑浊情况及发光性质,区分出实际样品中是手性青霉胺、外消旋体青霉胺和/或手性青霉胺混合物;再通过加标一种手性青霉胺的方法判断实际样品中青霉胺的手性构型;最后通过加标另外一种手性青霉胺的方法确证实际样品中青霉胺的手性构型。本发明采用的设备简单、污染小、成本低、操作简单迅速,而且灵敏度高、结果准确可靠。此外,本发明抗干扰能力强,其他结构相似的氨基酸,比如半胱氨酸、N‑乙酰基‑D‑青霉胺,均不会对本发明造成干扰。本发明可应用于基层实验室,有望发展成为手性氨基酸区分的实用技术。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速可视化区分样品中不同手性青霉胺和外消旋体青霉胺的方法,属于手性铜纳米簇和聚集诱导发光结合实现对不同手性配体和外消旋配体氨基酸快速可视化检测的技术领域。
背景技术
青霉胺是青霉素的代谢产物,分为手性青霉胺和外消旋体青霉胺,在治疗慢性活动性肝炎、风湿性关节炎等疾病方面疗效显著(斯崇文,青霉胺治疗慢性活动性肝炎的几个问题,国外医学,1980,544-548)。然而临床结果表明,青霉胺长期用药给病人带来很多有害的副作用(包括皮疹、荨麻疹、皮肤黏膜反应等),甚至导致病人死亡(严庆惠,青霉胺的毒性,国外医学,1979,519)。
手性青霉胺包括左旋(L-型)和右旋(D-型)青霉胺,其中左旋青霉胺对病人的毒副作用较大,因此,临床上选用D-青霉胺作为药物治病。为了深刻认识青霉胺的代谢情况和药物疗效,尿液中青霉胺的手性状态(D-型、L-型、外消旋体)及其含量是一项很重要的指标(斯崇文,青霉胺治疗慢性活动性肝炎的几个问题,国外医学,1980,544–548)。常见的方法是利用圆二色谱进行测量,该方法能够测出青霉胺的手性状态(Yang X, Gan L, Han L,Li D, Wang J, Wang E. Facile preparation of chiral penicillamine protectedgold nanoclusters and their applications in cell imaging, Chem. Commun.2013,49: 2302–2304)。然而,尿液中含有的一些手性的氨基酸和蛋白质,会严重干扰手性信号的测量,给尿液中青霉胺手性成分的分析带来一定的困难。因此,急需要建立一种尿液中不同手性和外消旋体青霉胺快速可视化地区分方法。
铜纳米簇是一类尺寸小于2nm的纳米簇材料,具有较强的发光性能,在细胞成像、化学传感等方面具有潜在的应用价值。研究表明,铜纳米簇的发光主要来源于一价铜和硫的电荷转移(配体硫到铜的电荷转移跃迁LMCT和/或配体硫到铜-铜的电荷转移跃迁LMMCT)。然而,一价铜不稳定,很容易被空气中的氧气氧化,导致发光淬灭。因此,急需要建立一种使铜纳米簇持续稳定发光的方法(Kong L, Chu X, Wang C, Zhou H, Wu Y, LiuW. D-Penicillamine-coated Cu/Ag alloy nanocluster superstructures:aggregation-induced emission and tunable photoluminescence from red toorange, Nanoscale2018, 10: 1631-1640)。
聚集诱导发光是一种很好的方法,它通过铜纳米簇的有序组装来稳定铜纳米簇并增强它的发光效率。这种有序组装可以通过多种非共价键的协同作用实现,比如金属-金属作用,氢键,疏水-疏水作用,范德华力等(Liu Y, Yao D, Zhang H. Self-AssemblyDriven Aggregation-Induced Emission of Copper Nanoclusters: A NovelTechnology for Lighting, ACS Applied Mater. Interfaces2018, 10: 12071–12080)。
对于不同手性青霉胺和外消旋体青霉胺的区分,常见的方法有圆二色谱法以及液相色谱法。但是它们在区分过程中都面临着抗干扰能力差、特异性不足、而且不能进行现场检测等缺点。通过可视化方法对其进行区分的研究更是鲜有报道。本发明通过手性青霉胺对映体以及手性青霉胺混合物稳定的铜纳米簇聚集诱导发光性质的差异实现不同手性青霉胺和外消旋体青霉胺的快速可视化区分。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处,提供一种快速可视化区分样品中不同手性青霉胺和外消旋体青霉胺的方法,该方法通过溶液浑浊后的颜色和手提紫外灯照射下发光颜色、发光强弱以及随着反应时间增加发光变化这些现象实现不同手性和外消旋体青霉胺的快速可视化区分。在实际水样和尿液中青霉胺手性构型检测方面具有重要的应用价值。
本发明的技术方案,一种快速可视化区分样品中不同手性青霉胺和外消旋体青霉胺的方法,首先利用实际样品反应溶液的浑浊情况及发光性质,区分出实际样品中是手性青霉胺、外消旋体青霉胺和/或手性青霉胺混合物;再通过加标一种手性青霉胺的方法判断实际样品中青霉胺的手性构型;最后通过加标另外一种手性青霉胺的方法确证实际样品中青霉胺的手性构型。
所述不同手性的青霉胺具体是指D-青霉胺和L-青霉胺;所述外消旋体青霉胺是指DL-青霉胺。
所述实际样品具体为水样和/或尿样;所述水样为自来水样或矿泉水样。
具体步骤如下:
(1)将实际样品和甲醇混合,加入硫酸铜溶液,搅拌1~2min,观察溶液状态,并在手提紫外灯照射下观察发光情况;使用荧光光谱仪对其发光进行检测,并测量1h后的发光光谱;
(2)在步骤(1)溶液中加标一种手性青霉胺,判断实际样品中青霉胺的手性构型。将一种手性的青霉胺溶于实际样品中,加入甲醇和硫酸铜溶液,搅拌1~2min,观察溶液状态,并在手提紫外灯照射下观察发光情况;之后,使用荧光光谱仪对其发光进行检测,并测量1h后和2h后的发光光谱;
(3)在步骤(2)溶液的基础上,另取步骤(1)溶液加标另一种手性青霉胺,确证实际样品中青霉胺的手性构型。将另一种手性青霉胺溶于实际样品中,加入甲醇,加入硫酸铜溶液,搅拌1~2min,观察溶液状态,并在手提紫外灯照射下观察发光情况;之后,使用荧光光谱仪对其发光进行检测,并测量1小时后和2小时后的发光光谱。
所述实际样品首先使用0.22 µm的滤膜进行过滤。
所述实际样品和甲醇混合时采用1mL的实际样品和3mL的甲醇混合而成。
所述硫酸铜溶液的浓度是0.1 mol·L–1,加入量为20 µL。
判定过程如下:
a、当(1)中溶液是澄清溶液,且在手提紫外灯照射下不发光,说明实际水样或尿样中含有的青霉胺是外消旋体青霉胺。当(1)中溶液出现浑浊,且在手提紫外灯照射下发出红光,发光峰位位于615nm,说明实际水样或尿样中含有的青霉胺是D-青霉胺或L-青霉胺或两者的混合物。
在上面认识的基础上,进一步研究它们的发光光谱。当溶液搅拌1~2min后,(1)中溶液出现浅黄色浑浊物质,在手提紫外灯照射下发出较弱的红光,而且发光峰位在615nm,并迅速向571nm移动,搅拌1h后,发光峰位保持在571nm,说明实际水样中的青霉胺是手性青霉胺。一般来讲,这种实际水样是比较干净的水样,如二次水或矿泉水。
当溶液搅拌5~6min后,(1)中溶液出现乳白色浑浊物质,在手提紫外灯照射下发出较强的红光,而且发光峰位在615nm,并且比较稳定;搅拌1h后,发光峰位保持不变(如自来水)或消失(如尿样),说明实际水样中的青霉胺是同一种手性青霉胺。如果随着搅拌时间的增加,发光峰位一直向561nm移动,说明水样中含有两种手性的青霉胺,但不是外消旋体。一般来讲,这种实际水样是相对脏的自来水或尿样。
b、在(1)的溶液中加标一种手性青霉胺,判断实际水样或尿样中青霉胺的手性构型。当溶液搅拌1~2min后,(2)中溶液变成黄色浑浊液体,在手提紫外灯照射下发出强的橙黄色光(最大发光波长在561nm),说明样品中的青霉胺和加入的青霉胺手性构型不同,而且此时的两种不同手性构型青霉胺D-青霉胺:L-青霉胺的摩尔比小于3。随着反应时间的增加,发光峰位一直保持在561nm。当溶液开始浑浊时,发光不在561nm,但是1h或2h后发光逐渐移到了561nm,说明水样或尿样中的青霉胺和加入的青霉胺手性构型不同。当溶液开始浑浊时,发光不在571nm,但是1h或2h后发光移到了571nm,说明水样或尿样中的青霉胺和加入的青霉胺手性构型一致。
c、在(2)的基础上,另取(1)的溶液加标另一种手性青霉胺,确证实际水样或尿样中的青霉胺的手性构型。改变条件后,溶液呈现黄色悬浊液,手提紫外灯照射下发出橙黄色的光,发光峰位位于561nm,说明实际水样或尿样中的青霉胺和加入的青霉胺的手性构型不同;1h或2h后,溶液呈现黄色悬浊液,手提紫外灯照射下发出弱的紫红色光,发光峰位位于571nm,说明实际水样或尿样中的青霉胺和加入的青霉胺手性构型相同。
所述方法能够快速可视化区分的实际样品中的手性青霉胺最小量是0.5 mg。
本发明发现D-青霉胺和L-青霉胺稳定的铜纳米簇在水中或者在水和甲醇的混合溶液中(水和甲醇的体积比是1:3)产生的聚集体能使溶液变浑浊并且发出很强的光,而外消旋体青霉胺稳定的铜纳米簇却不能使溶液变浑浊。而且,在水和甲醇混合溶液中,D-青霉胺和L-青霉胺的混合物作为稳定剂能将铜纳米簇的发光峰位从615nm调节到561nm。这可能由于它们作为稳定剂改变了铜-铜之间的距离,导致铜纳米簇发光的变化。特别当D-青霉胺和L-青霉胺的比值小于3时,它们稳定合成的铜纳米簇溶液是黄色溶液,在紫外灯照射下发出很强的橙黄色光,发光峰位在561nm;当两种青霉胺的比值大于3时,溶液开始浑浊时的发光峰位虽然不在561nm,但是随着反应时间的增加会逐渐移动到561nm。而单独的D-青霉胺或L-青霉胺作为稳定剂仅能将铜纳米簇的发光峰位从615nm调节到571nm,而且此时的铜纳米簇的发光强度极其微弱。这些结果为D-青霉胺和L-青霉胺的加标区分提供了可能。
本发明将手性青霉胺稳定的铜纳米簇和聚集诱导发光结合起来,利用铜-铜作用、羧基和羧基之间的氢键作用以及范德华作用等多种非共价键的协同作用将铜纳米簇组装成具有有序结构的组装体,此组装体限制了金属和青霉胺的运动,实现了铜纳米簇强的聚集诱导发光性质。而且,手性青霉胺混合物作为稳定剂可以使铜纳米簇发出橙黄色光,发光峰位在561nm,这是单独的手性青霉胺对映体作为稳定剂所无法实现的。基于此,本发明实现了不同手性青霉胺和外消旋体青霉胺的快速可视化区分,该方法对青霉胺具有很好的特异性,其他具有类似结构的氨基酸及其衍生物,如半胱氨酸、N-乙酰基-D-青霉胺,都不具有聚集诱导发光性质,不会对本方法造成干扰。
本发明通过加标手性青霉胺的方法,根据D-青霉胺、L-青霉胺以及两者混合物对铜纳米簇溶液颜色、发光性质的影响,实现了不同手性青霉胺的快速可视化区分。该方法稳定、抗干扰能力强,不仅能够实现实际水样中不同手性青霉胺的区分,而且可以实现尿液中不同手性青霉胺的区分。
本发明的有益效果:本发明采用的设备简单、污染小、成本低、操作简单迅速,而且灵敏度高、结果准确可靠。此外,本发明抗干扰能力强,其他结构相似的氨基酸,比如半胱氨酸、N-乙酰基-D-青霉胺,均不会对本发明造成干扰。本发明可应用于基层实验室,有望发展成为手性氨基酸区分的实用技术。
附图说明
图1不同D-青霉胺的加入量(1, 3, 5, 10, 20, 30mg)对双蒸水形成的铜纳米簇发光的影响。
图2不同D-青霉胺加入量(3.5, 4, 5, 6, 8, 11, 15, 18, 21, 24 mg)对双蒸水形成的铜纳米簇发光的影响。
图3 D-青霉胺加入量3.5 mg与双蒸水形成的铜纳米簇的发光光谱。
图4 D-青霉胺的加入量5 mg与双蒸水形成的铜纳米簇发光光谱。
图5 D-青霉胺的加入量18 mg与双蒸水形成的铜纳米簇发光光谱。
图6 D-青霉胺和L-青霉胺的加入量12 mg时,与双蒸水形成的铜纳米簇的发光光谱。
图7不同L-青霉胺的加入量(2, 3, 5, 8, 10, 20, 30 mg)以及手性青霉胺混合物与双蒸水形成的铜纳米簇发光的影响。
图8不同手性青霉胺的加入量(D-青霉胺3mg + L-青霉胺1 mg, D-青霉胺5 mg +L-青霉胺1 mg, D-青霉胺6 mg + L-青霉胺2 mg, D-青霉胺10 mg + L-青霉胺2 mg)与双蒸水形成的铜纳米簇发光光谱的影响。
图9不同手性青霉胺的加入量(D-青霉胺6 mg + L-青霉胺1 mg, D-青霉胺4 mg +L-青霉胺3 mg)与双蒸水形成的铜纳米簇发光光谱的影响。
图10固定D-青霉胺和L-青霉胺的总质量为7 mg,不同比例的D-青霉胺和L-青霉胺与双蒸水形成的铜纳米簇发光的影响。
图11固定D-青霉胺和L-青霉胺的总质量为7 mg,不同摩尔比的D-青霉胺和L-青霉胺与双蒸水形成的铜纳米簇发光的影响。
图12不同手性D-青霉胺和L-青霉胺的加入量与双蒸水形成的铜纳米簇发光光谱的影响(D-青霉胺3 mg + L-青霉胺12 mg 摩尔比1:4;D-青霉胺3 mg + L-青霉胺15 mg 摩尔比1:5;D-青霉胺3 mg + L-青霉胺18 mg 摩尔比1:6)。
图13当D-青霉胺和L-青霉胺共同作为稳定剂时(D-青霉胺3 mg + L-青霉胺12mg),随着反应时间的增加,与双蒸水形成的铜纳米簇发光光谱的变化。
图14 D-青霉胺和L-青霉胺作为稳定剂时(D-青霉胺3 mg + L-青霉胺15 mg),随着反应时间的增加,与双蒸水形成的铜纳米簇发光光谱的变化。
图15 D-青霉胺和L-青霉胺共同作为稳定剂时(D-青霉胺3 mg + L-青霉胺18mg),随着反应时间的增加,与双蒸水形成的铜纳米簇发光光谱变化。
图16不同手性的青霉胺与自来水形成的铜纳米簇发光的影响。
图17随反应时间增加,D-青霉胺(7 mg)作为稳定剂与自来水形成的铜纳米簇的发光光谱变化。
图18随反应时间增加,L-青霉胺(7 mg)作为稳定剂与自来水形成的铜纳米簇的发光光谱变化。
图19随反应时间增加,D-青霉胺(5.9 mg)和L-青霉胺(1.2 mg)作为稳定剂与自来水形成的铜纳米簇的发光光谱变化。
图20随反应时间增加,D-青霉胺(5 mg)和L-青霉胺(2 mg)作为稳定剂与自来水形成的铜纳米簇发光光谱变化。
图21随反应时间增加,D-青霉胺(3.5 mg)和L-青霉胺(3.5 mg)作为稳定剂与自来水形成的铜纳米簇的发光光谱变化。
图22不同手性构型的青霉胺与矿泉水形成的铜纳米簇发光的影响。
图23随反应时间增加,D-青霉胺(7 mg)作为稳定剂与矿泉水形成的铜纳米簇的发光光谱变化。
图24随反应时间增加,L-青霉胺(7 mg)作为稳定剂与矿泉水形成的铜纳米簇的发光光谱变化。
图25随反应时间增加,D-青霉胺(6 mg)和L-青霉胺(1.2 mg)作为稳定剂与矿泉水形成的铜纳米簇的发光光谱变化。
图26随反应时间增加,D-青霉胺(5mg)和L-青霉胺(2mg)作为稳定剂与矿泉水形成的铜纳米簇的发光光谱变化。
图27随反应时间增加,D-青霉胺(3.5 mg)和L-青霉胺(3.5 mg)作为稳定剂与矿泉水形成的铜纳米簇的发光光谱变化。
图28不同手性的青霉胺与尿液形成的铜纳米簇发光的影响。
图29以D-青霉胺作为稳定剂,随反应时间增加,与尿液形成的铜纳米簇的发光光谱变化。
图30以L-青霉胺作为稳定剂,随反应时间增加,与尿液形成的铜纳米簇的发光光谱变化。
图31以D-青霉胺和L-青霉胺混合物作为稳定剂(D-青霉胺6.5 mg + L-青霉胺0.5mg),随反应时间增加,与尿液形成的铜纳米簇的发光光谱变化。
图32以D-青霉胺和L-青霉胺混合物作为稳定剂(D-青霉胺3.5 mg + L-青霉胺3.5mg),随反应时间增加,与尿液形成的铜纳米簇的发光光谱变化。
具体实施方式
本发明主要基于溶液颜色变化和发光颜色变化以及发光峰位区分D-青霉胺、L-青霉胺和外消旋体DL-青霉胺。D-青霉胺和L-青霉胺的发光峰位最终会保持在615nm(发光较强)或移动到571nm(发光很弱),此时在日光灯下溶液是乳白色浑浊液体或黄色浑浊液体,在手提紫外灯照射下发出红光或紫红色光。而D-青霉胺和L-青霉胺两者的比值小于3时,铜纳米簇的发光峰位于561nm,而且发光比较强,此时在日光灯下溶液是黄色浑浊液体,在手提紫外灯下发出橙黄色光。而外消旋体DL-青霉胺却不能使溶液变浑浊,在紫外灯照射下溶液也不发光。
以下实施实例对本发明做更详细的描述,但所述实例不构成对本发明的限制。
实施例1 研究当样品为双蒸水时铜纳米簇与D-青霉胺稳定后的发光状态
加入不同量的D-青霉胺,随后加入1mL双蒸水与3mL甲醇混合,再加入20 µL、0.1mol·L–1的硫酸铜溶液,搅拌;随着搅拌时间逐渐延长,对应检测一定时间的发光强度。
当D-青霉胺的加入量依次为1,3,5,10,20,30mg时,具体结果如图1所示。图中的符号1-6分别代表D-青霉胺的加入量是1,3,5,10,20,30mg时,铜纳米簇的发光光谱。图1中两张荧光试管对比图是D-青霉胺的加入量分别是20 mg和30 mg时,铜纳米簇在日光下和手提紫外灯照射下的照片。
当D-青霉胺的量小于20 mg时,搅拌1~2min,溶液变成黄色悬浊液,在手提紫外灯照射下,溶液的发光很弱,发光峰位在571nm或611nm。当D-青霉胺的量大于30 mg时,搅拌5~6min,溶液变成乳白色悬浊液,在手提紫外灯照射下发出很强的红光,发光峰位在614纳米。图1中两张荧光试管对比图是D-青霉胺的加入量分别是20 mg和30 mg时,铜纳米簇在日光下和手提紫外灯照射下的照片。
当D-青霉胺的加入量依次为3.5,4,5,6,8,11,15,18,21,24mg时,对铜纳米簇发光的影响如图2所示。图中的符号1-10分别代表D-青霉胺的加入量是3.5, 4, 5, 6, 8, 11,15, 18, 21, 24 mg时,铜纳米簇的发光光谱变化。当D-青霉胺的质量小于24 mg时,铜纳米簇的发光都很弱,发光强度小于100,与图1结果一致。进一步研究发现,当D-青霉胺的量小于8mg时,开始浑浊时的发光峰位在610nm处;当D-青霉胺的量大于11mg小于24mg时,开始浑浊时的发光峰位在571nm处。
当D-青霉胺的加入量是3.5mg时,溶液刚刚浑浊和浑浊20min时铜纳米簇的发光光谱如图3所示。溶液刚刚浑浊时,铜纳米簇的发光峰位在609nm。20min后,铜纳米簇的发光峰位移动到572nm。同时溶液的颜色也从刚刚混浊时的浅黄色浑浊液体变化到20min后的黄色浑浊液体。
当D-青霉胺的加入量是5mg时,溶液刚刚浑浊和浑浊20min时铜纳米簇发光光谱如图4所示。溶液刚刚混浊时,溶液是浅黄色浑浊液体,发光峰位在609nm;20min后,溶液变成黄色浑浊液体,发光峰位在572nm。
当D-青霉胺的加入量是18mg时,溶液刚刚浑浊和浑浊20min时铜纳米簇发光光谱如图5所示。溶液刚刚浑浊时是黄色溶液,发光峰位在569nm处;20min后,溶液还是黄色溶液,发光峰位也没有明显变化。
实施例2研究当样品为双蒸水时铜纳米簇与不同手性的D-青霉胺、L-青霉胺同时或分别加入后的发光状态
加入不同量的D-青霉胺和L-青霉胺,继续加入1mL双蒸水与3mL甲醇混合,再加入20µL、0.1mol·L–1的硫酸铜溶液,搅拌;随后随着搅拌时间逐渐延长,对应检测一定时间的发光强度。
当加入D-青霉胺的质量为12mg时,分别对应溶液刚刚浑浊,浑浊20min和20h时的发光强度;当加入L-青霉胺的质量为12mg时,分别对应溶液刚刚浑浊,浑浊20min和20h时的发光强度;具体结果如图6所示。图中的符号1, 3, 5分别代表D-青霉胺的加入量是12 mg时,溶液刚刚浑浊、浑浊20min和浑浊20h的时候,铜纳米簇的发光光谱变化;图中的符号2,4, 6分别代表L-青霉胺的加入量是12 mg时,溶液刚刚浑浊、浑浊20min和浑浊20h的时候,铜纳米簇的发光光谱变化。
当D-青霉胺作为稳定剂时,溶液刚刚浑浊时是浅黄色悬浊液,发光峰位在575nm处,20min后,发光峰位移动到571nm,20h后发光完全消失。当L-青霉胺作为稳定剂时,溶液刚刚混浊时是乳白色悬浊液,发光峰位在616nm处,20min后发光强度明显降低,但发光峰位不变,20h后发光完全消失。
当加入的L-青霉胺的量依次为2,3,5,8,10,20,30,5mg,同时加入的D-青霉胺的量依次为0,0,0,0,0,0,0,2mg时,检测其发光强度;具体结果如图7所示。图中的符号1-8分别代表L-青霉胺的加入量是2,3,5,8,10,20,30mg以及手性青霉胺混合物(D 2 mg + L 5mg)作为配体时,铜纳米簇的发光光谱变化。照片是L-青霉胺的加入量是10 mg以及手性青霉胺混合物作为配体时,铜纳米簇在日光下和手提紫外灯照射下的照片。
当L-青霉胺的加入量小于10 mg时,搅拌1~2min,溶液变成黄色悬浊液。在手提紫外灯照射下,溶液发出很弱的紫红色光,发光峰位在571nm。当L-青霉胺的量大于10 mg时,搅拌1~2min后,溶液变成乳白色悬浊液,在手提紫外灯照射下发出很强的红光,发光峰位在615nm。当使用D-青霉胺和L-青霉胺共同作为稳定剂时,搅拌1~2min,溶液变成黄色悬浊液,在手提紫外灯照射下发出很强的橙黄色光,发光峰位在561nm,这种特别的实验现象为D-青霉胺和L-青霉胺的区分提供了可能。
当加入的D-青霉胺的量依次为3,5,6,10mg,同时加入的L-青霉胺的量依次为1,1,2,2mg时,检测其发光强度;具体结果如图8所示。图中的符号1-4分别代表D-青霉胺3mg +L-青霉胺1 mg, D-青霉胺5 mg + L-青霉胺1 mg, D-青霉胺6 mg + L-青霉胺2 mg, D-青霉胺10 mg + L-青霉胺2 mg手性青霉胺混合物作为配体时,铜纳米簇的发光光谱变化。
当D-青霉胺和L-青霉胺的摩尔比是3或5时,生成的铜纳米簇在紫外灯照射下发出很强的红光,发光峰位在610nm。但是,当含量低的手性青霉胺(这儿是L-青霉胺)的摩尔数超过铜离子的6倍时(这是因为2Cu2++4RSH→2Cu-SR+RS-SR+4H+,从反应中可以看出,一分子的铜离子反应两分子青霉胺。在形成铜纳米簇过程中,根据实验现象可知,一分子铜离子需要结合三分子青霉胺才可以稳定,这样估计一摩尔二价铜原料生成铜纳米簇时,大约需要六摩尔青霉胺),在D-青霉胺和L-青霉胺的比值是3时进行反应,生成的铜纳米簇发出很强的橙黄色光,发光峰位在561nm。
当加入的D-青霉胺的量依次为6,4mg,同时加入的L-青霉胺的量依次为1,3mg时,检测其发光强度;具体结果如图9所示。图中的符号1和2分别代表D-青霉胺6 mg + L-青霉胺1 mg和D-青霉胺4 mg + L-青霉胺3 mg手性青霉胺混合物作为配体时,铜纳米簇的发光光谱变化。加入不同比例的手性青霉胺,得到的铜纳米簇溶液都是乳白色浑浊液,在紫外灯照射下都发出红光,发光峰位也在615nm处。
当加入的D-青霉胺的量依次为7,6,5,4,3.5,3,2,1,0mg,同时加入的L-青霉胺的量依次为0,1,2,3,3.5,4,5,6,7mg时,检测其发光强度;具体结果如图10所示。图中的符号1-9分别代表D-青霉胺7mg, D-青霉胺6mg + L-青霉胺1mg, D-青霉胺5mg + L-青霉胺2mg,D-青霉胺4mg + L-青霉胺3mg, D-青霉胺3.5mg + L-青霉胺3.5mg, D-青霉胺3mg + L-青霉胺4mg, D-青霉胺2mg + L-青霉胺5mg, D-青霉胺1mg + L-青霉胺6mg, L-青霉胺7mg作为配体时,铜纳米簇的发光光谱变化。
以同手性的D-青霉胺或L-青霉胺作为稳定剂,制备的铜纳米簇是黄色悬浊液,在紫外灯照射下发出很弱的紫红色光,发光峰位在571nm。当D-青霉胺和L-青霉胺的摩尔比是1:6或6:1时,铜纳米簇溶液是乳白色溶液,在紫外灯照射下发出很强的红光,发光峰位在615nm。当D-青霉胺和L-青霉胺的摩尔比是2.5, 1.3, 1或L-青霉胺和D-青霉胺的摩尔比是2.5, 1.3, 1时,铜纳米簇溶液是黄色浑浊液,在紫外灯照射下发出很强的橙黄色光,发光峰位在561nm。这可能因为D-青霉胺和L-青霉胺作为稳定剂制备的手性铜纳米簇进一步组装成更稳定的结构(比如双螺旋结构),影响了铜-铜之间的距离,从而导致了发光的变化。
当加入的D-青霉胺:L-青霉胺的摩尔比依次为2:1、3:1、4:1、5:1、6:1时,检测其发光强度;具体结果如图11所示。图中的符号1−5分别代表D-青霉胺和L-青霉胺的摩尔比是2:1、3:1、4:1、5:1、6:1时,铜纳米簇的发光光谱变化。当D-青霉胺和L-青霉胺的摩尔比大于5时,铜纳米簇溶液是乳白色浑浊液,在紫外灯照射下,溶液发出红光,发光峰位在615nm。随着D-青霉胺和L-青霉胺的摩尔比的减小,铜纳米簇的发光峰位逐渐从615nm移动到561nm。当D-青霉胺和L-青霉胺的摩尔比小于3时,铜纳米簇溶液是黄色溶液,在手提紫外灯照射下发出很强的橙黄色光,发光峰位在561nm,并一直稳定在561nm。
当加入的D-青霉胺的量依次为3,3,3mg,同时加入的L-青霉胺的量依次为12,15,18mg时,检测其发光强度;具体结果如图12所示。图中的符号1-3分别代表D-青霉胺3 mg +L-青霉胺12 mg, D-青霉胺3 mg + L-青霉胺15 mg, D-青霉胺3 mg + L-青霉胺18 mg手性青霉胺混合物作为配体时,铜纳米簇的发光光谱变化。当D-青霉胺和L-青霉胺的摩尔比大于4,而且含量少的手性青霉胺的摩尔量大于硫酸铜的6倍时,溶液刚刚浑浊时,铜纳米簇溶液均是乳白色悬浊液,在手提紫外灯照射下发出红光,发光峰位在610nm附近。
当加入的D-青霉胺的量为3mg,同时加入的L-青霉胺的量为12mg时,按照溶液浑浊时间依次为0,20,40,60,80,100,120,150min,检测其发光强度;具体结果如图13所示。图中的符号1-8分别代表反应溶液刚刚混浊,浑浊20 min,40 min,60 min,80 min,100 min,120min,150 min时,铜纳米簇的发光光谱变化。溶液刚浑浊时,铜纳米簇溶液是乳白色浑浊液,在紫外灯照射下发出红光,发光峰位在609nm。20min后,纳米簇溶液变成黄色浑浊液,在手提紫外灯照射下发出很强的橙黄色光,发光峰位在561nm。
当加入的D-青霉胺的量为3mg,同时加入的L-青霉胺的量为15mg时,按照溶液浑浊时间依次为0,20,40,60,80,100,120,150min,检测其发光强度;具体结果如图14所示。图中的符号1-8分别代表反应溶液刚刚浑浊,浑浊20 min,40 min,60 min,80 min,100 min,120min,150 min时,铜纳米簇的发光光谱变化。溶液刚浑浊时,铜纳米簇溶液是乳白色溶液,在紫外灯照射下发出很强的红光,发光峰位在611nm。20min后,铜纳米簇溶液变成黄色溶液,在紫外灯照射下发出橙黄色光,发光峰位在562nm。
当加入的D-青霉胺的量为3mg,同时加入的L-青霉胺的量为18mg时,按照搅拌时间依次为0,20,40,60,80,100,120,150min,检测其发光强度;具体结果如图15所示。图中的符号1-8分别代表反应溶液刚刚浑浊,浑浊20 min,40 min,60 min,80 min,100 min,120min,150 min时,铜纳米簇的发光光谱变化。溶液刚浑浊时,铜纳米簇溶液是浅黄色浑浊液体,在手提紫外灯照射下发出红光,发光峰位在612nm。随着反应时间的增加,在反应时间是150min时,铜纳米簇溶液变成黄色溶液,在手提紫外灯照射下发出橙黄色光,发光峰位在567nm,估计随着反应时间的增加还会进一步移动到562nm。
实施例3 当样品为自来水时,加入不同手性的D-青霉胺、L-青霉胺后的发光状态
加入不同量的D-青霉胺和L-青霉胺,继续加入1mL自来水与3mL甲醇混合,再加入20µL、0.1mol·L–1的硫酸铜溶液,搅拌;随后随着溶液浑浊时间逐渐延长,对应检测一定时间的发光强度。
当加入的D-青霉胺的量依次为7,0,5.9,5,3.5mg,同时加入的L-青霉胺的量依次为0,7,1.2,2,3.5mg时,检测其发光强度;具体结果如图16所示。图中的符号1-5分别代表D-青霉胺7mg,L-青霉胺7mg,D-青霉胺5.9mg + L-青霉胺1.2mg,D-青霉胺5mg + L-青霉胺2mg,D-青霉胺3.5mg + L-青霉胺3.5mg作为配体时,铜纳米簇的发光光谱变化。附图照片是D-青霉胺稳定的铜纳米簇在日光下和紫外灯照射下的照片以及D-青霉胺(3.5 mg)和L-青霉胺(3.5 mg)共同作为稳定剂稳定合成的铜纳米簇在日光下和紫外灯照射下的照片。
同手性的青霉胺稳定的铜纳米簇和不同手性青霉胺稳定的铜纳米簇(D-青霉胺和L-青霉胺的摩尔比是5:1)溶液都是乳白色溶液,在紫外灯照射下发出很强的红光,发光峰位在615纳米;当手性青霉胺混合物作为配体时,铜纳米簇在日光下是黄色浑浊液,在手提紫外灯照射下发出很强的橙黄色光。其中,同手性的青霉胺稳定的铜纳米簇发光强度更大,这与二次水中的情况相反,可能是由于自来水更脏一点。所以,从一定意义上讲,这个指标可用于水质状况的评价,后面在矿泉水和尿液中进行铜纳米簇反应也说明了该观点。当D-青霉胺和L-青霉胺的摩尔比小于3时,铜纳米簇溶液是黄色溶液,在紫外灯照射下发出很强的橙黄色光,发光峰位在561纳米。
当加入的D-青霉胺的量为7mg,按照溶液浑浊时间依次为0,0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4h,检测其发光强度;具体结果如图17所示。图中的符号1-9分别代表溶液刚刚浑浊、浑浊0.5h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4 h的时候,铜纳米簇的发光光谱变化。附图分别是溶液刚浑浊和浑浊4 h的时候铜纳米簇在日光下和紫外灯照射下的照片。
溶液刚刚浑浊时,随着反应时间的增加,4h内铜纳米簇溶液都是乳白色浑浊溶液;溶液浑浊3.5h的时候,铜纳米簇在日光下是乳白色浑浊液体,在紫外灯照射下发出很强的红光,发光峰位在615纳米。虽然发光强度有一定的变化,但是发光峰位一直保持在615纳米。
当加入的L-青霉胺的量为7mg,按照溶液浑浊时间依次为0,0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4h,检测其发光强度;具体结果如图18所示。图中的符号1-9分别代表溶液刚刚浑浊、浑浊0.5h、1h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4 h的时候,铜纳米簇的发光光谱变化。随着反应时间的增加,铜纳米簇的溶液都是乳白色浑浊液,在手提紫外灯照射下发出很强的红光,发光峰位在615纳米。4h内,铜纳米簇的发光强度有减小的趋势,但是发光峰位一直稳定在615纳米。
当加入的D-青霉胺的量为5.9mg,同时加入的L-青霉胺的量为1.2mg,按照溶液浑浊时间依次为0,0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4h,检测其发光强度;具体结果如图19所示。图中的符号1-10分别代表溶液刚刚浑浊、浑浊10min、0.5h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4h的时候,铜纳米簇的发光光谱变化。附图照片是反应1h后铜纳米簇在日光下和手提紫外灯照射下的照片。随着反应时间的增加,铜纳米簇浑浊液的颜色从乳白色变成黄色,发光颜色从红色逐渐变成橙红色,发光峰位从615纳米逐渐移动到561纳米。在日光下,铜纳米簇是浅黄色浑浊液体,在手提紫外灯照射下发出较强的红光。
当加入的D-青霉胺的量为5mg,同时加入的L-青霉胺的量为2mg,按照溶液浑浊时间依次为0,0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4h,检测其发光强度;具体结果如图20所示。图中的符号1-9分别代表溶液刚浑浊、浑浊0.5h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4 h的时候,铜纳米簇的发光光谱变化。随着反应时间的增加,铜纳米簇溶液都是黄色溶液,在紫外灯照射下发出很强的橙黄色光,发光峰位在561纳米。虽然发光强度有减小的趋势,但发光峰位一直稳定在561纳米。
当加入的D-青霉胺的量为3.5mg,同时加入的L-青霉胺的量为3.5mg,按照溶液浑浊时间依次为0,0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4h,检测其发光强度;具体结果如图21所示。图中的符号1-9分别代表溶液刚浑浊、浑浊30min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h和4h的时候,铜纳米簇的发光光谱变化。附图照片是溶液刚浑浊和浑浊4h的时候,铜纳米簇在日光下和手提紫外灯照射下的照片。溶液刚刚浑浊时,铜纳米簇在日光下是黄色浑浊液体,在手提紫外灯照射下发出很强的橙黄色光;溶液浑浊4h的时候,铜纳米簇在日光下是黄色浑浊液体,在手提紫外灯照射下发出较弱的橙黄色光。随着反应时间的增加,铜纳米簇溶液一直是黄色溶液,在紫外灯照射下发出很强的橙黄色光,发光峰位在561纳米。虽然铜纳米簇的发光强度逐渐减小,但是发光峰位一直保持在561纳米。
实施例4当样品为矿泉水时,加入不同手性的D-青霉胺、L-青霉胺后的发光状态
加入不同量的D-青霉胺和L-青霉胺,继续加入1mL矿泉水与3mL甲醇混合,再加入20µL、0.1mol·L–1的硫酸铜溶液,搅拌;随后随着搅拌时间逐渐延长,对应检测一定时间的发光强度。
当加入的D-青霉胺的量依次为7,0,6,5,3.5mg,同时加入的L-青霉胺的量依次为0,7,1,2,3.5mg时,检测其发光强度;具体结果如图22所示。图中的符号1-5分别代表D-青霉胺7mg,L-青霉胺7mg,D-青霉胺6mg + L-青霉胺1mg,D-青霉胺5mg + L-青霉胺2mg,D-青霉胺3.5mg + L-青霉胺3.5mg作为配体时,铜纳米簇的发光光谱变化。附图照片是D-青霉胺7mg,D-青霉胺6mg + L-青霉胺1mg,D-青霉胺3.5mg + L-青霉胺3.5mg作为配体时,铜纳米簇在日光下和手提紫外灯照射下的照片。
当D-青霉胺的加入量是7mg时,铜纳米簇在日光下是浅黄色浑浊液体,在紫外灯照射下发出较弱的紫红色光;当D-青霉胺加入6mg并且L-青霉胺加入1mg时,铜纳米簇在日光下是乳白色浑浊液体,在手提紫外灯照射下发出很强的红光;当D-青霉胺加入3.5mg并且L-青霉胺加入3.5mg时,铜纳米簇在日光下是黄色浑浊液体,在紫外灯照射下发出很强的橙黄色光。同手性的青霉胺稳定的铜纳米簇溶液是浅黄色溶液,在紫外灯照射下发出较弱的紫红色光,发光峰位在615纳米。不同手性的青霉胺稳定的铜纳米簇溶液是乳白色溶液,在手提紫外灯照射下发出很强的红光,发光峰位在615纳米(D-青霉胺和L-青霉胺的比值是6:1)。而且,同手性的青霉胺稳定的铜纳米簇的发光强度明显比不同手性的青霉胺稳定的铜纳米的发光强度小,这与二次水的结果一致,而与自来水的结果相反,可能也说明矿泉水的水质比自来水好。当D-青霉胺和L-青霉胺的摩尔比小于3时,它们作为稳定剂制备的铜纳米簇溶液是黄色溶液,在紫外灯照射下发出很强的橙黄色光,发光峰位在561纳米,这与二次水和自来水的结果一致。
当加入的D-青霉胺的量为7mg,按照溶液浑浊时间依次为0,0.5,1,1.5,2h,检测其发光强度;具体结果如图23所示。图中的符号1-5分别代表溶液刚浑浊、浑浊0.5h、1 h、1.5h和2 h的时候,铜纳米簇的发光光谱变化。溶液刚混浊时,溶液是浅黄色溶液,在手提紫外灯照射下发出较弱的紫红色光,发光峰位在615纳米。随着反应时间的增加,铜纳米簇溶液变成黄色溶液,发光强度明显减小,发光峰位移动到571纳米。
当加入的L-青霉胺的量为7mg,按照溶液浑浊时间依次为0,0.5,1,1.5,2h,检测其发光强度;具体结果如图24所示。图中的符号1-5分别代表溶液刚刚浑浊、浑浊0.5h、1 h、1.5 h和2 h的时候,铜纳米簇的发光光谱变化。溶液刚浑浊时,L-青霉胺稳定的铜纳米簇溶液是浅黄色溶液,在紫外灯照射下发出较弱的紫红色光,发光峰位在615纳米。随着反应时间的增加,铜纳米簇的发光强度明显降低,发光峰位移动到571纳米。
当加入的D-青霉胺的量为6mg,同时加入的L-青霉胺的量为1.2mg,按照溶液浑浊时间依次为0,0.5,1,1.5,2h,检测其发光强度;具体结果如图25所示。图中的符号1-5分别代表溶液刚浑浊、浑浊0.5h、1 h、1.5 h和2 h的时候,铜纳米簇的发光光谱变化。当D-青霉胺和L-青霉胺的摩尔比是5时,刚开始混浊,铜纳米簇溶液是乳白色溶液,在紫外灯照射下发出很强的红光,发光峰位在615纳米。随着反应时间的增加,铜纳米簇的发光强度有降低的趋势,但发光峰位一直保持在615纳米。
当加入的D-青霉胺的量为5mg,同时加入的L-青霉胺的量为2mg,按照溶液浑浊时间依次为0,0.5,1,1.5,2h,检测其发光强度;具体结果如图26所示。图中的符号1-5分别代表溶液刚浑浊、浑浊0.5h、1 h、1.5 h和2 h的时候,铜纳米簇的发光光谱变化。当D-青霉胺和L-青霉胺的摩尔比是2.5时,制备的铜纳米簇溶液是黄色溶液,在紫外灯照射下发出很强的橙黄色光,发光峰位在565纳米。随着反应时间的增加,发光峰位迅速移动到561纳米,发光强度逐渐减小。
当加入的D-青霉胺的量为3.5mg,同时加入的L-青霉胺的量为3.5mg,按照溶液浑浊时间依次为0,0.5,1,1.5,2h,检测其发光强度;具体结果如图27所示。图中的符号1-5分别代表溶液刚浑浊、浑浊0.5h、1 h、1.5 h和2 h的时候,铜纳米簇的发光光谱变化。当D-青霉胺和L-青霉胺的摩尔比是1时,铜纳米簇溶液是黄色溶液,在紫外灯照射下发出橙黄色的光,发光峰位在561纳米。随着反应时间的增加,发光强度逐渐减小,但是发光峰位一直保持在561纳米。
实施例5当样品为尿液时,加入不同手性的D-青霉胺、L-青霉胺后的发光状态
加入不同量的D-青霉胺和L-青霉胺,继续加入1mL尿液与3mL甲醇混合,再加入20µL、0.1mol·L–1的硫酸铜溶液,搅拌;随后随着搅拌时间逐渐延长,对应检测一定时间的发光强度。
当加入的D-青霉胺的量依次为7,0,6.5,3.5mg,同时加入的L-青霉胺的量依次为0,7,0.5,3.5mg时,检测其发光强度;具体结果如图28所示。图中的符号1-4分别代表D-青霉胺7mg,L-青霉胺7mg,D-青霉胺6.5mg + L-青霉胺0.5mg,D-青霉胺3.5mg + L-青霉胺3.5mg作为配体时,铜纳米簇的发光光谱变化。在尿液和甲醇的混合溶液中,当使用D-青霉胺或L-青霉胺作为稳定剂时,铜纳米簇溶液是乳白色溶液,在紫外灯照射下发出很强的红光,发光峰位在615纳米,发光强度和在自来水中的差不多,但比在二次水和矿泉水中大,这从一定程度上可以用来评价水质质量。当使用D-青霉胺和L-青霉胺两种手性构型的青霉胺做稳定剂时(它们的摩尔比是13)铜纳米簇的发光强度较弱,发光峰位在615纳米。当它们的摩尔比是1时,铜纳米簇溶液是黄色溶液,在紫外灯照射下发出很强的橙黄色光,发光峰位在562纳米,与在二次水、自来水、矿泉水中的结果一致。此外,427纳米处比较强的峰可能是尿液中残留的蛋白质的发光,因为纯的尿液也有这个峰。
当加入的D-青霉胺的量为7mg,按照溶液浑浊时间依次为0,20min,40min,24h,检测其发光强度;具体结果如图29所示。图中的符号1-4分别代表溶液刚浑浊、浑浊20 min、40min和24h的时候,铜纳米簇的发光光谱变化。当使用D-青霉胺作为稳定剂时,溶液刚混浊时,铜纳米簇溶液是乳白色溶液,在紫外灯照射下发出很强大的红光,发光峰位在615纳米。随着反应时间的增加,发光强度轻微地降低,但是铜纳米簇的发光一直保持在615纳米。然而较长时间的搅拌(24h)使铜纳米簇的发光完全消失。
当加入的L-青霉胺的量为7mg,按照溶液浑浊时间依次为0,20min,40min,24h,检测其发光强度;具体结果如图30所示。图中的符号1-4分别代表溶液刚浑浊、浑浊20min、40min和24h的时候,铜纳米簇的发光光谱变化。当使用L-青霉胺作为稳定剂时,铜纳米簇溶液是黄色溶液,在紫外灯照射下发出很强的红光,发光峰位在615纳米。随着反应时间的增加,发光强度轻微地降低,但发光峰位一直保持在615纳米。直到24h后铜纳米簇的发光完全消失。
当加入的D-青霉胺的量为6.5mg,同时加入的L-青霉胺的量为0.5mg,按照搅拌时间依次为0,20min,40min,24h,检测其发光强度;具体结果如图31所示。图中的符号1-4分别代表溶液刚浑浊、浑浊20min、40min和24h的时候,铜纳米簇的发光光谱变化。刚开始浑浊时,铜纳米簇溶液是浅黄色溶液,在紫外灯照射下发出红光,发光峰位在615纳米。随着反应时间的增加,铜纳米簇的发光逐渐减小,但发光峰位一直保持在615纳米。40min后,铜纳米簇的发光几乎完全消失,只剩下残留的蛋白质的蓝色发光。
当加入的D-青霉胺的量为3.5mg,同时加入的L-青霉胺的量为3.5mg,按照溶液浑浊时间依次为0,20min,40min,24h,检测其发光强度;具体结果如图32所示。图中的符号1-4分别代表溶液刚浑浊、浑浊20min、40min和24h的时候,铜纳米簇的发光光谱变化。刚开始混浊时,铜纳米簇浑浊液是黄色溶液,在紫外灯照射下发出很强的橙黄色光,发光峰位在561纳米。随着反应时间的增加,铜纳米簇的发光强度逐渐减小,但发光峰位一直保持在615纳米。24h后,铜纳米簇的发光完全消失,只剩下蛋白质的蓝色发光。
应用实施例1
将待检测的二次水溶液(1 mL)和甲醇(3 mL)混合,加入硫酸铜溶液(20 µL,0.1mol·L–1),搅拌1~3min。如果溶液不浑浊,说明是外消旋体青霉胺;如果浑浊,说明是手性青霉胺或者两者混合物。在此基础上,进一步测量其发光光谱,如果发光峰位在611纳米,并且反应1h后,发光峰位移动到572纳米,说明是手性青霉胺;如果溶液刚混浊时发光峰位在610纳米,反应1h后,发光峰位逐渐移动到561纳米,说明是两种不同手性青霉胺的混合物。在此基础上,进一步区分不同手性的青霉胺,可以通过加标D-青霉胺或L-青霉胺的方法进行判断。如果发光峰位在561纳米或者开始发光峰位不在561纳米,但是1~2h后发光峰位逐渐移动到561纳米,说明加标的青霉胺和二次水中的青霉胺手性构型不一致;如果发光峰位在611纳米,反应1h后峰位移动到572纳米,说明加标的青霉胺和二次水中的青霉胺手性构型一致。
应用实施例2
将待检测的自来水(1 mL)和甲醇(3 mL)混合,加入硫酸铜溶液(20 µL,0.1 mol·L–1),搅拌1~2min。如果溶液不浑浊,说明是外消旋体青霉胺;如果浑浊,说明是手性青霉胺或者两者混合物。在此基础上,进一步测量其发光光谱,如果发光峰位在615纳米,并且反应1h后,发光峰位继续保持在615纳米,说明是手性青霉胺;如果溶液刚混浊时发光峰位在610纳米,反应1h后,发光峰位逐渐移动到561纳米,说明是两种不同手性青霉胺的混合物。在此基础上,进一步区分不同手性的青霉胺,可以通过加标D-青霉胺或L-青霉胺的方法进行判断。如果发光峰位在561纳米或者开始发光峰位不在561纳米,但是1~2h后发光峰位逐渐移动到561纳米,说明加标的青霉胺和自来水中的青霉胺手性构型不一致;如果发光峰位还是位于615纳米,说明加标的青霉胺和自来水中的青霉胺手性构型一致。
应用实施例3
将待检测的矿泉水(1 mL)和甲醇(3 mL)混合,加入硫酸铜溶液(20 µL,0.1 mol·L–1),搅拌1~3min。如果溶液不浑浊,说明是外消旋体青霉胺;如果浑浊,说明是手性青霉胺或者两者混合物。在此基础上,进一步测量其发光光谱,如果发光峰位在615纳米,并且反应1h后,发光峰位继续保持在615纳米,说明是手性青霉胺混合物;如果溶液刚混浊时发光峰位在615纳米,反应0.5h后,发光峰位迅速移动到571纳米,说明是手性青霉胺。在此基础上,进一步区分不同手性的青霉胺,可以通过加标D-青霉胺或L-青霉胺的方法进行判断。如果发光峰位在561纳米或者开始发光峰位在615纳米并且1h后发光峰位一直保持在615纳米,说明加标的青霉胺和矿泉水中的青霉胺手性构型不一致;如果发光峰位开始位于615纳米,但0.5h内迅速移动到571纳米,说明加标的青霉胺和矿泉水中的青霉胺手性构型一致。
应用实施例4
将待检测的尿样(1 mL)和甲醇(3 mL)混合,溶液浑浊,这是甲醇使尿中的蛋白质变性引起的。加入硫酸铜溶液(20 µL,0.1 mol·L–1),搅拌1~3min。在紫外灯照射下,如果溶液发蓝光,这是尿中的杂质发的光,说明是外消旋体青霉胺;如果溶液发红光,说明是手性青霉胺或者两者混合物。在此基础上,进一步测量其发光光谱,如果发光峰位在615纳米,并且反应40min后,发光峰位继续保持在615纳米,说明是手性青霉胺;如果发光峰位在615纳米,并且反应40min后,红色发光峰位消失,说明是手性青霉胺混合物。在此基础上,进一步区分不同手性的青霉胺,可以通过加标D-青霉胺或L-青霉胺的方法进行判断。如果发光峰位在561纳米,说明加标的青霉胺和尿中的青霉胺手性构型不一致;如果发光峰位还是位于615纳米,说明加标的青霉胺和尿中的青霉胺手性构型一致。
Claims (7)
1.一种快速可视化区分样品中不同手性青霉胺和外消旋体青霉胺的方法,其特征在于步骤如下:
(1)将实际样品和甲醇混合,加入硫酸铜溶液,搅拌1~2分钟,观察溶液状态,并在手提紫外灯照射下观察发光情况;使用荧光光谱仪对其发光进行检测,并测量1小时后的发光光谱;
(2)在步骤(1)溶液中加标一种手性青霉胺,判断实际样品中青霉胺的手性构型;将一种手性的青霉胺溶于实际样品中,加入甲醇和硫酸铜溶液,搅拌1~2分钟,观察溶液状态,并在手提紫外灯照射下观察发光情况;之后,使用荧光光谱仪对其发光进行检测,并测量1小时后和2小时后的发光光谱;
(3)在步骤(2)溶液的基础上,另取步骤(1)溶液加标另一种手性青霉胺,确证实际样品中青霉胺的手性构型;将上述另一种手性青霉胺溶于实际样品中,加入甲醇,加入硫酸铜溶液,搅拌1~2分钟,观察溶液状态,并在手提紫外灯照射下观察发光情况;之后,使用荧光光谱仪对其发光进行检测,并测量1小时后和2小时后的发光光谱;
具体判定过程如下:
a、当步骤(1)所得溶液是澄清溶液,且在手提紫外灯照射下不发光,说明实际样品中含有的青霉胺是外消旋体青霉胺;当(1)中溶液出现浑浊,且在手提紫外灯照射下发出红光,发光峰位位于615nm,说明实际样品中含有的青霉胺是D-青霉胺和/或L-青霉胺;
当溶液搅拌1~2分钟后,步骤(1)所述溶液出现浅黄色浑浊物质,在手提紫外灯照射下发出较弱的红光,且发光峰位在615nm,并迅速向571nm移动,搅拌1h后,发光峰位保持在571nm,说明实际样品中的青霉胺是手性青霉胺;
当溶液搅拌5~6分钟后,步骤(1)中溶液出现乳白色浑浊物质,在手提紫外灯照射下发出较强的红光,而且发光峰位在615nm,并且比较稳定;搅拌1h后,发光峰位保持不变或消失,说明实际样品中的青霉胺是同一种手性青霉胺;如果随着搅拌时间的增加,发光峰位一直向561nm移动,说明水样中含有两种手性的青霉胺,但不是外消旋体;
b、在步骤(1)的溶液中加标一种手性青霉胺,判断实际样品中青霉胺的手性构型;当溶液搅拌1~2分钟后,步骤(2)中所述溶液变成黄色浑浊液体,在手提紫外灯照射下发出很强的橙黄色光,最大发光波长在561nm,说明样品中的青霉胺和加入的青霉胺手性构型不同,而且此时的两种不同手性构型青霉胺D-青霉胺:L-青霉胺的摩尔比小于3;随着反应时间的增加,发光峰位一直保持在561nm;
当溶液开始浑浊时,发光不在561nm,但是1或2h后发光逐渐移到了561nm,说明实际样品中的青霉胺和加入的青霉胺手性构型不同;
当溶液开始浑浊时,发光不在571nm,但是1或2h后发光移到了571nm,说明实际样品中的青霉胺和加入的青霉胺手性构型一致;
c、在步骤(2)的基础上,另取步骤(1)的溶液加标另一种手性青霉胺,确证实际样品中青霉胺的手性构型;改变条件后,溶液呈现黄色悬浊液,手提紫外灯照射下发出橙黄色的光,发光峰位位于561nm,说明实际样品中的青霉胺和加入的青霉胺手性构型不同;
1或2h后,溶液呈现黄色悬浊液,手提紫外灯照射下发出弱的紫红色光,发光峰位位于571nm,说明实际样品中的青霉胺和加入的青霉胺的手性构型相同。
2.根据权利要求1所述快速可视化区分样品中不同手性青霉胺和外消旋体青霉胺的方法,其特征在于:所述不同手性的青霉胺具体是指D-青霉胺和L-青霉胺;所述外消旋体青霉胺是指DL-青霉胺。
3.根据权利要求1所述快速可视化区分样品中不同手性青霉胺和外消旋体青霉胺的方法,其特征在于:所述实际样品具体为水样和/或尿样;所述水样为自来水样或矿泉水样。
4. 根据权利要求1所述快速可视化区分样品中不同手性青霉胺和外消旋体青霉胺的方法,其特征在于:所述实际样品首先使用0.22 µm的滤膜进行过滤。
5.根据权利要求1所述快速可视化区分样品中不同手性青霉胺和外消旋体青霉胺的方法,其特征在于:所述实际样品和甲醇混合时采用1mL的实际样品和3mL的甲醇混合而成。
6. 根据权利要求1所述快速可视化区分样品中不同手性青霉胺和外消旋体青霉胺的方法,其特征在于:所述硫酸铜溶液的浓度是0.1 mol·L–1,加入量为20 µL。
7. 根据权利要求1所述快速可视化区分样品中不同手性青霉胺和外消旋体青霉胺的方法,其特征在于:所述方法能够快速可视化区分的实际样品中的手性青霉胺最小量是0.5mg。
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Title |
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"Optically active red-emitting Cu nanoclusters originating from complexation and redox reaction between copper(II) and D/L-penicillamine";Tengfei Long等;《Nanoscale》;9764-9770 * |
"青霉胺对映体的毛细管电泳手性分离及应用研究";何敏等;《分析化学》;655-658 * |
"D-Penicillamine-coated Cu/Ag alloy nanocluster superstructures: aggregation-induced emission and tunable photoluminescence from red to orange";Lingcan Kong等;《Nanoscale》;1631-1640 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN110927135A (zh) | 2020-03-27 |
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