CN105327684B - 识别莫西菌素的磁性荧光分子印迹材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种识别莫西菌素的磁性荧光分子印迹材料及其制备方法。本发明的制备方法包括：步骤A)、制备磁性明胶；步骤B)、修饰异硫氰酸荧光素；以及步骤C)、制备分子印迹膜。本发明制备的磁性荧光分子印迹材料可以直接萃取和分析复杂样本中的莫西菌素，具有选择性好、基质干扰小、萃取效率高、灵敏度好、分析时间短、价格低廉的优点。本发明制备的磁性荧光分子印迹材料既可以满足快速检测技术中所需要的高效高选择性的净化富集，又可以不依赖大型分析仪器，进行快速灵敏的发光检测，真正实现复杂样本中痕量物质的快速检测。

Description

识别莫西菌素的磁性荧光分子印迹材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及食品安全领域，具体涉及一种用于识别莫西菌素的磁性荧光分子印迹材料及其制备方法。

背景技术

莫西菌素(Moxidectin)是一种新型抗寄生虫药，是由链霉菌发酵产生、半合成的、成分单一的大环内酯类药物。该药具有对害虫作用强烈、用药量少、对人畜安全、不污染环境、只杀害虫、不伤害天敌，也不易产生抗性的特点，可作为防止该类药物产生抗性的复配及轮换用药，是目前最有前途的广谱、高效、新型无交叉抗性的生物杀虫剂。

尽管莫西菌素具有较高的安全性，但是在我国尚未批准使用，而国外已经广泛应用此类药物。因此，十分有必要建立动物源食品中多种米尔贝霉素的检测方法，做好相关技术储备，以保障我国进口食品安全，同时，该方法的建立对于构建我国的技术贸易壁垒体系具有积极的意义。

对于莫西菌素而言，目前国外建立了相应的检测标准，目前国外对米尔贝霉素类药物，除了莫西菌素之外，均未制定残留限量标准，欧盟、美国、日本对莫西菌素在牛/羊肉中的最高残留限量为20μg/kg，牛/羊肝脏中为100μg/kg，牛/羊肾脏中为50μg/kg，牛乳中为40μg/kg。而我国尚无莫西菌素检测的国家标准。

对于莫西菌素的分析，常规方法是采用C18固相萃取柱进行萃取，液相色谱荧光分析。但是，一方面由于缺乏选择性，其对复杂样本的净化效果不好，容易带来基质干扰；二是分析时间长，需要衍生化用于荧光分析。

因此，开发一种快速、高灵敏、高通量检测技术势在必行。

发明内容

针对上述问题，本发明希望提供一种能够高选择性地识别莫细菌素的材料的制备方法及相应材料。

具体而言，本发明提供一种识别莫西菌素的磁性荧光分子印迹材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤A)、制备磁性明胶；

步骤B)、修饰异硫氰酸荧光素；以及

步骤C)、制备分子印迹膜。

进一步地，所述步骤A)包括：

步骤A1)、将第一预定量的明胶溶解于水中，获得明胶溶液；

步骤A2)、向所述明胶溶液中加入三氯化铁和硫酸铁；

步骤A3)、对所获得明胶溶液进行加热并逐步加入氨水溶液，进行机械搅拌以获得磁性明胶；

步骤A4)对所获得的磁性明胶进行洗涤。

进一步地，所述步骤B)包括：

步骤B1)、将步骤A)中所获得的磁性明胶分散到溶剂中，获得相应溶液；

步骤B2)、在所获得溶液中加入异硫氰酸荧光素，并在常温条件下搅拌预定时间，获得荧光磁性明胶；

步骤B3)、清洗所获得产物。

进一步地，所述步骤C)包括：

步骤C1)、将步骤B)中所获得的荧光磁性明胶分散到第二预定量的乙腈中；

步骤C2)、加入第三预定量的丙烯酸并进行抚育；

步骤C3)、加入预定摩尔比的莫西菌素和N,N—二甲基丙烯酰胺，以及第四预定量的过硫酸铵，反应第二预定时间，获得磁性荧光分子印迹材料；

步骤C4)、对反应产物进行洗涤。

进一步地，在所述步骤A1)中，所述第一预定量的明胶为0.1-10g，所加水量为10-100mL，在所述步骤A2)中所加入的三氯化铁和硫酸铁的质量比为1：1至4:1，在所述步骤A3)中所加氨水的量为3-10mL。

进一步地，在所述步骤B1)中，所使用的溶剂为乙醇/水溶液，其中，乙醇比例大于50％，在所述步骤B2)中，所加入的异硫氰酸荧光占步骤B1)所获溶液的体积比为1-5％，搅拌时间为12-20小时。

进一步地，在所述步骤C1)中，所述第二预定量的乙腈为10-70mL，在所述步骤C2)中，所述第三预定量的丙烯酸为100-500mg，在所述步骤C3)中，所述预定摩尔比为1:10-40，所述第四预定量的过硫酸铵为10-50mg。

进一步地，在所述步骤C3)中，所采用的反应条件为温度40～60℃，反应时间12～24小时，所加入的莫细菌素用作模板。

另一方面，本发明提供一种磁性荧光分子印迹材料，其特征在于，所述磁性荧光分子印迹材料是采用上述制备方法制备的。

本发明将磁性纳米颗粒、异硫氰酸荧光素、分子印迹聚合物有机结合，制备出集磁、光、分子识别三种性能为一体的新型多功能复合材料，将该多功能复合材料作为选择性的萃取吸附剂和特异性识别的荧光探针，制备了一种集萃取/富集/检测一体化的莫西菌素快速检测材料，利用其进行检测，可以省略了常规样品预处理后期的浓缩蒸干及再溶解进样的繁琐操作过程，不依赖于高成本的色谱仪器分析，具有简便、快速、经济、易于实施、可广泛应用于基层实验室的特点，有望真正满足大量复杂样本中痕量莫西菌素快速检测的需要。

本发明的磁性荧光分子印迹材料可以直接萃取和分析复杂样本中莫西菌素，具有选择性好、基质干扰小、萃取效率高、灵敏度好、分析时间短、价格低廉的优点

此外，相对于现有的制备分子印迹材料的方法，本发明也进行了改进。

传统方法中，需要经过磁性材料-二氧化硅膜的修饰-荧光修饰-二氧化硅膜修饰-乙烯基修饰-分子印迹膜，6个步骤。相比之下，本发明的制备方法利用明胶丰富的氨基基团，实现磁性明胶-荧光修饰-分子印迹膜，3个步骤，无需反复二氧化硅膜的修饰。此外，传统方法的荧光基团包裹在二氧化硅膜内，因而光强度不高，检测灵敏度不好。我们提出方法的荧光基团插入到分子印迹膜内，因而光强度很高，检测灵敏度很好。

附图说明

图1示意性示出了本发明的磁性@荧光@分子印迹材料的制备过程；

图2示出磁性@荧光@分子印迹材料(MIPs)和磁性@荧光@非分子印迹材料(NIPs)的吸附动力学过程；

图3示出了磁性@荧光@分子印迹材料和磁性@荧光@非分子印迹材料的吸附容量研究；

图4示出了磁性@荧光@分子印迹材料对不同浓度莫西菌素的荧光响应曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施例进行详细描述。

实施例

在实施例中，介绍磁性荧光分子印迹材料的一种制备方法。

一、磁性明胶材料的制备

将3g的明胶溶解在50mL的纯水中，常温下抚育30分钟后，加热溶解明胶，随后加入质量比为2/1的三氯化铁和硫酸铁。将溶液温度升到80℃后，逐滴加入5mL的氨水溶液，并在此温度下机械搅拌5小时。最后用乙醇、水等溶液洗涤磁性明胶材料。磁性明胶材料一方面可以实现复合材料的磁分离，有助于目标物的萃取和检测，另一方面能够提供大量氨基，有助于后期荧光修饰和分子印迹膜的制备。

二、修饰异硫氰酸荧光素

将制备的磁性明胶分散到乙醇/水溶液中(乙醇比例大于50％)，随后加入体积比5％的异硫氰酸荧光素，并在常温条件下搅拌12小时。最后用乙醇、水等溶液洗涤磁性明胶材料，去除未反应的异硫氰酸荧光素。

三、磁性荧光分子印迹材料的聚合

将修饰处理的产物——荧光@磁性明胶分散到50mL乙腈中，随后加入100mg的甲基丙烯酸(功能单体)并常温抚育过夜，有助于丙烯酸的羧基和磁性明胶的氨基进行离子间作用，随后加入摩尔比为1：10的莫西菌素(模板)和二甲基丙烯酸乙二醇酯(交联剂)，以及10mg的偶氮二异丁腈(引发剂)。60℃条件下，反应24小时。离心收集所得聚合物，甲酸/乙酸溶液(9:1，V/V)洗脱模板分子36h，然后用甲醇再次洗涤12h，以除去残留的乙酸，最后将聚合物置于通风橱中干燥至恒重，得到印迹复合材料。非印迹聚合物(Non-imprintedPolymers，NIPs)的制备在无模板存在下同印迹聚合物制备过程。磁性明胶表面分子印迹膜的修饰能够选择性识别莫西菌素，排除样本杂质的干扰。

从图2可见，磁性@荧光@分子印迹复合材料在前60min内对模板分子的吸附速率很快，而后逐渐趋于缓慢，120min后吸附量基本达到平衡。这是由于磁性@荧光@分子印迹复合材料具有立体印迹孔穴结构的高分子聚合物，在开始阶段，吸附过程主要发生在聚合物的表面，所以速率较快。随着时间的延长，表层吸附位点逐步达到平衡

从图3可知，磁性@荧光@分子印迹材料对莫西菌素的吸附容量随着浓度的升高而逐步增强，当莫西菌素的浓度达到200mg L^-1时，吸附容量达至平衡，最大吸附量为87.1mgg^-1，远大于磁性@荧光@非印迹材料(24.2mg g^-1)，说明组成相同的印迹材料和非印迹材料在空间结构上存在着明显差异，印迹材料含有与莫西菌素的立体结构相吻合的印迹孔穴和固定排列的功能基团，因而表现出极佳的吸附容量。

选择性研究

食品样品中大量的杂质和在磁性MIPs固相萃取-荧光检测过程中使用的大量外源物质，极有可能影响荧光强度。已有文献报道，依赖于MIPs的选择性可以有效的去除基质干扰，消除背景噪声，增强抗干扰的能力。本研究为探讨干扰物质对荧光强度的影响，以1μgmL^-1的莫西菌素为参考溶液，研究在磁性MIPs固相萃取前后，可耐受的样品基质和外来物质的最大浓度(表1)。结果表明：磁性MIPs复合材料可以极大地改善荧光测定的选择性，提高方法抵抗干扰的能力。一般而言，食品样本中干扰组分的含量均低于方法的可耐受浓度，因而不会对莫西菌素的测定带来影响，保证了方法的准确性和灵敏度。

表1

磁性@荧光@分子印记材料对莫西菌素检测中的抗干扰性能

验证：下面描述如何利用本发明制备的材料进行食品样本中莫西菌素的残留检测

自当地的超市购买猪肉、牛奶、猪肝等样品，并通过LC-MS标定，未检测到莫西菌素的存在。检测过程如下：准确称量10.00g样品加入到50mL离心管中，加入一定量的莫西菌素标准溶液后，加入10mL乙腈涡旋均质后，离心。重复均质、离心过程一次，两次上清液被转移50mL的离心管中。将MIPs材料加入到离心管中振荡、抚育5分钟，经外加磁场分离，2mL ACN：H₂O(9：1，v/v)淋洗去除非特异性吸附于印迹材料上的干扰化合物，然后通过酶标仪计算复合材料萃取莫西菌素前后的荧光值，定量分析食品中莫西菌素的含量。研究结果见表2。依赖于多功能分子印迹磁性复合材料的选择性固相萃取和灵敏的荧光检测技术，本发明建立了一种快速、灵敏、高效、高选择性、低成本检测莫西菌素的新方法。在最佳的试验条件下，莫西菌素浓度在10-1000ng mL^-1的范围内与荧光强度呈良好的线性关系(图4)。本发明方法的添加回收率在96.3％-107.2％之间，相对标准偏差低于8.5％。此外，本发明所制备材料的测定结果与经典液相色谱-荧光检测技术的测定结果具有良好的一致性，由此可知，本研究建立的方法能够用于莫西菌素的快速、高效、灵敏分析。

表2

本发明所提出的方法与经典的LC-FLD方法测定食品中莫西菌素的比较研究。

综述

本发明将磁性纳米颗粒、异硫氰酸荧光素、分子印迹聚合物有机结合，制备出集磁、光、分子识别三种性能为一体的新型多功能复合材料，将该多功能复合材料作为选择性的萃取吸附剂和特异性识别的荧光探针，建立一种集萃取/富集/检测一体化的莫西菌素快速检测新技术，该技术省略了常规样品预处理后期的浓缩蒸干及再溶解进样的繁琐操作过程，降低了利用色谱/质谱联用技术分离检测时的高成本，具有简便、快速、经济、易于实施、可广泛应用于基层实验室的特点，有望真正满足大量复杂样本中痕量莫西菌素快速检测的需要。

虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。

Claims (6)

1.一种识别莫西菌素的磁性荧光分子印迹材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤A)、制备磁性明胶；

步骤B)、修饰异硫氰酸荧光素；以及

步骤C)、制备分子印迹膜，

其中，所述步骤A)包括：

步骤A1)、将第一预定量的明胶溶解于水中，获得明胶溶液；

步骤A2)、向所述明胶溶液中加入三氯化铁和硫酸铁；

步骤A3)、对所获得的明胶溶液进行加热并逐步加入氨水溶液，进行机械搅拌以获得磁性明胶；

步骤A4)对所获得的磁性明胶进行洗涤，

所述步骤B)包括：

步骤B1)、将步骤A)中所获得的磁性明胶分散到溶剂中，获得相应溶液；

步骤B2)、在所获得溶液中加入异硫氰酸荧光素，并在常温条件下搅拌预定时间，获得荧光磁性明胶；

步骤B3)、清洗所获得产物，

所述步骤C)包括：

步骤C1)、将步骤B)中所获得的荧光磁性明胶分散到第二预定量的乙腈中；

步骤C2)、加入第三预定量的丙烯酸并进行抚育；

步骤C3)、加入预定摩尔比的莫西菌素和N,N—二甲基丙烯酰胺，以及第四预定量的过硫酸铵，反应第二预定时间，获得磁性荧光分子印迹材料；

步骤C4)、对反应产物进行洗涤。

2.根据权利要求1所述的磁性荧光分子印迹材料的制备方法，其特征在于，在所述步骤A1)中，所述第一预定量的明胶为0.1-10g，所加水量为10-100mL，在所述步骤A2)中所加入的三氯化铁和硫酸铁的质量比为1：1至4:1，在所述步骤A3)中所加氨水的量为3-10mL。

3.根据权利要求2所述的磁性荧光分子印迹材料的制备方法，其特征在于，

在所述步骤B1)中，所使用的溶剂为乙醇/水溶液，其中，乙醇比例大于50％，在所述步骤B2)中，所加入的异硫氰酸荧光素占步骤B1)所获溶液的体积比为1-5％，搅拌时间为12-20小时。

4.根据权利要求3所述的磁性荧光分子印迹材料的制备方法，其特征在于，

在所述步骤C1)中，所述第二预定量的乙腈为10-70mL，在所述步骤C2)中，所述第三预定量的丙烯酸为100-500mg，在所述步骤C3)中，所述预定摩尔比为1:10-40，所述第四预定量的过硫酸铵为10-50mg。

5.根据权利要求4所述的磁性荧光分子印迹材料的制备方法，其特征在于，

在所述步骤C3)中，所采用的反应条件为温度40～60℃，反应时间12～24小时，所加入的莫西菌素用作模板。

6.一种磁性荧光分子印迹材料，其特征在于，所述磁性荧光分子印迹材料是采用权利要求1-5中任意一项所述的制备方法制备得到的。