CN105287620A - 长春西汀药物组合物及其在改善脑功能不全方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及长春西汀药物组合物及其在改善脑功能不全方面的应用，是由长春西汀、硫酸戊聚糖纳和药学上可接受的赋形剂组合制成的药物制剂，具体涉及一种改善脑代谢、对抗脑缺血、缺氧，改善微循环、药物中的应用。

Description

长春西汀药物组合物及其在改善脑功能不全方面的应用

技术领域：

本发明涉及一种长春西汀药物组合物及其在改善脑功能不全方面的应用，属于药品的技术领域。

背景技术：

中国已进入老龄化高峰，65岁以上老年人已达2～3亿以上，而脑血管疾病成为了目前这个群体的头号杀手，据流行病学调查得知，近50年来不论在农村或城市，脑血管疾病的发病率和死亡率均呈上升趋势，全世界范围内脑血管疾病的发病率为140～200/10万人口，其平均死亡率为100/10万人口，而我国因心脑血管疾病死亡者每年达200万另有部分患者虽然经抢救而幸存，但是多数留下残疾，生活不能自理给亲属和社会带来了沉重的负担。因此，研制和开发出新型、有效、副作用小的预防和治疗脑血管疾病的药物是目前亟待解决的问题。

长春西汀是从小蔓长春花中得到的一种天然药物，属吲哚类生物碱。为脑血管扩张药，能抑制磷酸二酯酶活性，增加血管平滑肌松弛的信使c-GMP的作用，选择性地增加脑血流量，此外还能抑制血小板凝集，降低人体血液粘度，增强红细胞变形力，改善血液流动性和微循环，促进脑组织摄取葡萄糖，增加脑耗氧量，改善脑代谢等药理作用；现代药理研究表明，长春西汀使用过程中，具有白细胞减少、转氨酶升高等副作用，同时本品使用不可静脉或肌肉推注等局限性，该药物目前主要适用于老年群体，其不良反应，给老年群体也带来了一定的麻烦，现代药理学研究过程中，研究人员惊奇的发现，该药物使用过程中，与硫酸戊聚糖纳药物合用，能明显消除上述不良反应，完全解决了上述药物的使用局限性，不仅可以制成相关口服制剂，同时也适用于静脉或肌肉推注，完全解决了只适用于静脉滴注的局限，为老年群体的健康带来了福音，减轻国家和家庭经济负担及精神压力，均具有可观的经济和社会效益。

发明内容：

本发明的目的在于通过药物组合使用，解决长春西汀药物长期使用过程中的一些不良反应以及该药物制剂使用的局限性。为相关患者提供了一种使用安全、方便的在对抗脑缺血、缺氧方面药物中的应用。

为了解决上述的问题，本发明采用如下技术方案：

本发明涉及一种药物组合物一种药物组合物，是由活性成分长春西汀、硫酸戊聚糖纳和药学上可接受的赋形剂组合而成。

按照重量份计，该药物组合物中活性成分含有1～10份的长春西汀和10～1份的硫酸戊聚糖纳。

上述活性成分按照重量份计优选含有1份的长春西汀和10份的硫酸戊聚糖纳。

上述药物的活性成分包括其光学异构体、药用盐及水合物。

同时，上述的药物组合物，解决了目前该药物临床使用的局限性，采用常规方法可以制成任何医学上允许的制剂，包括口服制剂或注射制剂。

上述的药物组合物，主要用于改善脑功能不全方面的药物中的应用，尤其是在对抗脑缺血、缺氧等病人药物中的应用。

上述的药物组合物制剂，优选注射制剂，其制备方法为：取长春西汀1g、硫酸戊聚糖纳10g、氯化钠、1，2-丙二醇；氯化钠溶解至20％丙二醇水溶液500ml，加入长春西汀、硫酸戊聚糖纳，于60～70℃水浴上搅拌至全溶，冷却至室温，加入的注射用水至1000ml，混匀后用0.22μm滤膜过滤；滤液分瓶灌装，封口，灭菌，即得。

本申请人进行了长春西汀和硫酸戊聚糖纳组合物药效学实验研究，以进一步阐述本发明提供的药物组合物的有益效果。

本发明药物的疗效由以下药效学实验证明：

一药物组合物对抗脑缺血的研究

1.1研究采用线栓法大鼠大脑中动脉闭塞及再通模型，观察本药物组合物对大鼠脑缺血边缘区神经细胞凋亡的影响，探讨其对脑缺血保护作用的机制，临床应用提供理论依据。

1.1.1实验动物：Wistar清洁型大鼠84只，体重220～280g，自然喂养，随机分组。

1.1.2实验分组：将Wistar大鼠随机分为假手术组、单纯缺血组(缺血组)、缺血再灌注组(再灌注组)、本药物组合物注射剂治疗组(包括缺血/缺血再灌注)，每组动物6只。治疗组于缺血前30min和缺血后即刻分别经腹腔注射药物组合物溶液(1ml/kg)，假手术组和缺血/再灌注组均于相同时限腹腔注射等容量的生理盐水。

1.1.3仪器与试剂：氯化三苯四氮唑(2、3、5tripheyltetrazolium，chlorideTTC)(上海试剂三厂)，药物组合物注射液，流式细胞仪(FACS420，河北医科大学肿瘤医院研究所)，原位末端标记试剂盒(美国BM公司)。

1.2方法

1.2.1建立大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型，缺血模型动物清醒后具备同侧Homer氏征，提尾时左前肢屈曲内收者方列为研究对象，排除蛛网膜下腔出血者。

1.2.2标本制备

新鲜标本：各实验组到达观察时间点后(缺血90min、缺血90min再灌12h)，大鼠经水合氯醛过量麻醉，迅速断头取脑，将右侧鼠脑内侧尾壳核和额顶皮质上部界定为缺血边缘区。取新鲜脑组织50mg，于4℃70％乙醇中剪碎，保存备用做流式细胞分析。

固定标本：将缺血90min再灌24h的大鼠麻醉，用37℃生理盐水200ml经左心室插管快速灌注冲洗出血液，再用4℃4％多聚甲醛(pH7.40.01mol/LPBS)400ml灌注固定，恒定灌注(输液瓶高出心脏1米)时间30～60min。灌注完毕立即断头取脑，于中1/3处取冠状切片(厚约3～4mm)，4％多聚甲醛溶液中固定2～3h，然后浸泡在20％蔗糖溶液中过夜后作冰冻切片备用。

1.2.3TTC染色结合球积仪测定各实验组鼠脑梗塞面积

各实验组鼠于缺血90min再灌24h迅速断头取脑，切去额极后，间隔2mm连续作6个脑冠状切片，立即置切块于37℃2％TTC生理盐水中避光恒温孵育30min，在15min时将脑组织块翻面，染色后用10％甲醛固定，固定24h，直接用球积仪测定脑梗塞面积(TTC被线粒体过氧化氢酶还原，可使正常组织染色呈红色，坏死组织呈白色)。

1.2.4神经功能缺失征象的评定采用临床神经功能评分标准观察药物对缺血大鼠神经功能缺失征象的影响(缺血90min再灌注12h)。

评分标准

1.2.5流式细胞仪检测凋亡细胞取各实验组70％乙醇固定的鼠脑组织上机检测，各实验组神经细胞凋亡百分率计算公式为：凋亡细胞数/细胞总数×100％。

1.2.6原位末端标记DNA片段(TUNEL)检测细胞凋亡

取各实验组鼠脑冰冻切片，采用原位末端标记(thymidine/deoxythymidinemediateddexoyUTP-biotinnickandlabeling，TUNEL)法标记DNA片段检测凋亡细胞。具体步骤如下：(1)2％过氧化氢室温消毒10min，清除内源性过氧化物酶。(2)Tritox-100室温作用30min，破膜。(3)0.01mol/LPBS洗2～3min×2。(4)加TUNEL反应液37℃作用60min。(5)加Converter-POD37℃作用30min。(6)DAB显色20min。常规封片镜检：其中核为棕黄色即为凋亡细胞，以16目镜测微网，在400倍放大镜下(面积为0.1024mm²)，计数网格中的阳性细胞数，每例计数10网格，重复3次，取均值为该例的凋亡细胞数。

1.2.7统计学处理

所有数值采用均数±标准差表示，采用方差分析进行统计，不同组间的比较用q检验。

1.3结果

1.3.1TTC染色结合球积仪观察鼠脑梗塞面积

24只大鼠缺血再灌后经TTC染色可见右侧顶叶皮质出现苍白的梗塞灶，经面积仪可测得额叶至顶叶6个连续脑冠状切片的梗塞面积。单纯缺血90min再灌24h大鼠脑梗塞面积为(21.52±4.76)药物组合物治疗组于缺血90min再灌24h脑梗塞面积为(11.46±2.58)与对照组相比脑梗塞面积明显减小(P＜0.01)。

1.3.2神经功能缺失征象的观察

假手术组6只大鼠肢体活动自如，无神经功能缺失。单纯缺血组4只大鼠于缺血90min时向左侧划圈，有中度神经功能缺失；1只行走时向左侧倾倒；1只不能伸展左前肢。缺血90min再灌24h，3只鼠行走时有追尾现象，即向左侧划圈；2只行走时向左侧倾倒；1只出现意识障碍。而药物组合物治疗组于相同时间点只有3只鼠不能伸展左前肢，其余大鼠无明显神经功能缺损。表明药物组合物能明显减轻脑缺血及再灌注损伤后所致的神经功能缺损，具有脑保护作用。

1.3.3流式细胞仪检测神经细胞凋亡率

假手术组神经细胞凋亡率为(3.6±1.4)％；缺血90min缺血边缘区神经细胞凋亡率为(9.2±2.1)％；对应药物组合物治疗组为(5.7±1.3)％；缺血90min再灌12h药物组合物治疗组边缘区神经细胞凋亡率为(8.1±1.7)％。表明药物组合物组均能减少缺血边缘区神经细胞的凋亡。见表1。

表1流式细胞术检测缺血边缘区神经细胞凋亡百分率A％

*与假手术组比较P＜0.01，**与对照组比较P＜0.01。

1.3.4TUNEL检测神经细胞凋亡

假手术组鼠脑组织偶见染色为棕褐色的凋亡细胞；单纯缺血90min组可见缺血中心区边缘出现凋亡细胞，与假手术组相比差异显著(P＜0.01)；药物组合物组缺血90min在缺血中心区边缘亦可见凋亡细胞；但较单纯缺血组减少(P＜0.01)。缺血90min再灌24h组于缺血边缘区可见大量凋亡细胞，对应药物组合物组缺血边缘区凋亡细胞较之明显减少(P＜0.01)。显示药物组合物能明显减少缺血边缘区神经细胞凋亡数量。见表2。

表2TUNEL检测鼠脑缺血边缘区神经细胞凋亡阳性细胞数

*与假手术组比较P＜0.01，**与对照组比较P＜0.01。

1.4讨论

已有研究表明，脑血管闭塞后若缺血区血流未能在短期内恢复供应，处于严重缺血状态的中心区会很快发生梗死并逐渐向周围扩展，演进中的梗死灶周围的缺血边缘区出现神经细胞的凋亡，边缘区中细胞凋亡的发生可能是梗塞灶扩大的关键。本实验结果显示，单纯缺血90min细胞凋亡主要出现在坏死中心区边缘，即缺血边缘区；缺血再灌注后细胞凋亡亦出现在缺血边缘区但较单纯缺血细胞凋亡数目明显增多，表明缺血后血流再通神经元损伤加重。

本实验结果表明：药物组合物能明显减小实验性大鼠脑缺血后脑梗塞面积、减轻脑缺血后神经功能缺损、显著减少缺血边缘区神经细胞凋亡数量、减缓缺血区神经元损害，具有抗脑缺血的作用，有显著的脑保护作用。

二、药物组合物对抗脑缺氧的研究

2.1材料和方法

2.1.1缺氧存活实验取20只ICR小白鼠，体重20±1g，随机分为对照组与用药组，雌雄各半。缺氧前48h、24h、1h时分别给两组小白鼠腹腔注射双蒸水或者药物组合物，每只0.2ml。缺氧时将小白鼠放于150ml密闭三角烧瓶内，瓶内预先加入10g钠石灰，以吸收CO2。观察三角烧瓶密闭后至小白鼠死亡(以呼吸停止为准)的时间，即缺氧存活时间。

2.2离体海马脑片实验

2.2.1ACSF配制人工脑脊液的配制：氯化钠124mmol·L^-1，氯化钾3.3mmol·L^-1，磷酸二氢钠1.24mmol·L^-1，硫酸镁2.4mmol·L^-1，碳酸氢钠25.7mmol·L^-1，氯化钙2.4mmol·L-1，葡萄糖10.0mmol·L^-1，pH调至7.35～7.45。

2.2.2脑片制备用雄性大鼠，体重100～150g，乙醚麻醉后切开头皮，暴露颅骨，断头取脑组织并置于0～4℃经95％O2-5％CO2混合气饱和的ACSF中，洗净血液并降温后，用振动切片机沿冠状面切成厚度为400μm的全脑片，然后分离出海马脑片。将海马脑片置于32.0℃的ACSF内孵育1h，并不断通入95％O2-5％CO2混合气。

2.2.3OPS记录将孵育后的海马脑片全浸于32.0±0.5℃恒温灌流槽内，液面高出脑片表面2mm，不断通入经95％O2-5％CO2混合气饱和的ACSF(气体流量200ml·min^-1)，ACSF的灌流速度为1.5～ml·min^-1。双极刺激电极置于海马CA3区schaffer侧枝路径上，刺激强度为0.2～0.8mA，玻璃微电极(阻抗＜10MΨ)置于CA1区海马锥体细胞层，记录顺向群峰电位(OPS)。电位经放大、叠加4次后由X-Y记录仪记录。

2.2.4缺氧时OPS观察待OPS波形稳定后，取OPS＞3mV的脑片进行实验。缺氧时将通入灌流槽的灌流液改为经95％N2-5％CO2混合气饱和的ACSF，36min后恢复供氧。观察缺氧损伤电位(hypoxicinjurypotential，HIP)及复氧1h后OPS的恢复情况。1h后OPS幅度恢复至缺氧前60％水平的脑片定为恢复，不足60％者为未恢复。OPS恢复的脑片占脑片总数的比例称为OPS恢复率。

2.2.5给药方法用药组脑片在实验时将长春西汀4g，硫酸戊聚糖纳5g，直接溶于ACSF中，药物组合物与ACSF的容积比为1∶10000。用药从缺氧前15min开始，一直持续至恢复供氧15min为止。

2.3统计处理实验数据以x-±s表示，小白鼠缺氧存活时间及OPS恢复程度的比较用成组设计两样本均数比较的t检验。其他数据比较用四格表确切概率法。显著性差异标准为P＜0.05。

3实验结果

3.1小白鼠缺氧存活时间对照组为21.1±3.97min，用药组为33.16±6.87min，两组间有显著性差异(P＜0.01)。

3.2离体海马脑片实验对照组脑片缺氧后诱发场电位OPS在数分钟内迅速减小并消失，而用药组脑片在使用药物组合物制剂组后大部分脑片的OPS幅度明显减小，平均降至用药前的46.5％。两组间HIP出现率、OPS恢复程度及恢复率比较，差异均有显著性(P＜0.05)，见附表。与用药后OPS幅度明显减小的脑片比较，OPS幅度未明显减小的脑片缺氧后OPS的恢复幅度略低

药物组合物对缺氧时HIP及复氧1h后OPS的影响(％)

*P＜0.05，与对照组比较

4讨论

本研究结果显示，药物组合物能使小鼠缺氧存活时间较对照组显著延长，进一步证明药物组合物确能提高小鼠的耐缺氧能力。在本实验中，海马脑片CA1区锥体细胞的诱发场电位OPS在缺氧过程中逐渐减小，最终消失，然后出现HIP，持续1～2min即消失。OPS的改变反映缺氧对突触传递功能的损害，HIP的消失是神经元突触传递不可逆损伤发生的标志。HIP出现频率低，表明缺氧导致神经元损伤的脑片数目较少，OPS得以恢复的脑片数目多。本研究发现，用药组脑片OPS恢复明显好于对照组脑片，HIP出现率低。证明药物组合物确实具有明显的抗缺氧脑损伤作用。

三药物组合物对白细胞的影响

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.1.1药物药物组合物。配制方法：称取烟酰胺7.3mg，加RPMI-1640培养液3.65ml，配成2×10³ug/ml药液，再用培养液对倍稀释，使终浓度为1×10³、5×10²、2.5×10²、1.25×10²ug/ml。

4.1.1.2细胞人外周血白细胞取自南京市中心血站全血(AB型)，用聚蔗糖分离制备成8×107/ml悬液。

4.1.1.3培养液及附加物RPMI-1640培养基购于Gibco公司，新生牛血清(特级)由杭州四季生物工程研究所提供，聚蔗糖(29.8万)、甲酰三肽(fMLP)购于Sigma公司。

4.1.2实验方法

4.1.2.1步聚用0.8％琼脂糖-RPMI1640培养基混合液铺板，固化，打孔三行，每行6孔，在设定孔内分别加含不同浓度及配比(1～10份的长春西汀和10～1份的硫酸戊聚糖纳)的药物组合物WBC悬液和含fMLP的RPMI1640培养液(fMLP终浓度10nmol/L)进行正交实验，实验中设无药对照、空白对照，37℃、5％CO2下培养5h，4℃干燥、固定、染色。上述实验平行重复6个样本。

4.1.2.2结果观察显微镜下用测微器测量WBC移动距离，以给药组与无药对照组实际趋化距离平均值之比求出趋化百分率。

4.1.2.3统计学处理直线回归方程求IC50值。

4.1.3结果

实验结果显示不同配比的药物组合物对人白细胞趋化影响，不明显，药物组合物的使用，避免了长春西汀药物使用引起人体白细胞减少的副作用，同时，发明人通过小鼠实验研究发现，在长期服用该药物组合物进行转氨酶变化的观察，没有发现转氨酶升高的迹象。为此该药物的组合使用为临床用药提供了方便。

五具体实施方式

实施例1注射液的制备

1、处方：

2、制备：

取长春西汀、硫酸戊聚糖纳、氯化钠、1，2-丙二醇；氯化钠溶解至20％丙二醇水溶液500ml，加入长春西汀、硫酸戊聚糖纳，于60～70℃水浴上搅拌至全溶，冷却至室温，加入余量的注射用水至1000ml，混匀后用0.22μm滤膜过滤。滤液分瓶灌装，封口，灭菌，即得。

实施例2滴丸的制备

1、处方：

2、制备：

取聚乙二醇6000，置于容器中，加热至70-80℃，待全部熔融，温度降到50℃左右时，加入长春西汀、硫酸戊聚糖纳使熔融，温度控制在40-50℃，倒入滴丸机中滴制，滴入二甲基硅油中，制成滴丸，即得。

实施例3舌下含片的制备

1、处方：

2、取长春西汀、硫酸戊聚糖纳、羟丙基甲基纤维素(E-50)、羟丙基甲基纤维素(E-4M)、羟丙基纤维素、微粉硅胶、硬脂酸镁以等量递加法混合均匀，直接压制成舌下含片，即得。

实施例4软胶囊剂的制备

1、处方：

2、制备：

取明胶加入反应罐中，在搅拌状态下加入适量水，密闭，待明胶完全溶解后，再加入甘油，搅拌均匀，抽真空脱气2小时，放入保温桶中，保温静置过夜，待用。取大豆油、卵磷脂、蜂蜡混合均匀，称取长春西汀、硫酸戊聚糖纳加入，搅拌均匀，胶体磨研磨至胶体状，室温静置。将药液倒入软胶囊机中，压制软胶囊，干燥，即得。

实施例5冻干制剂的制备

1、处方：

2、制备：

取长春西汀、硫酸戊聚糖纳加适量乙醇溶解，补充注射用水至3000ml，用碳酸钠溶液调节PH值至6.0～8.0，加入甘露醇、乳糖使完全溶解，按注射剂的要求进行高压消毒灭菌，采用微孔滤膜过滤，滤液按每只3ml进行分装，冷冻干燥，封口，即得。

Claims (8)

1.一种长春西汀药物组合物，其特征在于所述药物组合物由活性成分长春西汀、硫酸戊聚糖纳和药学上可接受的赋形剂组合而成。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于活性成分按照重量份计：含有1～10份的长春西汀和10～1份的硫酸戊聚糖纳。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于活性成分按照重量份计：含有1份的长春西汀和10份的硫酸戊聚糖纳。

4.根据权利要求1～3所述的药物组合物，其特征在于所述的活性成分包括光学异构体、药用盐及水合物。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物可以制成医学上允许的制剂，包括口服制剂或注射制剂。

6.根据权利1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物在改善脑功能不全方面的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于对抗脑缺血、缺氧方面的应用。

8.根据权利要求5所述的注射制剂，取长春西汀1g、硫酸戊聚糖纳10g、氯化钠、1，2-丙二醇；氯化钠溶解至20％丙二醇水溶液500ml，加入长春西汀、硫酸戊聚糖纳，于60～70℃水浴上搅拌至全溶，冷却至室温，加入的注射用水至1000ml，混匀后用0.22μm滤膜过滤；滤液分瓶灌装，封口，灭菌，即得。