CN105294792A - 一种从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法，以碱性醇试剂为提取溶剂，采用超声加热提取的方法从桔柚果皮中提取橙皮苷，再用大孔树脂进行纯化，方法简便，成本低，得到的橙皮苷得率好，纯度高，具有良好的稳定性与重复性，为桔柚果皮中提取橙皮苷的工业化生产提供了科学依据。

Description

一种从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法

技术领域

本发明涉及一种从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法。

背景技术

橙皮苷具有增强毛细血管抵抗力，维持血管通透性，降低胆固醇和防止动脉硬化等多种功能，可应用于药品、医疗制品和保健食品等，具有十分广泛的用途，其需求量也在逐年上升。但现有的橙皮苷制备方法，效率低下，收率小，纯度低，设备方法复杂，生产成本高，不利于橙皮苷的大规模生产，为橙皮苷的应用带来了瓶颈。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法，方法简单，操作简便，成本低，得到的橙皮苷纯度好，得率高，且具有良好的稳定性和重复性，可为橙皮苷的大规模工业化生产提供依据。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法，包括：

1)桔柚果皮取白皮层，剪碎，置55℃～65℃烘干，粉碎成桔柚果皮粗粉；取该桔柚果皮粗粉按料液比1:20～35(w/v)加入0.05～0.3％NaOH-60～70％乙醇溶液，40℃～75℃超声提取1～3次，每次25～50min；合并提取液并浓缩至原体积的0.35～0.65倍；调节pH值至4.5～5.5，置于2～6℃下静置过夜待沉淀析出；取沉淀，减压干燥沉淀，得到橙皮苷粗提物；

2)取经预处理的大孔树脂滤去水分后装柱，按大孔树脂与橙皮苷粗提物1:1.2～1.6(v/w)的比例称取橙皮苷粗提物，加水溶解制成0.17～0.18mg/ml的上样液后上样；用水洗脱1～2.5BV以洗去杂质；再用40～55％乙醇洗脱4～6BV；收集洗脱液并浓缩至2～8ml，置于2～6℃下冷藏至白色沉淀析出；取沉淀，减压干燥沉淀，得到橙皮苷。

一实施例中：所述步骤1)中，桔柚果皮取白皮层，剪碎，置55℃～65℃烘干，粉碎成粒径为18～25目的桔柚果皮粗粉；取该桔柚果皮粗粉按料液比1:29～31(w/v)加入0.09～0.11％NaOH-64～66％乙醇溶液，68～72℃超声提取2次，每次28～32min；合并提取液并浓缩至原体积的0.45～0.55倍；调节pH值至4.5～5.5，置于2～6℃下静置过夜待沉淀析出；取沉淀，减压干燥沉淀，得到橙皮苷粗提物；

一实施例中：所述步骤2)中，取经预处理的大孔树脂滤去水分后装柱，按大孔树脂与橙皮苷粗提物1:1.3～1.5(v/w)的比例称取橙皮苷粗提物，加水溶解制成0.171～0.172mg/ml的上样液后上样；用水洗脱1.8～2.2BV以洗去杂质；再用48～52％乙醇洗脱4.8～5.2BV；收集洗脱液并浓缩至4～6ml，置于2～6℃下冷藏至白色沉淀析出；取沉淀，减压干燥沉淀，得到橙皮苷。

一实施例中：所述减压干燥沉淀步骤为：将沉淀在40～50℃，-0.1～-0.08MPa下减压干燥。

一实施例中：所述步骤2)中，大孔树脂装柱之径高比为1:8～10。

一实施例中：所述步骤2)中，上样流速为0.5ml/min；洗脱流速为0.5ml/min。

一实施例中：所述大孔树脂为D101、AB-8中的一种。

一实施例中：还包括：

3)测定步骤1)所得之橙皮苷粗提物纯度：通过高效液相色谱法测定：

色谱条件：色谱柱：lichrocartC18；流动相：25:75～20:80(v/v)的乙腈-0.1％磷酸水溶液；流速：0.8～1.2mL/min；检测波长283nm；柱温24～26℃；理论板数按橙皮苷峰计算不低于2000。

一实施例中：还包括：

4)测定步骤2)所得之橙皮苷纯度：通过高效液相色谱法测定：

色谱条件：色谱柱：lichrocartC18；流动相：25:75～20:80(v/v)乙腈-0.1％磷酸水溶液；流速：0.8～1.2mL/min；检测波长283nm；柱温24～26℃；理论板数按橙皮苷峰计算不低于2000。

本发明所述之室温为25℃。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

1.本发明所提供的从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法，不需要采用高速逆流色谱等复杂的分离手段，仅用大孔树脂即可达到纯化橙皮苷的目的，方法简单，操作简便，橙皮苷得率高且纯度可达90％以上，且所需设备简单经济，试剂价格低廉且毒性低、来源广泛、易于获得，无形中降低了橙皮苷的生产成本，更有利于大规模推广用于橙皮苷的工业化生产。

2.我国是桔柚生产和消费大国，每年都有很多桔柚果皮作为废渣被丢弃，不仅造成了资源的浪费，也对环境带来污染，还会提高生产厂家处理废料的成本；本发明提供的从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法，不仅提供了橙皮苷的工业化生产思路，也有效地解决了桔柚果皮的浪费问题，使桔柚果皮能够得到充分再利用，大大减轻了废料处理和环境污染的压力。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1A为对照品的高效液相色谱图，图中1即为橙皮苷峰。

图1B为供试品的高效液相色谱图，图中1即为橙皮苷峰。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容：

实施例1

1)桔柚果皮去掉外皮，取白皮层，剪碎，置电热恒温鼓风干燥箱中在60℃下烘干，粉碎成粒径为20目的桔柚果皮粗粉；取该桔柚果皮粗粉10.0g，按料液比1:30加入300ml的0.1％NaOH-65％乙醇溶液(65％(v/v)乙醇中含有0.1％(w/v)的NaOH，即100ml的65％乙醇中含有0.1g的NaOH)，70℃超声提取2次，每次30min；合并提取液，置于旋转蒸发仪中在50℃,30rpm下将提取液浓缩至1/2体积，用3％HCl调节pH值至5.0，置于4℃冰箱中静置过夜待沉淀析出；4000rpm离心15min，去离子水洗涤沉淀2次，沉淀置于真空干燥箱中，在45℃，-0.09MPa下减压干燥，得到橙皮苷粗提物；

2)大孔树脂预处理：量取大孔树脂，用4倍体积量的95％乙醇浸泡24h，用95％乙醇洗涤大孔树脂至洗涤液加水(1：5)不呈白色浑浊为止，用蒸馏水反复清洗大孔树脂至无醇味，再加入4倍体积的2％NaOH溶液浸泡2h后，用水洗至pH值为6.8～7.2，再加入4倍体积量的0.5％HCl溶液浸泡2h，用水洗至pH值为6.8～7.2后备用；

取预处理后大孔树脂D101，滤去水分后量取10ml装柱，柱径高比为1:9，按大孔树脂与橙皮苷粗提物1:1.37(v/w)的比例，称取13.7mg橙皮苷粗提物，加入适量水，在70℃水浴中加热溶解后制成0.1713mg/ml的上样液，按上样流速为0.5ml/min上样；用水洗脱2BV(柱床体积，本实施例中为10ml)以洗去杂质；再用50％乙醇洗脱5BV，洗脱流速为0.5ml/min；收集洗脱液，置于旋转蒸发仪中在50℃,30rpm下浓缩至5ml，置4℃冰箱中冷藏24h至白色沉淀析出；4000rpm离心15min，去离子水洗涤沉淀2次，沉淀置于真空干燥箱中，在45℃，-0.09MPa下减压干燥，得到橙皮苷；橙皮苷称重，得到橙皮苷质量；

橙皮苷回收率＝(橙皮苷质量/橙皮苷粗提物质量)×100％

本实施例中，橙皮苷粗提物质量为13.7mg。

经计算，本实施例中，橙皮苷回收率为16.80％。

3)测定步骤1)所得之橙皮苷粗提物纯度：

对照品溶液制备：精密称取橙皮苷对照品(购自中国食品药品检定研究院)6.16mg，置于25mL容量瓶，加甲醇在50℃水浴中加热溶解后，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得0.2464mg/mL的对照品溶液。

供试品溶液制备：精密称取步骤1)所得之橙皮苷粗提物6mg，置于5mL容量瓶中，加甲醇在50℃下加热超声溶解，冷却至室温后，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，精密吸取滤液100μL置于10ml容量瓶，用甲醇稀释至刻度，即得供试品溶液。

色谱条件与系统适应性试验：Waters2695高效液相色谱仪；色谱柱：lichrocartC18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液(22:78)；流速：1.0mL/min；检测波长283nm；柱温25℃；理论板数按橙皮苷峰计算应不低于2000；精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，测定，记录图谱见图1A-图1B，其中图1A为对照品溶液图谱，图1B为供试品溶液图谱，图中1标注的即为橙皮苷峰。

标准曲线制备：精密吸取对照品溶液10、50、100、200、300、500μL分别置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到橙皮苷浓度分别为0.246、1.232、2.464、4.928、7.329、12.32μg/mL的系列对照品溶液；分别取上述对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，分析测定；以对照品浓度X(μg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并按最小二乘法回归计算，得到标准曲线及回归方程,结果如表1所示：

表1标准曲线与线性关系考察结果

橙皮苷粗提物纯度测定：分别吸取对照品溶液、供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，分析测定，采用外标法按回归方程Y＝3.43×10⁴X+3.05×10³计算，将供试品峰面积作为Y值代入，计算得到X值，即为供试品溶液中的橙皮苷浓度；

橙皮苷粗提物纯度通过下式计算：

橙皮苷粗提物纯度＝(X×供试品溶液体积×50/橙皮苷粗提物质量实际值)×100％

本实施例中，供试品溶液体积为10ml，橙皮苷粗提物质量实际值为6mg。

经计算，本实施例中，橙皮苷粗提物纯度为59.48％。

4)测定步骤2)所得之橙皮苷纯度：

待测样品溶液制备：精密称取步骤2)所得之橙皮苷6mg，置于5mL容量瓶中，加甲醇在50℃下加热超声溶解，冷却至室温后，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，精密吸取滤液100μL置于10ml容量瓶，用甲醇稀释至刻度，即得待测样品溶液。

其余溶液配制、色谱条件等同步骤3)。

橙皮苷纯度测定：分别吸取对照品溶液、待测样品溶液各20μL，注入液相色谱仪，分析测定，采用外标法按回归方程Y＝3.43×10⁴X+3.05×10³计算，将待测样品峰面积作为Y值代入，计算得到X值，即为待测样品溶液中的橙皮苷浓度；

橙皮苷纯度通过下式计算：

橙皮苷纯度＝(X×待测样品溶液体积×50/橙皮苷质量实际值)×100％

本实施例中，待测样品溶液体积为10ml，橙皮苷质量实际值为6mg。

经计算，本实施例中，橙皮苷纯度为94.04％。

结合提取效果、工艺放大及生产实际考虑，本实施例为最佳工艺。

实施例2

1)桔柚果皮去掉外皮，取白皮层，剪碎，置电热恒温鼓风干燥箱中在60℃下烘干，粉碎成粒径为20目的桔柚果皮粗粉；取该桔柚果皮粗粉10.0g，按料液比1:20加入200ml的0.1％NaOH-65％乙醇溶液，55℃超声提取2次，每次40min；合并提取液，置于旋转蒸发仪中在50℃,30rpm下将提取液浓缩至1/2体积，用3％HCl调节pH值至5.0，置于4℃冰箱中静置过夜待沉淀析出；4000rpm离心15min，去离子水洗涤沉淀2次，沉淀置于真空干燥箱中，在45℃，-0.09MPa下减压干燥，得到橙皮苷粗提物；

2)大孔树脂预处理方法同实施例1，取预处理后大孔树脂D101，滤去水分后量取10ml装柱，柱径高比为1:9，按大孔树脂与橙皮苷粗提物1:1.37(v/w)的比例，称取13.7mg橙皮苷粗提物，加入适量水，在70℃水浴中加热溶解后制成0.1713mg/ml的上样液，按上样流速为0.5ml/min上样；用水洗脱1BV以洗去杂质；再用40％乙醇洗脱6BV，洗脱流速为0.5ml/min；收集洗脱液，置于旋转蒸发仪中在50℃,30rpm下浓缩至5ml，置4℃冰箱中冷藏24h至白色沉淀析出；4000rpm离心15min，去离子水洗涤沉淀2次，沉淀置于真空干燥箱中，在45℃，-0.09MPa下减压干燥，得到橙皮苷；橙皮苷称重，得到橙皮苷质量；橙皮苷回收率计算方法同实施例1。

本实施例中，橙皮苷粗提物质量为13.7mg。

经计算，本实施例中，橙皮苷回收率为15.37％。

3)测定步骤1)所得之橙皮苷粗提物纯度：

橙皮苷粗提物纯度测定及计算方法同实施例1。

经计算，本实施例中，橙皮苷粗提物纯度为52.41％。

4)测定步骤2)所得之橙皮苷纯度：测定方法同实施例1：

橙皮苷纯度测定及计算方法同实施例1。

经计算，本实施例中，橙皮苷纯度为91.54％。

实施例3

1)桔柚果皮去掉外皮，取白皮层，剪碎，置电热恒温鼓风干燥箱中在60℃下烘干，粉碎成粒径为20目的桔柚果皮粗粉；取该桔柚果皮粗粉10.0g，按料液比1:30加入300ml的0.1％NaOH-65％乙醇溶液，40℃超声提取3次，每次40min；合并提取液，置于旋转蒸发仪中在50℃,30rpm下将提取液浓缩至1/2体积，用3％HCl调节pH值至5.0，置于4℃冰箱中静置过夜待沉淀析出；4000rpm离心15min，去离子水洗涤沉淀2次，沉淀置于真空干燥箱中，在45℃，-0.09MPa下减压干燥，得到橙皮苷粗提物；

2)大孔树脂预处理方法同实施例1，取预处理后大孔树脂D101，滤去水分后量取10ml装柱，柱径高比为1:9，按大孔树脂与橙皮苷粗提物1:1.37(v/w)的比例，称取13.7mg橙皮苷粗提物，加入适量水，在70℃水浴中加热溶解后制成0.1713mg/ml的上样液，按上样流速为0.5ml/min上样；用水洗脱2BV以洗去杂质；再用50％乙醇洗脱4BV，洗脱流速为0.5ml/min；收集洗脱液，置于旋转蒸发仪中在50℃,30rpm下浓缩至5ml，置4℃冰箱中冷藏24h至白色沉淀析出；4000rpm离心15min，去离子水洗涤沉淀2次，沉淀置于真空干燥箱中，在45℃，-0.09MPa下减压干燥，得到橙皮苷；橙皮苷称重，得到橙皮苷质量；橙皮苷回收率计算方法同实施例1。

本实施例中，橙皮苷粗提物质量为13.7mg。

经计算，本实施例中，橙皮苷回收率为14.39％。

3)测定步骤1)所得之橙皮苷粗提物纯度：

橙皮苷粗提物纯度测定及计算方法同实施例1。

经计算，本实施例中，橙皮苷粗提物纯度为51.69％。

4)测定步骤2)所得之橙皮苷纯度：测定方法同实施例1：

橙皮苷纯度测定及计算方法同实施例1。

经计算，本实施例中，橙皮苷纯度为93.66％。

实施例4

1)桔柚果皮去掉外皮，取白皮层，剪碎，置电热恒温鼓风干燥箱中在60℃下烘干，粉碎成粒径为20目的桔柚果皮粗粉；取该桔柚果皮粗粉10.0g，按料液比1:30加入300ml的0.1％NaOH-65％乙醇溶液，55℃超声提取50min；提取液置于旋转蒸发仪中在50℃,30rpm下将提取液浓缩至1/2体积，用3％HCl调节pH值至5.0，置于4℃冰箱中静置过夜待沉淀析出；4000rpm离心15min，去离子水洗涤沉淀2次，沉淀置于真空干燥箱中，在45℃，-0.09MPa下减压干燥，得到橙皮苷粗提物；

2)大孔树脂预处理方法同实施例1，取预处理后大孔树脂AB-8，滤去水分后量取10ml装柱，柱径高比为1:9，按大孔树脂与橙皮苷粗提物1:1.37(v/w)的比例，称取13.7mg橙皮苷粗提物，加入适量水，在70℃水浴中加热溶解后制成0.1713mg/ml的上样液，按上样流速为0.5ml/min上样；用水洗脱2BV以洗去杂质；再用50％乙醇洗脱5BV，洗脱流速为0.5ml/min；收集洗脱液，置于旋转蒸发仪中在50℃,30rpm下浓缩至5ml，置4℃冰箱中冷藏24h至白色沉淀析出；4000rpm离心15min，去离子水洗涤沉淀2次，沉淀置于真空干燥箱中，在45℃，-0.09MPa下减压干燥，得到橙皮苷；橙皮苷称重，得到橙皮苷质量；橙皮苷回收率计算方法同实施例1。

本实施例中，橙皮苷粗提物质量为13.7mg。

经计算，本实施例中，橙皮苷回收率为14.17％。

3)测定步骤1)所得之橙皮苷粗提物纯度：

橙皮苷粗提物纯度测定及计算方法同实施例1。

经计算，本实施例中，橙皮苷粗提物纯度为61.24％。

4)测定步骤2)所得之橙皮苷纯度：测定方法同实施例1：

橙皮苷纯度测定及计算方法同实施例1。

经计算，本实施例中，橙皮苷纯度为92.21％。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (9)

1.一种从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法，其特征在于：包括：

1)桔柚果皮取白皮层，剪碎，置55℃～65℃烘干，粉碎成桔柚果皮粗粉；取该桔柚果皮粗粉按料液比1:20～35(w/v)加入0.05～0.3％NaOH-60～70％乙醇溶液，40℃～75℃超声提取1～3次，每次25～50min；合并提取液并浓缩至原体积的0.35～0.65倍；调节pH值至4.5～5.5，置于2～6℃下静置过夜待沉淀析出；取沉淀，减压干燥沉淀，得到橙皮苷粗提物；

2)取经预处理的大孔树脂滤去水分后装柱，按大孔树脂与橙皮苷粗提物1:1.2～1.6(v/w)的比例称取橙皮苷粗提物，加水溶解制成0.17～0.18mg/ml的上样液后上样；用水洗脱1～2.5BV以洗去杂质；再用40～55％乙醇洗脱4～6BV；收集洗脱液并浓缩至2～8ml，置于2～6℃下冷藏至白色沉淀析出；取沉淀，减压干燥沉淀，得到橙皮苷。

2.根据权利要求1所述的一种从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法，其特征在于：所述步骤1)中，桔柚果皮取白皮层，剪碎，置55℃～65℃烘干，粉碎成粒径为18～25目的桔柚果皮粗粉；取该桔柚果皮粗粉按料液比1:29～31(w/v)加入0.09～0.11％NaOH-64～66％乙醇溶液，68～72℃超声提取2次，每次28～32min；合并提取液并浓缩至原体积的0.45～0.55倍；调节pH值至4.5～5.5，置于2～6℃下静置过夜待沉淀析出；取沉淀，减压干燥沉淀，得到橙皮苷粗提物。

3.根据权利要求1所述的一种从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法，其特征在于：所述步骤2)中，取经预处理的大孔树脂滤去水分后装柱，按大孔树脂与橙皮苷粗提物1:1.3～1.5(v/w)的比例称取橙皮苷粗提物，加水溶解制成0.171～0.172mg/ml的上样液后上样；用水洗脱1.8～2.2BV以洗去杂质；再用48～52％乙醇洗脱4.8～5.2BV；收集洗脱液并浓缩至4～6ml，置于2～6℃下冷藏至白色沉淀析出；取沉淀，减压干燥沉淀，得到橙皮苷。

4.根据权利要求1所述的一种从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法，其特征在于：所述减压干燥沉淀步骤为：将沉淀在40～50℃，-0.1～-0.08MPa下减压干燥。

5.根据权利要求1所述的一种从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法，其特征在于：所述步骤2)中，大孔树脂装柱之径高比为1:8～10。

6.根据权利要求1所述的一种从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法，其特征在于：所述步骤2)中，上样流速为0.5ml/min；洗脱流速为0.5ml/min。

7.根据权利要求1所述的一种从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法，其特征在于：所述大孔树脂为D101、AB-8中的一种。

8.根据权利要求1所述的一种从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法，其特征在于：还包括：

3)测定步骤1)所得之橙皮苷粗提物纯度：通过高效液相色谱法测定：

色谱条件：色谱柱：lichrocartC18；流动相：25:75～20:80(v/v)的乙腈-0.1％磷酸水溶液；流速：0.8～1.2mL/min；检测波长283nm；柱温24～26℃；理论板数按橙皮苷峰计算不低于2000。

9.根据权利要求1所述的一种从桔柚果皮中提取纯化橙皮苷的方法，其特征在于：还包括：

4)测定步骤2)所得之橙皮苷纯度：通过高效液相色谱法测定：

色谱条件：色谱柱：lichrocartC18；流动相：25:75～20:80(v/v)乙腈-0.1％磷酸水溶液；流速：0.8～1.2mL/min；检测波长283nm；柱温24～26℃；理论板数按橙皮苷峰计算不低于2000。