CN105297145B - 一种制备基因dna探针文库的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种遗传代谢病的筛查方法和试剂盒。所述方法和试剂盒包括构建如下文库：针对遗传代谢病相关致病基因的每个编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为120bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在60bp的重叠；在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加TAGGTGTGTAGGCGC和GTCAGCTAGTACGCA序列；采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成；用氨水将芯片上的寡核苷酸洗脱下来，溶于水中，形成寡核苷酸混合物；通过PCR的方法，采用5’端带有生物素标记的正向引物(TTAGATAGGTGTGTAGGCGC)和反向引物(TAAGGTGCGTACTAGCTGAC)，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的遗传代谢病相关致病基因DNA探针文库。
Description
技术领域
本发明属于遗传检测，特别涉及基因突变的检测。
背景技术
遗传代谢病是因维持机体正常代谢所必需的某些由多肽和(或)蛋白组成的酶、受体、载体及膜泵生物合成发生遗传缺陷，即编码这类多肽(蛋白)的基因发生突变而导致的疾病。多为单基因遗传病，遗传代谢病一部分病因由基因遗传导致，还有一部分是后天基因突变造成，发病期不仅仅是新生儿，覆盖全年龄阶段。
遗传代谢病对人体损伤极大，常见有神经系统异常、代谢性酸中毒和酮症、严重呕吐、肝脏肿大或肝功能不全、特殊气味、容貌怪异、皮肤和毛发异常、眼部异常、耳聋等，多数遗传代谢病伴有神经系统异常，在新生儿期发病者可表现为急性脑病，造成痴呆、脑瘫、甚至昏迷、死亡等严重并发症。
随着高通量测序技术的发展与成熟，人全基因组测序已经成为遗传代谢病相关致病基因突变研究和诊断的重要工具。通过全基因组测序对被测样本进行全基因组扫描，可实现对基因突变零遗漏，从而成为遗传代谢病相关致病基因突变研究和诊断的有效工具。
由于人类基因组的大小约为3Gb，对其进行全基因组测序总计约需 90Gb测序数据。巨大的数据量要求所致高昂的测序成本，导致全基因组测序应用于遗传代谢病的基因诊断受到限制。
全基因组测序需要产生大量的测序数据量，测序成本高，因此测序深度不可能太深。对于检查基因突变而言，想要实现突变检查的零遗漏，全基因组测序确实难以担当此任。特别是对于，一次检测数百个基因上发生的所有突变，高深度测序才能实现对突变检测的准确性。
因此，开发一款价格低廉的，准确性高的基因突变检查产品，特别是对于遗传代谢病基因突变的诊断产品，具有重要的作用。
发明内容
在第一方面，本发明涉及一种制备基因DNA探针文库的方法：
1)针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为110-130bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3；
2)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加 TAGGTGTGTAGGCGC(SEQ ID NO.1)和GTCAGCTAGTACGCA (SEQ ID NO.2)序列，形成两端带有同样序列的探针序列；
3)合成上述探针序列，形成寡核苷酸混合物；
4)通过PCR的方法，采用5’端均带有标记(例如生物素标记)的正向引物(SEQ IDNO.3：TTAGATAGGTGTGTAGGCGC)和反向引物 (SEQ ID NO.4：TAAGGTGCGTACTAGCTGAC)，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带标记(例如生物素标记)的基因DNA探针文库。
在一个实施方案中，步骤3)中的采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下列，形成寡核苷酸混合物。
在一个实施方案中，所述基因选自表1中示出的遗传代谢病相关致病基因，例如表1中的所有基因。
在一个实施方案中，所述探针序列的长度为120bp，所述探针在每两个相邻的探针序列之间存在60bp或80bp的重叠。
在一个实施方案中，所述探针序列的长度为114bp，所述探针在每两个相邻的探针序列之间存在76bp的重叠。该优选实施方案中的所述方法，特别适合于检测选自表2(优选表3)中示出的遗传代谢病相关致病基因，例如表3中的所有基因。
在一个实施方案中，所述基因选自表3中示出的遗传代谢病相关致病基因，例如表3中的所有基因。
在第二方面，本发明涉及本发明第一方面的方法制备的基因DNA 探针文库和包括所述基因DNA探针文库的试剂盒。
在第三方面，本发明涉及一种利用试剂盒筛查受试者基因突变的方法，所述方法包括：
1)提取所述受试者的基因组DNA，打断至200-300bp的范围；
2)对上述打碎的基因组DNA进行DNA小片段文库的制备；
3)将DNA小片段文库和本发明第二方面的基因DNA探针文库进行杂交，进行基因的捕获；
4)采用PCR，以SEQ ID NO.5：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT和SEQ IDNO.6：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT为引物，对上述捕获后的产物进行扩增，得到扩增产物；
5)对步骤4)中获得的扩增产物进行上机测序，得到所述基因的测序数据；
6)将测序数据与到人类参考基因组进行比对，从而得到与参考基因组不同的单核苷酸多态性、插入或缺失，即所检测到的基因突变。
在一个实施方案中，所述人类参考基因组是HG19。
在一个实施方案中，在步骤2)中采用Illumina TruSeq DNA librarypreparation试剂盒，进行DNA小片段文库的制备。
本发明的方法和试剂盒至少有如下优点：
相对于全基因组测序，大大节约了所需要的测序数据量；
一次性检测疾病相关致病基因的所有突变，实现对疾病基因诊断的零遗漏，为疾病的治疗和干预提供保障；
高深度的测序，实现对基因突变的高准确性检测；
成本低，一次检测数百个基因上发生的所有突变；
高深度测序实现对突变检测的准确性。
具体实施方式
通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。
在本发明中，针对基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为110-130bp的探针序列，优选120bp，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3。对于所述探针序列的长度，大于130bp会带来合成上的困难，小于110bp一是其捕获能力降低，二是会增加探针数量，从而增加成本，二者平衡非常重要，发明人经过不断试验，得到了110-130bp的较优值。对于所述探针在每两个相邻的探针序列之间的重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3，这是因为会对每一个区域都形成2层或者3层的探针覆盖，因此探针覆盖均匀，进而不影响捕获的均一性，而探针覆盖不均匀会影响到捕获的均一性。因此，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3。在所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2的情况下，优选探针长度是偶数；在所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的2/3的情况下，优选探针长度是3的整倍数。但是，在探针长度不是偶数或3的整倍数的情况下，所述重叠取所述探针长度1/2或2/3的近似整数也是可以的，虽然其效果不如探针长度是偶数或3的整倍数的情况。
一般而言，所述探针长度较短时，比如110-120bp之间，优选所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的2/3。这样虽然探针的捕获能力较低，但探针的覆盖增加50％，效果反而更好。从性价比的角度看，优选所述探针长度为111或114、所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的2/3的情况。
在本发明中，在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加 TAGGTGTGTAGGCGC(SEQ IDNO.1)和GTCAGCTAGTACGCA (SEQ ID NO.2)序列，这是为了PCR扩增富集探针而加入的引物结合序列，这样使用一对引物即可实现对所有探针的扩增。
在本发明中，对于正向引物(SEQ ID NO.3： TTAGATAGGTGTGTAGGCGC)和反向引物(SEQ ID NO.4： TAAGGTGCGTACTAGCTGAC)，选择这对引物是因为它们在人基因组上没有同源序列，对PCR扩增不会产生干扰，它们自身之间也没有重叠和干扰。
实施例
1.遗传代谢病相关致病基因的试剂盒制备
所述试剂盒包括如下方法制备的遗传代谢病相关致病基因DNA探针文库：
1)根据人类参考基因组HG19，结合Ensembl、CCDS、Gencode、 VEGA、SNP以及CytoBand数据库，获取以下表1中遗传代谢病相关致病基因的所有编码序列；
表1遗传代谢病相关致病基因列表
(基因名称来自http://www.genenames.org/)：
| GNPTG | FOXG1 | HGD | SARDH | GNPTAB | HMGCL | ARX | GM2A | UROC1 |
| SLC36A2 | ABAT | CPS1 | HPD | MMACHC | IDUA | ARG1 | AMT | OAT |
| BTD | MVK | SLC6A19 | SUOX | ETFDH | OPA3 | MUT | HEXA | BCAT1 |
| SLC6A20 | PCCB | MMAB | DDC | PNPO | ALDH6A1 | FOLR2 | HEXB | ALPL |
| SLC7A9 | PCCA | MMAA | ACADM | ABCD4 | GATM | FOLR1 | HLCS | BCAT2 |
| OGDH | PRODH | LAMP2 | ALDH5A1 | INPP5E | SUCLG1 | IVD | ACSF3 | ABCD1 |
| SLC7A7 | HSD17B10 | SLC25A13 | OTC | PTS | TAZ | GALNS | AUH | ETHE1 |
| FAH | NAGLU | DHFR | SLC3A1 | AGL | QDPR | GALC | GLB1 | TH |
| GLDC | ACADSB | MLYCD | DGUOK | ETFB | MECP2 | ALDH4A1 | MCCC2 | SLC37A4 |
| SLC25A20 | AHCY | MTR | LMBRD1 | ETFA | HAL | GCSH | SERAC1 | ABHD5 |
| IDS | NAGS | SLC25A15 | MTRR | GBA | PNPLA2 | MOCS1 | MCEE | AASS |
| MAT1A | ASS1 | SLC46A1 | ACADVL | BCKDHA | TAT | FH | MCCC1 | SLC19A1 |
| SLC2A2 | PAH | PC | CTH | PSAP | CDKL5 | GCDH | SLC22A5 | GCH1 |
| SLC2A1 | ASL | SGSH | ALDH7A1 | BCKDHB | NPC1 | MOCS2 | ACAD8 | GALK1 |
| SPR | ACAT1 | ARSB | G6PC | NTNG1 | NPC2 | MMADHC | DHTKD1 | MTHFR |
| MCOLN1 | HADHA | D2HGDH | ADK | FTCD | DLD | MAOA | MAN2B1 | GPHN |
| HADH | HADHB | CPT2 | GAA | DBH | C7ORF10 | MANBA | CPT1A | DBT |
| GLA | SLC6A8 | L2HGDH | SMPD1 | PHGDH | ARSA | GAMT | PSAT1 | CBS |
2)针对每个编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为120bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在60bp的重叠；
3)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加 TAGGTGTGTAGGCGC(SEQ ID NO.1)和GTCAGCTAGTACGCA (SEQ ID NO.2)序列，形成两端带有同样序列的探针序列列表；
4)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列列表中的序列；
5)用氨水将芯片上的寡核苷酸洗脱下列，溶于100微升的超纯水中，形成寡核苷酸混合物；
6)通过PCR的方法，采用5’端带有生物素标记的正向引物(SEQ ID NO.3：TTAGATAGGTGTGTAGGCGC)和5’端带有同样标记的反向引物(SEQ ID NO.4：TAAGGTGCGTACTAGCTGAC)，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的遗传代谢病相关致病基因DNA探针文库。
反应体系如下：
| 试剂名称 | 体积 |
| KAPA 2G Buffer B 5× | 10μl |
| dNTP(10mM each) | 1μl |
| 正向引物(25μM) | 0.5μl |
| 反向引物(25μM) | 0.5μl |
| 寡核苷酸混合物 | 5μl |
| KAPA 2G robust DNA Taq | 0.8μl |
| H<sub>2</sub>O | 32.2μl |
反应条件如下：
2.遗传代谢病相关致病基因的试剂盒筛查突变
1)取人受试者的基因组DNA 1μg，采用超声破碎仪，打断至200- 300bp的范围；
2)采用Illumina TruSeq DNA library preparation试剂盒，进行DNA 小片段文库的制备；
3)将DNA小片段文库和上述制备的遗传代谢病相关致病基因 DNA探针文库进行液相杂交，进行遗传代谢病相关致病基因的捕获；
4)采用PCR，以Illumina PE PCR primer 1.0(SEQ ID NO.5： AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT)和Illumina PE PCR primer 2.0(SEQID NO.6： CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT)为引物，对捕获后的产物进行扩增，得到测序文库；
反应体系如下：
| 试剂名称 | 体积 |
| 捕获产物 | 10μl |
| PE PCR primer 1.0(25μM) | 2.5μl |
| PE PCR primer 2.0(25μM) | 2.5μl |
| Phusion High-Fidelity 2×PCR Master Mix | 25μl |
| 超纯水 | 10ul |
反应条件如下：
5)采用Illumina高通量测序仪Hiseq 4000，对测序文库进行上机测序，得到遗传代谢病相关致病基因的测序数据；
6)利用BWA MEM软件，将测序数据与到人类参考基因组HG19 进行比对，所用的参数为：bwa mem-M-k 40-t 8-R ″@RG\tID:Hiseq\tPL:Illumina\tSM:sample″，从而得到与参考基因组不同的单核苷酸多态性、插入或缺失，即所检测到的基因突变。
3.目标区域捕获效果评估
1)采用samtools-1.2软件中的samtools stats工具统计数据的大小、比对率、重复率、质量值，接着再用软件中的samtools depth工具，计算目标区域每个位置的测序深度；
2)用比对到目标区域的数据量除以总数据量，获得捕获效率；
3)根据目标区域每个位置的测序深度，分别统计测序深度≥1、≥4、≥10及≥20的碱基数量，再将该碱基数量除以目标区域的总碱基数量，从而得到1×覆盖率、4×覆盖率、10×覆盖率及20×覆盖率的参数。
4.全基因组测序以及目标区域捕获效果评估
1)取人受试者的基因组DNA 1μg，采用超声破碎仪，打断至200- 300bp的范围；
2)采用Illumina TruSeq DNA library preparation试剂盒，进行DNA 小片段文库的制备；
3)采用Illumina高通量测序仪Hiseq 4000，对DNA小片段文库进行上机测序，得到遗传代谢病相关致病基因的测序数据；
4)利用BWA MEM软件，将测序数据与到人类参考基因组HG19 进行比对。所用的参数为：bwa mem-M-k 40-t 8-R ″@RG\tID:Hiseq\tPL:Illumina\tSM:sample″，从而得到与参考基因组不同的单核苷酸多态性、插入或缺失，即所检测到的基因突变；
5)采用samtools-1.2软件中的samtools stats工具统计数据的大小、比对率、重复率、质量值；接着再用软件中的samtools depth工具，计算目标区域每个位置的测序深度；
6)根据比对到目标区域的数据量，除以总数据量，获得捕获效率；
7)根据目标区域每个位置的测序深度，分别统计测序深度≥1、≥4、≥10及≥20的碱基数量，再将该碱基数量除以目标区域的总碱基数量，从而得到1×覆盖率、4×覆盖率、10×覆盖率及20×覆盖率的参数。
表2：遗传代谢病相关致病基因的试剂盒筛查和全基因组测序所得结果比较
从以上表2可以看出，全基因组测序和遗传代谢病相关致病基因的试剂盒筛查相比，1)全基因组测序的绝大多数数据(99.98％)是没有用的，数据利用率仅为0.02％；2)目标区域有效数据量相比也比较小，导致目标区域的平均深度只有34.46层，相比之下，遗传代谢病相关致病基因的试剂盒筛查的平均深度高达368.04层；3)全基因组测序在深度为20×的目标区域比例也比较小，仅为88.73％，而遗传代谢病相关致病基因的试剂盒筛查的为99.60％。
由于表1中的基因，从其DNA序列碱基组成的角度来看，其碱基组成没有经过任何选择和筛选，所以本发明的方法和试剂盒对于所适用的基因没有特别要求。从发明人对表1中列出的每个基因分别考察来看，利用本发明的方法和试剂盒对基因突变的检测都明显优于全基因测序的方法。
然而，不希望拘囿于任何理论，发明人进一步以类似的方法对于每个测试基因分析了表2中的比较结果，实施例中的方法和试剂盒(选择所述探针长度为114、所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的2/3的情况)对如下表3中的基因的突变检测而言，相对于全基因组检测，比其余基因具有更加优的检测效果(遗传代谢病相关致病基因的试剂盒筛查在深度为20×的目标区域比例为99.93％)。这可能和选择的探针序列的长度为114bp，所述探针在每两个相邻的探针序列之间存在76bp的重叠有关，将探针序列的长度为110-130bp之间、探针在每两个相邻的探针序列之间的重叠进行调整，对于每个基因的基因突变检测会找到更优的探针序列的长度和探针在每两个相邻的探针序列之间存在的重叠。因此，本发明还提供了一种极为适合于检测表2(更优选表 3)中的基因的基因突变的方法和试剂盒，所述方法和试剂盒如发明内容中所述，不同之处在于所述探针长度为114、所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的2/3。通过上述结果，对于表3中的基因的基因突变进行检测，无疑是重要的并且可以实现的。
表3，本实施例的条件下特别优选的基因列表：
| SARDH | MUT | INPP5E | ABCD1 | GNPTAB |
| GBA | ARSA | CPS1 | HPD | CPT2 |
| SLC7A7 | MTR | DHFR | MMADHC | ETFDH |
| IDS | PC | PAH | GCDH | ACAT1 |
虽然已经结合优选实施例对本发明进行了描述，但应当理解本发明的保护范围并不局限于这里所描述的实施例。结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。
Claims (11)
1.一种制备基因DNA探针文库的方法，所述基因为遗传代谢病相关致病基因，所述方法包括：
1)针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计等长的探针序列，长度为110-130bp，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠长度是所述探针长度的1/2或2/3；
2)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列，形成两端带有同样序列的探针序列；
3)合成步骤2)形成的所述探针序列，形成寡核苷酸混合物；
4)通过PCR的方法，采用5’端均带有标记的正向引物SEQ ID NO.3和反向引物SEQ IDNO.4，对所述寡核苷酸混合物进行扩增，形成带标记的基因DNA探针文库。
2.权利要求1的方法，步骤3)中的采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下来，形成寡核苷酸混合物。
3.权利要求1的方法，步骤4)中的所述标记是生物素标记。
4.权利要求1的方法，步骤1)中的所述探针序列的长度为120bp，所述探针在每两个相邻的探针序列之间存在60bp或80bp的重叠；或者所述探针序列的长度为114bp，所述探针在每两个相邻的探针序列之间存在76bp的重叠。
5.权利要求1-4任一项的方法，所述基因选自如下的遗传代谢病相关致病基因：GNPTG、FOXG1、HGD、SARDH、GNPTAB、HMGCL、ARX、GM2A、UROC1、SLC36A2、ABAT、CPS1、HPD、MMACHC、IDUA、ARG1、AMT、OAT、BTD、MVK、SLC6A19、SUOX、ETFDH、OPA3、MUT、HEXA、BCAT1、SLC6A20、PCCB、MMAB、DDC、PNPO、ALDH6A1、FOLR2、HEXB、ALPL、SLC7A9、PCCA、MMAA、ACADM、ABCD4、GATM、FOLR1、HLCS、BCAT2、OGDH、PRODH、LAMP2、ALDH5A1、INPP5E、SUCLG1、IVD、ACSF3、ABCD1、SLC7A7、HSD17B10、SLC25A13、OTC、PTS、TAZ、GALNS、AUH、ETHE1、FAH、NAGLU、DHFR、SLC3A1、AGL、QDPR、GALC、GLB1、TH、GLDC、ACADSB、MLYCD、DGUOK、ETFB、MECP2、ALDH4A1、MCCC2、SLC37A4、SLC25A20、AHCY、MTR、LMBRD1、ETFA、HAL、GCSH、SERAC1、ABHD5、IDS、NAGS、SLC25A15、MTRR、GBA、PNPLA2、MOCS1、MCEE、AASS、MAT1A、ASS1、SLC46A1、ACADVL、BCKDHA、TAT、FH、MCCC1、SLC19A1、SLC2A2、PAH、PC、CTH、PSAP、CDKL5、GCDH、SLC22A5、GCH1、SLC2A1、ASL、SGSH、ALDH7A1、BCKDHB、NPC1、MOCS2、ACAD8、GALK1、SPR、ACAT1、ARSB、G6PC、NTNG1、NPC2、MMADHC、DHTKD1、MTHFR、MCOLN1、HADHA、D2HGDH、ADK、FTCD、DLD、MAOA、MAN2B1、GPHN、HADH、HADHB、CPT2、GAA、DBH、C7ORF10、MANBA、CPT1A、DBT、GLA、SLC6A8、L2HGDH、SMPD1、PHGDH、ARSA、GAMT、PSAT1、CBS。
6.权利要求5的方法，所述基因选自如下的遗传代谢病相关致病基因：SARDH、MUT、INPP5E、ABCD1、GNPTAB、GBA、ARSA、CPS1、HPD、CPT2、SLC7A7、MTR、DHFR、MMADHC、ETFDH、IDS、PC、PAH、GCDH、ACAT1。
7.权利要求1-4任一项的方法制备的基因DNA探针文库或包括所述基因DNA探针文库的试剂盒。
8.权利要求5或6的方法制备的基因DNA探针文库或包括所述基因DNA探针文库的试剂盒。
9.一种筛查受试者基因突变的方法，所述方法包括：
1)提取所述受试者的基因组DNA，将其打断至200-300bp的范围；
2)对上述打碎的基因组DNA进行DNA小片段文库的制备；
3)将DNA小片段文库和权利要求7的基因DNA探针文库或试剂盒进行杂交，进行基因的捕获；
4)采用PCR，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物，对步骤3)中捕获的产物进行扩增，得到扩增产物；
5)对步骤4)获得的扩增产物进行上机测序，得到所述基因的测序数据；
6)将步骤5)的测序数据与人类参考基因组进行比对，从而得到与参考基因组不同的单核苷酸多态性、插入或缺失，即所检测到的基因突变，
所述方法用于非诊断目的。
10.权利要求9的方法，在步骤2)中采用Illumina TruSeq DNA library preparation试剂盒，进行DNA小片段文库的制备。
11.权利要求9或10的方法，在步骤6)中所述人类参考基因组是HG19。
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