CN105339371A - 作为沉默调节蛋白调节剂的噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺和类似物 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了新的取代的噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺沉默调节蛋白抑制剂及其使用方法。所述沉默调节蛋白抑制剂可用于抑制沉默调节蛋白介导的生物过程，以及，例如用于治疗和/或预防疾病和障碍，其包括但不限于癌症、神经变性疾病和炎症。本申请还提供了包含这些沉默调节蛋白抑制剂的药物组合物和包含与其它治疗剂组合的沉默调节蛋白抑制剂的组合物。

Description

作为沉默调节蛋白调节剂的噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺和类似物
背景技术
基因的沉默信息调节剂(SIR)家族代表了高度保守的一组基因，其存在于从古细菌(archaebacteria)至真核生物(eukaryote)的有机体的基因组中。编码的SIR蛋白参与多种过程，从基因沉默的调节至DNA的修复。在该家族中明确表征的基因是啤酒糖酵母(S.cerevisiae，SIR2)，其参与沉默HM基因座，该基因座含有详细说明酵母接合型、端粒位置效应和细胞衰老的信息。酵母Sir2蛋白属于组蛋白脱乙酰酶家族。由SIR基因家族成员编码的蛋白在250氨基酸核心区域显示了高度的序列保守性。在鼠伤寒沙门氏菌中，Sir2同系物CobB起到NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)-依赖性的ADP-核糖基转移酶的作用。
Sir2蛋白是III类脱乙酰酶，其使用NAD作为协同底物。与其它脱乙酰酶不同，它们中的许多与基因沉默有关，Sir2对I类和II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂(例如制滴菌素A(trichostatinA，TSA))不敏感。
由Sir2引起的乙酰基-赖氨酸的脱乙酰作用与NAD水解作用紧密联系，产生烟酰胺和新的乙酰基-ADP核糖化合物(即，2’/3’-O-乙酰基-ADP-核糖(OAADPR))。Sir2的NAD依赖性的脱乙酰酶活性对它的功能而言是必不可少的，在酵母中，其可以将它的生物学作用与细胞代谢联系在一起。哺乳动物Sir2同系物具有NAD依赖性的组蛋白脱乙酰酶活性。
生物化学研究已经表明，Sir2可以容易地将组蛋白H3和H4的氨基-端尾部脱乙酰化，形成OAADPR和烟酰胺。具有另外的SIR2拷贝的菌株显示了提高的rDNA沉默和延长30％寿命。也已经表明，线虫SIR2同系物(sir-2.1)和黑腹果蝇(dSir2)基因的其它拷贝可延长其有机体的寿命。这意味着针对于衰老的SIR2-依赖性调节途径出现在进化的早期，并且在整个真核生物进化期间是保守的。当今，认为，Sir2基因经过演变，增强有机体的健康和应激反应抗性，从而增加其在逆境中的存活机会。
在人中，有七种Sir2样基因(SIRT1-SIRT7)，它们共享Sir2的保守催化域。SIRT1是与Sir2具有最高程度的序列相似性的核内蛋白。SIRT1通过脱乙酰作用来调节多个细胞靶点，包括肿瘤抑制基因p53，细胞信号因子NF-κB和FOXO转录因子。
SIRT2和SIRT3是SIRT1类似物，并具有NAD+依赖性的蛋白脱乙酰酶活性(Baur等人2012NatureReviews,11,443-461)。另外，SIRT2和3广泛地表达(Botta等人2012Curr.Med.Chem,19,5871-5884.)。SIRT2是主要位于胞质蛋白的微管蛋白脱乙酰酶，其中在胞质蛋白中它调节正常有丝分裂进展(Botta等人2012Curr.Med.Chem,19,5871-5884)。SIRT3蛋白通过位于N-末端的独特区域来靶向线粒体嵴，并广泛地表达，尤其是表达在代谢性的活性组织中。认为，一旦转入线粒体中，SIRT3通过线粒体基质加工肽酶(MPP)裂解成更小的活性形式(Shi等人2005JBC,14,13560-13567)。
据报告，调节沉默调节蛋白(sirtuin)的活性(通过活化或者抑制)在大量疾病状态中是有益的，所述疾病状态包括代谢疾病(Banks,A.S.等人(2008)CellMetab8,333-341)、癌症(Peck,B.等人(2010)MolCancerTher9,844-855和Wang等人(2008)CancerCell14,312-323)、神经变性(Liu,L.等人(2012)JBiolChem287,32307-32311；Tang,B.L.等人(2009)CellMolNeurobiol29,1093-1103和Outeiro,T.F.等人(2007)Science317,516-519)、炎症(Yoshizaki,T.等人(2009)MolCellBiol29,1363-1374和Yoshizaki,T.等人(2010)AmJPhysiolEndocrinolMetab298,E419-E428)和局部缺血损害(Narayan,N.等人(2012)Nature492,199-204。
近来已经报告，这些酶的功能取决于它们的细胞定位和细胞所属组织的类型(Bauer,J.A.等人(2012)NatRevDrugDisc11,443-461)，然而，我们对于沉默调节蛋白功能的理解远远不够详尽。
有证据显示，沉默调节蛋白功能的药理调节可得到显著的临床应用。例如，同时抑制SIRT1和SIRT2可有益于对抗癌症，其通过抑制导致细胞死亡的沉默调节蛋白介导的p53的脱乙酰作用，不过，单独抑制SIRT1或SIRT2不足以抑制体内p53的脱乙酰作用(Peck,B.等人(2010)MolCancerTher9,844-855)。在神经变性情况下，有证据显示，SIRT2介导的脱乙酰作用经FOXO3a脱乙酰作用促进神经元损伤，并且证实，在小鼠中SIRT2的遗传缺失导致细胞凋亡的减少(Liu,L.等人(2012)JBiolChem287,32307-32311)。近来的综述报告，SIRT3可在调节线粒体代谢和线粒体呼吸的中心途径中发挥作用(Botta等人(2012)CurrMedChem19,5871-5884)。
由于SIRT1-SIRT7高度保守的催化核心，一个感兴趣的领域是抑制多个沉默调节蛋白亚型(具体为SIRT1、SIRT2和SIRT3)。
迄今为止，已有多个鉴定沉默调节蛋白抑制剂(主要是SIRT1和SIRT2抑制剂)的报告。最早被鉴定的SIRT1/SIRT2抑制剂包括瑟汀诺(sirtinol)(Bauer,J.A.等人(2012)NatRevDrugDisc11,443-461)和紧密相关的salermide(Finkel,T.等人(2009)Nature460,587-591)。舒拉明(Suramin)(Banks,A.S.等人(2008)CellMetab8,333-341)抑制SIRT1和SIRT2，但是呈现差的选择性(Trapp,J.等人(2007)ChemMedChem2,1419-1431)，而EX-527(Peck,B.等人(2010)9,844-855)相对于SIRT2和SIRT3，对SIRT1呈现高度选择性(Napper,A.D.等人(2005)48,8045-8054)。EX-527是研究最多的已公布的抑制剂之一并且已经用作生物研究中的标准抑制剂和用于鉴定新抑制剂骨架的筛选工具。迄今为止，广谱化合物类别已经证实了沉默调节蛋白的抑制作用(Sanders,B.D.等人(2009)BioorgMedChem17,7031-7041)，其抑制范围从肽底物类似物(Kiviranta,P.H.等人(2009)JMedChem52,2153-2156和Tervo,A.J.等人(2006)JMedChem49,7239-7241)至杂环小分子如cambinol(Heltweg,B.等人(2006)CancerRes66,4368-4377)。这些抑制剂通常呈现微摩尔至高纳摩尔IC50值并且具有中等SIRT1选择性，除了等效SIRT1/SIRT2抑制剂Cambinol。
近来，已经报告了大量新的选择性SIRT2抑制剂。例如，Suzuki,T.等人(2012JMedChem55,5760-5773)报告了选择性2-苯胺基苯甲酰胺抑制剂(相对于SIRT1和SIRT3，其对SIRT2呈现>500:1的优先选择性)和Friden-Saxin,M.等人(2012JMedChem55,7104-7113)公开了选择性色烯酮(chromenone)抑制剂(相对于SIRT1和SIRT3，其对SIRT2显示>500:1的优先选择性，并且在200mM对SIRT1/3呈现小于10％的抑制)。另外，Galli,等人((2012)EurJMedChem55,58-66)报告了3-(1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶(一种烟酰胺类似物)，其对SIRT3(IC50＝38μM)呈现适度选择性，相对于SIRT1和SIRT2而言(在1mM分别剩余16％、88％和92％活性)，并且它对多种癌细胞系显示出适度的抗增殖效果。通常，这些抑制剂呈现微摩尔或者高纳摩尔效力并且倾向于具有至少中等的SIRT1选择性。
除了治疗潜力，新的有效的沉默调节蛋白抑制剂可用于促进对沉默调节蛋白的生物功能的理解、可用于进一步理解沉默调节蛋白抑制作用的机制并可用于帮助研发用于鉴定新的沉默调节蛋白调节剂的测试。
发明内容
本发明的一个方面涉及新的噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺类似物，包括下面详细描述的结构式(I)(例如，Ia、Ib和Ic)的化合物。本发明的第二方面涉及新的噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺类似物作为沉默调节蛋白调节剂的用途，或者涉及组合物，其包含调节沉默调节蛋白的化合物。本发明的第三方面涉及新的噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺类似物作为沉默调节蛋白抑制剂的用途，或者涉及组合物，其包含沉默调节蛋白抑制剂。本发明的第四方面涉及新的噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺类似物作为SIRT1、SIRT2和SIRT3的抑制剂的用途，或者涉及组合物，其包含SIRT1、SIRT2和SIRT3的抑制剂。本发明的另一方面提供使用本发明化合物或者包含本发明化合物的组合物在治疗许多哺乳动物的障碍和疾病中的方法。
在一些实施方案中，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的本发明化合物或者包含本发明化合物的组合物可用于许多治疗应用，包括但不限于治疗和/或预防涉及以下的疾病：代谢疾病、炎症、癌症治疗、神经变性疾病、局部缺血损害，或者其并发症等。
如下面进一步描述的，所述方法包括向有此需要的哺乳动物受试者给予药学上有效量的本发明化合物，或者包含本发明化合物的组合物。
在一些方面，本发明化合物可单独给药或者与其它化合物(包括其它调节沉默调节蛋白的化合物)，或其它治疗剂组合给药。
附图说明
图1示出在文献中报告的沉默调节蛋白抑制剂的化学结构。
图2示出噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺SIRT1/2/3抑制剂的通用结构。
图3示出用于3周期线性ELT筛选库(3-cyclelinearELTscreeninglibrary)的一般结构。
图4示出来自SIRT3ELT亲合力筛选的SpotfireTM立体数据分析。
图5示出用于制备化合物11a、11b、11c和11d的合成反应式。
图6显示用化合物25、28和EX-527对乙酰基-p65进行沉默调节蛋白介导的脱乙酰作用。
具体实施方式
1.定义
本文使用的下列术语和短语具有下面所述的含义。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。
术语“ED50”是指本领域公认的有效剂量的量度。在一些实施方案中，ED50是指药物产生其最大响应或效果的50％时的药物剂量，或者，在50％测试患者或制品(如分离的组织或者细胞)中产生预先测定响应的剂量。术语“LD50”是指本领域公认的致死剂量的量度。在一些实施方案中，LD50是指在50％测试患者中是致命的药物的剂量。术语“治疗指数”是本领域公认的术语，其是指药物的治疗指数，定义为LD50/ED50。
术语“IC50”是本领域公认的并且是指产生50％它的最大应答或者效果的药物剂量。换句话说，它是药物的半数最大抑制浓度。
本文使用的术语“药剂(agent)”表示化合物、化合物的混合物、生物大分子(例如核酸、抗体、蛋白或其一部分，例如肽)，或由生物材料(例如细菌、植物、真菌或动物(尤其是哺乳动物)的细胞或组织)制备的提取物。
当术语“生物可利用的”是指化合物时，其是本领域所公认的，并且是指化合物的一种形式，这种形式可以使所给药的化合物全部或部分的量被所给药的患者或病人吸收、引入患者或病人中或对患者或病人是生理学可利用的。
“沉默调节蛋白的生物活性部分”是指具有生物活性如脱乙酰化能力(“催化活性的”)的沉默调节蛋白的部分。沉默调节蛋白的催化活性部分可含有(但不限于)沉默调节蛋白的核心结构域。具有GenBank登记号NP_036370的包含NAD+结合结构域和底物结合结构域的SIRT1的催化活性部分例如可非限制性地包括具有GenBank登记号NP_036370的氨基酸240-664或者240-505，其由具有GenBank登记号NM_012238的聚核苷酸编码。因此，该区域有时被称为核心结构域。SIRT1的其它催化活性部分(有时也被称为核心结构域)包括约氨基酸242至493(GenBank登记号NP_036370)，其由核苷酸777至1532(GenBank登记号NM_012238)编码，或者约氨基酸240至505(GenBank登记号NP_036370)，其由聚核苷酸(GenBank登记号NM_012238)编码。SIRT1的另一“生物活性”部分是氨基酸183-225(GenBank登记号NP_036370)，其包含N-端至核心结构域(其对于化合物结合位点是重要的)的结构域。
具有GenBank登记号NP_036369.2的包含NAD+结合结构域和底物结合结构域的SIRT2的催化活性部分例如可非限制性地包括氨基酸57-356(GenBank登记号NP_036369.2)，其由聚核苷酸(GenBank登记号NM_012237.3)编码。因此，该区域有时被称为核心结构域。
具有GenBank登记号NP_036371.1的包含NAD+结合结构域和底物结合结构域的SIRT3的催化活性部分例如可非限制性地包括氨基酸118-399(GenBank登记号NP_036371.1)，其由聚核苷酸(GenBank登记号NM_012239.5)编码。因此，该区域有时被称为核心结构域。
术语“哺乳动物”在本领域是已知的，示例性的哺乳动物包括人、灵长类、家畜动物(包括牛，猪，等等)、宠物(例如犬，猫，等等)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。
术语“肠胃外的给药”和“胃肠外给药”在本领域是公认的，并且是指除了肠内和局部给药的给药方式，通常经注射给药，且包括但不限于：静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注给药。
“病人”、“受试者”、“个体”或“宿主”是指人或非人动物。
术语“可药用载体”是本领域公认的，并且是指可药用材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其参与携带或输送任何主题组合物或其组分。各种载体就其可与主题组合物及其组分相容并且不伤害病人的意义上说，必须是“可接受的”。可以用作可药用载体的材料的一些例子包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和它的衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；和(21)用于药物制剂的其它无毒的相容物质。
术语“预防”为本领域公认的，并且当涉及病症例如局部复发(如疼痛)、疾病例如癌症、综合征例如心力衰竭或任何其它的医学病症使用时，其在本领域中是众所周知的且包括给药组合物，其相对于没有接受该组合物的患者能减少医学病症的症状发病率或延迟患者医学病症的症状的发作。因此，癌症的预防包括例如相对于未经治疗的对照群体，例如以统计学上和/或临床上显著量减少接受预防性治疗的患者群体中可检测到的癌生长的数目，和/或相对于未经治疗的对照群体，例如以统计学上和/或临床上显著量延迟在治疗的群体中可检测的癌生长的出现。感染的预防包括，例如相对于未经治疗的对照群体，减少在治疗的群体中诊断出感染的数目，和/或相对于未经治疗的对照群体，延迟在治疗的群体中感染症状的出现(onset)。疼痛的预防包括，例如相对于未经治疗的对照群体减少在治疗的群体中患者遭受的疼痛感觉的强度，或者相对于未经治疗的对照群体延缓在治疗的群体中的患者遭受的疼痛感觉。
术语“预防性”或“治疗性”治疗是本领域公认的，并且是指给药宿主药物。如果在不希望的病症(例如，宿主动物的疾病或其它不希望的状态)的临床表现之前给药，那么治疗是预防性的，即，它保护该宿主抵御不希望的病症的形成，而如果在不希望的病症的表现之后给药，则治疗是治疗性的(即，其用于降低、改善或保持所存在的不希望的病症或由此而来的副作用)。
“调节沉默调节蛋白的化合物”是指这样的化合物：其为沉默调节蛋白抑制剂化合物或者沉默调节蛋白活化剂化合物。
“活化沉默调节蛋白的化合物”或者“沉默调节蛋白活化剂化合物”是指提高沉默调节蛋白的水平和/或提高沉默调节蛋白的至少一种活性的化合物。在示例性的实施方案中，活化沉默调节蛋白的化合物可以使沉默调节蛋白的至少一种生物活性提高至少约10％、25％、50％、75％、100％或更多。沉默调节蛋白的示例性生物学活性包括脱乙酰作用，例如组蛋白类和p53的脱乙酰作用；延长寿命；提高基因组稳定性；沉默转录；有丝分裂调节和控制在母细胞和子细胞之间氧化蛋白的分离。
“抑制沉默调节蛋白的化合物”或者“沉默调节蛋白抑制剂化合物”是指降低沉默调节蛋白的水平和/或降低沉默调节蛋白的至少一种活性的化合物。在示例性实施方案中，抑制沉默调节蛋白的化合物可以使沉默调节蛋白的至少一种生物活性降低至少约10％、25％、50％、75％、100％或更多。沉默调节蛋白的示例性生物活性包括脱乙酰作用，例如，组蛋白类和p53的脱乙酰作用；延长寿命；提高基因组稳定性；沉默转录；和控制在母细胞和子细胞之间氧化蛋白的分离。
“SIRT1/2/3抑制剂”是指沉默调节蛋白抑制剂，其使SIRT1、SIRT2和SIRT3蛋白的至少一种生物活性降低至少约10％、25％、50％、75％、100％或更多。SIRT1、SIRT2和SIRT3蛋白的示例性生物活性包括脱乙酰作用，例如，乙酰化的肽底物的脱乙酰作用。
“沉默调节蛋白泛抑制剂(Sirtuinpan-inhibitor)”是指沉默调节蛋白抑制剂，其使两种或者更多种沉默调节蛋白脱乙酰酶蛋白(例如，SIRT1和SIRT2)的至少一种生物活性降低至少约10％、25％、50％、75％、100％或更多。沉默调节蛋白的示例性生物活性包括脱乙酰作用，例如，乙酰化的肽底物的脱乙酰作用。
“沉默调节蛋白”是指沉默调节蛋白脱乙酰基酶蛋白家族的成员，或优选sir2家族，其包括酵母Sir2(GenBank登记号P53685)，线虫Sir-2.1(GenBank登记号NP_501912)和人SIRT1(GenBank登记号NM_012238和NP_036370(或AF083106))和SIRT2(GenBank登记号NM_012237，NM_030593，NP_036369，NP_085096和AF083107)蛋白。其它家族成员包括：四种其它酵母Sir2样基因，称为“HST基因”(Sir2的同系物)HST1、HST2、HST3和HST4，和五种其它的人同系物hSIRT3、hSIRT4、hSIRT5、hSIRT6和hSIRT7(Brachmann等人(1995)GenesDev.9:2888和Frye等人(1999)BBRC260:273)。
“SIRT1蛋白”是指沉默调节蛋白脱乙酰基酶的sir2家族的成员。在一些实施方案中，SIRT1蛋白包括酵母Sir2(GenBank登记号P53685)、线虫Sir-2.1(GenBank登记号NP_501912)、人SIRT1(GenBank登记号NM_012238或NP_036370(或AF083106))、小鼠SIRT1(GenBank登记号NM_019812或NP_062786)及其同等物和片段。在另一个实施方案中，SIRT1蛋白包括多肽，其包含由GenBank登记号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685中所列出的氨基酸序列组成的，或基本上由其组成的序列。SIRT1蛋白包括多肽，其包含所有或一部分在GenBank登记号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685中列出的氨基酸序列；在GenBank登记号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685中列出的氨基酸序列，具有1至约2、3、5、7、10、15、20、30、50、75或更多个保守的氨基酸取代；与GenBank登记号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，及其功能性片段。本发明的多肽也包括GenBank登记号NP_036370、NP_501912、NP_085096、NP_036369或P53685的同系物(例如，直系同源物和旁系同源物)、变体或片段。
本文使用的“SIRT2蛋白”、“SIRT3蛋白”、“SIRT4蛋白”、“SIRT5蛋白”、“SIRT6蛋白”和“SIRT7蛋白”指的是其它哺乳动物(例如人)的沉默调节蛋白脱乙酰基酶蛋白，其与SIRT1蛋白同源，尤其在大约275氨基酸保守的催化区域。例如，“SIRT3蛋白”是指与SIRT1蛋白同源的沉默调节蛋白脱乙酰基酶蛋白家族的成员。在一些实施方案中，SIRT3蛋白包括人SIRT3(GenBank登记号AAH01042、NP_036371或NP_001017524)和小鼠SIRT3(GenBank登记号NP_071878)蛋白和其等同物和片段。在一些实施方案中，SIRT4蛋白包括人SIRT4(GenBank登记号NM_012240或NP_036372)。在一些实施方案中，SIRT5蛋白包括人SIRT5(GenBank登记号NM_012241或NP_036373)。在一些实施方案中，SIRT6蛋白包括人SIRT6(GenBank登记号NM_016539或NP_057623)。在另一个实施方案中，SIRT3蛋白包括多肽，其包含由GenBank登记号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878中所列出的氨基酸序列组成的或基本上由其组成的序列。SIRT3蛋白包含多肽，其包含所有或一部分GenBank登记号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878中列出的氨基酸序列；GenBank登记号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878中列出的氨基酸序列具有1至大约2、3、5、7、10、15、20、30、50、75或更多个保守氨基酸取代；与GenBank登记号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，及其功能性片段。本发明的多肽也包括GenBank登记号AAH01042、NP_036371、NP_001017524或NP_071878的同系物(例如，直系同源物和旁系同源物)、变体或片段。在一些实施方案中，SIRT3蛋白包括SIRT3蛋白的片段，其是通过用线粒体基质加工肽酶(MPP)和/或线粒体中间体肽酶(MIP)裂解而产生的。
术语“系统性给药”和“全身性给药”是本领域公认的，并且是指肠内或者肠胃外给药主题组合物、治疗剂或者其它材料。
术语“治疗剂”是本领域公认的，并且是指作用于患者局部或全身的任何生物学、生理学或药理学活性物质。该术语也是指在动物或人中用于诊断、治愈、减轻、治疗或预防疾病的任何物质，或提高所需的身体或心理发育和/或状态的任何物质。
术语“治疗效果”是本领域公认的，并且是指由药理学活性物质所引起的动物，尤其是哺乳动物，且更尤其是人的有益的局部或全身效应。短语“治疗有效量”是指以适用于任何治疗的合理的效益/风险比产生一些所需要的局部或全身效应的这种物质的量。这种物质的治疗有效量可基于所治疗的患者和疾病状况、患者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、给药方式等等而变化，本领域技术人员可以容易地确定这些因素。例如，在适用于这种治疗的合理效益/风险比，可以足够以产生所需效果的量给药本文所描述的一些组合物。
“治疗”病症或疾病是指治愈以及改善该病症或疾病的至少一种症状。
“烷基”或者“烷烃”是直链或支链的非芳香烃，其为完全饱和的。通常，直链或支链烷基具有1至约20个碳原子，优选1至约10个，除非另外定义。直链和支链烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、戊基和辛基。C1-C4直链或支链烷基也被称为“低级烷基”。
术语“烯基”(“烯烃”)和“炔基”(“炔烃”)是指不饱和的脂肪族基团，其在长度和可能的取代方面类似于上述烷基，不同的是其分别含有至少一个双键或者叁键。
术语“芳香碳环”是指含有至少一个芳香环的芳香烃环系统。所述环可稠合或者以其它方式连接至其它芳香碳环或者非芳香碳环。芳香碳环基团的实例包括碳环芳香基团如苯基、萘基和蒽基。
“氮杂二环”是指在环骨架中含有氮原子的二环分子。该二环的两个环可在两个互相键合的原子处稠合(例如，吲哚)、可跨越一系列原子稠合(例如，氮杂二环[2.2.1]庚烷)或者可在单一原子处接合(例如，螺环)。
“二环”或者“二环的”是指两个环系统，其中在两个环之间共用一个、两个或者三个或者更多的原子。二环包括稠合二环，其中两个相邻原子被两个环共用，例如，萘烷、吲哚。二环也包括螺二环，其中两个环共用单一原子，例如，螺[2.2]戊烷、1-氧杂-6-氮杂螺[3.4]辛烷。二环还包括桥连二环，其中在两个环之间共用至少三个原子，例如，降莰烷(norbornane)。
“桥连二环”化合物是二环的环系统，其中所述系统的两个环共用至少三个原子，即，所述环系统包含连接两个桥头原子的一个或多个原子的至少一个桥。桥连氮杂二环是指在至少一个环中含有氮原子的桥连二环分子。
本申请使用的术语“碳环”和“碳环的”是指饱和或不饱和环，其中该环的每个原子均是碳。术语碳环包括芳香碳环和非芳香碳环。非芳香碳环包括环烷烃环，其中所有碳原子是饱和的，和环烯烃环，其含有至少一个双键。“碳环”包括5-7元单环和8-12元二环。二环碳环的每个环可选自非芳香环和芳香环。碳环包括二环分子，其中在两个环之间共用一个、两个或三个或者更多个原子。术语“稠合碳环”是指二环碳环，其中每个环与其它环共用两个相邻原子。稠合碳环的每个环可选自非芳香环和芳香环。在示例性实施方案中，芳香环(例如，苯基)可与非芳香环或者芳香环(例如，环己烷、环戊烷或环己烯)稠合。当化合价允许时，在碳环的定义中包括非芳香和芳香二环的任意组合。示例性“碳环”包括环戊烷、环己烷、二环[2.2.1]庚烷、1,5-环辛二烯、1,2,3,4-四氢萘、二环[4.2.0]辛-3-烯、萘和金刚烷。示例性的稠合碳环包括萘烷、萘、1,2,3,4-四氢萘、二环[4.2.0]辛烷、4,5,6,7-四氢-1H-茚和二环[4.1.0]庚-3-烯。“碳环”可在能够携带氢原子的任意一个或多个位置上被取代。
“环烷基”基团是环烃，其为完全饱和的(非芳香的)。通常，环烷基具有3至约10个碳原子，更通常为3至8个碳原子，除非另外定义。“环烯基”基团为含有一个或多个双键的环烃。
“卤素”是指F、Cl、Br或I。
“卤素取代”或者“卤取代”是指用F、Cl、Br或者I替代一个或多个氢。
术语“杂芳基”或者“芳香杂环”包括取代的或者未取代的芳香单环结构，优选为5至7元环，更优选为5至6元环，其环结构包含至少一个杂原子，优选1-4个杂原子，更优选1或2个杂原子。术语“杂芳基”也包括具有一个或两个环的环系统，其中至少一个环为杂芳香环，例如，其它环状的环可为环烷基、环烯基、环炔基、芳香碳环、杂芳基和/或杂环基。杂芳基包括例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶。
本申请使用的术语“杂环”和“杂环的”是指非芳香环或者芳香环，其包含一个或多个杂原子，所述杂原子选自例如N、O、B和S原子，优选为N、O或S。术语“杂环”包括“芳香杂环”和“非芳香杂环”。杂环包括4-7元单环的和8-12元二环的环。杂环包括二环分子，其中在两个环之间共用一个、两个或三个或者更多个原子。二环杂环的每个环可选自非芳香环和芳香环。术语“稠合杂环”是指二环杂环，其中每个环与其它环共用两个相邻原子。稠合杂环的每个环可选自非芳香环和芳香环。在示例性实施方案中，芳香环(例如，吡啶基)可与非芳香环或者芳香环(例如，环己烷、环戊烷、吡咯烷、2,3-二氢呋喃或者环己烯)稠合。“杂环”基团包括例如哌啶、哌嗪、吡咯烷、吗啉、嘧啶、苯并呋喃、吲哚、喹啉、内酯和内酰胺。示例性“稠合杂环”包括苯并二氮杂、吲哚、喹啉、嘌呤和4,5,6,7-四氢苯并[d]噻唑。“杂环”可在能够携带氢原子的任意一或多个位置上被取代。
“单环”包括5-7元芳香碳环或者杂芳基、3-7元环烷基或者环烯基和5-7元非芳香杂环基。示例性单环基团包括取代的或未取代的杂环或碳环，例如噻唑基、噁唑基、噁嗪基、噻嗪基、二噻烷基、二噁烷基、异噁唑基、异噻唑基、三唑基、呋喃基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、吡喃基、四唑基、吡唑基、吡嗪基、哒嗪基、咪唑基、吡啶基、吡咯基、二氢吡咯基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、嘧啶基、吗啉基、四氢噻吩基、噻吩基、环己基、环戊基、环丙基、环丁基、环庚基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丙烷基、氧杂环丙烷基、氮杂环丙烷基和硫吗啉基。
本申请使用的“取代的”是指用除氢之外的原子或者分子取代结构中的氢原子。可取代的原子如“可取代的氮”是携带呈至少一种共振形式的氢原子的原子。氢原子可被另一原子或者基团(如CH3或者OH基团)取代。例如，如果哌啶分子中的氮与氢原子结合，则该氮是可取代的。如果，例如，哌啶的氮与氢之外的原子结合，那么该氮是不可取代的。无法携带呈任意共振形式的氢原子的原子是不可取代的。
本发明设想的取代基和变量的组合仅为形成稳定化合物的那些。本文所用术语“稳定的”是指这样的化合物：其具有足以允许制造的稳定性且其在足以用于本申请详述的目的的时间内维持化合物的完整性。
本文公开的化合物也包括部分和全部氘代的变体。在一些实施方案中，氘代的变体可用于动力学研究。本领域技术人员可选择这种氘原子存在的位置。
还包括在本发明中的是本文所述化合物的盐，尤其是药学上可接受的盐。具有足够酸性、足够碱性或者这两种官能团的本发明化合物可与任意一些无机碱以及无机和有机酸反应，以形成盐。或者，固有带电化合物(如具有季氮的那些化合物)可与适合的抗衡离子(例如，卤素如溴、氯或氟，特别是溴)形成盐。
形成酸加成盐通常所使用的酸是无机酸(例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等等)和有机酸(例如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、枸橼酸、苯甲酸、乙酸等等)。这种盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯磺酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、羟乙酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等等。
碱加成盐包括衍生自无机碱(例如铵或碱金属或碱土金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)的那些盐。因此用于制备本发明盐的这种碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾，等等。
本发明的一些化合物可以特定的几何或者立体异构形式存在。本发明涵盖落在本发明范围内的所有这种化合物，包括顺式-和反式-异构体、(R)-和(S)-对映体、非对映体、(D)-异构体、(L)-异构体、其外消旋混合物及其其它混合物。其他不对称碳原子可存在于取代基(如烷基)中。所有这种异构体及其混合物旨在包括在本发明中。
本文所用的术语“立体异构体”是本领域公认的并且是指任意两种或多种异构体，它们具有相同分子构成且区别仅在于它们的原子分组在空间中的三维排列。当立体异构体在本申请中用于描述化合物或者化合物种类时，立体异构体包括化合物的任何部分或者化合物整体。例如，非对映体和对映体是立体异构体。
本文所用的术语“互变异构体”是本领域公认的并且是指互变异构现象导致的可存在的任何一种可能的可选结构，所述互变异构现象是指组成同分异构现象的形式，其中结构可按两种或多种组成排列存在，具体为关于与氧结合的氢的位置。当在本申请中用于描述化合物或者化合物种类时，应进一步理解的是，“互变异构体”是容易互变的并且平衡地存在。例如，酮和烯醇互变异构体以在任意给定的条件或者一组条件下的平衡位置所确定的比例存在：
本发明化合物(包括本发明的新化合物)也可用于本文所述的方法。
本文所述的化合物及其盐也可作为相应的水合物(例如，半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、四水合物)或溶剂合物存在。用于制备溶剂合物和水合物的适合的溶剂通常可由技术人员选择。
化合物及其盐可以非结晶或者结晶(包括共结晶和多晶型物)形式存在。
本发明的调节沉默调节蛋白的化合物可有利地调节沉默调节蛋白的水平和/或活性，尤其是沉默调节蛋白的脱乙酰酶活性。
按照另一个实施方案，本发明提供了制备上面所定义的化合物的方法。该化合物可使用常规技术合成。优选地，这些化合物由容易获得的起始物料合成。
用于合成本文所述化合物的合成化学转化和方法学在本领域是已知的，并且包括例如描述在下列文献中的那些：R.Larock,ComprehensiveOrganicTransformations(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第2版(1991)；L.Fieser和M.Fieser,FieserandFieser'sReagentsforOrganicSynthesis(1994)；和L.Paquette,ed.,EncyclopediaofReagentsforOrganicSynthesis(1995)。
2.化合物
在一个方面，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的本发明化合物或者包含本发明化合物的组合物可用于治疗和/或预防疾病和障碍，其包括癌症、神经变性疾病和炎性障碍和病症。本文公开的化合物可适用于本文公开的药物组合物和/或一或多种方法。
在一个实施方案中，本发明的调节沉默调节蛋白的化合物由结构式(I)或其盐表示:
其中：
各Z1和Z2独立地选自N和CR1，其中：
Z1和Z2中的至少一个为N；
各R1独立地选自氢、卤素、C1-C4直链或支链烷基、卤素取代的C1-C4直链或支链烷基、-O-C1-C4直链或支链烷基、-O-卤素取代的C1-C4直链或支链烷基、C1-C4烷氧基取代的C1-C4直链或支链烷基和羟基取代的C1-C4直链或支链烷基；
W选自S和O；
X选自-C(＝O)-NH2、-S(＝O)2-NH2、-C(＝NH)-NH2、-C(＝O)NHOH、-C(＝S)-NH2、-S(＝O)-NH2和-SO3H；
Y选自CHR2、CR2-(C1-C4直链或支链烷基)-NR3R3、CH-(C1-C4直链或支链烷基)-R2、CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NR3R3、CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝O)-R2、CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝S)-R2、CH-(C1-C4直链或支链烷基)-C(＝O)-NR3R3、N-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝O)-R2、N-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝S)-R2、N-(C1-C4直链或支链烷基)-NR3R3、N-(C1-C4直链或支链烷基)-R2和C连接的5-6元饱和杂环；
R2选自5至6元的饱和或不饱和碳环或杂环、-OH、-O-(C1-C4直链或支链烷基)、-C1-C4直链或支链烷基、-S(＝O)2-CH3、-C(＝O)-O-(C1-C4直链或支链烷基)、-C(＝O)-(C1-C4直链或支链烷基)且当R2为5至6元的饱和或不饱和碳环或杂环时，R2还任选取代有一个或多个独立选自以下的取代基：卤素、-C1-C4直链或支链烷基、-C(＝O)-NH-(C1-C4直链或支链烷基)、-C(＝O)-O-(C1-C4直链或支链烷基)、-C(＝O)-O-(C1-C4直链或支链烷基)、-C(＝O)-OH、-O-PO3H2和-C(＝O)-NH-(C1-C4直链或支链烷基)-NH2；以及
R3独立地选自氢、-C1-C4直链或支链烷基、-C(＝O)-(5至6元的饱和碳环或者杂环)和-S(＝O)2-CH3；或者
结合至相同氮的两个R3与所述氮原子一起形成5至6元的饱和杂环，其任选包含一个或两个选自N、S、S(＝O)、S(＝O)2和O的另外的杂原子，其中所述杂环在任意碳原子上任选取代有以下取代基中的一个或多个：-OH、＝O、卤素、-C1-C4直链或支链烷基、氟取代的C1-C4直链或支链烷基、羟基取代的C1-C4直链或支链烷基、烷氧基取代的C1-C4直链或支链烷基、-C(＝O)-C1-C4直链或支链烷基，以及在任意可取代的氮原子上任选取代有-C1-C4直链或支链烷基、-C(＝O)-C1-C4直链或支链烷基、羟基取代的C1-C4直链或支链烷基、烷氧基取代的C1-C4直链或支链烷基或卤素取代的C1-C4直链或支链烷基；其中
当Y为C连接的5至6元的杂环时，它在任意碳原子上还任选取代有以下取代基中的一个或多个：-C(＝O)-R2、-OH、＝O、卤素、-C1-C4直链或支链烷基、氟取代的C1-C4直链或支链烷基、羟基取代的C1-C4直链或支链烷基、烷氧基取代的C1-C4直链或支链烷基，以及在任意可取代的氮原子上任选取代有-C1-C4直链或支链烷基、-C(＝O)-R2、羟基取代的C1-C4直链或支链烷基、烷氧基取代的C1-C4直链或支链烷基或卤素取代的C1-C4直链或支链烷基。
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物由结构式(Ia)或其盐表示：
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物由结构式(Ib)或其盐表示：
在一些实施方案中，结构式(I)的化合物由结构式(Ic)或其盐表示：
在一些实施方案中，结构式(I)(包括所有的(Ia)、(Ib)和(Ic))的化合物的特征在于W为S。
在一些实施方案中，结构式(I)(包括所有的(Ia)、(Ib)和(Ic))的化合物的特征在于W为O。
在一些实施方案中，结构式(I)(包括所有的(Ia)、(Ib)和(Ic))的化合物的特征在于X为-C(＝O)-NH2。
在一些实施方案中，结构式(I)(包括所有的(Ia)、(Ib)和(Ic))的化合物的特征在于Y选自CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝O)-R2、CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NR3R3、N-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝O)-R2、N-(C1-C4直链或支链烷基)-NR3R3、CH-(C1-C4直链或支链烷基)-R2和CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝S)-R2。
在具体实施方案中，结构式(I)(包括所有的(Ia)、(Ib)和(Ic))的化合物中，Y为CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝O)-R2。这些实施方案的实例包括：
在其它实施方案中，结构式(I)(包括所有的(Ia)、(Ib)和(Ic))的化合物中，Y为CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NR3R3。这些实施方案的实例包括：
在其它实施方案中，结构式(I)(包括所有的(Ia)、(Ib)和(Ic))的化合物中，Y为N-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝O)-R2。这些实施方案的实例包括：
在其它实施方案中，结构式(I)(包括所有的(Ia)、(Ib)和(Ic))的化合物中，Y为N-(C1-C4直链或支链烷基)-NR3R3。这些实施方案的一个实例为：
在其它实施方案中，结构式(I)(包括所有的(Ia)、(Ib)和(Ic))的化合物中，Y为CH-(C1-C4直链或支链烷基)-R2。这些实施方案的实例包括：
在其它实施方案中，结构式(I)(包括所有的(Ia)、(Ib)和(Ic))的化合物中，Y为CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝S)-R2。这些实施方案的一个实例为：
在其它实施方案中，结构式(I)(包括所有的(Ia)、(Ib)和(Ic))的化合物中，Y为CHR2。这些实施方案的一个实例为：
在其它实施方案中，结构式(I)(包括所有的(Ia)、(Ib)和(Ic))的化合物中，Y为C连接的杂环。这些实施方案的实例包括：
在上述的具体实施方案中，Y为CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝O)-R2或者N-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝O)-R2。
在上述的其它实施方案中，R2选自5至6元的饱和或不饱和碳环或杂环、-C1-C4直链或支链烷基、-O-(C1-C4直链或支链烷基)和-OH。
在上述的一些实施方案中，R3选自-C1-C4直链或支链烷基和-S(＝O)2-CH3。
在上述的其它实施方案中，结合至相同氮的两个R3与所述氮原子一起形成任选取代的5至6元饱和杂环。
本发明化合物(包括本发明的新化合物)也可用于本文所述的方法中。本申请所述的化合物及其盐也包括它们相应的水合物(例如，半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、四水合物)和溶剂合物。用于制备溶剂合物和水合物的适合的溶剂通常可由技术人员选择。
化合物及其盐可以非结晶或者结晶(包括共结晶和多晶型物)形式存在。本发明的调节沉默调节蛋白的化合物有利地调节沉默调节蛋白的水平和/或活性，具体是沉默调节蛋白的脱乙酰酶活性。
单独地或除了上述性能之外，在有效调节沉默调节蛋白(例如SIRT1和/或SIRT3蛋白)的脱乙酰活性的化合物浓度下，本发明的一些调节沉默调节蛋白的化合物基本上不具有下列一种或多种活性：抑制PI3-激酶、抑制醛糖还原酶(aldoreductase)、抑制酪氨酸激酶、反式激活(transactivation)EGFR酪氨酸激酶、冠状动脉的扩张或解痉活性。
在其它实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含任意上述化合物或者上述实施方案和药学上可接受的载体或者稀释剂。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含另外的活性剂。另外的活性剂的实例包括抗炎剂、化疗剂、镇痛药、抗微生物剂、抗真菌剂、抗生素、维生素、抗氧化剂和通常存在于防晒制剂中的遮光剂，其包括但不限于邻氨基苯甲酸酯、二苯甲酮(具体为二苯甲酮-3)、樟脑衍生物、肉桂酸酯(例如，甲氧基肉桂酸辛酯)、二苯酰甲烷(例如，丁基甲氧基二苯酰甲烷)、对氨基苯甲酸(PABA)及其衍生物和水杨酸酯(例如，水杨酸辛酯)。
在一些实施方案中，本发明提供治疗患有神经变性障碍或者癌症的受试者的方法，其包括向有此需要的受试者给予本发明的药物组合物，即，包含任意上述化合物或者上述实施方案和药学上可接受的载体或者稀释剂的药物组合物。
在其它实施方案中，本发明提供任意上述化合物或者实施方案，以用作药物。
在一些实施方案中，本发明提供在细胞或者裂解液中抑制沉默调节蛋白活性的方法。在具体实施方案中，所抑制的沉默调节蛋白活性为SIRT1、SIRT2和/或SIRT3沉默调节蛋白活性。
在其它实施方案中，本发明提供了方法，其用于确定在细胞或细胞裂解液中检测的过程、信号或者效果是否是沉默调节蛋白依赖性的。所述方法包括以下步骤：将存在本发明化合物时的过程、信号或者效果的存在、水平或量与在本发明化合物不存在下的过程、信号或者效果的存在、水平或量进行对比，其中与不存在化合物相比，存在化合物时的过程、信号或效果的存在、水平或者量的变化表明，该过程、信号或者效果是沉默调节蛋白依赖性的。
在另一实施方案中，本发明提供在生物信号中检测沉默调节蛋白依赖性的方法。所述方法包括以下步骤：将存在本发明的沉默调节蛋白抑制剂化合物时的生物信号与不存在所述沉默调节蛋白抑制剂化合物时的生物信号进行对比，其中与不存在本发明的沉默调节蛋白抑制剂化合物时的生物信号相比，存在本发明的沉默调节蛋白抑制剂化合物时的生物信号的提高或降低表明，所述生物信号是沉默调节蛋白依赖性的。
任何上述化合物或者实施方案可用于本发明的这些方法中。
在本发明的这些方法的一些实施方案中，所述沉默调节蛋白依赖性选自SIRT1依赖的、SIRT2依赖和SIRT3依赖的中的一或多个。
本发明包括药物组合物，其包含结构式(I)、(Ia)、(Ib)或者(Ic)的任意化合物，或者上面以其它方式阐述的任意化合物。结构式(I)、(Ia)、(Ib)或(Ic)化合物的药物组合物可包含一种或者多种药学上可接受的载体或者稀释剂。结构式(I)、(Ia)、(Ib)或(Ic)化合物的药物组合物可包含第二/另外的活性剂。
本发明化合物也可用于本文所述的方法中。在具体实施方案中，本发明化合物可用于治疗患有或者易患代谢综合征、神经变性障碍、炎性障碍或其并发症的受试者，其包括向有此需要的受试者给药包含结构式(I)、(Ia)、(Ib)或(Ic)的化合物的组合物。在具体实施方案中，本发明化合物可用于治疗患有或者易患代谢综合征、神经变性障碍、炎性障碍或其并发症的受试者，其包括向有此需要的受试者给药包含结构式(I)、(Ia)、(Ib)或(Ic)的化合物的组合物，还包括给药第二/另外的活性剂。
在任意前述实施方案中，C1-C4烷氧基取代的基团可包含一或多个烷氧基取代基，例如一、两或三个甲氧基或者一个甲氧基和一个乙氧基。示例性的C1-C4烷氧基取代基包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基和叔丁氧基。
在任何前述实施方案中，羟基取代的基团可包含一个或多个羟基取代基，例如两个或者三个羟基。
在任何前述实施方案中，“卤代的”基团包括有一个卤素的取代基至最多全卤素取代。示例性的卤素取代的C1-C4烷基包括CFH2、CClH2、CBrH2、CF2H、CCl2H、CBr2H、CF3、CCl3、CBr3、CH2CH2F、CH2CH2Cl、CH2CH2Br、CH2CHF2、CHFCH3、CHClCH3、CHBrCH3、CF2CHF2、CF2CHCl2、CF2CHBr2、CH(CF3)2和C(CF3)3。全卤素取代的C1-C4烷基例如包括CF3、CCl3、CBr3、CF2CF3、CCl2CF3和CBr2CF3。
本发明的一些化合物可以特定的几何或者立体异构形式存在。本发明涵盖落在本发明范围内的所有这种化合物，包括顺式-和反式-异构体、(R)-和(S)-对映体、非对映体、(D)-异构体、(L)-异构体、其外消旋混合物及其其它混合物。另外的不对称碳原子可存在于取代基(如烷基)中。所有这种异构体及其混合物旨在包括在本发明中。
本申请所述的化合物及其盐也可以相应的水合物(例如，半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、四水合物)或者溶剂合物存在。用于制备溶剂合物和水合物的适合的溶剂通常可由技术人员选择。
化合物及其盐可按非结晶或者结晶(包括共结晶和多晶型物)形式存在。
3.示例性用途
调节沉默调节蛋白的化合物的细胞渗透性和蛋白亲合力
在示例性实施方案中，治疗性化合物可穿过细胞的胞质膜。例如，化合物的细胞渗透性可为至少约20％、50％、75％、80％、90％或95％。
在一些实施方案中，调节沉默调节蛋白的化合物对沉默调节蛋白的亲合力为约10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或较小。调节沉默调节蛋白的化合物可将沉默调节蛋白对其底物或者NAD+(或者其它辅因子)的表观Km降低(活化剂)或者提高(抑制剂)至少约2、3、4、5、10、20、30、50或者100倍。在一些实施方案中，Km值是使用本文所述的质谱分析来测定的。调节沉默调节蛋白的化合物可将沉默调节蛋白的Vmax提高或者降低至少约2、3、4、5、10、20、30、50或者100倍。调节沉默调节蛋白的化合物的调节SIRT1和/或SIRT3蛋白的脱乙酰酶活性的IC50可为小于约1nM、小于约10nM、小于约100nM、小于约1μM、小于约10μM、小于约100μM或约1-10nM、约10-100nM、约0.1-1μM、约1-10μM或者约10-100μM。调节沉默调节蛋白的化合物可调节SIRT1、SIRT2和SIRT3蛋白的脱乙酰酶活性至少约5、10、20、30、50或100倍，如在细胞测定中或在基于细胞的测定中所测量的。
沉默调节蛋白的调节
在一些方面，本发明提供调节沉默调节蛋白的水平和/或活性的方法及其使用方法。
在一些实施方案中，本发明提供使用调节沉默调节蛋白的化合物的方法，其中所述调节沉默调节蛋白的化合物抑制沉默调节蛋白，例如，降低沉默调节蛋白的活性。降低沉默调节蛋白的活性的抑制沉默调节蛋白的化合物可用于多种治疗应用，包括例如降低细胞寿命和治疗和/或预防各种疾病和障碍，其包括例如涉及衰老或者应激的疾病或者障碍、糖尿病、肥胖、神经变性疾病、心血管疾病、血凝固障碍、炎症和癌症。方法包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的调节沉默调节蛋白的化合物，例如，调节沉默调节蛋白的化合物。
在一些实施方案中，本文所述的调节沉默调节蛋白的化合物可单独使用或者与其它化合物组合使用。在一些实施方案中，可将两种或多种调节沉默调节蛋白的化合物的混合物给予需要的受试者。在另一实施方案中，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可与以下化合物中的一种或多种一起给药：瑟汀诺；salermide；EX-527；舒拉明；cambinol；新托米辛(splitomicin)；NF023(G蛋白拮抗剂)；NF279(嘌呤型受体拮抗剂)；Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-甲酸)；(-)-表没食子儿茶素(羟基在3,5,7,3',4',5'位上)；(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(羟基在5,7,3',4',5'位上和没食子酸酯在3位上)；氯化氰定(3,5,7,3',4'-五羟基氯化黄鎓盐(3,5,7,3',4'-pentahydroxyflavyliumchloride))；氯化翠雀啶(3,5,7,3',4',5'-六羟基氯化黄鎓盐(3,5,7,3',4',5'-hexahydroxyflavyliumchloride))；杨梅黄酮(大麻双酮；3,5,7,3',4',5'-六羟基黄酮)；3,7,3',4',5'-五羟基黄酮；棉黄素(3,5,7,8,3',4'-六羟基黄酮)；(S)-2-((S)-2-((S)-2-乙酰氨基丙酰氨基)-6-硫代乙酰氨基己酰氨基)丙酸(化合物5)；2-((3-(3-氟苯乙氧基)苯基)氨基)苯甲酰胺(化合物7)；(S)-8-溴-6-氯-2-戊基色满-4-酮(化合物8)。
在示例性实施方案中，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可与烟酸或者烟酰胺核苷组合给药。在另一实施方案中，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可与一种或多种以下化合物一起给药：烟酰胺(NAM)、白藜芦醇、紫铆因、非瑟酮、四羟反式芪、槲皮素；烟酰胺、丙戊酸、丁酸钠、伏立诺他、贝利司他(belinostat)、帕比司他(panobinostat)、恩替诺特(entinostat)、mocetinostat、罗米地辛(romidepsin)、abexinostat、resminostat、givinostat、quisinostat、SB939、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202、CG200745、ACY-1215、ME-344、kevetrin、莱菔硫烷和制滴菌素A。还在另一实施方案中，一种或者多种调节沉默调节蛋白的化合物可与一种或者多种治疗剂一起给药，以用于治疗或者预防多种疾病，包括，例如，癌症、糖尿病、神经变性疾病、心血管疾病、血液凝固、炎症、潮红、肥胖、衰老、应激等。在各种实施方案中，包含调节沉默调节蛋白的化合物的组合疗法可指的是(1)药物组合物，其包含一种或多种调节沉默调节蛋白的化合物与一种或多种治疗剂(例如本文所描述的一种或多种治疗剂)的组合；和(2)共同给药一种或多种调节沉默调节蛋白的化合物与一种或多种治疗剂，其中所述调节沉默调节蛋白的化合物和治疗剂并未配制于同一组合物(但是可以存在于同一试剂盒或包装内，例如泡罩包装或其它多隔室包装；使用者可分开的相连独立密封的容器(例如箔包)；或试剂盒，其中化合物及其它治疗剂在独立的容器中)。当使用独立的制剂时，所述调节沉默调节蛋白的化合物可以与另一种治疗剂同时给药、周期性给药、交错给药、在其之前给药、在其之后给药或以这些方式的组合形式给药。
在一些实施方案中，使用调节沉默调节蛋白的化合物来减轻、预防或治疗疾病或病症的方法还可以包括：提高沉默调节蛋白(例如人SIRT1、SIRT2和SIRT3，或其同系物)的蛋白水平。提高沉默调节蛋白水平可根据本领域已知的方法实现。
调节沉默调节蛋白水平的方法也包括调节编码沉默调节蛋白的基因的转录的方法、稳定/去稳定相应的mRNA的方法和本领域已知的其它方法。
细胞死亡/癌症和病毒感染
调节沉默调节蛋白的化合物也可用于治疗和/或预防癌症。在一些实施方案中，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的抑制沉默调节蛋白的化合物可用于治疗和/或预防癌症。可以使用调节沉默调节蛋白的化合物进行治疗的示例性的癌症是脑和肾癌；激素依赖性癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌和卵巢癌；淋巴瘤和白血病。在与实体瘤相关的癌症中，可以将调节化合物直接给药到肿瘤中。血细胞的癌症，例如白血病，可通过将调节化合物给药到血流或给到骨髓中进行治疗。还可以治疗良性细胞生长，例如疣。
化疗剂可以与本文所描述的具有抗癌活性的调节化合物共同给药，例如，诱导细胞凋亡的化合物或使细胞对应激反应敏感的化合物。化疗剂可以与本文所描述的调节沉默调节蛋白的化合物一起使用，引起细胞死亡或降低寿命或提高对应激反应的敏感性，和/或与其它化学治疗药剂组合使用。除了常规化学治疗之外，本文所描述的调节沉默调节蛋白的化合物也可以和反义RNA、RNAi或其它聚核苷酸一起使用，以抑制促使无用的细胞增生的细胞组分的表达。
包含调节沉默调节蛋白的化合物和常规化疗剂的组合疗法可比本领域已知的组合疗法有利，因为该组合可以使常规化疗剂在较低剂量下产生更强的作用。在一个优选实施方案中，当与调节沉默调节蛋白的化合物组合使用时，化疗剂或常规化疗剂的组合的抑制浓度(IC50)比单独化疗剂的IC50有效2倍，且更优选是5倍、10倍或甚至是25倍。相反地，当与本文所描述的调节沉默调节蛋白的化合物组合使用时，这种化疗剂或这种化疗剂的组合的治疗指数(TI)可以是单独常规化学疗法方案的治疗指数的至少2倍，且更优选是5倍、10倍或甚至25倍。
可将降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的抑制沉默调节蛋白的化合物给药至近期已接受或可能接受了辐射或毒素的患者。在一些实施方案中，一定量的辐射或毒素是在部分工作相关或医学过程中接受的，例如以预防措施形式施用。在另一个实施方案中，辐射或毒素的暴露是无意中接受的。在这种情况下，优选地，在暴露之后尽快给药所述化合物，以抑制细胞凋亡和随后的急性放射综合症的形成。
已经描述了用沉默调节蛋白抑制剂治疗癌症的方法。例如：US2011/0092695描述了SIRT1抑制剂在治疗癌症中的用途，具体地用于预防化疗抗性或者治疗慢性髓性白血病(CML)；WO2012/135149描述了SIRT1抑制剂在有效地再活化p53并由此治疗异常细胞生长(如癌症)中的用途；WO2008/082646描述了使用沉默调节蛋白抑制剂来活化甲基化沉默的基因，包括肿瘤抑制基因(例如，卷曲相关蛋白(frizzledrelatedprotein)、p53、上皮细胞钙粘蛋白、错配修复基因和细胞视黄醇结合蛋白-I)，以治疗包括癌症的疾病；和US20110178153描述了沉默调节蛋白抑制剂在治疗复发和化疗抗性癌症中的用途。
可通过给予调节沉默调节蛋白的化合物得到治疗的其它疾病包括病毒感染，如疱疹、HIV、腺病毒和HTLV-1相关的恶性和良性障碍。或者，细胞可获自受试者，将该细胞进行体外处理以除去一些不希望的细胞(如癌细胞)，并将其送回至相同或者不同的受试者。WO2012/106509描述了两种或多种沉默调节蛋白的抑制剂在抑制病毒产生中的用途。
神经元疾病/障碍
在一些方面，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的抑制沉默调节蛋白的化合物可用于治疗患有神经变性疾病和对中枢神经系统(CNS)、脊髓或周围神经系统(PNS)造成外伤性或机械性损伤的病人。神经变性疾病通常引起人脑质量和体积的减少，这可能归因于脑细胞的萎缩和/或死亡，相比于在属于衰老的健康人中，这种现象在患该病的患者中药严重得多。在长期正常脑功能之后，由于特定脑区域的进行性退化(例如神经细胞功能障碍和死亡)，神经变性疾病可逐渐发展。或者，神经变性疾病可快速发作，例如，与创伤或毒素相关的那些神经变性疾病。脑退化的实际发作可早于临床表现许多年。神经变性疾病的实例包括但不限于：阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏症(PD)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS；LouGehrig疾病)、弥漫性Lewy体疾病、舞蹈病-棘状红细胞增多症、原发性侧索硬化症、眼病(眼神经炎)、化疗引起的神经病(例如，由长春新碱、紫杉醇、硼替佐米(Bortezomib)所引起的)、糖尿病引起的神经病和弗里德赖希共济失调。提高沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗这些障碍及如下所述的其它障碍。
AD是一种导致记忆丧失、行为异常、人格改变和思维能力降低的CNS病症。这些丧失与特定类型脑细胞的死亡和它们之间的联系与支持性网状组织(例如胶质细胞)的衰变有关。最早的症状包括近事记忆丧失、判断力有缺陷和人格改变。PD是一种导致不受控制的身体动作、僵直、震颤和运动障碍的CNS病症，并且与产生多巴胺的脑区域中的脑细胞死亡有关。ALS(运动神经元疾病)是一种攻击运动神经元(连接脑与骨骼肌的CNS组分)的CNS障碍。
HD是另一种神经变性疾病，其可引起不受控制的运动、智能损失和情绪紊乱。泰-萨克斯病和桑德霍夫病是糖脂储存疾病，在这种疾病中，GM2神经节糖苷和β-己糖胺酶相关的糖脂底物聚集在神经系统中，并引发急性神经变性。
众所周知，细胞凋亡在免疫系统的AIDS发病机制中起作用。然而，HIV-1也引起神经系统疾病，其可以用本发明的调节沉默调节蛋白的化合物进行治疗。
神经元丧失也是朊病毒疾病的显著特点，所述疾病例如，人的克-雅病、牛的BSE(疯牛病)、绵羊和山羊的瘙痒病和猫的海绵状脑病(FSE)。降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防由于这些先前的疾病所造成的神经元丧失。
在另一个实施方案中，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防涉及轴突病(axonopathy)的任何疾病或病症。末端轴突病是由周围神经系统(PNS)神经元的一些代谢性或毒性紊乱导致的一类周围神经病。其是神经对代谢性或毒性紊乱的最常见的响应，并因此可以由代谢疾病(例如糖尿病，肾衰竭，缺失综合症(deficiencysyndrome)，例如营养失调和酒精中毒)或毒素或药物的作用所引起。患有末端轴突病的那些人通常存在对称的手套-长袜样感觉-运动障碍(glove-stockingsensori-motordisturbance)。深度腱反射和自主神经系统(ANS)功能也在受影响的区域丧失或减少。
糖尿病性神经病是与糖尿病相关的神经性病症。可能与糖尿病性神经病变相关的相对常见的病症包括：第三神经麻痹；单神经病；多发性单神经炎；糖尿病性肌萎缩；痛苦性多发性神经病；自主神经病；和胸腹神经病。
周围神经病是指代周围神经系统的神经损害的医学术语，其可由神经疾病或系统疾病的副作用所导致。周围神经病的主要病因包括癫痫发作、营养缺乏和HIV，但糖尿病是最有可能是的病因。
在示例性的实施方案中，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防多发性硬化(MS)，包括复发性MS和单症状的MS，及其它脱髓鞘病症，例如，慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)或与此相关的症状。
还在另一个实施方案中，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗神经损伤，包括，由于疾病造成的损伤、创伤(包括外科手术)或环境损伤(例如神经毒素、酒精中毒等等)。
降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物也可用于预防、治疗和减轻各种PNS障碍的症状。术语“周围神经病”包括宽范围的病症，在这些病症中，脑和脊髓外面的神经，即外周神经受到损害。周围神经病也可以被称为周围神经炎，或如果涉及许多神经，可以使用术语多发性神经病或多发性神经炎。
能使用降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物治疗的PNS疾病包括：糖尿病、麻疯病、夏-马-图三氏病(Charcot-Marie-Toothdisease)、Guillain-Barré综合症和臂丛神经病(颈和第一胸椎、神经干、束和臂丛的周围神经组分的疾病)。
在另一个实施方案中，调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防多谷氨酰胺疾病。示例性的多谷氨酰胺疾病包括：脊髓延髓肌萎缩(肯尼迪疾病)、亨廷顿病(HD)、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩(郝鸟河综合症，HawRiversyndrome)、1型脊髓小脑共济失调、2型脊髓小脑共济失调、3型脊髓小脑共济失调(马-约病)、6型脊髓小脑共济失调、7型脊髓小脑共济失调和17型脊髓小脑共济失调。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗中枢神经系统细胞的方法，用以在对流至细胞的血流减少的响应过程中防止受到损害。通常，可以预防的损害的严重程度在很大程度上取决于流向细胞的血液的减少程度和减少的持续时间。在一些实施方案中，可以防止细胞凋亡或坏死性细胞死亡。在进一步的实施方案中，可以防止缺血介导的损害，例如细胞毒性水肿或中枢神经系统组织缺氧症。在各实施方案中，中枢神经系统细胞可以是脊椎细胞或脑细胞。
另一个方面包括向患者给药调节沉默调节蛋白的化合物，用以治疗中枢神经系统缺血性病症。许多中枢神经系统缺血性病症可以用本文所描述的调节沉默调节蛋白的化合物进行治疗。在一些实施方案中，缺血性病症是中风，其导致任意类型的缺血性中枢神经系统损害，例如细胞凋亡或坏死性细胞死亡、细胞毒性水肿或中枢神经系统组织缺氧症。中风可以影响脑的任何区域，或由通常已知可导致发生中风的任何病源所引起。在该实施方案的一个替代性实施方案中，中风是脑干中风。在该实施方案的另一个替代性实施方案中，中风是小脑中风。在另一个实施方案中，中风是栓塞中风。在又一个替代性实施方案中，中风可以是出血性中风。在进一步的实施方案中，中风是血栓性中风。
还在另一个方面，可以给药调节沉默调节蛋白的化合物，用以在患有中枢神经系统缺血性病症之后减小缺血性核心的梗塞面积。此外，也可以有利地给药调节沉默调节蛋白的化合物，用以在患有中枢神经系统缺血性病症之后减小缺血半影区或过渡带的大小。
HDAC抑制剂(包括沉默调节蛋白抑制剂)重新编程细胞以产生多能细胞(例如，用于再生医学中)的用途已经被描述(WO2010/56831)。
在一些实施方案中，复方制剂方案可包含用于治疗或预防神经变性病症或与这些病症相关的继发性病症的药物或化合物。因此，复方制剂方案可以包含一种或多种沉默调节蛋白活化剂和一种或多种抗神经变性药剂。
炎性疾病
在其它方面，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防与炎症相关的疾病或障碍。可以在炎症发作之前、发作之时或发作之后给药可降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物。当预防性使用时，优选地，在任意炎症响应或症状开始前提供该化合物。给药该化合物可预防或减弱炎症响应或症状。
在另一个实施方案中，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗或预防变态反应和呼吸病症，包括哮喘、支气管炎、肺纤维化、过敏性鼻炎、氧中毒、肺气肿、慢性支气管炎、急性呼吸窘迫综合征和任何慢性阻塞性肺病(COPD)。该化合物可用于治疗慢性肝炎感染，包括乙型肝炎和丙型肝炎。
另外，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的调节沉默调节蛋白的化合物可用于治疗自身免疫疾病和/或与自身免疫疾病相关的炎症，例如关节炎，包括类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎和强直性脊柱炎、以及器官-组织自身免疫疾病(例如雷诺氏综合征)、溃疡性结肠炎、克罗恩病、口腔粘膜炎、硬皮病、重症肌无力、移植物排斥、内毒素休克、败血症、牛皮癣、湿疹、皮炎、多发性硬化、自身免疫性甲状腺炎、葡萄膜炎、系统性红斑狼疮、阿狄森氏病、自身免疫多腺性疾病(也称为自身免疫性多内分泌腺综合症)和格雷夫斯病。
在一些实施方案中，降低沉默调节蛋白的水平和/或活性的一种或多种调节沉默调节蛋白的化合物可以单独使用，或与用于治疗或预防炎症的其它化合物组合使用。
4.试验
本文所涉及的其它方法包括鉴别调节沉默调节蛋白的化合物或药剂的筛选法。药剂可以是核酸，例如适体。试验可以是基于细胞或以无细胞形式进行的。例如，试验可以包括：在可以用已知调节沉默调节蛋白的试剂来调节沉默调节蛋白的条件下，用试验试剂培养沉默调节蛋白(或使沉默调节蛋白与试验试剂接触)，且在试验试剂的存在下，监控或测定沉默调节蛋白的调节水平(相对于不存在试验试剂)。可通过测定沉默调节蛋白脱乙酰化底物的能力来确定沉默调节蛋白的调节水平。其它底物是获自人组蛋白H3和H4或乙酰化氨基酸的肽。底物可以是荧光性的。沉默调节蛋白可为SIRT1、SIRT2、SIRT3或其部分。在试验中沉默调节蛋白的调节水平可与存在一种或多种(单独地或同时地)本文所述化合物时的沉默调节蛋白的调节水平(其可用作阳性或阴性对照)进行对比。
在一些实施方案中，Trp5聚肽(Ac-RHKKAcW-NH,Biopeptide,SanDiego,CA)经His-SIRT1(1-747)、His-SIRT2(1-389)和His-SIRT3(102-399)的脱乙酰化通过不连续的OAADPr质谱试验进行测量，所述不连续OAADPr质谱测定测量OAADPr(2'-O-乙酰基-ADP-核糖)的产生。所有试验在室温的反应缓冲液(50mMHEPES,pH7.5,150mMNaCl,1mMDTT,0.05％BSA)中实施。将测试化合物(1μL，在DMSO中)用SIRT1(5nM)、SIRT2(10nM)或SIRT3(5nM)在反应缓冲液(50μL)中预培养20分钟。为了测定IC50，将Trp5聚肽在KM条件(在SIRT1的情况下为2μM、在SIRT2的情况下为10μM或在SIRT3的情况下为2.2μM)下，连同在KM的NAD(在SIRT1的情况下为80μM、在SIRT2的情况下为50μM和在SIRT3的情况下为130μM)一起添加，最终体积为100μL。在30分钟后，将该反应用10μL终止缓冲液(50mM烟酰胺在10％甲酸中)淬灭，得到0.9％甲酸和4.5mM烟酰胺的最终浓度。为准备用于分析的试验，将20μL反应体积混合于80μL的50:50乙腈:甲醇混合物中。将该板在与配有电喷雾离子化源的ABSciexAPI4000质谱仪连接的AgilentRapidFire200高通量质谱系统(Agilent,Wakefield)上以负离子MRM模式分析，所述负离子MRM模式在低分辨条件下监测母/子离子的转变600.1/345.9。峰数据使用RapidFireIntegrator软件(Agilent,SantaClara,CA)求积分。
5.药物组合物
本文所述化合物可使用一种或多种生理学或药学上可接受的载体或赋形剂，以用常规方法配制。例如，可以配制化合物及其可药用盐和溶剂合物，其通过例如注射(例如皮下(SubQ)、肌内(IM)、腹腔(IP))、吸入或吹入(通过口腔或鼻子)方式给药，或通过口服、口腔、舌下、透皮、鼻内、胃肠外或直肠给药。在一些实施方案中，可以在靶细胞存在的位点(即，在具体组织、器官或液体(例如血液、脑脊液等等)中)局部给药化合物。
可配制化合物以用于各种给药方式，包括系统和局部或定域给药。技术和制剂通常可见于Remington'sPharmaceuticalSciences(MeadePublishingCo.,Easton，PA)。对于胃肠外给药，优选注射给药，包括肌内、静脉内、腹腔内和皮下给药。对于注射，可将所述化合物在液体溶液，优选在生理学上相容的缓冲液(例如Hank溶液或Ringer溶液)中配制。另外，可将该化合物配制成固体形式，并且在使用之前立即将其再溶解或悬浮。也包括冻干形式。
对于口服给药，药物组合物可以采取例如片剂、糖锭或胶囊形式，其用常规方法与可药用赋形剂一起制备，赋形剂例如粘合剂(例如预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羟基乙酸钠)；或湿润剂(例如十二烷硫酸钠)。片剂可以利用本领域熟知的方法进行涂布。用于口服的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆或混悬液形式，或它们可以干燥产物形式存在，在使用之前，用水或其它合适载剂进行配制。这种液体制剂可以通过常规方法，用可药用添加剂进行制备，所述添加剂例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水载剂(例如杏仁油、油酯、乙醇或分馏植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。视情况，该制剂还可含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。可适当地配制用于口服给药的制剂，以控制释放活性化合物。
对于吸入给药(例如肺部递送)，化合物可用合适的喷射剂(二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适气体)，以气雾喷射剂形式方便地递送，所述气雾喷射剂用加压包装或雾化器提供。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过以下进行确定：提供阀门来递送计量量。可以配制用于吸入器或吹入器的例如凝胶的胶囊和药筒，使其含有化合物与合适粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
可以将化合物配制为注射用的胃肠外给药形式，例如通过快速推注或连续输液。注射用制剂可存在于单位剂型中，例如在安瓿瓶或多剂量容器(加入防腐剂)中。组合物可以采用在油或含水载剂中的混悬液、溶液或乳液形式，并且可以包含配制试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，该活性组分可为粉末形式，其在使用之前，用合适载剂(例如无菌无热原水)进行配制。
还可以将化合物配制为直肠用组合物的形式，例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规栓剂基质(例如可可脂和/或其它甘油酯)。
除了先前所描述的制剂之外，也可以将化合物配制为长效制剂。这种长效制剂可以用植入(例如皮下或肌内)或肌肉注射进行给药。由此，例如，化合物可以用合适的聚合物或疏水性物质(例如在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制，或以微溶的衍生物形式，例如微溶的盐形式。控制释放制剂也包括贴片。
在一些实施方案中，可以配制本文所述化合物，用于递送至中枢神经系统(CNS)(在Begley等人(2004)Pharmacology&Therapeutics104,29-45中进行了评述)。药物递送至CNS的常规方法包括：神经外科策略(例如脑内注射或脑室内输液)；药剂的分子变换(例如制备包含转运肽的嵌合融合蛋白，该转运肽对与本身不能穿过BBB的药剂组合的内皮细胞表面分子具有亲合性)，其尝试利用一种BBB的内源性运输途径；为了提高药剂的脂质溶解性而设计的药理学策略(例如水溶性药剂与脂质或胆固醇载体的共轭)；通过高渗透性破坏使BBB的完整性暂时破坏(由于将甘露糖醇溶液输注到颈动脉中，或使用生物活性剂，例如血管紧张素肽所导致的)。
脂质体是容易注射的另外的药物递送系统。因此，在本发明的方法中，还可以以脂质体递送系统形式给药活性化合物。脂质体为本领域技术人员所熟知。脂质体可以由各种磷脂(例如胆固醇、磷脂酰胆碱硬脂胺)形成。适用于本发明方法的脂质体包括所有类型的脂质体，包括但不限于：小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。
制备本文所述化合物的制剂(尤其是溶液)的另一个方法是使用环糊精。环糊精是指α-、β-或γ-环糊精。环糊精详细描述在Pitha等人的美国专利4,727,064中，将其引入本文作为参考。环糊精是葡萄糖的环状低聚物；这些化合物与任何药物(该药物分子可以与环糊精分子寻找亲脂体的空隙匹配)形成包合络合物。
快速崩解或溶解的剂型可用于药学活性剂的快速吸收，尤其是口腔和舌下吸收。速融剂型有益于病人，例如老年和儿科病人，他们难以吞入常见的固体剂型，例如锭和片剂。另外，速融剂型克服了与例如咀嚼剂型有关的缺点，其中活性剂保留在病人口腔中的持续时间在确定味道屏蔽剂的量和病人讨厌活性剂的咽喉砂砾感的程度中起重要作用。
药物组合物(包括化妆品制剂)可包含义重量剂约0.00001至100％，例如0.001至10％或0.1％至5％的一种或多种本文所述化合物。在另一个实施方案中，该药物组合物包含：(i)0.05至1000mg的本发明化合物或其可药用盐，和(ii)0.1至2克的一种或多种可药用赋形剂。
在一些实施方案中，将本文所述化合物加入含有局部载体(其通常适合于局部药物的施用)且包含本领域已知的任意这种物质的局部制剂中。可以选择所述局部载体，以便提供所需形式的组合物，例如软膏剂、洗剂、乳膏剂、微乳剂、凝胶剂、油、溶液，等等，并且所述局部载体可包括天然存在的或合成来源的物质。优选地，所选择的载体不会不利地影响局部制剂的活性剂或其它组分。本文使用的合适局部载体的例子包括：水、醇及其它无毒有机溶剂、甘油、矿物油、硅酮、凡士林、羊毛脂、脂肪酸、植物油、对羟苯甲酸酯、蜡，等等。
制剂可以是无色无味的软膏剂、洗剂、乳膏剂、微乳剂和凝胶剂。
所述化合物可以加入软膏剂中，软膏剂通常是半固体制剂，其通常基于凡士林或其它石油衍生物。正如本领域技术人员所理解的那样，所使用的具体软膏基质是可以提供最佳药物递送的基质，并且优选地，同时提供其它所需要的特性，例如柔润性，等等。如同其它载体或载剂，软膏基质应该是惰性的、稳定的、无刺激性的和非敏感性的。
可将化合物加入洗剂中，洗剂通常是不用摩擦就可以施用于皮肤表面的制剂，并且通常是液体或半流体制剂，其中固体颗粒(包括活性剂)存在于水或醇基质中。洗剂通常是固体的混悬液，并且可包含水包油型的液体油性乳液。
可将化合物加入乳膏剂中，其通常是粘性液体或半固体乳液，可以是水包油型或油包水型。乳膏基质是可用水洗涤的，并且含有油相、乳化剂和水相。油相通常包括凡士林和脂肪醇，例如鲸蜡醇或十八醇；水相通常(尽管不是必须的)在体积方面超过油相，并且通常含有湿润剂。如Remington's(上文)所述，在乳膏制剂中的乳化剂通常是非离子型、阴离子型、阳离子型或两性表面活性剂。
可将化合物加入微乳剂中，其通常是两种不互溶液体(例如油和水)的热力学稳定、各向同性的澄清分散液，这两种液体通过表面活性剂分子的界面膜使之稳定(EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology(NewYork：MarcelDekker，1992)，第9卷)。
可将化合物加入凝胶制剂中，其通常是由以下组成：由小的无机颗粒构成的混悬液(两相系统)或基本上均匀地分布在整个载体液体中的大的有机分子(单相凝胶剂)。尽管凝胶剂通常使用载体水溶液，但醇和油也可以用作载体液体。
另外的活性剂也可以包括在制剂中，例如，其它消炎剂、镇痛药、抗微生物剂、抗真菌药、抗生素、维生素、抗氧化剂和通常存在于防晒制剂中的防晒剂，包括但不限于：邻氨基苯甲酸酯、二苯甲酮(尤其是二苯甲酮-3)、樟脑衍生物、肉桂酸酯(例如甲氧基肉桂酸辛酯)、二苯甲酰甲烷(例如丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷)、对氨基苯甲酸(PABA)及其衍生物，和水杨酸酯(例如水杨酸辛酯)。
在一些局部制剂中，所述活性剂以一定量存在，其范围为制剂的大约0.25wt.％至75wt.％，优选为制剂的大约0.25wt.％至30wt.％，更优选为制剂的大约0.5wt.％至15wt.％，最优选为制剂的大约1.0wt.％至10wt.％。
眼睛的病症可以通过例如系统性、局部、眼内注射化合物或通过嵌入可释放化合物的持续释放装置来治疗或预防。化合物可以用药学可接受的眼用载剂递送，以使该化合物保持与眼睛表面接触足够的时间，使化合物渗入眼睛的角膜和内部区域，例如前房、后房、玻璃体、眼房水、玻璃体液、角膜、虹膜/毛状体、晶状体、脉络膜/视网膜和巩膜。药学可接受的眼用载剂可以例如是软膏剂、植物油或包封物质。或者，本发明化合物可以直接注射到玻璃体和房水中。在另一个可选实施方案中，可将所述化合物以系统地给药，例如，通过静脉输液或注射，用于治疗眼睛。
本文所述化合物可以在无氧环境中保存。例如，组合物可以制备成口服给药的密封胶囊，例如Pfizer,Inc的Capsugel。
细胞，例如用本文所述化合物进行体外处理的细胞，可以按照向患者给予移植物的方法进行给药，其可以伴随例如给药免疫抑制剂药物(例如环孢子菌素A)。对于药物配制的一般原理，读者可参考CellTherapy:StemCellTransplantation,GeneTherapy,andCellularImmunotherapy,byG.Morstyn&W.Sheridaneds,CambridgeUniversityPress,1996；和HematopoieticStemCellTherapy,E.D.Ball,J.Lister&P.Law,ChurchillLivingstone,2000。
可以在细胞培养物或实验动物中利用标准药学方法测定化合物的毒性和治疗效果。LD50是使50％群体致死的剂量。ED50是在50％群体中治疗有效的剂量。毒性和治疗效果之间的剂量比(LD50/ED50)是治疗指数。显示出高治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用显示出毒性副作用的化合物，但应该仔细设计递送系统，使这种化合物靶向感染组织的位点，以便最小化对未感染细胞的潜在损害，并由此降低副作用。
由细胞培养试验和动物研究获得的数据可用于配制在人类中使用的剂量范围中。这种化合物的剂量可以在循环浓度(其包括几乎没有毒性或无毒的ED50)的范围之内。根据所使用的剂型和所使用的给药途径，剂量可以在该范围之内变化。对于任何化合物，最初可以由细胞培养试验来评估治疗有效剂量。剂量可以在动物模型中进行配制，以获得在细胞培养中测定的循环血浆浓度范围，其包括IC50(即，达到症状最大抑制一半时的试验化合物的浓度)。这种信息可用于更准确地测定人的有效剂量。血浆中的水平可以例如用高效液相色谱测定。
6.试剂盒
本文还提供了试剂盒，例如，治疗目的的试剂盒，或调节细胞寿命或调节细胞凋亡的试剂盒。试剂盒可包含例如一种或多种预先测定剂量的本文所述化合物。试剂盒可以任选地包含使细胞与化合物接触的装置和使用说明书。装置包括注射器、支架及其它装置，该装置将化合物引入到受试者(例如受试者的血管)中或将其施加到受试者的皮肤上。
还在另一实施方案中，本发明提供了物质的组合物，其包含本发明化合物和另一治疗剂(与在组合疗法和联用组合物中使用的治疗剂相同的治疗剂)，其是独立剂型，但彼此相关。本文使用术语“彼此相关”是指：将独立的剂型包装在一起，或彼此相连，使得显而易见的是所述独立剂型是意欲销售的，且作为同一方案的一部分进行给药。优选地，将化合物与其它药剂一起包装在泡罩包装或其它多室包装中，或者包装成使用者可以分开(例如，在两个容器之间的刻痕线处撕开)的相连独立密封的容器(例如箔包等)。
在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其在独立的容器中包含：a)本发明化合物；和b)另一种治疗剂，例如说明书的其它地方所描述的那些治疗剂。
除非另有提及，否则，本方法的实践将会使用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统方法，其是在本领域技术范围之内。这种技术在文献中进行了充分解释。参见例如，MolecularCloningALaboratoryManual,第2nd版,Sambrook,Fritsch和Maniatis编辑(ColdSpringHarborLaboratoryPress:1989)；DNACloning,卷I和II(D.N.Glover等,1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gaited.,1984)；Mullis等人，美国专利4,683,195；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑，1984年)；TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑，1984年)；CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc.,1987)；ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress,1986)；B.Perbal,APracticalGuideToMolecularCloning(1984)；thetreatise,MethodsInEnzymology(AcademicPress,Inc.,N.Y.)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.Miller和M.P.Calos编辑，1987年,ColdSpringHarborLaboratory)；MethodsInEnzymology,卷154和155(Wu等人编辑),ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer和Walker编辑，AcademicPress,London,1987年)；HandbookOfExperimentalImmunology,卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，1986年)；ManipulatingtheMouseEmbryo,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1986)。
实施例
通过参考下列实施例更容易了解对本发明的一般描述，这些实施例仅为说明本发明一些方面及实施方案，而不是用来以任何方式限制本发明。
实施例1.编码库技术(ELT)筛选
利用从编码库技术(ELT)筛选(Clark,M.A.等人(2009)NatChemBiol5,647-654和Deng,H.等人(2012)JMedChem55,7061-7079)的体外SIRT3亲合力选择来鉴定初始SIRT1/2/3泛抑制剂。ELT是强大的活性分子鉴定平台(hitidentificationplatform)，其使用化学上典型的多种DNA编码的小分子库的大集合，筛选所述小分子库对所需蛋白质靶标的亲合力。所述技术使得可以访问在扩展的库集合中具有结构多样性的一组广泛的化学类型。它也是有吸引力的平台，因为它使用量可忽略的靶标蛋白质进行选择性实验，并且它在不考虑配体的功能活性的情况下鉴定配体。在过去的几年中，ELT已经成功地用于鉴定对一些可溶性靶标的活性分子(Evindar,G.等人(2009)238thNationalMeetingoftheAmericanChemicalSociety,Washington,DC,August16-20,ppMEDI-126；Graybill,T.L.(2009)237thNationalMeetingoftheAmericanChemicalSociety,SaltLakeCity,UT,March22-26,ppMEDI-297；Davie,C.P.等人(2010)240thNationalMeetingoftheAmericanChemicalSociety,Boston,MA,UnitedStates,August22-26,ppMEDI-150；Ding,Y.等人(2010)240thNationalMeetingoftheAmericanChemicalSociety,Boston,MA,UnitedStates,August22-26,ppMEDI-150；和Gentile,G.等人(2012)BioorgMedChemLett22,1989-1994)。
ELT选择活动是针对Flag-SBP标记的SIRT3构造进行的。将Flag-SIRT3-SBP固定在链亲和素基质顶端，并在三种不同的条件下进行选择：单独的SIRT3；SIRT3加上β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)；和SIRT3加上硫代乙酰基-肽AceCS2底物(TRSGKs-AcVMRRLLR)(Jin,L.等人(2009)JBiolChem284,24394-24405)。SIRT3选择条件用于筛选用杂芳基部分封端的3周期线性库(化合物10,图3)。所述库通过以下方法建立：将16个二酸结构单元(周期1)偶联至ELT头片(headpiece，HP)，其允许用134个二胺(周期2)进一步加工所述第二羧酸。然后将周期2的第二胺用570个杂芳基结构单元(周期3)官能化，得到具有120万个列举化合物的ELT库。
ELT亲合力选择通过以下方法进行三轮：在1)无β-NAD/无肽底物、2)100μMβ-NAD(Sigma)，或3)20μMTRSGK硫代乙酰基VMRRLLR的存在下，在链亲和素基质顶端(Phynexus)捕捉2μgFlag-hSIRT3(118-399)-SBP。使用缓冲液的无靶标对照选择在不存在SIRT3蛋白的情况下同时实施。链亲和素顶端在选择缓冲液中预洗涤：50mMTris(pH7.5)、150mMNaCl、0.1％Tween-20和0.1mg/mL剪切的鲑鱼精DNA(sssDNA,Ambion)、0.1mg/mLBSA(Ambion)和5mMβ-巯基乙醇(BME)。在选择的第一轮，在1)无β-NAD/无肽底物、2)100μMβ-NAD，或3)20μM硫代乙酰化肽的存在下，将2μgFlag-hSIRT3(118-399)-SBP蛋白固定在预洗涤的顶端上。当需要时，将顶端用含有相应的辅因子和底物的缓冲液洗涤两次。在室温，在相应的辅因子和底物的存在下，将集合的ELT库(5纳摩尔)经过固定的SIRT3，持续1小时。将顶端用含有相应的辅因子和底物的选择缓冲液洗涤8次并用含有相应的辅因子和底物的无BSA选择缓冲液洗涤2次。结合的分子通过以下方法加热洗脱：在72℃，使不含辅因子和底物的无BSA选择缓冲液经过顶端，持续10分钟。将冷却的热洗脱液通过以下方法后澄清(post-clear)两次：使所述洗脱液经过链亲和素顶端持续15分钟以除去任何变质的SIRT3和基质粘合剂。将新鲜的BSA和sssDNA添加至所有样品中，并将相应的辅因子和底物按需要添加至洗脱液。第2轮按第1轮所述实施，其在相应的辅因子和底物以及后澄清的第1轮产物的存在下，使用在链亲和素顶端上新鲜固定的SIRT3。第3轮按第1轮所述实施，其在相应的辅因子和底物以及后澄清的第2轮产物的存在下，使用在链亲和素顶端上新鲜固定的SIRT3，不同的是，最后两次洗涤和洗脱是使用无BSA和无ssDNA的选择缓冲液，且第3轮产物未进行后澄清。使用定量PCR将每轮选择的产物定量。将第3轮产物使用Illumina测序平台进行测序。
将人SIRT3-(118-399)克隆至修饰的pET21b载体(Novagen)中。蛋白质在大肠杆菌BL21-Gold(DE3)细胞(Stratagene)中表达为与具有整合的TEV蛋白酶位点的六组氨酸亲和标记物的N端融合。将单一菌群在37℃接种在含有100μg/ml氨苄西林的LB培养基中，以250rpm涡旋，直到A600达到0.3。然后将该培养物冷却至18℃，以250rpm涡旋，直到A600达到0.6-0.8。添加1-(2-异丙基硫基)-β-D-吡喃半乳糖苷(IPGT)至0.3mM的最终浓度，并在18℃持续表达，以160rpm涡旋过夜。细胞通过离心收集，并将离心沉淀物再悬浮于细胞裂解缓冲液(200mMNaCl、5％甘油、5mM2-巯基乙醇和25mMHEPES-NaOH,pH7.5)中并超声处理以破碎所述细胞。将上清液通过在4℃以10,000×g离心40分钟从细胞碎片中分离并加载至Ni-NTA柱(Qiagen)上，所述Ni-NTA柱(Qiagen)用含有200mMNaCl、5％甘油、5mM2-巯基乙醇、20mM咪唑和25mMHEPES-NaOH,pH7.5的缓冲液平衡。将所述柱用5个柱体积的含有200mMNaCl、5％甘油、5mM2-巯基乙醇、50mM咪唑和25mMHEPES-NaOH,pH7.5的缓冲液洗涤，然后用含有200mMNaCl、5％甘油、5mM2-巯基乙醇、250mM咪唑和25mMHEPES-NaOH,pH7.5的缓冲液洗脱。将洗脱的蛋白质在细胞裂解缓冲液中透析并用TEV蛋白酶(Invitrogen)在4℃消化过夜以除去N-端His标记物。将蛋白质加载在用细胞裂解缓冲液平衡的第二Ni-NTA柱上。将未标记的蛋白质用含有200mMNaCl、5％甘油、5mM2-巯基乙醇、5mM咪唑和25mMHEPES-NaOH,pH7.5的缓冲液洗脱。将纯化的蛋白质用含有200mMNaCl、5mM2-巯基乙醇和20mMTris-HCl,pH8.0的缓冲液透析，并浓缩。将蛋白质通过用透析缓冲液经S200柱(GEHealthcare)洗脱进一步纯化至95％纯度，其通过由CoomassieBrilliantBlueR-250染色的SDS-PAGE分析进行评估，并在透析缓冲液中浓缩至10-15mg/ml。
将获自ELT筛选的测序数据转移至SpotfireTM中的用于可视化和分析的立体散点图中，其中每个轴代表库中的一个周期的多样性(参见图4)。将背景噪声、单一活性分子和低拷贝数分子除去以简化数据分析和允许密切观察立方体内的更高度富集的家族和特征。
主要化学类型通过在立方体中单一点处交叉的水平和垂直线表示。这些线在周期3中限定平面，所述周期3源于4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺结构单元，该结构单元通过氯的胺替代连接至周期2。在平面内选择的水平和垂直线源于选择的周期3结构单元和具体周期1或周期2的结构单元(分别为噻吩-2,5-二羧酸和2-(哌啶-4-基)乙胺)的组合。
由于两条蓝色线所描绘的周期1和周期2结构单元的较大多样性，最常观察到的药效团通过以大点代表的交叉产物(化合物11c)表示。为了简单，与DNA的连接点被乙酰胺取代。鉴于对周期1和周期2残基的选择产物观察到的较大差异性，取决于分析哪条线，选择周期1和周期2另外的结构单元(间苯二甲酸和2-(哌嗪-1-基)乙胺)并合成简单的2×2库以证实非DNA(off-DNA)生物化学活性(参见图5)。这产生足量的非DNA化合物以证实该化学类型的活性和允许潜在的非DNA初步SAR研究。
一类新的有效SIRT1/2/3泛抑制剂通过利用编码库技术识别，以丰富与SIRT3相互作用的多种ELT库的集合的分子。基于ELT测序数据的分析，SAR研究被实施并揭示：选择的周期3噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺是核心骨架并且对于化学类型抑制功能是重要的，且周期1和周期2可为更加可变。
实施例2.2×2库结构的合成
由选择的化学类型组装的2×2库结构通过以下方法完成：羧化市售可得的4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶(化合物12,参见图5)以得到羧酸化合物13。用草酰氯处理化合物13，并用氨/二噁烷淬灭该中间体酰氯，得到通用的4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺中间体化合物14。随后将在化合物14上的氯用4-(2-Boc-氨基乙基)哌啶或者4-(2-Boc-氨基乙基)哌嗪替代，得到Boc-保护的前体(化合物15a和15b)。Boc基团通过用三氟乙酸/CH2Cl2处理除去，并将所得的胺(化合物16a和16b)在标准酰胺偶合条件(HATU,DIEA)下与3-(乙基氨基甲酰基)苯甲酸或者5-(乙基氨基甲酰基)噻吩-2-甲酸反应，得到化合物11a-d。其它公开的类似物中的大部分通过相似的路线(即，取代，然后脱保护和酰胺偶合)合成。
实施例3.在SIRT1/2/3生物化学试验中评价代表性非DNA化合物
在使用SIRT1、SIRT2和SIRT3的生物化学试验(具体试验条件参见详细描述)中评价了四种非DNA合成的代表性化合物(参见表1,化合物11a-d)的抑制最小肽底物(Ac-RHKKAcW-NH2)的沉默调节蛋白介导的脱乙酰作用的能力(Dai,H.等人(2010)JBiolChem285,32695-32703)。评价了活性数据，连同物理化学性质和计算的性质(动力学溶解度，CHILogD(Stepanic,V.等人(2012)EurJMedChem47,462-472),tPSA,CLogP)，以测定类药性。
表1.无标记物的ELT筛选活性分子的沉默调节蛋白抑制活性
iIC50值由三个单独的滴定曲线测定。每个示出的IC50值代表至少三次测定的平均值，单个值的变化量<50％。iiLogD是通过基于HPLC的亲脂性试验34以如下方法测定的：通过反相HPLC测量色谱疏水性指数(CHI)值并基于已知标准将它们转化成LogD量度。iii动力学溶解度通过化学发光氮检测(CLND)溶解度试验测定。34将DMSO母液在磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)中培养(1小时)，过滤并通过CLND测量。
具有代表性的常见化学类型化合物11c显示优异的SIRT3效力(IC50为4nM)并证实：非DNA化学类型是针对SIRT3有用的抑制剂，并且不仅为具有强亲合力的配体。还观察到其对SIRT1和SIRT2具有类似的效力。总之，在2×2库中的所有化合物(化合物11a-d)是SIRT1、SIRT2和SIRT3的非常有效的泛抑制剂。用哌嗪替代化合物11c的哌啶(化合物11d)仅轻微降低对SIRT2的效力(11c的效力是11d的≤2倍)，而将对SIRT1和SIRT3的抑制降低至约1/7-1/8。相应的基于苯基的类似物(化合物11a和11b)显示类似的趋势。比较用苯基替代化合物11c和11d的噻吩(化合物11a和11b)的影响揭示出对SIRT1和SIRT2的效力的普遍降低(降低至1/2-1/3)，然而观察到SIRT3活性的改善(化合物11a,SIRT3IC50＝1nM)。化合物11a-d的进一步分析揭示：更加碱性的哌嗪使得CLogP,LogD降低且同时使得水溶性提高至10倍。噻吩至苯的变化对于生理化学性质具有很小的影响。
非DNA化合物(化合物11a、11b、11c和11d)代表了新的高效的一类SIRT1/2/3泛抑制剂。尽管鉴定新的沉默调节蛋白抑制剂骨架的目标实现了，但是抑制剂化合物11a-d倾向于具有欠佳的类药性(MW、PSA、溶解度、芳香环数)，这限制了它们的发展。
实施例4.构效关系(SAR)研究
为了探索改进化合物11c(最有效的类似物)的生理化学性质且同时维持生物化学效力的可能性，将嘧啶基噻吩甲酰胺核心保持并从化合物11c的DNA标记物端系统地截短。将一系列截短的类似物(参见表2)制备并在SIRT1、SIRT2和SIRT3生物化学抑制试验中评价(具体试验条件参见详细描述)。
表2.11c截短的类似物的SIRT1/2/3抑制
iIC50值是由三个独立的滴定曲线测定的。每个所示IC50值代表至少三次测定的平均值，单个值的变化<50％。
将噻吩上的乙酰胺取代基变为叔丁酯(化合物17,参见表2)、羧酸(化合物18)或者氢(化合物19)导致与化合物11c相比SIRT1、SIRT2或者SIRT3抑制的适度降低(降低至约1/2)，这意味着末端乙酰胺对活性而言并不重要。
由于上面这些结果，评价了除去噻吩环的影响。用氨基甲酸叔丁酯替代化合物19中的噻吩的化合物15a导致SIRT1和SIRT3活性降低至1/3至1/4，而SIRT2的抑制保持不变。当将化合物19中的噻吩换成乙酰胺(化合物20)时，我们观察到SIRT1(降低至1/18)、SIRT2(降低至1/3)和SIRT3(降低至1/7)活性的更加显著的降低。这种趋势随着胺类似物化合物16a中的乙酰胺的除去而继续(与化合物20相比，SIRT1、SIRT2和SIRT3的效力分别降低至1/15、1/5和1/5)。用哌啶替代氨基乙基哌啶的化合物21将沉默调节蛋白抑制活性急剧降低至微摩尔水平。最后，SIRT1/2/3抑制活性未保留在严重截短的乙胺化合物22或者氯化合物14中，这表明单独的噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺核心不足以产生可观察到的SIRT1/2/3抑制。
在提出的截短的类似物中，化合物20呈现最平衡的SIRT1/2/3抑制活性(23-110nM)和低分子量(MW＝347)。为了进一步优化该效力，制备了更大的一组化合物(参见表3)，其中探索了三个组的变化：1)在化合物20上的乙酰胺官能团及其使用硫代乙酰基-、特戊酰基-、磺酰胺或者吡咯烷基团的替代物，2)改变连接基长度(n)以测定在官能团和噻吩并嘧啶核心之间的最佳距离，和3)探索了将哌啶改变为更加极性的哌嗪环系统(其中X＝CH或者N)的影响。
表3.脂肪族官能团和连接基长度对于SIRT1/2/3抑制的影响
iIC50值是由三个单独的滴定曲线测定的。每个所示IC50值代表至少三次测定的平均值，单个值的变化<50％。
通常，乙基哌啶类(其中X＝CH和n＝2)是比乙基哌嗪类(其中X＝N和n＝2)更为有效的抑制剂(比较化合物20与24，25与26，28与30，31与32)。然而，对于吡咯烷类似物(化合物34和35)，该哌嗪(其中X＝N)类似物与对应的哌啶(其中X＝CH)类似物相比，对于SIRT1、SIRT2或者SIRT3显示相似的或者较大的效力。
连接基长度的变化在乙酰胺类(化合物20和23)、特戊酰胺类(化合物27-29)和吡咯烷类(化合物33和34)中进行评价。对于特戊酰胺，乙基连接基(化合物28，其中n＝2)比更长的丙基连接基(化合物29，其中n＝3)稍微更有效。较短的亚甲基连接基(化合物27，其中n＝1)导致SIRT1、SIRT2和SIRT3效力急剧降低。具有短(其中n＝1)连接基长度的这种效力的急剧降低在其它类似物(化合物23和33)中广泛地观察到。
用硫代酰胺(化合物25和26)替代乙酰胺(化合物20和24)是良好耐受的，从而导致效力的适度改善。将乙酰基变为更加亲脂的特戊酰胺或者极性磺胺类对于抑制沉默调节蛋白而言是有利的。有趣地是，含有用于抑制的最佳结构元素的磺酰胺化合物31(其中X＝CH和n＝2)是SIRT1、SIRT2和SIRT3的几纳摩尔抑制剂，并且在研究中代表最有效的泛抑制剂之一。在评价吡咯烷类似物(化合物33-35)时观察到，相比于SIRT1和SIRT2，选择性特性似乎稍微有利于SIRT3抑制。通常，在抑制剂的该区域中似乎存在较宽的官能团耐受性(例如亲脂的、极性的、碱性的、氢键供体或者氢键受体基团)。
也评价了杂芳香噻吩并[3,2-d]嘧啶核心的SAR。通过利用有效的泛抑制剂化合物28作为比较剂，制备了一小系列的杂芳香甲酰胺核心，并评价了它们抑制SIRT1/2/3的能力(参见表4)。用呋喃并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物36，其中X＝O)替代化合物28(其中X＝S)的核心导致SIRT1/2/3效力降低至1/15-1/40。为了评价杂芳香核心的嘧啶部分，制备了两个噻吩并吡啶甲酰胺骨架。用CH替代了N3的第一噻吩并吡啶类似物(化合物37，其中Y＝CH和Z＝N)导致SIRT1/2/3抑制的适度降低(降低至1/3至1/4)。而用CH(化合物38，其中Y＝N和Z＝CH)替代N1导致效力更显著的降低(降低至1/30-1/63)。为了评估噻吩环的未取代部分的敏感性，在7位引入甲基(化合物39)，其将所有这三种酶的活性降低至1/4-1/12。
表4.噻吩并[3,2-d]嘧啶核心的修饰对SIRT1/2/3抑制的影响
i以μM表示的IC50值由三个单独的滴定曲线测定。每个所示IC50值代表至少三次测定的平均值，单个值的变化<50％。
最后，噻吩并[3,2-d]嘧啶甲酰胺的SAR通过以下方法评价(参见表5)：在噻吩并[3,2-d]嘧啶(化合物28，其中R＝(C＝O)NH2)的6位进行数个小的调节。单甲基化酰胺(化合物41，其中R＝-(C＝O)NHCH3)显示SIRT2活性的急剧损失(10μM)和不可测的SIRT1或SIRT3活性。类似地，将甲酰胺变为羧酸化合物40(其中R＝COOH)或者完全去除甲酰胺的化合物42(其中R＝H)，在测试浓度下导致不可测的SIRT1、SIRT2或SIRT3抑制。这些结果表明，甲酰胺对维持SIRT1/2/3抑制是重要的，并且可能参与蛋白质的关键接触中。修饰甲酰胺的敏感性类似于EX-527(化合物4,Napper,A.D.等人(2005)48,8045-8054)中的甲酰胺观察到的SAR。
表5.甲酰胺的修饰对SIRT1/2/3抑制的影响
iIC50值由三个单独的滴定曲线测定。每个所示IC50值代表至少三次测定的平均值，单个值的变化<50％。
为改善11c的生理化学性质而降低分子量，这导致将乙酰胺化合物20鉴定为效力和降低的分子量的良好折衷。进一步的SAR显示：硫代乙酰基(化合物25)、叔丁基-酰胺(化合物28)和磺酰胺(化合物31)是特别有效的泛抑制剂。化合物31的低分子量(MW＝383)和几纳摩尔效力使它成为示例性化合物。
实施例5.SIRT3的X射线结构研究
已有数个报告关于沉默调节蛋白的晶体结构(Jin,L.等人(2009)JBiolChem284,24394-24405；Sanders,B.D.等人(2010)1804,1604-1616；Szczepankiewicz,B.G.等人(2012)77,7319-7329；Avalos,J.L.等人(2005)17,855-868和Finnin,M.S.等人(2001)8,621-625)，包括SIRT2、SIRT3和SIRT5。沉默调节蛋白具有可变的N-和C-端区域和通常保守的催化核心，其含有两个裂片(lobe)；一个大的Rossmann裂片和一个较小的裂片，其含有结构上的锌结合基序。乙酰化底物结合在裂缝中，所述裂缝在两个裂片与朝NAD+的烟酰胺核苷部分突出的乙酰化赖氨酸的交界处形成。在较小裂片上的柔性环在脱乙酰化反应期间关闭，以防止亚氨酸酯中间体暴露于溶剂。
先前，我们已经报告了人SIRT3(PDB代号：3GLS)、底物结合的AceCS2/SIRT3(PDB代号：3GLR)、亚氨酸酯反应中间体模拟物SIRT3-AceCS2-Ks-ac-ADPR(PDB代号：3GLT)和三元carbaNAD/AceCS2/SIRT3(PDB代号：4FVT)的晶体结构。在此研究中，通过X射线晶体学在人SIRT3络合物中评价一种鉴定的ELT活性分子(化合物11c)和两个最有效的截短的泛SIRT1/2/3抑制剂(化合物28和31)。SIRT3和抑制剂的晶体通过与SIRT3(118-399)共结晶得到。SIRT3/化合物11c和SIRT3/化合物31的晶体分别衍射至1.70和然而，对于SIRT3/化合物28，该晶体的衍射质量差。结果，不得不将化合物28浸渍/交换至SIRT3/化合物31晶体中以实现适合的衍射()。
大体上，二元SIRT3/抑制剂结构的总体折叠类似于在先前报告的人SIRT3(PDB代号：3GLR,3GLS,3GLT,3GLU,4FVT)结构中观察到的总体折叠。Rossmann折叠是可高度叠加的，并且在结合至底物、辅因子中间体(Jin,L.等人(2009)JBiolChem284,24394-24405和Szczepankiewicz,B.G.等人(2012)JOrgChem77,7319-7329)或者活性位点靶向抑制剂(本申请提供)后存在结构域关闭。在与不同配体结合的SIRT3结构中的最大区别出现在柔性环I154-Y175处，其向下靠近烟酰胺C口袋。
为了更好地理解它们的作用模式，将三种泛抑制剂(化合物11c、28和31)与SIRT3一起结晶。噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺抑制剂结合在大Rossmann折叠和小锌结合结构域之间的活性位点裂缝中，从而除了底物通道之外还占据了烟酰胺C-口袋。与先前描述的其它SIRT3结构的比较揭示了相似的蛋白质折叠，除了柔性环区域，在该处F157与噻吩并嘧啶核心发生π-堆叠相互作用。抑制剂的甲酰胺与烟酰胺结合口袋内的残基发生关键氢键结合相互作用，类似于carba-NAD。SAR研究确证，需要甲酰胺基团以维持抑制活性。
SIRT3/化合物31和SIRT3/化合物11c晶体在18℃通过使用悬滴蒸气扩散方法得到。液滴包含1μl蛋白质/化合物混合物和1μl结晶缓冲液。对于SIRT3/31，结晶条件为0.1MHEPESpH7.5、20％w/vPEG8000。用于SIRT3/11c的结晶缓冲液为0.1MTrispH8.0、20％PEG4000或者20％PEG6000。随后将SIRT3/化合物31和SIRT3/化合物11c晶体在含有20％甘油的母液中冷冻防护(cryo-protected)，然后在液氮中速冻。随后将浸渍在化合物28中的SIRT3/化合物31晶体在含有20％甘油和10mM化合物28的母液中冷冻防护。衍射数据在ShanghaiSynchrotronRadiationFacility(SSRF)beamline工作站BL17U1和APS21-ID-D处收集并使用Xia2和HKL2000处理。SIRT3结构是通过利用分子置换，使用底物结合的AceCS2/SIRT3结构(PDB代号：3GLR)作为搜索模型(参见表6)解析的。另外，将用于每一衍射数据组的所有参数使用Mosflm和Scala重新处理，以及精修统计(refinementstatistics)获自Refmac，即CCP4套件的一部分。
表6：晶体衍射和精修参数(RefinementParameters)
*括号中的值对于最高分辩率壳(highest-resolutionshell)
SRT1/2/3抑制剂化合物11c、28和31相同地结合至催化活性位点( )，从而占据乙酰基赖氨酸底物通道和烟酰胺C-口袋。在结合的过程中，当抑制剂位于催化位点时，所述小裂片轻微转移至较大的Rossmann折叠上，且柔性环(I154-Y175)向下靠近抑制剂。化合物11c、28和31的结合相互作用的更精密的评价揭示了，芳基甲酰胺与蛋白质表面形成四个氢键，类似于carba-NAD+的相似的烟酰胺部分。化合物11c、28和31的6-甲酰胺羰基接受I230和D231的NH的氢键，所述I230和D231位于蛋白质主链上。化合物11c、28和31的甲酰胺NH与D231的羧酸氧的孤电子对形成氢键，以及化合物11c、28和31的其它甲酰胺的氢与结构桥连水结合，其继而与I154和A146氢键结合。SIRT3/AceCS2/carba-NAD+复合物的烟酰胺与I154、A146和I230，以及与相邻的结构水形成类似的氢键接触。NAD的烟酰胺甲酰胺的氢键识别基序由小分子沉默调节蛋白抑制剂(化合物11c、28和31)非常良好地模拟，并解释了在表5中观察到的SAR。因此，对于缺乏在烟酰胺C-口袋中形成这些关键氢键的能力的化合物(化合物40，其中R＝CO2H；化合物41，其中R＝CONHCH3和化合物42，其中R＝H)，观察到沉默调节蛋白的抑制活性的大量降低。
关于底物通道，所述噻吩并[3,2-d]嘧啶芳香核心沿着疏水锌结合裂片，排列在受体口袋的顶部。所述噻吩并[3,2-d]嘧啶与F157的苯环π-堆叠以及嘧啶氮(N1)与F157酰胺NH供体氢键结合。其它嘧啶氮(N3)充分暴露于溶剂以促进与自由水的氢键结合。化合物11c的乙基哌啶采取展开的构型，其沿着小结构域的疏水裂缝的顶部座落(通过Y165、F180、I230、I291和F294限定)，而芳基酰胺朝向N-乙酰基赖氨酸底物通道。这种架子的疏水性质解释了为何亲脂的哌啶(化合物11a、11c、20、28和31)是比极性哌嗪类似物(化合物11b、11d、24、30和32)(其中哌嗪氮可能位于疏水表面的中间)更有效力的沉默调节蛋白抑制剂。
此外，在底物通道的下部，芳基酰胺NH与V292氢键结合。在其它底物结合结构(3GLR和4FVT)中，V292与来自底物的N-ε-乙酰基赖氨酸形成氢键。对于SIRT1/2/3抑制剂，随着与V292相互作用的NH供体的酸性增强，观察到抑制的适度改善。例如，比较磺酰胺(化合物25)与乙酰胺(化合物20)对SIRT1/2/3抑制活性，揭示了效力8至28倍的改善。然而，SIRT1/2/3抑制剂缺乏可利用的NH供体以与V292相互作用，如吡咯烷(化合物34)所示，从而仅导致沉默调节蛋白的抑制活性的适度改变。
X射线结构也为连接基长度(n)的SAR提供了解释(参见图3)。哌啶(化合物20和28)的乙基连接基(其中n＝2)最佳地调整酰胺NH使其与V292形成氢键，而亚甲基(化合物23&27，其中n＝1)大概是由于太短以至于不能最佳地形成这种相互作用，从而导致效力的降低。较长的丙基哌啶(化合物29，其中n＝3)被认为是要扭曲以维持这种相互作用，但是活性稍微损失(降低至2/3–1/3)。最后，在化合物11c上的2-噻吩上取代的末端乙酰胺与Glu296形成氢键。这种伸出底物空腔的乙酰胺暴露于溶剂，其中它是在初始DNA上的分子(on-DNAmolecule)中发现的DNA连接基的连接点。考虑到小分子抑制剂与催化位点的其它相互作用的总和，除去该部分对于抑制沉默调节蛋白的活性具有极小的影响(比较化合物19和11c)。
催化位点的较大部分(空间通常被NAD+的呋喃核糖至腺嘌呤位点占据)在SIRT3/化合物11c、SIRT3/化合物28和SIRT3/化合物31结构中仍然在很大程度上未被占据，除了大量水或结晶介质。该空间在未来的设计中可更有效地进行探索。形成NAD+结合口袋的残基在SIRT1/2/3之间是高度保守的，其可能解释了为何这些化合物是泛抑制剂。有趣地是，在文献中已经描述了的多种小分子沉默调节蛋白抑制剂具有甲酰胺。烟酰胺，EX-527(化合物4)和苯甲酰胺(例如化合物7)均具有对取代敏感的甲酰胺。有趣的是测定这些其它含甲酰胺的沉默调节蛋白抑制剂如何结合并且赋予它们的选择性特征(它们应该类似地结合在烟酰胺C-口袋中)。
综合来说，基于噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺的SIRT1/2/3抑制剂所观察到的SAR与见于SIRT3/化合物11c、SIRT3/化合物28和SIRT3/化合物31结构中所观察到的配体相互作用高度一致。当针对一组激酶、细胞核受体、离子通道、转运蛋白和GPCR广泛表征时，化合物11c和28是大体选择性的(XC50>10μM)。另外，它们是差的hERG结合剂(化合物11c和28,>50μM)且对多种CYP(化合物28,1A2,2C19,2D6和3A4>50μM,2C9＝7.2μM)无活性。此外，化合物28具有低LogD(2.73)、高溶解度(297μM)且在微粒体中稳定(人CLint＝15.8μL/min/mg,小鼠CLint＝12.7μL/min/mg)。
相对于目前可利用的沉默调节蛋白抑制剂，抑制剂化合物11c和截短的类似物(化合物28和31)代表了显著的进步。它们的竞争性作用模式已经通过X射线晶体学数据验证，并且SAR与该结构信息一致。这种新的抑制剂类型的效力使它们成为用于理解调节SIRT1、SIRT2和SIRT3的脱乙酰酶活性的生物效果的有价值的工具。
实施例6.乙酰基-P65试验
在U2OS细胞中，化合物25和28和化合物4(Napper,A.D.等人(2005)JMedChem48,8045-8054)已经证实抑制乙酰基-p65的沉默调节蛋白介导的脱乙酰作用(参见图6)。
在一些实施方案中，将U2OS细胞用血细胞计数器计数并稀释至1.5X105个细胞/ml的浓度。将BacMamp65和BacMamp300-HAT病毒以1％和1％(vol/vol)添加至稀释的细胞。将含有所述病毒的细胞混悬液的40μl等分试样用多滴分配器置于384孔板上。在7小时后，在DMSO中实施化合物25、28和化合物4(在下文中称为试验化合物)的2倍连续稀释。随后将试验化合物在中间化合物板中用培养基稀释(20倍)，并将4μL的各试验化合物通过液体处理器从中间板转移至细胞板。在病毒转导24小时后，将细胞板中的培养基通过以下方法除去：倒置并轻弹所述板，并用纸巾吸干板。将30μl细胞裂解缓冲液(25mMHEPESpH7.4,0.5％TritonX-100,1mg/mlDextran500,0.1％BSA,300mMNaCl,2mMMgCl2,1x蛋白酶抑制剂混合物)添加至各孔以裂解该细胞。在室温用细胞裂解缓冲液培养该细胞30分钟后，将10μl和3μl等分试样的细胞裂解液转移至测试板，并将含有3μl等分试样的细胞裂解液的测试板用另外的7μl细胞裂解缓冲液稀释以得到10μl的最终体积。在细胞裂解液中的乙酰基-p65和总p65蛋白使用AlphaScreen试验形式(PerkinElmer)测量。用于检测乙酰基-p65蛋白的抗体是生物素化的抗-HA抗体(Roche,12158167001)和抗-乙酰化K310-p65抗体(Abcam,ab19870)。用于检测总p65蛋白的抗体是生物素化的抗-HA抗体(Roche,12158167001)和抗-p65抗体(SantaCruz,sc109)。将6μl稀释的抗体(最终浓度各自为2nM)和稀释在检测缓冲液(25mMHEPESpH7.4,0.5％TritonX-100,1mg/mlDextran500,0.1％BSA)中的蛋白质A包被的受体珠粒(最终浓度为20μg/ml)的混合物添加至含有细胞裂解液的测试板中。在将所述板在室温培养2小时后，将2μl链亲和素包被的供体珠粒(在检测缓冲液中稀释至最终浓度20μg/ml)添加至同一板中。在将所述板在黑暗中再培养2小时后，通过PHERAstar微量培养板读数器读板。在图中显示的数据代表了相对于DMSO对照样品，在试验样品中的信号的百分数。在一些实施方案中，U2OS、HEK293MSRII细胞可用于本文所述的乙酰基p65试验中以检测本发明的SIRT1/2/3抑制剂。
实施例7.4-(4-((二甲基氨基)甲基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物43)的制备:
步骤1.4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(化合物13)的合成：
在0℃的氮气下，向2,2,6,6-四甲基哌啶(1.484mL,8.79mmol)在无水THF(15mL)中的搅拌溶液中滴加2.5MBuLi/己烷(3.52mL,8.79mmol)。将该反应混合物在0℃搅拌30分钟，然后在-78℃将该混合物滴加至4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶(化合物12；1.00g,5.86mmol)在无水THF(15mL)中的溶液中，持续30分钟。将该反应在-78℃搅拌1小时，然后将干冰(2.58g,58.6mmol)添加至该反应中。将该反应温热至室温，持续2小时。将该反应用EtOAc(100mL)稀释并用0.1MHCl洗涤。将有机层用MgSO4干燥并蒸发至干，得到4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(化合物13；1.1g,83％)。MS(ESI)C7H3ClN2O2S的计算值：213.96；实测值：215.0[M+H]。
步骤2.4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物14)的合成:
在0℃的氮气下，向草酰氯(4.17mL,47mmol)在无水二氯甲烷(50mL)中的溶液中添加DMF(0.8mL)。将该溶液在0℃搅拌30分钟，然后在0℃滴加4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(13；5.04g,23.5mmol)在二氯甲烷(50mL)中的混悬液，持续10分钟。将该反应混合物加热至60℃，保持3.5小时，并浓缩至干。将该粗制的酰氯溶于二噁烷(80mL)中，并在0℃滴加182mL(91mmol)的0.5M氨在二噁烷中的溶液，持续10分钟。将该反应混合物在0℃搅拌30分钟，温热至室温，用水(150mL)稀释并用CH2Cl2(3x)萃取。将合并的有机层用水(2x)、NaHCO3稀水溶液、盐水洗涤并浓缩至干。将产物从CH3CN中重结晶，得到4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物14；0.842g)。浓缩母液，得到第二批(化合物14；1.499g)和第三批(化合物14；0.259g)的4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺，总共2.6g(52％)化合物14。MS(ESI)C7H4ClN3OS的计算值：212.98；实测值：214.0[M+H]。
步骤3.4-(4-((二甲基氨基)甲基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物43)的合成:
将4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(14；0.043g,0.200mmol)、N,N-二甲基-1-(哌啶-4-基)甲胺(0.028g,0.200mmol)和DIEA(42μL,0.24mmol)在NMP(1mL)中的溶液加热至100℃，保持2小时。将该反应混合物浓缩至干，将残留物溶于DMSO中并通过质量定向制备型HPLC纯化。将级分冻干，得到4-(4-((二甲基氨基)甲基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺，其为TFA盐(化合物43；0.039g,46％)。MS(ESI)C15H21N5OS的计算值：319.15；实测值：320[M+H]。
表7的化合物34和44–52以相似的方式制备。
实施例8.4-(4-(乙酰氨基甲基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物23)的制备:
将4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(0.043g,0.200mmol)和N-(哌啶-4-基甲基)乙酰胺(14；0.031g,0.200mmol)在吡啶(1mL)中的溶液在80℃加热1.5小时。将该反应混合物浓缩至干，并通过质量定向制备型HPLC纯化，得到4-(4-(乙酰氨基甲基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺，其为TFA盐(化合物23；0.052g,37％)。MS(ESI)C15H19N5O2S的计算值：333.13；实测值：334[M+H]。
表7的化合物31、33和53以相似的方式制备。
实施例9.4-(4-((甲基氨基)甲基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物55)的制备:
步骤1.((1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)甲基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(化合物54)的合成:
将4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(14；0.043g,0.200mmol)和甲基氨基甲酸叔丁酯(0.200mmol)在NMP(1mL)中的溶液在100℃加热2小时。将该反应混合物浓缩至干，并通过质量触发制备型HPLC纯化。将级分冻干，得到((1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)甲基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(化合物54；0.200mmol,假定定量)，其直接用于后续步骤中。MS(ESI)C19H27N5O3S的计算值：405.18。
步骤2.4-(4-((甲基氨基)甲基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物55)的合成:
将化合物54(假定0.200mmol)溶于CH2Cl2(5mL)中并添加TFA(0.3mL)。将该混合物在室温搅拌18小时，浓缩至干，溶于CH3CN/H2O混合物中并冻干，得到4-(4-((甲基氨基)甲基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺，其为TFA盐(化合物55；0.082g,98％)。MS(ESI)C14H19N5OS的计算值：305.13；实测值：306[M+H]。
表7的化合物56以类似的方式制备。
实施例10.(2-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物15a)的制备:
将4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(14；1.30g,6.08mmol)、(2-(哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(1.39g,6.08mmol)和DIEA(1.05mL,6.08mmol)在CH3CN(80mL)中的溶液加热回流1小时。将该反应混合物冷却至室温并浓缩至干。将残留物悬浮在MeOH(10mL)中，然后添加水(90mL)。将该混合物超声处理，将析出物通过过滤收集，用水洗涤并在高真空下干燥，得到(2-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物15a；2.23g,90％)。MS(ESI)C19H27N5O3S的计算值：405.18；实测值：406[M+H]。
表7的化合物182、183和184以类似的方式制备。
实施例11.4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺·HCL盐(化合物16a)的制备:
向(2-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(15a；0.840g,2.07mmol)在CH2Cl2(40mL)中的溶液中添加三氟乙酸(10mL)。将该反应混合物搅拌72小时，浓缩至干并用CH2Cl2(2x)加工(chased)。将残留物用MeOH稀释，然后添加1.25MHCl在MeOH(2mL)中的溶液中。向所得油状物中添加乙醚(15mL)和戊烷(5mL)。将该溶液超声处理，产生固体，将固体通过倾析分离并在真空下干燥，得到4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺，其为盐酸盐(化合物16a；1.09g)。MS(ESI)C14H19N5OS的计算值：305.13；实测值：306[M+H]。
表7的化合物185以类似的方式制备。
实施例12.4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺·TFA盐(化合物16a)的制备:
将(2-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(15a；2.23g,5.5mmol)与25％TFA/CH2Cl2(40mL)一起搅拌3小时。将该混合物浓缩至干并用乙醚研磨，得到4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺，其为TFA盐(16a；3.74g,假定定量)。MS(ESI)C14H19N5OS的计算值：305.13；实测值：306[M+H]。
实施例13.(2-(4-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物15b)的制备:
将4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(14；0.250g,1.17mmol)、DIEA(245μL,1.40mmol)和(2-(哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.332g,1.40mmol)在CH3CN(15mL)中的溶液在60℃加热18小时。将该反应混合物冷却至室温并过滤收集固体产物。将固体用CH3CN(2x10mL)洗涤并干燥，得到(2-(4-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯，其为白色固体(化合物15b；0.440g,93％)。MS(ESI)C18H26N6O3S的计算值：406.18；实测值：407[M+H]。
实施例14.4-(4-(2-氨基乙基)哌嗪-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物16b)的制备:
将(2-(4-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(15b；0.440g,2.46mmol)的溶液与25％TFA/CH2Cl2(8mL)一起搅拌6小时。将该溶液浓缩至干并用乙醚和戊烷的混合物研磨，得到4-(4-(2-氨基乙基)哌嗪-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺，其为二-TFA盐(化合物16b；0.844g,64％)，一种棕色固体。MS(ESI)C13H18N6OS的计算值：306.13；实测值：307[M+H]。
实施例15.((1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(化合物57)的制备:
将4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(14；0.128g,0.6mmol)和(哌啶-4-基甲基)氨基甲酸叔丁酯(0.193g,0.9mmol)在CH3CN中的溶液在80℃加热18小时。将该反应混合物浓缩至干，悬浮在EtOAc中，用饱和NaHCO3、水、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，并浓缩至干。将粗产物通过快速色谱纯化(0至10％MeOH/CH2Cl2梯度)，得到((1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(化合物57；0.224g,95％)。MS(ESI)C18H25N5O3S的计算值：391.17；实测值：392[M+H]。
表7的化合物58以类似的方式制备。
实施例16.4-(4-(氨基甲基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物59)的制备:
向((1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(57；0.125g,0.32mmol)在THF(20mL)和水(5mL)中的溶液中添加浓HCl(0.5mL)。将该反应混合物在室温搅拌3小时并浓缩。将残留物用乙醚(2x)、戊烷加工，并干燥，得到4-(4-(氨基甲基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物59；0.117g,假定定量)。MS(ESI)C13H17N5OS的计算值：291.12；实测值：292[M+H]。
实施例17.N1-(2-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)-N3-乙基间苯二甲酰胺(化合物11a)的制备:
步骤1.3-(乙基氨基甲酰基)苯甲酸甲酯(化合物61)的合成:
将3-(甲氧基羰基)苯甲酸(化合物60；1.0g,5.55mmol)、HATU(2.53g,6.65mmol)、DIEA(1.44mL,8.31mmol)在DMF(15mL)中的溶液在室温搅拌10分钟，然后添加乙胺(70％，在水中，8.84mL)，并将该反应混合物在室温搅拌18小时。将该混合物用乙酸乙酯稀释，将有机层用饱和NaHCO3、水(3x)洗涤，干燥(Na2SO4)，浓缩并用甲醇加工，得到3-(乙基氨基甲酰基)苯甲酸甲酯，其为橙色油状物(化合物61；1.20g,假定定量)，其不经进一步纯化直接用于后续步骤中。MS(ESI)C11H13NO3的计算值：207.09。
步骤2.3-(乙基氨基甲酰基)苯甲酸(化合物62)的合成:
向3-(乙基氨基甲酰基)苯甲酸甲酯(61；1.20g,5.55mmol)在甲醇(50mL)中的溶液中添加在水(10mL)中的LiOH(0.666g,27.8mmol)。将该反应混合物在室温搅拌72小时，浓缩至干，溶于水中，并用浓HCl酸化至pH＝1-2。将析出物通过过滤收集，用水洗涤并干燥，得到3-(乙基氨基甲酰基)苯甲酸(化合物62；0.793g,在2个步骤后为74％)。MS(ESI)C10H11NO3的计算值：193.07；实测值：194[M+H]。
步骤3.N1-(2-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)-N3-乙基间苯二甲酰胺(化合物11a)的合成：
向3-(乙基氨基甲酰基)苯甲酸(62；0.040g,0.207mmol)和HATU(0.076g,0.200mmol)在DMF(3mL)中的混合物中添加DIEA(0.175mL,1.0mmol)。将该反应混合物搅拌10分钟，然后添加4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(16a；0.166mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜，并将产物通过制备型HPLC纯化，得到N1-(2-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)-N3-乙基间苯二甲酰胺(化合物11a；0.090g,77％)。MS(ESI)C24H28N6O3S的计算值：480.19；实测值：481[M+H]。
表7的化合物11b、11c、11d和63和表8的化合物190、193、194以相似的方式制备。
实施例18.5-((2-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酰基)噻吩-2-甲酸叔丁酯(化合物17)的制备:
步骤1.5-(乙基氨基甲酰基)噻吩-2-甲酸甲酯(化合物65)的合成:
向5-(甲氧基羰基)噻吩-2-甲酸(化合物64；0.500g,2.68mmol)和HATU(1.23g,3.23mmol)在DMF(10mL)中的溶液中添加DIEA(1.16mL,6.70mmol)。将该反应混合物在室温搅拌10分钟，然后添加为固体的乙胺盐酸盐(0.219g,2.68mmol)。将该反应混合物搅拌7小时，并添加另一批乙胺盐酸盐(0.219g,2.68mmol)和DIEA(1.16mL,6.70mmol)，并继续搅拌，总共持续24小时。向该反应混合物中添加饱和NaHCO3(30mL)和水(50mL)。将析出的产物通过过滤收集，并用水洗涤，得到5-(乙基氨基甲酰基)噻吩-2-甲酸甲酯，其为棕色固体(化合物65；0.555g,97％)。MS(ESI)C9H11NO0S的计算值：213.05；实测值：214[M+H]。
步骤2.5-(乙基氨基甲酰基)噻吩-2-甲酸(化合物66)的合成:
向5-(乙基氨基甲酰基)噻吩-2-甲酸甲酯(化合物65；0.555g,2.60mmol)在THF(5mL)中的溶液中添加LiOH(0.124g,5.18mmol)在水(5mL)中的溶液。将该反应混合物在室温搅拌72小时，浓缩至干，溶于水中，并用浓HCl酸化至pH＝1。将析出物通过过滤收集，用水洗涤并在真空下干燥，得到5-(乙基氨基甲酰基)噻吩-2-甲酸，其为灰白色固体(化合物66；0.221g,43％)。MS(ESI)C8H9NO3S的计算值：199.03；实测值：200[M+H]。
步骤3.5-((2-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酰基)噻吩-2-甲酸叔丁酯(化合物17)的合成:
将5-(叔丁氧基羰基)噻吩-2-甲酸(化合物66；0.057g,0.25mmol)、HATU(0.114g,3.0mmol)和DIEA(248μL,2.0mmol)在DMF(3mL)中的溶液在室温搅拌5分钟。添加4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺2,2,2-三氟乙酸盐(化合物16a；0.105g,0.25mmol)，并将该反应混合物在室温搅拌过夜。将该反应混合物用水稀释，用CH2Cl2(3x)萃取，用NaHCO3水溶液(饱和)、盐水洗涤，并浓缩至干。将粗物质通过制备型HPLC纯化，并将级分冻干，得到5-((2-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酰基)噻吩-2-甲酸叔丁酯(化合物17；0.048g,37％)。MS(ESI)C24H29N5O4S2的计算值：515.17；实测值：516[M+H]。
表7的化合物67以类似的方式制备。
实施例19.5-((2-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酰基)噻吩-2-甲酸(化合物18)的制备：
将5-((2-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酰基)噻吩-2-甲酸叔丁酯(化合物17；0.0341g,0.066mmol)在1:1TFA/CH2Cl2(5mL)中的溶液中搅拌过夜。将该反应混合物浓缩至干，用乙醚/戊烷的混合物研磨并在真空下干燥，得到标题化合物，其为固体(化合物18；0.0216g,71％)。MS(ESI)C20H21N5O4S2的计算值：459.10；实测值：460[M+H]。
实施例20.4-(4-(2-(噻吩-2-甲酰氨基)乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物19)的制备:
向4-[4-(2-氨基乙基)-1-哌啶基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物16a；0.025g,0.060mmol)和HATU(0.0272g,0.072mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(3mL)中的混合物中添加噻吩-2-甲酸(0.0076g,0.06mmol)和DIPEA(0.052mL,0.298mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜。将产物通过制备型HPLC纯化，得到4-(4-(2-(噻吩-2-甲酰氨基)乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物19；0.025g,81％)。MS(ESI)C19H21N5O2S2的计算值：415.11；实测值：416[M+H]。
表7的化合物20以类似的方式制备。
实施例21.4-(4-(2-硫代乙酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物25)的制备:
向4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺2,2,2-三氟乙酸盐(16a；0.428g,1.0mmol)和Na2CO3(0.845g,8mmol)在EtOH(10mL)和水(50mL)中的溶液中添加二硫代乙酸乙酯(136μL,1.2mmol)。将该反应混合物在室温搅拌6小时，浓缩至干。添加水(50mL)，并将固体通过过滤收集。将固体用甲醇研磨并在真空下干燥，得到4-(4-(2-硫代乙酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物25；0.137g,38％)。MS(ESI)C16H21N5OS2的计算值：363.12；实测值：364[M+H]。
表7的化合物26以类似的方式制备。
实施例22.4-(4-(特戊酰氨基甲基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物27)的制备:
将4-(4-(氨基甲基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺盐酸盐(59；0.0915g,0.28mmol)悬浮在EtOAc(20mL)和水(5mL)中。添加碳酸钠(150mg,1.39mmol)，然后添加特戊酰氯(69μL,0.56mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜并产生固体产物。将该反应混合物蒸发除去有机层，将固体通过过滤收集，用水洗涤并干燥，得到4-(4-(特戊酰氨基甲基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物27；0.085g,81％)。MS(ESI)C18H25N5O2S的计算值：375.17；实测值：376[M+H]。
表7的化合物186以相似的方式制备。
实施例23.4-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物28)的制备:
步骤1.4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(化合物69)的合成:
向4-(2-氨基乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(化合物68；1.0g,4.38mmol)和碳酸钠(1.39g,13.1mmol)在乙酸乙酯(15mL)和水(5mL)中的溶液中添加特戊酰氯(1.07mL,8.70mmol)，并将该反应混合物在室温搅拌18小时。将该反应混合物用乙酸乙酯稀释，将有机层用水、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(化合物69；假定定量)。
步骤2.N-(2-(哌啶-4-基)乙基)特戊酰胺(化合物70)的合成:
将4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(69；假定4.38mmol)用THF(80mL)稀释并与浓HCl(3mL)一起搅拌过夜。将该反应混合物浓缩至干，用乙酸乙酯和水稀释。将该混合物碱化(pH＝14)，将水层用乙酸乙酯(1x)和CH2Cl2(3x)萃取。将有机层干燥(MgSO4)并浓缩，得到N-(2-(哌啶-4-基)乙基)特戊酰胺(化合物70；0.831g,在2个步骤后为89％)。MS(ESI)C12H24N2O的计算值：212.19；实测值：213[M+H]。
步骤3.4-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物28)的合成:
将4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(14；0.534g,2.5mmol)和N-(2-(哌啶-4-基)乙基)特戊酰胺(0.530g,2.5mmol)和DIEA(866μL,5mmol)在CH3CN(30mL)中的溶液在80℃加热过夜。将该反应混合物浓缩并在硅胶色谱上纯化(0至10％MeOH/CH2Cl2梯度)，得到4-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物28；0.727g,75％)，其为黄色固体。MS(ESI)C19H27N5O2S的计算值：389.19；实测值：390[M+H]。
实施例24.4-(4-(3-特戊酰氨基丙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物29)的制备:
步骤1.2-(3-(吡啶-4-基)丙基)异二氢吲哚-1,3-二酮(化合物72)的合成:
在0℃，向3-(吡啶-4-基)丙-1-醇(化合物71；5.0g,36.5mmol)、邻苯二甲酰亚胺(5.25g,36.5mmol)和三苯基膦(12.25g,38.0mmol)在THF(100mL)中的搅拌溶液中滴加DIAD(8.1g,43.8mmol)。将该反应混合物缓慢温热至室温，然后搅拌过夜。将该混合物用0.1NHCl稀释并用乙醚洗涤。将水萃取物用6N氢氧化钠碱化，并用EtOAc萃取。将有机萃取物用1N氢氧化钠和水洗涤，干燥(MgSO4)，并浓缩，得到粗制的2-(3-(吡啶-4-基)丙基)异二氢吲哚-1,3-二酮(化合物72；10g,假定定量)，其直接用于后续步骤中。MS(ESI)C16H14N2O2的计算值：266.11。
步骤2.3-(吡啶-4-基)丙-1-胺(化合物73)的合成:
向2-(3-(吡啶-4-基)丙基)异二氢吲哚-1,3-二酮(72；10g粗品,假定36.5mmol)在MeOH(50mL)中的溶液中添加水合肼(5.5g,110mmol)。将该混合物在室温搅拌18小时，过滤并将滤液浓缩成油状物。将油状物用氯仿研磨，过滤，并浓缩滤液，得到3-(吡啶-4-基)丙-1-胺(化合物73；4.0g,80％)，其直接用于后续步骤中。MS(ESI)C8H12N2的计算值：136.10。
步骤3.(3-(吡啶-4-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物74)的合成:
向3-(吡啶-4-基)丙-1-胺(73；4g,29.4mmol)和三乙胺(6.06g,60mmol)在THF(200mL)中的溶液中滴加焦碳酸二叔丁酯(7.8g,36.0mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜。添加水和乙酸乙酯，并用乙酸乙酯(3x)萃取水层。将合并的有机层干燥，浓缩并通过柱色谱纯化(1％MeOH/CH2Cl2)，得到(3-(吡啶-4-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物74；6.0g,88％)，其不经进一步纯化直接使用。MS(ESI)C13H20N2O2的计算值：236.15。
步骤4.(3-(哌啶-4-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物75)的合成:
将(3-(吡啶-4-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(74；6.0g,25.3mmol)在90％乙酸(80mL)中的溶液用PtO2(0.600g)处理。在40℃，将该混合物在氢气氛(50psi)下搅拌12小时。将催化剂通过过滤除去，并蒸发溶剂。将残留物溶于水中，并用1NNaOH调节至pH11。将水层用CH2Cl2(3x)萃取，将合并的有机层干燥(Na2SO4)并浓缩，得到(3-(哌啶-4-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物75；3.0g,50％)。MS(ESI)C13H26N2O2的计算值：242.20；实测值：243[M+H]。
步骤5.(3-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物76)的合成：
将4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(14；0.176g,0.82mmol)、(3-(吡啶-4-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(75；0.200g,0.82mmol)和DIEA(573μL,3.3mmol)在CH3CN(20mL)中的溶液在80℃加热20小时。将该反应混合物浓缩至干，并通过柱色谱纯化(0至10％MeOH/CH2Cl2梯度)，得到(3-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物76；0.216g,62％)。MS(ESI)C20H29N5O3S的计算值：419.20；实测值：420[M+H]。
步骤6.4-(4-(3-氨基丙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺2,2,2-三氟乙酸盐(化合物77)的合成：
将(3-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(76；0.200g,0.476mmol)在TFA(2.5mL)/CH2Cl2(7.5mL)中的溶液在室温搅拌4小时。将该反应混合物浓缩至干，用乙醚和戊烷加工，并在真空下干燥，得到为橙色固体的4-(4-(3-氨基丙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺2,2,2-三氟乙酸盐(化合物77；0.373g,假定定量)，其不经进一步纯化直接使用。MS(ESI)C15H21N5OS的计算值：319.15；实测值：320[M+H]。
步骤7.4-(4-(3-特戊酰氨基丙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物29)的合成:
将4-(4-(3-氨基丙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺2,2,2-三氟乙酸盐(77；0.100g,0.230mmol)和碳酸钠(0.121g,1.41mmol)在EtOAc(5mL)和水(2mL)中的溶液在室温搅拌5分钟。添加特戊酰氯(30μl,243mmol)，并将该反应混合物在室温搅拌18小时。分离各层，将有机层用水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩至干。将粗产物在CH3CN中重结晶，得到4-(4-(3-特戊酰氨基丙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物29；0.0385g,41％)。MS(ESI)C20H29N5O2S的计算值：403.20；实测值：404[M+H]。
实施例25.4-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌嗪-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物30)的制备:
向4-(4-(2-氨基乙基)哌嗪-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺二(2,2,2-三氟乙酸盐)(16b；0.107g,0.200mmol)在乙酸乙酯(5mL)和水(2mL)中的溶液中添加碳酸钠(212mg,2.0mmol)，然后添加特戊酰氯(36μL,0.293mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜，浓缩至干，悬浮在水中并过滤，得到为白色固体的4-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌嗪-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物30；0.062g,81％)。MS(ESI)C18H26N6O2S的计算值：390.18；实测值：391[M+H]。
表7的化合物24以类似的方式，用乙酰氯替代特戊酰氯制备。
实施例26.4-(4-(5,5-二甲基-1,3-二噁烷-2-基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物78)的制备:
将4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(14；0.712g,3.33mmol)和4-(5,5-二甲基-1,3-二噁烷-2-基)哌啶草酸盐(1.06g,3.66mmol)和DIEA(1.73mL,10mmol)在CH3CN(30mL)中的溶液在80℃加热过夜。将该反应混合物浓缩至干。添加NaHCO3水溶液(饱和)，将该溶液用乙酸乙酯(2x)萃取，并过滤回收碎屑层(0.516g粗产物，将其保留)。将有机层用水、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到0.715g粗产物。将粗产物合并，并通过柱色谱纯化(0至10％MeOH/CH2Cl2梯度)，得到4-(4-(5,5-二甲基-1,3-二噁烷-2-基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物78；0.926g,74％)。MS(ESI)C18H24N4O3S的计算值：376.16；实测值：377[M+H]。
实施例27.4-(4-(2-(甲基磺酰氨基)乙基)哌嗪-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺2,2,2-三氟乙酸盐(化合物32)的制备:
步骤1.4-(2-(甲基磺酰氨基)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物79)的合成：
向4-(2-氨基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(68；0.400g,1.74mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加吡啶(423μL,5.22mmol)，然后添加甲烷磺酰氯(271μL,3.53mmol)。将该反应混合物在室温搅拌18小时，浓缩至干，溶于CH2Cl2中，用饱和NaHCO3、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到4-(2-(甲基磺酰氨基)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物79；0.471g,88％)。MS(ESI)C12H25N3O4S的计算值：307.16；实测值：308[M+H]。
步骤2.N-(2-(哌嗪-1-基)乙基)甲烷磺酰胺二-2,2,2-三氟乙酸盐(化合物80)的合成:
将油状残留物4-(2-(甲基磺酰氨基)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(79；0.471g,1.53mmol)溶于CH2Cl2(10mL)中并添加三氟乙酸(2mL)。将该反应混合物在室温搅拌过夜，浓缩至干，先后用乙醚、戊烷/乙醚和乙醚研磨，并在真空下干燥，得到N-(2-(哌嗪-1-基)乙基)甲烷磺酰胺二-2,2,2-三氟乙酸盐(化合物80；0.706g,假定定量)。MS(ESI)C7H17N3O2S的计算值：207.10；实测值：208[M+H]。
步骤3.4-(4-(2-(甲基磺酰氨基)乙基)哌嗪-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺2,2,2-三氟乙酸盐(化合物32)的合成：
将4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(14；0.4mmol,0.085g)、N-(2-(哌嗪-1-基)乙基)甲烷磺酰胺二(2,2,2-三氟乙酸盐)(80；0.48mmol,0.146g)和DIEA(208μL,1.2mmol)在CH3CN中的溶液加热至60℃，保持18小时。将该反应混合物浓缩至干，用甲醇研磨并通过过滤收集固体。将产物通过制备型HPLC纯化并冻干，得到4-(4-(2-(甲基磺酰氨基)乙基)哌嗪-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物32；0.030g,15％)。MS(ESI)C14H20N6O3S2的计算值：384.10；实测值：385[M+H]。
实施例28.4-(4-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)哌嗪-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺二(2,2,2-三氟乙酸盐)(化合物35)的制备:
步骤1.4-(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物44)的合成:
将4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(14；0.100g,0.468mmol)和2-(哌嗪-1-基)乙醇(0.073g,0.56mmol)和DIEA(122μL,0.7mmol)在CH3CN中的溶液在60℃加热18小时。将该反应混合物浓缩至干，重新悬浮在NaHCO3稀水溶液中并通过过滤收集。将滤饼在真空下干燥，得到4-(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物44；0.111g,77％)。MS(ESI)C13H17N5O2S的计算值：307.37；实测值：308[M+H]。
步骤2.4-(4-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)哌嗪-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物35)的合成:
向在CH2Cl2中的4-(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(44；0.111g,0.36mmol)中添加亚硫酰氯(1mL)和DMF(3滴)。将该反应混合物在室温搅拌6小时并浓缩至干。将残留物重新悬浮在CH2Cl2中并添加吡咯烷(1mL)。将该混合物在室温搅拌4天并浓缩至干。将残留物悬浮在最少量的甲醇中并添加水。将体积减少50％并通过过滤收集褐色固体。将母液浓缩并在制备型HPLC上纯化并冻干，得到4-(4-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)哌嗪-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物35；0.024g,11％)。MS(ESI)C17H24N6OS的计算值：402.18；实测值：403[M+H]。
实施例29.4-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物36)的制备:
步骤1.4-甲氧基呋喃并[3,2-d]嘧啶(化合物82)的合成:
向4-氯呋喃并[3,2-d]嘧啶(化合物81；1.0g,6.5mmol)在MeOH(30mL)中的溶液中添加甲醇钠(0.7g,13mmol)。将该反应混合物在80℃搅拌4小时。将该反应混合物倒入水中，用乙酸乙酯萃取并浓缩，得到4-甲氧基呋喃并[3,2-d]嘧啶(化合物82；0.600g,62％)。MS(ESI)C7H6N2O2的计算值：150.04。
步骤2.4-甲氧基呋喃并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(化合物83)的合成:
在-40℃，向4-甲氧基呋喃并[3,2-d]嘧啶(化合物82；0.300g,2.0mmol)在THF中的溶液中滴加2.5M正丁基锂/己烷(1.2mL,3mmol)。将该反应在-40℃搅拌30分钟并添加至无水CO2/醚。将该反应混合物在搅拌下倒入水中，并分离水层。将水层用醚洗涤。将合并的有机层用水萃取。将合并的水层用浓HCl酸化并用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯层干燥，过滤并真空浓缩，得到4-甲氧基呋喃并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸，其为黄色固体(化合物83；0.291g,80％)。MS(ESI)C8H6N2O4的计算值：194.03。
步骤3.4-氯呋喃并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物84)的合成:
在60℃，向上面的4-甲氧基呋喃并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(83；3g,15mmol)、苄基三乙基氯化铵(7g,31mmol)和二甲基苯胺(3mL,24mmol)在乙腈(70mL)中的溶液中添加三氯氧磷(10mL)。将该混合物在60℃搅拌4小时。将该反应混合物真空浓缩，将残留物溶于THF中，并添加氢氧化铵溶液，直到pH＝9。将固体过滤并干燥，得到4-氯呋喃并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物84；1.0g,33％)。MS(ESI)C7H4ClN3O2的计算值：197.00；实测值：198[M+H]。
步骤4.(2-(1-(6-氨基甲酰基呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物85)的合成:
将4-氯呋喃并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(84；0.050g,0.254mmol)、(2-(哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.069g,0.305mmol)、DIEA(0.0655g,0.508mmol)在乙腈(2mL)中的混合物在60℃搅拌过夜。将该反应混合物浓缩，并将残留物通过制备型TLC纯化(CH2Cl2:MeOH＝15:1)，得到(2-(1-(6-氨基甲酰基呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物85；0.040g,40％)。MS(ESI)C19H27N5O4的计算值：389.21；实测值：390[M+H]。
表7的化合物86、87、88、89、90、91、92、93和94以相似的方式制备。
步骤4.4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物95)的合成:
将(2-(1-(6-氨基甲酰基呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸酯(85；0.440g,1.13mol)在1MHCl:MeOH(10mL)中的溶液在室温搅拌过夜。将该反应混合物浓缩，将残留物用NaHCO3溶液稀释至pH＝8-9，用CH2Cl2(3x)萃取并在真空下浓缩。将残留物用CH2Cl2:MeOH(10:1)研磨，得到4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物95；0.2165g,66％)。MS(ESI)C14H19N5O2的计算值：289.15；实测值：290[M+H]。
表7的化合物96以类似的方式制备。
步骤5.4-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物36)的合成:
将4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(95；0.100g,0.346mmol)和吡啶(0.055g,0.692mmol)在CH2Cl2(6mL)中的溶液冷却至0℃并缓慢添加特戊酰氯(0.083g,0.692mmol)。将该反应混合物在0℃搅拌15分钟，然后在室温搅拌过夜。将该反应溶液用氢氧化铵淬灭，在真空下浓缩并将残留物通过柱色谱法(15:1CH2Cl2/MeOH)纯化，得到4-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物36；0.0775g,60％)。MS(ESI)C19H27N5O3的计算值：373.21；实测值：374[M+H]。
表7的化合物97、98和99以相似的方式制备。
实施例30.4-([4,4'-联哌啶]-1-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物100)的制备:
将1'-(6-氨基甲酰基呋喃并[3,2-d]嘧啶-4-基)-[4,4'-联哌啶]-1-甲酸叔丁酯(94；0.044g,0.1mmol)和25％TFA在CH2Cl2(4mL)中的溶液在室温搅拌过夜。将该反应混合物浓缩，用乙醚和戊烷研磨。将残留物通过制备型HPLC纯化并冻干，得到4-([4,4'-联哌啶]-1-基)呋喃并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物100；0.034g,75％)。MS(ESI)C17H23N5O2的计算值：329.19；实测值：330[M+H]。
实施例31.7-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-甲酰胺(化合物37)的制备:
步骤1.7-氯噻吩并[3,2-b]吡啶-2-甲酰胺(化合物102)的合成:
将7-氯噻吩并[3,2-b]吡啶-2-甲酸(来自ASDIInc.的化合物101,0.64g,3.0mmol)、亚硫酰氯(3mL)、DMF(2滴)在CH2Cl2(15mL)中的浆液加热回流2小时。将该反应混合物浓缩并真空干燥。向残留物中添加二噁烷(20mL)，然后添加0.5M氨在二噁烷中的溶液(30mL,15mmol)。将该反应混合物在室温搅拌72小时并浓缩至干。将残留物悬浮在EtOAc和NaHCO3水溶液(饱和)的混合物中。将碎屑层通过过滤除去，将有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩至干，得到7-氯噻吩并[3,2-b]吡啶-2-甲酰胺(化合物102；0.302g,47％)。MS(ESI)C8H5ClN2OS的计算值：211.98；实测值：213[M+H]。
步骤2.(2-(1-(2-氨基甲酰基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物103)的合成:
将7-氯噻吩并[3,2-b]吡啶-2-甲酰胺(102；0.150g,0.705mmol)和(2-(哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.242g,1.06mmol)在NMP(4mL)中的溶液在200℃微波中加热2小时。将该反应混合物浓缩，用CH2Cl2稀释，过滤并浓缩。将该粗制的(2-(1-(2-氨基甲酰基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物103)通过柱色谱纯化(0至10％MeOH/CH2Cl2)，得到化合物103。MS(ESI)C20H28N4O3S的计算值：404.19；实测值：405[M+H]。
步骤3.7-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-甲酰胺(化合物104)的合成:
将(2-(1-(2-氨基甲酰基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(103；假定0.705mmol)在10％TFA/CH2Cl2中搅拌过夜并浓缩，得到7-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-甲酰胺，其为2,2,2三氟乙酸盐(化合物104)。MS(ESI)C15H20N4OS的计算值：304.14；实测值：305[M+H]。
步骤4.7-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-甲酰胺(化合物37)的合成:
向7-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-b]吡啶-2-甲酰胺(104；假定0.705mmol)中添加水(5mL)、乙酸乙酯(10mL)、碳酸钠(0.747g,7.0mmol)，然后添加特戊酰氯(130μl,1.05mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜并用乙酸乙酯萃取。将有机层用水、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。将产物通过柱色谱纯化(0至10％MeOH/CH2Cl2梯度)(化合物37；0.025g,9％)。MS(ESI)C20H28N4O2S的计算值：388.19；实测值：389[M+H]。
表7的化合物105以类似的方式制备。
实施例32.7-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(化合物38)的制备:
步骤1.4-溴-2-(甲氧基羰基)噻吩并[2,3-c]吡啶6-氧化物(化合物107)的合成:
在0℃，向4-溴噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酸甲酯(化合物106；1.9g,7.0mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液中添加间氯过氧苯甲酸(1.7g,8.4mmol)，将该混合物温热至室温并搅拌过夜。将该混合物用CH2Cl2(100mL)稀释，将有机层用1NNaOH溶液、盐水和水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到为固体的粗制的4-溴-2-(甲氧基羰基)噻吩并[2,3-c]吡啶6-氧化物，其不经进一步纯化直接使用(化合物107；2.8g,假定定量)。MS(ESI)C9H6BrNO3的计算值：286.93。
步骤2.4-溴-7-氯噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酸甲酯(化合物108)的合成:
在0℃的N2气氛下，向4-溴-2-(甲氧基羰基)噻吩并[2,3-c]吡啶6-氧化物(107；2.0g,6.9mmol)在CHCl3中的溶液中添加POCl3(1.95mL,20.8mmol)。然后将该反应温热并回流过夜。冷却后，将该混合物减压浓缩。将残留物通过硅胶色谱，使用石油醚:乙酸乙酯(10:1)纯化，提供4-溴-7-氯噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酸甲酯(化合物108；0.8g,38％)。MS(ESI)C9H5BrClNO2S的计算值：304.89。
步骤3.4-溴-7-氯噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(化合物109)的合成:
将4-溴-7-氯噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酸甲酯(108；0.200g,0.65mmol)和MeOH/NH3(2.0M,30mL)的混合物在45℃搅拌过夜。冷却后，将该混合物浓缩，得到为白色固体的4-溴-7-氯噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(化合物109；0.185g,97％)。MS(ESI)C8H4BrClN2OS的计算值：289.89。
步骤4.(2-(1-(4-溴-2-氨基甲酰基噻吩并[2,3-c]吡啶-7-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物110)的合成:
向4-溴-7-氯噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(109；0.100g,0.34mmol)和(2-(哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.118g,0.51mmol)在i-PrOH(10.0mL)中的溶液中添加DIEA(0.5mL)。将该混合物在微波条件下加热至160℃，保持3小时。冷却后，浓缩所得混合物。将残留物溶于CH2Cl2(20mL)中，用饱和NaHCO3洗涤，分离有机相并将水相用CH2Cl2(3×20mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将所得物质通过制备型TLC，使用3:2CH2Cl2/乙酸乙酯纯化，得到为淡黄色固体的(2-(1-(4-溴-2-氨基甲酰基噻吩并[2,3-c]吡啶-7-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物110；0.077g,46％)。MS(ESI)C20H27BrN4O3S的计算值：482.10。
步骤5.7-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)-4-溴噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(化合物111)的合成:
将(2-(1-(4-溴-2-氨基甲酰基噻吩并[2,3-c]吡啶-7-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(110；0.077g,0.16mmol)和MeOH/HCl(2.0M,5.0mL)的混合物在室温搅拌过夜。在除去溶剂后，得到为黄色固体的7-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)-4-溴噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺的HCl盐(化合物111；0.120g,假定定量)，并不经进一步纯化直接使用。MS(ESI)C15H19BrN4OS的计算值：382.05。
步骤6.4-溴-7-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(化合物112)的合成:
在0℃，向7-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)-4-溴噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(111；0.040g,0.08mmol)和吡啶(1.8mL,0.24mmol)在CH2Cl2(2.0mL)中的溶液中滴加特戊酰氯(0.0193g,0.168mmol)，持续10分钟。将该反应混合物温热至室温并搅拌过夜。将该混合物用CH2Cl2(10mL)和水(5mL)稀释，分离有机相并将水相用CH2Cl2(3×10mL)萃取。将合并的有机层用饱和NaHCO3和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过从乙酸乙酯中重结晶纯化，得到为淡黄色固体的4-溴-7-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(化合物112；0.0176g,47％)。MS(ESI)C20H27BrN4O2S的计算值：466.10；实测值：467[M+H]。
步骤7.7-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(化合物38)的合成:
将4-溴-7-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(112；0.050g,0.11mmol)和Pd/C(10％,0.015g)在MeOH(10mL)中的混合物在室温的H2气氛下搅拌过夜。将固体过滤并浓缩滤液。将残留物用乙酸乙酯(20mL)和饱和NaHCO3(5mL)稀释，分离有机相并将水相用乙酸乙酯(3x15mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。所得物质通过制备型TLC，使用乙酸乙酯纯化，得到为淡黄色固体的7-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(化合物38；0.004g,10％)。MS(ESI)C20H28N4O2S的计算值：388.19；实测值：389[M+H]。
实施例33.(2-(1-(6-氨基甲酰基-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物39)的制备:
步骤1.4-氯-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(化合物114)的合成:
将二异丙基胺(2.71mL,0.0193mol)在无水THF(70mL)中的溶液冷却至-78℃。将正丁基锂(2.5M)在己烷中的溶液滴加至这种反应混合物。在-78℃搅拌30分钟后，将该混合物在-78℃经注射器滴加至4-氯-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶(化合物113；2.5g,0.0135mol)在THF中的搅拌混悬液中。当添加结束时，混悬液变为均相。将该混合物在-78℃保持45分钟，然后将CO2气体鼓入该反应混合物，持续10分钟，从而导致绿色消失。将该反应保持在干燥氮气下并温热至室温过夜。将该混合物减压浓缩，然后添加THF，将该混合物搅拌1小时，然后过滤。将收集的固体悬浮在稀HCl水溶液中，搅拌，收集并用稀HCl水溶液洗涤。将所得米色固体在真空下干燥过夜，得到4-氯-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(化合物114；2.71g,88％)。MS(ESI)C8H5ClN2O2S的计算值：227.98；实测值：229[M+H]。
步骤2.4-氯-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物115)的合成:
向4-氯-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(114；0.518g,2.27mmol)在CH2Cl2(20mL)中的混悬液添加草酰氯(395μL,4.53mmol)。滴加少量DMF(50μL)，导致气体从混合物中逸出。将该反应在室温搅拌过夜，在此期间它几乎变成均相。将该反应在60℃加热2.5小时，然后冷却至室温。添加另外的草酰氯(500μL)，将该混合物在60℃加热3小时，冷却至室温并减压浓缩。添加二氯甲烷，使混合物达到0℃，并将干燥NH3气体鼓入该溶液，持续5分钟。在1小时后，将该溶液用另外的CH2Cl2稀释，然后用饱和NaHCO3溶液(2x)洗涤。将未溶于任一层中的固体通过过滤收集并干燥，得到为米色固体的4-氯-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物115；0.200g,39％)。MS(ESI)C8H6ClN3OS的计算值：226.99；实测值：228.0[M+H]。
步骤3.(2-(1-(6-氨基甲酰基-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物116)的合成:
将4-氯-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(115；0.195g,0.857mmol)、(2-(哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(259mg,1.13mmol)、二异丙基乙胺(223mL,1.29mmol)和乙腈的混合物在60℃加热2小时。添加另外的(2-(哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.050g)，并在60℃继续加热16小时。将该混合物冷却，用乙酸乙酯稀释并用5％HCl水溶液洗涤。将乙酸乙酯层干燥(Na2SO4)并浓缩，得到固体。将酸性萃取液用10％NaOH溶液碱化，得到乳状溶液，将其用乙酸乙酯萃取，干燥(Na2SO4)并浓缩。将由来自酸性和碱性溶液的乙酸乙酯萃取液提供的物质合并，然后在12g硅胶柱上纯化，用50％戊烷/乙酸乙酯至100％乙酸乙酯洗脱，得到为米色泡沫状物的(2-(1-(6-氨基甲酰基-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物116；0.285g,79％)。MS(ESI)C20H29N5O3S的计算值：419.20；实测值：420[M+H]。
步骤4.4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物117)的合成:
将(2-(1-(6-氨基甲酰基-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(116；0.265g,0.633mmol)的溶液用三氟乙酸(487μL,6.33mmol)处理，并将所得溶液在室温搅拌16小时。添加另外200μL三氟乙酸，并将该混合物在40℃加热1小时。将双相反应混合物减压浓缩，并将残留物溶于乙酸乙酯中。添加戊烷，直到溶液轻微浑浊，并将该混合物在室温静置。将所得析出物经过滤收集并用1:1乙酸乙酯/戊烷(3x)洗涤。将固体在真空下干燥，得到为奶油色固体的4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺单三氟甲磺酸盐(化合物117；0.266g,97％)。MS(ESI)C15H21N5OS的计算值：319.15；实测值：320[M+H]。
步骤5.7-甲基-4-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物39)的合成:
将4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)-7-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺单三氟甲磺酸盐(117；0.109g,0.251mmol)在1:1Na2CO3(1M):乙酸乙酯中的溶液剧烈搅拌，并一次性添加特戊酰氯(62mL,0.50mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜，然后减压浓缩。添加最少量的水，将固体通过过滤收集，并用水洗涤两次。将固体溶于二氯甲烷/甲醇中，将该溶液干燥(Na2SO4)，过滤并减压浓缩，得到为白色固体的7-甲基-4-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物39；0.071g,70％)。MS(ESI)C20H29N5O2S的计算值：403.20；实测值：404[M+H]。
实施例34.(3-((2-(4-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酰基)苯基)膦酸(化合物122)的制备:
步骤1.3-((二(苄基氧基)磷酰基)氧基)苯甲酸乙酯(化合物119)的合成:
在-10℃氮气下，向3-羟基苯甲酸乙酯(化合物118；1.76g,10.6mmol)在CH3CN中的溶液中添加CCl4(5.12mL,53mmol)，然后添加DIPEA(3.86mL,22.3mmol)和DMAP(0.130g,1.1mmol)。将该反应混合物在-10℃搅拌2分钟，滴加膦酸二苄酯(70％工业级,3.4mL)，持续3分钟，并将该反应混合物在-10℃搅拌1小时。将该反应混合物用0.5MKH2PO4(200mL)淬灭并用乙酸乙酯萃取。将有机层用水、盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩至干。将油状物通过硅胶色谱纯化(0至40％EtOAc/戊烷梯度)，得到为澄清油状物的3-((二(苄基氧基)磷酰基)氧基)苯甲酸乙酯(化合物119；4.05g,90％)。MS(ESI)C23H23O6P的计算值：426.12；实测值：427[M+H]。
步骤2.3-((二(苄基氧基)磷酰基)氧基)苯甲酸(化合物120)的合成:
将3-((二(苄基氧基)磷酰基)氧基)苯甲酸乙酯(119；4.05g,9.5mmol)溶于THF(50mL)中并添加LiOH(0.227g,9.50mmol)在水(10mL)中的溶液。添加第二当量的LiOH(0.227g,9.50mmol)，且该反应混合物显示出一些分解。将该反应混合物浓缩至干，并用HCl水溶液酸化至pH＝3。将该反应混合物用乙酸乙酯萃取，将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩成油状物。将该油状物通过制备型HPLC纯化。将级分浓缩除去乙腈，并用浓HCl酸化至pH＝1-2。将产物用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，得到3-((二(苄基氧基)磷酰基)氧基)苯甲酸(化合物120；1.00g,26％)。MS(ESI)C21H19O6P的计算值：398.09；实测值：399[M+H]。
步骤3.(3-((2-(4-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酰基)苯基)磷酸二苄酯(化合物121)的合成:
将4-(4-(2-氨基乙基)哌嗪-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺二盐酸盐(16b；0.250g,0.659mmol)、HATU(0.376g,0.989mmol)、DIEPA(228μL,1.31mmol)在DMF(3mL)中的溶液搅拌5分钟，然后添加3-((二(苄基氧基)磷酰基)氧基)苯甲酸(120；0.394g,0.989mmol)、DIEPA(228μL,1.31mmol)在DMF(3mL)中的浆液。将该反应混合物在室温搅拌5小时，用CH2Cl2稀释，用饱和NaHCO3、水、盐水洗涤，干燥(MgSO4)并浓缩成红色油状物。将产物通过硅胶色谱纯化(0至10％MeOH/CH2Cl2梯度)，得到(3-((2-(4-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酰基)苯基)磷酸二苄酯(化合物121；0.169g,37％)。MS(ESI)C34H35N6O6PS的计算值：686.21；实测值：687[M+H]。
步骤4.(3-((2-(4-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酰基)苯基)膦酸(化合物122)的合成:
向(3-((2-(4-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酰基)苯基)磷酸二苄酯(121；0.169g,0.25mmol)中添加10％Pd/C(0.015g)、甲酸(15mL)，并将该反应混合物与氢(1atm)一起搅拌过夜。将该反应混合物通过硅藻土(celite)过滤，用甲酸洗涤滤饼，将10％Pd/C(0.015g)添加至母液并与氢(1atm)一起搅拌经过周末。将该反应混合物通过硅藻土过滤，浓缩至干，用乙醚/戊烷混合物研磨并用MeOH研磨。将固体通过过滤收集并在真空下干燥，得到为白色固体的(3-((2-(4-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酰基)苯基)膦酸(化合物122；0.063mg,50％收率)。MS(ESI)C20H23N6O5PS的计算值：490.12；实测值：491[M+H]。
实施例35.N1-(2-氨基乙基)-N3-(2-(4-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)间苯二甲酰胺(化合物127)的制备:
步骤1.3-((2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯甲酸甲酯(化合物124)的合成:
将3-(甲氧基羰基)苯甲酸(化合物123；1.0g,5.55mmol)、HATU(2.53g,6.7mmol)和DIEPA(1.44mL,8.31mmol)在DMF(15mL)中的溶液在室温搅拌10分钟，然后添加(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(1.07g,6.68mmol)在DMF(4mL)中的溶液，并将该反应混合物在室温搅拌2.5小时。将该反应混合物用乙酸乙酯(150mL)稀释，并将有机层用饱和NaHCO3、水(2x)、盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，得到为红色固体的3-((2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯甲酸甲酯(化合物124；1.69g,94％)。MS(ESI)C16H22N2O5的计算值：322.15。
步骤2.3-((2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯甲酸(化合物125)的合成:
将3-((2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯甲酸甲酯(124；1.69g,5.24mmol)用甲醇(2x)加工，溶于甲醇(50mL)中并用LiOH(0.399g,16.7mmol)和水(10mL)搅拌过夜。将该反应混合物浓缩，溶于水中并用浓HCl酸化至pH＝4-5。将析出物通过过滤收集，用水洗涤并干燥，得到为褐色固体的3-((2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯甲酸(化合物125；1.44g,84％收率)。MS(ESI)C15H20N2O5的计算值：308.14。
步骤3.(2-(3-((2-(4-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酰基)苯甲酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物126)的合成:
将4-(4-(2-氨基乙基)哌嗪-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺二盐酸盐(16b；0.190g,0.50mmol)、3-((2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯甲酸(125；0.185g,0.60mmol)、HATU(0.228g,0.60mmol)和DIEPA(520μL,3.0mmol)在DMF(10mL)中的溶液在室温搅拌过夜。将该反应混合物用饱和NaHCO3水溶液/水的1:1混合物稀释，并用乙酸乙酯萃取。将有机层用水(2x)、盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将物质通过硅胶柱色谱纯化(10％MeOH/CH2Cl2)，得到(2-(3-((2-(4-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酰基)苯甲酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物126；180mg,60％)。MS(ESI)C28H36N8O5S的计算值：596.25；实测值：597[M+H]。
步骤4.N1-(2-氨基乙基)-N3-(2-(4-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)间苯二甲酰胺(化合物127)的合成:
将(2-(3-((2-(4-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酰基)苯甲酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物126；180mg,0.30mmol)在CH2Cl2(20mL)中稀释并添加TFA(4mL)。将该反应混合物在室温搅拌过夜，浓缩至干并用乙醚/戊烷研磨，并在真空下干燥，得到N1-(2-氨基乙基)-N3-(2-(4-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙基)间苯二甲酰胺二(2,2,2-三氟乙酸盐)，其为棕色固体(化合物127；0.104g,48％收率)。MS(ESI)C23H28N8O3S的计算值：496.20；实测值：497[M+H]。
表8的化合物191以类似的方式制备。
实施例36.4-(4-((3-(三氟甲基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物131)的制备：
步骤1.4-((3-(三氟甲基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(化合物129)的合成:
向4-甲酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(化合物128；0.107mg,0.5mmol)和3-(三氟甲基)哌啶(0.153g,1mmol)在CH2Cl2(5mL)中的溶液中添加乙酸(2滴)。将该反应混合物搅拌45分钟，添加Na(OAc)3BH(0.159g,0.75mmol)，并将所得溶液在室温搅拌过夜。将该反应混合物用NaHCO3水溶液(饱和)淬灭，将有机层用饱和NaHCO3、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到4-((3-(三氟甲基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(化合物129；假定定量)，其不经进一步纯化直接用于后续步骤中。MS(ESI)C17H29F3N2O2的计算值:350.22。
步骤2.1-(哌啶-4-基甲基)-3-(三氟甲基)哌啶(化合物130)的合成:
将4-((3-(三氟甲基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(129；假定0.5mmol)在25％TFA/CH2Cl2(4mL)中搅拌4小时并浓缩至干，得到1-(哌啶-4-基甲基)-3-(三氟甲基)哌啶(化合物130；假定定量)，其不经进一步纯化直接用于后续步骤中。MS(ESI)C12H21F3N2的计算值：250.17。
步骤3.4-(4-((3-(三氟甲基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物131)的合成：
将在CH3CN(5mL)中的1-(哌啶-4-基甲基)-3-(三氟甲基)哌啶(130；假定0.5mmol)、4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(14；0.071g,0.333mmol)和DIEA(230μL,1.33mmol)在85℃加热3天并浓缩至干。将残留物通过制备型HPLC纯化，得到4-(4-((3-(三氟甲基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺，其为二-TFA盐(化合物131；0.051g,8％)。MS(ESI)C19H24F3N5OS的计算值：427.17；实测值：428[M+H]。
表7的化合物132以类似的方式制备。
实施例37.5-溴-N1-(2-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)-N3-乙基间苯二甲酰胺(化合物136)的制备:
步骤1.3-溴-5-(乙基氨基甲酰基)苯甲酸甲酯(化合物134)的合成:
根据ChoiK.等人公布的操作(J.Am.Chem.Soc.,2003,125(34),pp10241-10249)制备。将3-溴-5-(甲氧基羰基)苯甲酸(化合物133；0.400g,1.54mmol)和HATU(0.587g,1.54mmol)在DMF中的溶液先后用二异丙基乙胺(538μL,3.09mmol)和乙胺(1.5mL在THF中的2M溶液，3.09mmol)处理。将该溶液在室温搅拌两天。将该混合物用乙酸乙酯稀释，用1NHCl溶液、盐水洗涤两次，用10％NaOH水溶液和盐水洗涤两次。将有机层干燥(Na2SO4)并减压浓缩，得到3-溴-5-(乙基氨基甲酰基)苯甲酸甲酯(化合物134；假定定量)。MS(ESI)C11H12BrNO3的计算值：285；实测值：286[M+H]。
步骤2.3-溴-5-(乙基氨基甲酰基)苯甲酸(化合物135)的合成:
将3-溴-5-(乙基氨基甲酰基)苯甲酸甲酯(134；0.452g,1.58mmol)溶于THF中并滴加水，直到该反应混合物刚好开始变得浑浊。添加固体LiOH(0.303g,12.6mmol)。将少量甲醇添加至搅拌溶液中以提高该混合物的均一性。在搅拌3-4小时后，将该混合物减压浓缩，并添加水。将水溶液用乙醚洗涤两次并丢弃乙醚。将水层用3NHCl酸化，得到白色析出物。将该混合物用乙酸乙酯萃取，干燥(Na2SO4)，并减压浓缩，得到为白色固体的3-溴-5-(乙基氨基甲酰基)苯甲酸(化合物135；0.302g,70％)。MS(ESI)C10H10BrNO3的计算值：270.98；实测值：272[M+H]。
步骤3.5-溴-N1-(2-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)-N3-乙基间苯二甲酰胺(化合物136)的合成:
向3-溴-5-(乙基氨基甲酰基)苯甲酸(135；0.115g,0.423mmol)在DMF中的溶液中添加HATU(0.161g,0.423mmol)，然后添加二异丙基乙胺(340μL,1.95mmol)。在添加4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺三氟乙酸盐(16a；0.136g,0.325mmol)后，将该反应在室温搅拌16小时。将该混合物用乙酸乙酯稀释并用30％AcOH(2×)洗涤，然后用10％NaOH(3x)洗涤。将该混合物干燥(Na2SO4)并减压浓缩。将产物在硅胶柱(12g)上纯化，用甲醇/二氯甲烷(5％-30％)洗脱，得到5-溴-N1-(2-(1-(6-氨基甲酰基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)-N3-乙基间苯二甲酰胺(化合物136；0.076g,32％)。MS(ESI)C24H27BrN6O3S的计算值：558.10；实测值：559.2[M+H]。
实施例39.2-甲基-4-(4-(2-(甲基磺酰氨基)乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物154)的制备:
步骤1.3-乙酰氨基噻吩-2-甲酰胺(化合物138)的合成:
在室温向3-氨基噻吩-2-甲酰胺(化合物137；11.8g,83.1mmol)和三乙胺(35mL)在甲苯(250mL)中的溶液中添加乙酸酐(9.5mL)。将该反应混合物回流2小时。冷却后，真空除去溶剂，并将残留物用1:1石油醚/乙酸乙酯洗涤，得到为白色固体的3-乙酰氨基噻吩-2-甲酰胺(化合物138；15.3g,100％)。MS(ESI)C7H8N2O2S的计算值：184.03。
步骤2.2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-醇(化合物139)的合成:
将3-乙酰氨基噻吩-2-甲酰胺(138；15.3g,83mmol)和NaOH(16.63g,415mmol)在水(400mL)中的溶液加热回流2小时。冷却后，将所得溶液在0℃使用2NHCl中和至pH6。将析出物通过过滤收集，用水洗涤，并真空干燥，得到2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-醇(化合物139；12.5g,91％)，其不经进一步纯化直接用于后续步骤中。MS(ESI)C7H6N2OS的计算值：166.02。
步骤3.4-氯-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶(化合物140)的合成:
在0℃向2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-醇(139；10.5g,63.3mmol)在DMF(12.2mL)和1,2-二氯乙烷(250mL)中的溶液中滴加POCl3(17.6mL)。然后将该反应混合物在150℃加热2小时。冷却后，将该混合物真空浓缩。将残留物使用2NNaOH中和至pH7。将所得混合物用乙酸乙酯(150mL)和水(70mL)稀释。分离有机层，并将水相用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残留物通过硅胶柱色谱法使用4:1石油醚/乙酸乙酯纯化，得到粗制的4-氯-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶(化合物140；11.2g,97％)。MS(ESI)C7H5ClN2S的计算值：183.99。
步骤4.4-甲氧基-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶(化合物141)的合成:
将4-氯-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶(140；11.2g,65.8mmol)和甲醇钠(30g,50％，在MeOH中)在MeOH(250mL)中的溶液回流2小时。冷却后，浓缩该混合物。将残留物用乙酸乙酯(500mL)和水(100mL)稀释。分离有机层，用乙酸乙酯(3×100mL)萃取水相，将合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残留物通过硅胶柱色谱纯化(使用4:1石油醚/乙酸乙酯)，得到4-甲氧基-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶(化合物141；8.5g,72％)。MS(ESI)C8H8N2OS的计算值：180.04。
步骤5.4-甲氧基-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(化合物142)的合成:
在-78℃，N2气氛下，向4-甲氧基-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶(141；0.5g,2.78mmol)在THF(25mL)中的溶液中添加n-BuLi(1.5ml,3.7mmol)。将该混合物在此温度搅拌1小时。将干燥的CO2鼓泡通入，并将该混合物温热至-20℃并搅拌3小时。将该反应用饱和NH4Cl淬灭，使用2NHCl中和至pH3。将析出物收集，用水洗涤，并真空干燥，得到4-甲氧基-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(化合物142；0.5g,80％)，其不经进一步纯化直接用于后续步骤中。MS(ESI)C9H8N2O3S的计算值：224.03。
步骤6.4-羟基-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(化合物143)的合成:
将4-甲氧基-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(142；0.150g,0.669mmol)和6NHCl(2mL)的混合物在100℃搅拌1.5小时。冷却后，将溶剂真空除去，得到粗制的4-羟基-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(化合物143；0.150g,定量)。MS(ESI)C8H6N2O3S的计算值：210.01。
步骤7.4-氯-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物144)的合成:
在0℃向4-羟基-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(143；0.150g,0.72mmol)在DMF(0.14mL)和1,2-二氯乙烷(25mL)中的溶液中滴加POCl3(0.2mL)。然后将该反应混合物在150℃加热2小时。冷却后，将该混合物真空浓缩。将残留物用2NNH3/二噁烷在0℃中和，并将该混合物再搅拌3小时。然后将溶剂再次除去，并将残留物通过硅胶柱色谱纯化(使用1:1石油醚/乙酸乙酯)，得到为白色固体的4-氯-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物144；0.025g,15％)。MS(ESI)C8H6ClN3OS的计算值：226.99。
步骤8.(2-(1-(6-氨基甲酰基-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物145)的合成:
将4-氯-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(144；0.200g,0.88mmol)、(2-(哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.241g,1.06mmol)和DIEA(0.5mL)在乙腈(5mL)中的混合物在60℃加热24小时。冷却后，除去溶剂，并将残留物通过制备型TLC(1:10MeOH/CH2Cl2)纯化，得到(2-(1-(6-氨基甲酰基-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物145；0.150g,41％)。MS(ESI)C20H29N5O3S的计算值：419.20；实测值：420[M+H]。
表7的化合物146、147、148、149、150和151以相似的方式制备。
步骤9.4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物152)的合成:
将(2-(1-(6-氨基甲酰基-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(145；0.310g,0.74mmol)在HCl/MeOH(5mL)中的混合物在室温搅拌4小时。除去溶剂。将残留物使用饱和Na2CO3中和至pH7。将该混合物用CH2Cl2(3×15mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩。将残留物通过制备型TLC纯化(1:10MeOH/CH2Cl2)，得到为白色固体的4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物152；0.160g,67％)。MS(ESI)C15H21N5OS的计算值：319.15；实测值：420[M+H]。
表7的化合物153以类似的方式制备。
步骤10.2-甲基-4-(4-(2-(甲基磺酰氨基)乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物154)的合成:
在0℃向4-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)-2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(152；0.090g,0.253mmol)和三乙胺(0.5mL)在吡啶(5mL)中的混合物添加甲烷磺酰氯(0.032g,0.278mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜，用1N氢氧化铵淬灭，然后真空浓缩。将残留物使用饱和Na2CO3中和至pH7并用CH2Cl2(315mL)萃取混合物。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩。将残留物通过制备型TLC纯化(1:10MeOH/CH2Cl2)，得到2-甲基-4-(4-(2-(甲基磺酰氨基)乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物154；0.0126g,11％)。MS(ESI)C16H23N5O3S2的计算值：397.12；实测值：398[M+H]。
表7的化合物155、156、157、158和159以相似的方式制备。
实施例39.7-(4-(2-(环戊烷甲酰氨基)乙基)哌啶-1-基)噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(化合物177)的制备:
步骤1.3-溴-4-(二溴甲基)吡啶(化合物161)的合成:
在室温，向3-溴-4-甲基吡啶(化合物160；200g,1.16mol)和AIBN(34.3g,209mmol)在CCl4(1.5L)中的溶液中分批添加NBS(414g,2.32mol)。将该反应混合物加热回流5小时。冷却至室温后，将该混合物真空浓缩，并将残留物通过硅胶柱色谱纯化，得到3-溴-4-(二溴甲基)吡啶(化合物161；58g,15％)。MS(ESI)C6H4Br3N的计算值：326.79。
步骤2.2-溴-4-(二乙氧基甲基)吡啶(化合物162)的合成:
在室温，向3-溴-4-(二溴甲基)吡啶(161；20.0g,60.8mmol)在EtOH(200mL)和水(200mL)中的溶液中添加AgNO3(60.0g,313mmol)，将该混合物在70℃搅拌过夜。在冷却至室温后，将所得混合物过滤，然后将滤液浓缩，得到粗2-溴-4-(二乙氧基甲基)吡啶(化合物162；15.0g,15％)，其直接用于后续步骤中。MS(ESI)C10H14BrNO2的计算值：259.02。
步骤3.3-溴吡啶-4-甲醛(化合物163)的合成:
将该粗制的2-溴-4-(二乙氧基甲基)吡啶(162；20.0g,76.9mmol)和HBr水溶液(100mL)的混合物在室温搅拌30分钟，然后在0℃用饱和NaHCO3(50mL)中和至pH8-10。将所得混合物用CH2Cl2(3x50mL)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并浓缩。将残留物通过硅胶柱色谱纯化，得到为白色固体的3-溴吡啶-4-甲醛(化合物163；15.0g,定量)。MS(ESI)C6H4BrNO的计算值：184.95。
步骤4.噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酸乙酯(化合物164)的合成:
在室温，向3-溴吡啶-4-甲醛(163；5.0g,27.2mmol)和K2CO3(5.3g,38.0mmol)在DMF(100ml)中的混合物中添加巯基乙酸乙酯(3.3g,27.2mmol)。将该反应混合物搅拌过夜，然后用水(100mL)稀释，用CH2Cl2(3x100mL)萃取。将合并的有机层用水(200mL)和盐水(200mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩。将残留物通过硅胶柱色谱纯化，得到噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酸乙酯(化合物164；2.1g,35％)。MS(ESI)C10H9NO2S的计算值：207.04。
步骤5.2-(乙氧基羰基)噻吩并[2,3-c]吡啶6-氧化物(化合物165)的合成:
在室温，向噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酸乙酯(164；1.4g,6.8mmol)在CCl4(50mL)中的溶液中分批添加间氯过氧苯甲酸(1.2g,20.3mmol)，持续15分钟。将该反应混合物在70℃加热并搅拌过夜。冷却至室温后，将该混合物用饱和NaHCO3(50mL)稀释，分离有机层，并将水相用CH2Cl2(3x100mL)萃取。将合并的有机物用水(200mL)、盐水(200mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残留物通过硅胶柱色谱纯化，得到为黄色固体的2-(乙氧基羰基)噻吩并[2,3-c]吡啶6-氧化物(化合物165；0.960g,64％)。MS(ESI)C10H9NO3S的计算值：223.03。
步骤6.7-氯噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酸乙酯(化合物166)的合成：
向2-(乙氧基羰基)噻吩并[2,3-c]吡啶6-氧化物(165；1.5g,6.7mmol)在二噁烷(30mL)中的溶液中添加POCl3(0.7g,13.4mmol)。将该混合物在110℃搅拌4小时。冷却至室温后，将该混合物倒入水(50mL)中，并用饱和NaHCO3中和至pH8-10。然后将所得混合物用乙酸乙酯(3x100mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，并浓缩。将残留物通过柱色谱纯化，得到为白色固体的7-氯噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酸乙酯(化合物166；0.900g,56％)。MS(ESI)C10H8ClNO2S的计算值：241.00。
步骤7.7-氯噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(化合物167)的合成:
将7-氯噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酸乙酯(166；0.950g,3.9mmol)和2NNH3/MeOH(20mL)的混合物在室温搅拌过夜。除去溶剂，并将残留物通过柱色谱纯化，得到7-氯噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺，其为白色固体(化合物167；0.700g,97％)。MS(ESI)C10H8ClNO2S的计算值：241.00。
步骤8.(2-(1-(2-氨基甲酰基噻吩并[2,3-c]吡啶-7-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物168)的合成:
将7-氯噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(167；0.100g,0.472mmol)、(2-(哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.129g,0.566mmol)和DIEA(0.122g,1.416mmol)在NMP(2mL)中的混合物在200℃微波中加热3小时。冷却至室温后，真空除去溶剂，并将残留物通过制备型TLC纯化(1:30MeOH/CH2Cl2)，得到(2-(1-(2-氨基甲酰基噻吩并[2,3-c]吡啶-7-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物168；0.039g,20％)。MS(ESI)C20H28N4O3S的计算值：404.19；实测值：405[M+H]。
表7的化合物169、170、171、172、173和174以相似的方式制备。
步骤9.7-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(化合物175)的合成:
将(2-(1-(2-氨基甲酰基噻吩并[2,3-c]吡啶-7-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(168；0.440g,1.13mmol)在HCl/MeOH(1M,10mL)中的混合物在室温搅拌过夜。浓缩该混合物，将残留物溶于氢氧化铵中，搅拌数分钟，并再次浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化(1:10MeOH/CH2Cl2)，得到7-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(化合物175；0.217g,31％)。MS(ESI)C15H20N4OS的计算值：304.14；实测值：305[M+H]。
表7的化合物176以类似的方式制备。
步骤10.7-(4-(2-(环戊烷甲酰氨基)乙基)哌啶-1-基)噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(化合物177)的合成:
在0℃向7-(4-(2-氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(0.080g,0.262mmol)和三乙胺(0.3mL)在CH2Cl2(6mL)中的混合物中滴加环戊烷甲酰氯(0.069g,0.525mmol)，持续15分钟。将该反应混合物温热至室温并搅拌过夜。将该混合物用1N氢氧化铵淬灭，然后真空浓缩。将该残留物通过硅胶柱色谱纯化(1:15MeOH/CH2Cl2)，得到7-(4-(2-(环戊烷甲酰氨基)乙基)哌啶-1-基)噻吩并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(化合物177；0.023g,17％)。MS(ESI)C21H28N4O2S的计算值：400.19；实测值：401[M+H]。
表7的化合物178、179、180和181以相似的方式制备。
实施例40.N-甲基-4-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物41)的制备:
步骤1.4-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸2,2,2-三氟乙酸盐(化合物40)的合成:
将4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(13,0.064g,0.3mmol)、N-(2-(哌啶-4-基)乙基)特戊酰胺(70,0.064g,0.3mmol)和DIEA(103μl,0.6mmol)在CH3CN(8mL)中的溶液在80℃加热过夜。将该反应混合物浓缩并通过制备型HPLC纯化并冻干，得到4-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸2,2,2-三氟乙酸盐(化合物40；0.080g,53％)。MS(ESI)C19H26N4O3S的计算值：390.17；实测值：391[M+H]。
表8的化合物192以类似的方式制备。
步骤2.N-甲基-4-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物41)的合成:
向4-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(40,0.026g,0.051mmol)、HATU(0.058g,0.15mmol)、DIEA(44μl,0.25mmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加甲胺盐酸盐(0.017g,0.25mmol)，并将该反应混合物搅拌两天。将该反应混合物用NaHCO3水溶液(饱和)稀释并用CH2Cl2(2x)萃取。将有机层浓缩并通过柱色谱纯化(0至10％MeOH/CH2Cl2梯度)，得到N-甲基-4-(4-(2-特戊酰氨基乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物41；0.007g,34％)。MS(ESI)C20H29N5O2S的计算值：403.20；实测值：404[M+H]。
实施例41.4-(哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物21)的制备:
将4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(14,0.085g,0.500mmol)和哌啶(0.34g,4mmol)在CH3CN(5mL)中的溶液在60℃加热18小时。将该反应混合物浓缩至干并通过制备型HPLC纯化，得到4-(哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物21；0.086g,82％)。MS(ESI)C12H14N4OS的计算值：262.09；实测值：263[M+H]。
实施例42.4-(乙基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物22)的制备:
将4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(14,0.085g,0.500mmol)和70％乙胺/水(200μL,过量)在CH3CN(5mL)中的溶液在60℃加热18小时。将该反应混合物浓缩至干并通过制备型HPLC纯化，得到4-(乙基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物22；0.083g,93％)。MS(ESI)C9H10N4OS的计算值：222.06；实测值：223[M+H]。
实施例43.N-(2-(1-(噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)特戊酰胺(化合物42)的制备:
步骤1.(2-(1-(噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物187)的合成:
向4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶(12,0.205g,1.20mmol)和二异丙基乙胺(417μL,2.4mmol)在乙腈中的溶液中添加(2-(哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.357g,1.56mmol)。将所得溶液在50℃搅拌2小时。将该反应混合物减压浓缩，溶于乙酸乙酯中并用盐水洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，过量并减压浓缩，得到为油状物的(2-(1-(噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物187；0.600g,假定定量)。产物不经进一步纯化直接使用。MS(ESI)C18H26N4O2S的计算值：362.18。
步骤2.2-(1-(噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙胺2,2,2-三氟乙酸盐(化合物188)的合成:
将来自上面反应的(2-(1-(噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(187,假定1.20mmol)的溶液溶于二氯甲烷中并在室温用三氟乙酸(924μL,12mmol)处理。将所得溶液在室温搅拌过夜，然后减压浓缩，得到2-(1-(噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙胺单三氟甲磺酸盐(化合物188；假定定量,1.20mmol)，其不经进一步纯化直接使用。MS(ESI)C13H18N4S的计算值：262.13；实测值：263[M+H]。
步骤3.N-(2-(1-(噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)特戊酰胺(化合物42)的合成:
将来自上面反应的2-(1-(噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙胺单三氟甲磺酸盐(188,假定1.20mmol)溶于乙酸乙酯(20mL)和1MNa2CO3(20mL)的双相混合物中。在快速搅拌的同时，将该混合物用特戊酰氯(295μL,2.4mmol)在室温处理，并再搅拌16小时。将有机层分离，并用NaHCO3(20mL)洗涤一次。将有机层干燥(Na2SO4)并减压浓缩。将粗产物用硅胶柱(24g)纯化，使用0至8％MeOH/CH2Cl2的梯度洗脱剂。蒸发溶剂得到无色油状物，将其用乙醚/乙酸乙酯研磨，得到为白色固体的N-(2-(1-(噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)哌啶-4-基)乙基)特戊酰胺(化合物42)。MS(ESI)C18H26N4OS的计算值：346.18；实测值：347[M+H]。
实施例44.4-(4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(化合物189)的制备:
向4-氯噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(13,0.213g,0.992mmol)在CH3CN中的溶液中添加三乙胺(0.415mL,2.98mmol)，然后添加(2-(哌啶-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.272g,1.2mmol)。将该反应混合物在60℃搅拌1.5小时，然后减压浓缩。将该反应混合物调节至pH4-5并用乙酸乙酯萃取。将不溶性固体通过过滤收集，溶于CH2Cl2/MeOH混合物中，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩，得到4-(4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)哌啶-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酸(100mg,25％)。MS(ESI)C19H26N4O4S的计算值：406.17；实测值：407[M+H]。
将抑制SIRT1、SIRT2和SIRT3的式(I)的调节沉默调节蛋白的化合物使用上述试验进行鉴定并显示在下表7中。IC50值是指产生50％的药物的最大应答或者效果的药物剂量。换句话说，它是药物的半数最大抑制浓度。式(I)的抑制化合物的IC50值用A(EC1.5<1μM)、B(EC1.51-10μM)、C(EC1.5>10μM)表示。“NT”意味着未测试；“ND”意味着不可测定。
表7.式(I)的化合物
表8.其它化合物
同等物
本发明尤其提供了调节沉默调节蛋白的化合物及其使用方法。尽管已经讨论了主题发明的具体实施方案，但上述说明书是说明性的，不是限制性的。依据该说明书的说明，本发明的许多变化对本领域技术人员来说是显而易见的。本发明的全部范围应该参考权利要求书，以及其等同物，说明书以及其变化的全部范围来确定。
参考文献的引入
本文提到的所有出版物和专利(包括下面列出的那些条目)以它们的整体引入到本文中作为参考，如同每个单一的出版物或专利具体地和单独地注明被引入作为参考那样。在出现矛盾的情况下，以本申请(包括本文任何定义)为准。
还以整体引入作为参考的是任何聚核苷酸和多肽序列，参考与公共数据库的目录相关的登记号码，例如，由TheInstituteforGenomicResearch(TIGR)(www.tigr.org)和/或theNationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov)保存的那些登记号码。

Claims (20)

1.式(I)化合物或其盐，所述式(I)为：
其中：
各Z1和Z2独立地选自N和CR1，其中：
Z1和Z2中的至少一个为N；
每个R1独立地选自氢、卤素、C1-C4直链或支链烷基、卤素取代的C1-C4直链或支链烷基、-O-C1-C4直链或支链烷基、-O-卤素取代的C1-C4直链或支链烷基、C1-C4烷氧基取代的C1-C4直链或支链烷基和羟基取代的C1-C4直链或支链烷基；
W选自S和O；
X选自-C(＝O)-NH2、-S(＝O)2-NH2、-C(＝NH)-NH2、-C(＝O)NHOH、-C(＝S)-NH2、-S(＝O)-NH2和-SO3H；
Y选自CHR2、CR2-(C1-C4直链或支链烷基)-NR3R3、CH-(C1-C4直链或支链烷基)-R2、CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NR3R3、CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝O)-R2、CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝S)-R2、CH-(C1-C4直链或支链烷基)-C(＝O)-NR3R3、N-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝O)-R2、N-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝S)-R2、N-(C1-C4直链或支链烷基)-NR3R3、N-(C1-C4直链或支链烷基)-R2和C连接的5-6元饱和杂环；
R2选自5至6元的饱和或不饱和碳环或杂环、-OH、-O-(C1-C4直链或支链烷基)、-C1-C4直链或支链烷基、-S(＝O)2-CH3、-C(＝O)-O-(C1-C4直链或支链烷基)、-C(＝O)-(C1-C4直链或支链烷基)和当R2为5至6元的饱和或不饱和碳环或杂环时，R2也任选取代有一个或多个独立选自以下的取代基：卤素、-C1-C4直链或支链烷基、-C(＝O)-NH-(C1-C4直链或支链烷基)、-C(＝O)-O-(C1-C4直链或支链烷基)、-C(＝O)-O-(C1-C4直链或支链烷基)、-C(＝O)-OH、-O-PO3H2和-C(＝O)-NH-(C1-C4直链或支链烷基)-NH2；以及
R3独立地选自氢、-C1-C4直链或支链烷基、-C(＝O)-(5至6元的饱和碳环或杂环)和-S(＝O)2-CH3；或
结合至相同氮的两个R3与所述氮原子一起形成5至6元的饱和杂环，所述杂环任选包含一个或两个选自N、S、S(＝O)、S(＝O)2和O的另外的杂原子，其中所述杂环在任意碳原子上任选取代有以下取代基中的一个或多个：-OH、＝O、卤素、-C1-C4直链或支链烷基、氟取代的C1-C4直链或支链烷基、羟基取代的C1-C4直链或支链烷基、烷氧基取代的C1-C4直链或支链烷基、-C(＝O)-C1-C4直链或支链烷基，以及在任意可取代的氮原子上任选取代有-C1-C4直链或支链烷基、-C(＝O)-C1-C4直链或支链烷基、羟基取代的C1-C4直链或支链烷基、烷氧基取代的C1-C4直链或支链烷基或卤素取代的C1-C4直链或支链烷基；其中
当Y为C连接的5至6元的杂环时，它在任意碳原子上还任选取代有以下取代基中的一个或多个：-C(＝O)-R2、-OH、＝O、卤素、-C1-C4直链或支链烷基、氟取代的C1-C4直链或支链烷基、羟基取代的C1-C4直链或支链烷基、烷氧基取代的C1-C4直链或支链烷基，以及在任意可取代的氮原子上任选取代有-C1-C4直链或支链烷基、-C(＝O)-R2、羟基取代的C1-C4直链或支链烷基、烷氧基取代的C1-C4直链或支链烷基或卤素取代的C1-C4直链或支链烷基。
2.权利要求1的化合物或盐，其具有式：
3.权利要求1的化合物或盐，其选自：
4.权利要求1的化合物或盐，其中W为S。
5.权利要求1的化合物或盐，其中X为-C(＝O)-NH2。
6.权利要求1的化合物或盐，其中Y选自CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝O)-R2、CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NR3R3、N-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝O)-R2、N-(C1-C4直链或支链烷基)-NR3R3、CH-(C1-C4直链或支链烷基)-R2和CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝S)-R2。
7.权利要求6的化合物或盐，其中Y为CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝O)-R2和其中所述化合物或者盐选自以下中的任意一个：
8.权利要求6的化合物或盐，其中Y为CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NR3R3，且其中所述化合物或盐选自以下中的任意一个：
9.权利要求6的化合物或盐，其中Y为N-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝O)-R2，且其中所述化合物或盐选自以下中的任意一个：
10.权利要求6的化合物或盐，其中Y为N-(C1-C4直链或支链烷基)-NR3R3，且其中所述化合物或盐为：
11.权利要求6的化合物或盐，其中Y为CH-(C1-C4直链或支链烷基)-R2，且其中所述化合物或盐选自以下中的任意一个：
12.权利要求6的化合物或盐，其中Y为CH-(C1-C4直链或支链烷基)-NH-C(＝S)-R2，且其中所述化合物或盐为：
13.权利要求1的化合物或盐，其中Y为CHR2，且其中所述化合物或盐为：
14.权利要求1的化合物或盐，其中Y为C连接的杂环，且其中所述化合物或盐选自以下中的任意一个：
15.权利要求1的化合物或盐，其中R2选自5至6元的饱和或不饱和碳环或杂环、-C1-C4直链或支链烷基、-O-(C1-C4直链或支链烷基)和-OH。
16.权利要求1的化合物或盐，其中R3选自-C1-C4直链或支链烷基和-S(＝O)2-CH3。
17.权利要求1的化合物或盐，其中结合至相同氮的两个R3与所述氮原子一起形成任选取代的5至6元的饱和杂环。
18.药物组合物，其包含权利要求1的化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。
19.治疗患有神经变性障碍或癌症的受试者的方法，其包括向所述有此需要的受试者给予权利要求18的组合物。
20.在生物信号中检测沉默调节蛋白依赖性的方法，其包括比较存在权利要求1的沉默调节蛋白抑制剂化合物时的生物信号和不存在沉默调节蛋白抑制剂化合物时的生物信号，其中与不存在所述沉默调节蛋白抑制剂化合物时的生物信号相比，存在所述沉默调节蛋白抑制剂化合物时的生物信号的提高或降低表明，所述生物信号是沉默调节蛋白依赖性的。
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