CN105255852A - 利用陶瓷膜分离固定化酶和肝素酶解液的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种陶瓷膜分离固定化酶和肝素酶解液的方法，包括以下步骤：1)、对陶瓷膜进行预处理；2)、固定化酶制备；3)、固定化胰蛋白酶制备肝素酶解液：在小肠粘膜中加入水后进行匀浆，调节所得浆液的pH为10.8～11.2；然后加入固定化胰蛋白酶进行酶解；4)、所得的肝素酶解液用100目滤网过滤；5)、利用步骤1)所得的处理后陶瓷膜对步骤4)所得的滤液进行微滤，滤液中含有肝素。本发明利用固定化酶替代游离酶提取肝素，并使用膜分离技术实现固定化酶与提取产物的分离，无需高温灭酶，克服了游离酶法提取肝素的蛋白酶无法重复利用、蛋白酶灭活后转变为杂质影响产品得率等缺陷。

Description

利用陶瓷膜分离固定化酶和肝素酶解液的方法

技术领域

本发明涉及一种陶瓷膜分离固定化酶和肝素酶解液的方法。

背景技术

肝素钠(HeparinSodium)是粘多糖硫酸酯类抗凝血药。肝素钠是由猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质。近年来研究证明肝素钠还有降血脂作用。

利用小肠粘膜制备肝素钠属于目前现有的公知技术，例如，《酶解法制备肝素钠关键工艺技术研究》一文中告知：首先，进行小肠粘膜酶解，小肠粘膜的胰蛋白酶最适合的酶解工艺条件为：酶底物比为0.7％，温度60℃，时间3h，pH8.5，盐浓度0.3mol/L，料液比为1:7。然后，离子交换树脂吸附黏膜酶解液，得粗品肝素钠；当采用FPA98cl类型的离子交换树脂在最适合工艺条件下对黏膜酶解液进行吸附时，肝素钠的吸附量达到218.47mg/g，粗品肝素钠的效价能达到90U/mg。最后，用乙醇直接沉淀法对粗品肝素钠进行精制，所得肝素钠的效价能达到120U/mg。但，上述方法尚存在以下缺陷：酶解结束后需要高温灭酶，对肝素效价有较大影响；灭酶后蛋白酶转变为杂质，在后续的离子交换树脂吸附工艺中易出现吸附不完全，影响产品得率。蛋白酶无法重复利用，成本较高。

陶瓷膜是无机膜中的一种，属于膜分离技术中的固体膜材料，主要以不同规格的氧化铝、氧化锆、氧化钛和氧化硅等无机陶瓷材料作为支撑体，经表面涂膜、高温烧制而成。商品化的陶瓷膜通常具有三层结构(多孔支撑层、过渡层及分离层)，呈非对称分布，其孔径规格为0.8nm～1μm不等，过滤精度涵盖微滤、超滤、纳滤级别。

目前，陶瓷膜在使用前的预处理方式为：新膜使用前需要用蒸馏水浸泡12h后，在温度30℃，压力0.2MPa，流速2m/s，循环蒸馏水压滤2～3小时至水通量稳定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种陶瓷膜分离固定化酶和肝素酶解液的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种陶瓷膜分离固定化酶和肝素酶解液的方法，包括以下步骤：

1)、对陶瓷膜进行预处理：

将孔径为800nm陶瓷膜用蒸馏水浸泡22～26h(较佳为24h)后，于压力0.2Mpa、温度29～31℃(较佳为30℃)、流速1.8～2.2m/s(较佳为2m/s)条件下循环蒸馏水55～65min(较佳为60min)；得处理后陶瓷膜；

备注说明：上述浸泡过程中需确保陶瓷膜始终被蒸馏水所浸没；上述预处理的目的是实现将膜压实，使其通量达到稳定状态；

2)、固定化酶制备：

在100ml的蒸馏水中加入0.22～0.26g(较佳为0.24g)胰蛋白酶，均匀搅拌，得酶液；

在所述酶液中加入平均粒径为1.8～2.2μm(较佳为2μm)的二氧化硅，磁力搅拌1.5～2.5h(较佳为2h)，离心，弃去上清，得固定化胰蛋白酶；所述胰蛋白酶与二氧化硅的质量比为1:25～28；

备注说明：上述磁力搅拌的目的是使胰蛋白酶能固定于二氧化硅上；

3)、固定化胰蛋白酶制备肝素酶解液：

按照1g/3～4ml(较佳为1g/3.3mL)的料液比，在小肠粘膜中加入水后进行匀浆，调节所得浆液的pH为10.8～11.2(较佳为pH为11)；然后加入固定化胰蛋白酶，胰蛋白酶与作为底物的小肠粘膜的质量比为0.24％(即，酶底物比为0.24％)，于45～47℃水浴中酶解4.8～5.2h(较佳为46℃水浴中酶解5h)；

4)、将步骤3)所得的肝素酶解液用100目滤网过滤，得滤液；

备注说明：上述过滤的目的是为了除去小肠粘膜残渣和脂肪组织等；该滤液中包括固定化胰蛋白酶、肝素、蛋白质等；其PH约为11；

5)、利用步骤1)所得的处理后陶瓷膜对步骤4)所得的滤液进行微滤，所述微滤的工艺参数为：压力0.3MPa，温度39～41℃(较佳为40℃)，流速1.8～2.2m/s(较佳为2m/s)，收集滤液；所述滤液中含有肝素。

备注说明：步骤1)所得的处理后陶瓷膜对固定化胰蛋白酶的拦截率100％，肝素透过率达到92.5％，平均膜通量达到656.4L/m².h。

作为本发明的陶瓷膜分离固定化酶和肝素酶解液的方法的改进，该方法还包括以下步骤：

6)、陶瓷膜的再生：

将步骤5)微滤所得的陶瓷膜利用质量浓度为1.8～2.2％(较佳为2％)NaOH溶液进行循环清洗，然后蒸馏水洗至中性。

作为本发明的陶瓷膜分离固定化酶和肝素酶解液的方法的进一步改进：

步骤6)中的循环清洗为：于40～45℃循环清洗30～45min，控制NaOH溶液的流速为1.8～2.2m/s(较佳为2m/s)。

备注说明：再生所得的陶瓷膜的通量不低于初始通量的85％。

本发明中：

1、所用的孔径为800nm陶瓷膜选用厦门福美科技有限公司生产的SMC-250型号的陶瓷膜。

2、所选用的胰蛋白酶的活性为250U/mg。

3、本发明的工艺步骤中，没有明确限定的均为在室温下进行，所述室温一般是指20～25℃。

本发明具有如下技术优势：

1、与游离酶相比，固定化酶可以重复使用，降低了生产成本，同时酶的稳定性也明显提高；

2、采用膜分离技术将固定化酶与产物分开，不仅简化了提纯工艺，而且无需高温灭酶，避免了蛋白酶灭活后转变为杂质影响后续的树脂吸附纯化工艺。

综上所述，本发明利用固定化酶替代游离酶提取肝素，并使用膜分离技术实现固定化酶与提取产物的分离，无需高温灭酶，克服了游离酶法提取肝素的蛋白酶无法重复利用、蛋白酶灭活后转变为杂质影响产品得率等缺陷；所得产物的效价也较为理想。

具体实施方式

实施例1、一种利用陶瓷膜分离固定化酶和肝素酶解液的方法，依次进行以下处理：

1)、对陶瓷膜进行预处理：

将孔径为800nm陶瓷膜用蒸馏水浸泡24小时后，于压力0.2MPa，温度30℃，流速2m/s条件下循环蒸馏水60min；从而实现将膜压实，使其通量达到稳定状态；得处理后陶瓷膜；

上述处理后陶瓷膜的膜通量为950L/m².h。

2)、固定化酶制备：

在100ml的蒸馏水中加入0.24g胰蛋白酶，均匀搅拌，得酶液；

在所述酶液中加入平均粒径约为2μm的二氧化硅，磁力搅拌2h，离心(转速为5000r/min)，弃去上清，得固定化胰蛋白酶；所述胰蛋白酶与二氧化硅的质量比为1:25；

备注说明：上述磁力搅拌的目的是使胰蛋白酶能固定于二氧化硅上；

3)、固定化胰蛋白酶制备肝素酶解液：

按照1g/3.3mL的料液比，在100g小肠粘膜中加入水后进行匀浆，利用质量浓度为20％的NaOH溶液从而调节所得浆液的pH为11；然后加入步骤2)所得的全部的固定化胰蛋白酶(即，所述酶底物比为0.24％)，于46℃水浴中酶解5h；

4)、将步骤3)所得的肝素酶解液用100目滤网过滤，得滤液(PH为11)；

备注说明：上述过滤的目的是为了除去小肠粘膜残渣和脂肪组织等；

5)、利用步骤1)所得的处理后陶瓷膜对步骤4)所得的滤液进行微滤，所述微滤的工艺参数为：压力0.3MPa，温度40℃，流速2m/s，收集滤液；所述滤液中含有肝素。

备注说明：步骤1)所得的处理后陶瓷膜对固定化胰蛋白酶的拦截率100％，肝素透过率达到92.5％，步骤5)微滤后所得的陶瓷膜的平均膜通量达到656.4L/m².h。

经标准羊血浆法进行检测，步骤3)所得的酶解液的效价为5.63U/mL，最终所得(即步骤5所得)滤液的效价为5.21U/mL。

实施例2、

将实施例1步骤5)微滤所得的陶瓷膜利用质量浓度为2％NaOH溶液进行循环清洗(于40～45℃循环清洗30～45min，控制NaOH溶液的流速为2m/s)，然后蒸馏水洗至中性。

清洗后的陶瓷膜的膜通量为912L/m².h(即，约为初始通量的96％)。

利用上述清洗后的陶瓷膜替代实施例1步骤1)中的陶瓷膜，其余等同于实施例1。

所得结果如下：

对固定化胰蛋白酶的拦截率100％，肝素透过率达到91.3％，平均膜通量达到628.9L/m².h；步骤5)所得的滤液的的效价为5.14U/mL。

对比例1-1：取消步骤2)的“固定化酶制备”，即，步骤3)中直接使用“胰蛋白酶”，且确保浆液中胰蛋白酶的有效含量同实施例1。

由于陶瓷膜对胰蛋白酶的拦截率0％，因此，步骤3)所得的酶解液需要进行常规的高温灭酶后；才能进行后续的步骤4)和步骤5)。高温灭酶会使蛋白酶转化为杂质。

所得结果如下：最终所得(即步骤5所得)滤液的效价为3.31U/mL。

对比例1-2、将实施例1步骤2)中的胰蛋白酶与二氧化硅的质量比由1:25改成1:40；其余等同于实施例1。

所得结果如下：

陶瓷膜对胰蛋白酶的拦截率100％，肝素透过率达到92.5％，步骤5)微滤后所得的陶瓷膜的平均膜通量达到417.5L/m².h；最终所得(即步骤5所得)滤液的效价为5.01U/mL。

对比例2-1、将实施例1步骤3)中的酶底物比由0.24％改成0.7％，其余等同于实施例1。

所得结果如下：

陶瓷膜对胰蛋白酶的拦截率100％，肝素透过率达到92.5％，步骤5)微滤后所得的陶瓷膜平均膜通量达到528.4L/m².h；最终所得(即步骤5所得)滤液的效价为2.35U/mL。

通过该对比例2-1，我们得知：加酶量增加，相应的载体二氧化硅也按比例增加；加酶量过大会导致酶的作用空间位阻过大，固定化酶的活性位点无法与底物充分接触。

对比例2-2、将实施例1步骤3)中的酶底物比由0.24％改成0.15％，且将酶解时间由5h改成10h；其余等同于实施例1。

所得结果如下：

陶瓷膜对胰蛋白酶的拦截率100％，肝素透过率达到92.5％，步骤5)微滤后所得的陶瓷膜平均膜通量达到701.9L/m².h；最终所得(即步骤5所得)滤液的效价为3.17U/mL。

对比例3、将实施例1步骤3)中的调节所得浆液的pH为11改成为8；其余等同于实施例1。

所得结果如下：

陶瓷膜对胰蛋白酶的拦截率100％，肝素透过率达到92.5％，步骤5)微滤后所得的陶瓷膜平均膜通量达到641.7L/m².h；最终所得(即步骤5所得)滤液的效价为1.83U/mL。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.陶瓷膜分离固定化酶和肝素酶解液的方法，其特征是包括以下步骤：

1)、对陶瓷膜进行预处理：

将孔径为800nm陶瓷膜用蒸馏水浸泡22～26h后，于压力0.2Mpa、温度29～31℃、流速1.8～2.2m/s条件下循环蒸馏水55～65min；得处理后陶瓷膜；

2)、固定化酶制备：

在100ml的蒸馏水中加入0.22～0.26g胰蛋白酶，均匀搅拌，得酶液；

在所述酶液中加入平均粒径为1.8～2.2μm的二氧化硅，磁力搅拌1.5～2.5h，离心，弃去上清，得固定化胰蛋白酶；所述胰蛋白酶与二氧化硅的质量比为1:25～28；

3)、固定化胰蛋白酶制备肝素酶解液：

按照1g/3～4ml的料液比，在小肠粘膜中加入水后进行匀浆，调节所得浆液的pH为10.8～11.2；然后加入固定化胰蛋白酶，胰蛋白酶与作为底物的小肠粘膜的质量比为0.24％，于45～47℃水浴中酶解4.8～5.2h；

4)、将步骤3)所得的肝素酶解液用100目滤网过滤，得滤液；

5)、利用步骤1)所得的处理后陶瓷膜对步骤4)所得的滤液进行微滤，所述微滤的工艺参数为：压力0.3MPa，温度39～41℃，流速1.8～2.2m/s，收集滤液；滤液中含有肝素。

2.根据权利要求1所述的陶瓷膜分离固定化酶和肝素酶解液的方法，其特征是该方法还包括以下步骤：

6)、陶瓷膜的再生：

将步骤5)微滤所得的陶瓷膜利用质量浓度为1.8～2.2％NaOH溶液进行循环清洗，然后蒸馏水洗至中性。

3.根据权利要求2所述的陶瓷膜分离固定化酶和肝素酶解液的方法，其特征是：

所述步骤6)中的循环清洗为：于40～45℃循环清洗30～45min，控制NaOH溶液的流速为1.8～2.2m/s。