CN104628731A - 一种微波辅助提取骆驼蓬生物碱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微波辅助提取骆驼蓬生物碱的方法，包括如下步骤：取骆驼蓬植物，烘干至恒重，用体积浓度为60～95%乙醇作溶剂，液料比为10～50ml/g，微波加热辅助提取8～12分钟，提取温度为60～100℃，过滤得提取液，提取液浓缩至无醇味，上制备型高效液相色谱C₁₈反相硅胶柱，用体积比为70∶30～96∶4的0.1mol/L乙酸铵缓冲盐溶液和乙腈为洗脱相，以0.5～1.0mL/min的流速，在20～40℃温度范围内，分离制备，通过紫外280nm在线监测，收集特定吸收峰的洗脱液，挥干，即得鸭嘴花碱、骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱三种生物碱。方法简便易行，可控，生物碱的得率高于现有提取方法。

Description

一种微波辅助提取骆驼蓬生物碱的方法

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及一种微波辅助提取骆驼蓬生物碱的方法。

背景技术

骆驼蓬(Peganum harmala L.)为蒺藜科(Zygophyllaceae)骆驼蓬属(Peganum)植物，以全草及种子入药，广泛分布于亚洲、北非等地。在我国，骆驼蓬主要生长在西北等地，常作为中药、维药和蒙古族药材，收载于《中华人民共和国药品标准维吾尔药分册》(WS3-bw-0080-98,1999年版)中，具有消肿止痛、通血调经的作用，用于关节骨痛、月经闭阻、咳嗽气喘等症。目前，以骆驼蓬种子为主要成分的复方骆驼蓬软膏已上市应用，具有清泻局部异常黑胆质、粘液质，消肿止痒，散气止痛。用于湿寒所引起的关节酸痛、风湿性关节炎、坐骨神经痛、湿疹，疥癣，疥疮等。

研究表明：骆驼蓬主要要含有生物碱类、黄酮类化合物等成分，其中生物碱为有效成分，包括鸭嘴花碱(visicine),骆驼蓬碱(harmaline)、去氢骆驼蓬碱(harmine)、鸭嘴花酮碱、哈儿明碱等，药理作用十分广泛，具有平喘、抗菌、抗肿瘤、抗炎镇痛、止痒杀虫及对中枢神经系统、心血管系统和气管平滑肌等方面的作用。自1841年第一个从骆驼蓬中生物碱分离鉴定以来，人们对其化学成分和药理活性开展了广泛的研究，早在30年代骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱作为单胺氧化酶抑制剂用于帕金森病的治疗，70年代我国首次将骆驼蓬碱制剂用于治疗消化道肿瘤的治疗，其抗癌作用引起国际上广泛的重视。同时，其良好的抗辐射、杀虫、抗病毒及抗氧化活性也引起人们的关注，医药行业对骆驼蓬生物碱的需求量越来越大。

目前，人们已采用多种化学分离方法提取制备骆驼蓬中总生物碱，在中国专利CN101433565A、CN101491557A、CN1250560C、CN101229203A、CN104107199A及相关文献中均有报道。但这些方法在提取制备生物碱过程中存在工艺复杂、有机溶剂使用量大和对环境污染、且得率较低的问题，不能满足对提高生物利用度、充分利用资源、保护环境和工业化生产的要求。

1)乙醇回流提取后，酸液酸化，氨水碱化析出沉淀，得到总生物碱提取物，再经硅胶柱和大孔吸附树脂等色谱法分离，既得单体化合物(CN101433565A)

2)用5％的盐酸浸提，酸液用阳离子交换树脂交换，用氨水碱化树脂，再用乙醚、氯仿或无水乙醇洗脱得到骆驼蓬总生物碱(李春杰，新疆医学院学报，1987,10,27)。或将骆驼蓬提取液酸化后，滤过，滤液上阳离子交换树脂，以水除杂，酸液洗脱后，收集洗脱液，加碱中和，脱盐处理后得到骆驼蓬总生物碱(CN101491557A)

3)比较了三种提取方法，结果发现用氯仿氨水混合溶媒沉淀法分离提取骆驼蓬子中的生物碱(浸膏中总生物碱的回收率6.93％)优于阳离子交换树脂法和氯仿提取法。(张学农，新疆医学院学报，1993,16,350)

4)用乙醇提取后，氯化汞处理后去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱以复合物沉淀下来，然后用H₂S处理得到骆驼蓬生物碱。(Munir,Fitoterapia,1995,66,73)

5)用碱性乙醇浸润后回流提取，经碱化游离，甲酸乙酯、乙酸乙酯等回流分离、硅藻土与活性碳减压过滤、回收溶剂、烘干、再用醇溶液回流提取。然后用水沉等方法处理后，得到骆驼蓬总生物碱。(CN1250560C)

6)采用二氧化碳超临界萃取技术，碱水冷浸除杂后再用酸性醇溶液提取，减压后再用盐酸浸泡，过滤后加氨水碱化，过滤干燥既得骆驼蓬总生物碱。(CN101229203A)

7)将骆驼蓬乙醇提取液在旋转薄膜蒸发器中制得紫褐色粗提膏。加盐酸加热至溶解，热过滤后用氯仿提取两次；用氢氧化钠溶液中和母液，析出棕黄色固体。再用盐酸，加热溶解后。通过乙醇加热等处理，析出结晶，制得骆驼蓬总碱盐酸盐。重结晶后，得骆驼蓬生物碱。(CN104107199A)

8)采用超声技术，在考察最优条件后，骆驼蓬总生物碱的得率为2.043g/50g,即40.1mg/g。(李越鲲，西北农业学报，14,110)

以上方法在推进骆驼蓬生物碱提取技术时，也均有不足之处：1)在提取骆驼蓬生物碱时虽然工艺简单，但提取率不高。在分离骆驼蓬生物碱单体时，采用了硅胶柱及大孔吸附树脂等色谱分离法，虽然分离出10个化合物，但操作复杂，没有与现代色谱分离技术相融合；2)氯仿等有机试剂的使用，对环境造成污染，且使用阳离子交换树脂，其再生及与处理复杂；3)尽管浸膏中总生物碱的回收率6.93％，回收率较高。但如果以骆驼蓬种子的重量计，则回收率很低。且提取过程使用有毒溶剂氯仿等；4)提取过程使用重金属，影响总生物碱的品质；5)提取过程复杂，且有机试剂用量较大，增加成本；6)使用二氧化碳临界萃取脱脂后，提取成本增加，且酸性乙醇提取后不宜过滤；7)使用氯仿等有机溶剂，对环境造成污染；8)总生物碱提取率较低，仅为40.1mg/g。

发明内容

本发明的针对目前骆驼蓬中生物碱制备方法不足，提取过程有机溶剂浪费和环境破坏严重，提供一种高效提取骆驼蓬生物碱的方法。

本发明实现上述目的所采用的技术方案如下：

一种微波辅助提取骆驼蓬生物碱的方法，包括如下步骤

1)取骆驼蓬，烘干至恒重，用体积浓度为60～95％乙醇作溶剂，液料比为10～50ml/g，微波加热辅助提取8～12分钟，提取温度为60～100℃，过滤得提取液，提取液浓缩至无醇味，得浓缩液；

优选的，乙醇浓度为75％，料液比为31ml/g，提取温度为81℃，提取时间为10分钟；

微波功率为400～1000W，优选的为600W；

2)将浓缩液上制备型高效液相色谱C₁₈反相硅胶柱，用体积比为70∶30～96∶4的0.1mol/L乙酸铵缓冲盐溶液和乙腈为洗脱相，以0.5～1.0mL/min的流速，在20～40℃温度范围内，分离制备，通过紫外280nm在线监测，收集特定吸收峰的洗脱液，挥干，即得鸭嘴花碱(visicine)、骆驼蓬碱(harmaline)和去氢骆驼蓬碱(harmine)三种生物碱。

优选的，洗脱相中乙腈的体积比变化如下：0～15min，4％～8％；15.1～30min，8％～10％；30.1～80min，10％～30％；

优选的，洗脱相的流速为0.7ml/min。

所述的visicine,harmaline和harmine三种生物碱的分子结构式：

优选的，所述骆驼蓬为种子和/全草。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明所述提取方法通过微波辅助提取方法，利用微波的高能作用，实现对样品快速、高效、可靠地处理，是一种新型的提取技术，具有提取时间短、提取率高等优点。相比回流提取和超声波辅助提取法，微波辅助提取工艺提取效率更高，更适合用于工业化生产，见表3。

本发明所述制备方法，采用制备型高效液相色谱，其目的是对产品的单体进行提取和纯化，与传统的纯化方法比较，制备液相是一种更有效的分离方法，因此被广泛应用在样品和产品的提取与纯化上。随着合成、植化、生化和制药等领域对高纯度组份的需求不断增加，制备液相应用的领域也在迅速的扩大。本发明采用C₁₈反相色谱法，建立的色谱方法能够较好地分离和制备骆驼蓬中3种生物碱。操作简单，稳定性良好，制备出的生物碱纯度高，能更好更快的制备骆驼蓬中生物碱，从而为骆驼蓬的分离制备和生产实践方面的提供基础。

本发明所用各种化学试剂通用、易购。色谱分离及收集可实现自动化，操作简便，visicine,harmaline和harmine三种生物碱的得率高。

附图说明

图1：微波辅助提取时乙醇浓度(A)、提取时间(B)、提取温度(C)、液料比(D)和功率(E)对骆驼蓬生物碱含量的影响示意图。

图2:微波辅助提取对visicine的响应面实验示意图。

图3:微波辅助提取对Harmaline的响应面实验示意图。

图4:微波辅助提取对Harmine的响应面实验示意图。

图5：HPLC色谱图(上为标准品，下为样品)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

取1.2g骆驼蓬种子，分别置于微波提取管中，按照液料比为30:1(ml/g)加入浓度为80vt％的乙醇溶液，在温度为80℃下，微波加热辅助提取10分钟。冷却后，过滤得提取液,经HPLC分析，visicine，harmaline和harmine含量为5.859mg/种子g，38.708mg/种子g和17.325mg/种子g。提取液浓缩至无醇味，得浓缩液，进行色谱分离制备。

将浓缩液上制备型高效液相色谱C₁₈反相硅胶柱，用体积比为70∶30～96∶4的0.1mol/L乙酸铵缓冲盐溶液(B，配制方法：取乙酸铵3.4g加水适量溶解，再加入冰醋酸溶液3mL，加水至500mL，摇匀，即得)和乙腈(A)为洗脱相，进行梯度洗脱，具体为：0～15min，4vt％～8vt％A；15.1～30min，8vt％～10vt％A；30.1～80min，10vt％～30vt％A；流速为0.7ml/min，柱温30℃，采用在线紫外检测，检测波长为280nm。分别收集各色谱峰对应的化合物(如图5所示)，真空干燥后得visicine,harmaline和harmine三种骆驼蓬生物碱，得率分别为0.48％，3.25％和1.44％。

为了确定本发明的最佳微波辅助提取条件，发明人开展了单因素试验和响应面法试验，具体的试验情况如下。

仪器与试药

仪器：WATERS高效液相色谱仪，超纯水仪(美国Millipore公司)，精密微量移液器(德国Eppendorf公司)，WX-4000微波反应系统(上海屹尧分析仪器公司)，Buchi制备性高效液相色谱仪(瑞士)。

试剂：vasicine(Sigma-Aldrich公司，纯度:≥98％)；harmaline(上海同田生物科技有限公司，purity≥98％)；harmine(上海中药标准化研究中心，purity≥98％)；乙腈、冰乙酸均为色谱醇(美国Fisher公司)；水为超纯水。

药材：骆驼蓬于2014年9月采集于内蒙古自治区阿拉善左旗，经兰州大学药学院马志刚教授鉴定为骆驼蓬(Peganum harmala L)及种子，50℃烘干至恒重，备用。

方法与结果

微波提取单因素试验及结果

选取液料比、提取时间、提取温度、乙醇浓度和微波功率5个影响骆驼蓬生物碱提取效果的因素，以visicine,harmaline和harmine的得率为指标确定这5个因素的适宜范围。单因素设计及结果见表1，图1。

实验结果显示液料比、提取时间、提取温度和乙醇浓度均对骆驼蓬生物碱含量有较大影响，但功率影响较少。所以选择前四个因素用于响应面法研究。

表1：单因素实验条件

微波提取响应面试验

采用Design-Expert 9.0软件研究液料比、提取时间、提取温度和乙醇浓度4个因素对骆驼蓬生物碱的影响，并用Box-Behnken中心组合设计(BBD)的试验方案，进行4因素3水平的响应面试验。响应面分析试验结果分别见表2和图2-4。

表2 响应曲面试验设计及结果

X₁:液料比；X₂:乙醇浓度；X₃:提取温度；X₄:提取时间

实验结果显示最佳提取条件为：乙醇浓度为75％，料液比31ml/g,微波加热辅助提取10分钟，温度81℃，功率600W，在该条件下，visicine,harmaline和harmine三种生物碱的得率分别为5.886mg/种子g，38.768mg/种子g和17.336mg/种子g，进一步采用制备型高效液相色谱C₁₈反相硅胶柱分离后，三种生物碱的得率分别为0.49％，3.28％和1.47％。

不同提取方法的三种生物碱得率比较

通过常规热回流提取法、超声辅助法、微波辅助法分别进行骆驼蓬生物碱的提取，其三种生物碱得率结果见表3

表3 微波提取法和其他两种提取方法的比较

结果显示：微波辅助提取的骆驼蓬三种生物碱得率远高于热回流和超声提取方法。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种微波辅助提取骆驼蓬生物碱的方法，包括如下步骤

1) 取骆驼蓬，烘干至恒重，用体积浓度为60～95%乙醇作溶剂，液料比为10～50ml/g，微波加热辅助提取8～12分钟，提取温度为60～100℃，过滤得提取液，提取液浓缩至无醇味，得浓缩液；

2) 将浓缩液上制备型高效液相色谱C₁₈反相硅胶柱，用体积比为70∶30～96∶4的0.1mol/L乙酸铵缓冲盐溶液和乙腈为洗脱相，以0.5～1.0 mL/min的流速，在20～40℃温度范围内，分离制备，通过紫外280nm在线监测，收集特定吸收峰的洗脱液，挥干，即得鸭嘴花碱、骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱三种生物碱。

2.如权利要求1所述微波辅助提取骆驼蓬生物碱的方法，其特征在于，微波功率为400～1000W。

3.如权利要求1所述微波辅助提取骆驼蓬生物碱的方法，其特征在于，步骤（1）中，乙醇浓度为75%，料液比为31 ml/g，提取温度为81℃，提取时间为10分钟。

4.如权利要求1所述微波辅助提取骆驼蓬生物碱的方法，其特征在于，洗脱相中乙腈的体积比变化如下：0～15min，4%～8 %；15.1～30min，8%～10%；30.1～80min，10%～30%。

5.如权利要求1所述微波辅助提取骆驼蓬生物碱的方法，其特征在于，洗脱相的流速为0.7 ml/min。

6.如权利要求1所述微波辅助提取骆驼蓬生物碱的方法，其特征在于，所述骆驼蓬为种子和/全草。