α-熊果苷转化液中氢醌的去除方法
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域,具体涉及一种α-熊果苷转化液中氢醌的去除方法。
背景技术
α-熊果苷是β-熊果苷的差向异构体,其化学名为4-羟苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷。研究表明,α-熊果苷较β-熊果苷而言性质更稳定,具有更好的抗炎、修复和美白功效,常作为增白剂应用于高端护肤品和化妆品中。在α-熊果苷发酵生产中,通常会残留少量的、稳定性差的氢醌,影响到α-熊果苷作为化妆品添加剂的使用安全性,因而,如何有效去除α-熊果苷发酵生产中产生的氢醌,是本领域亟需解决的技术问题。
现有技术中,CN102001917A和CN102001760A分别公开了一种浓缩分离对苯二酚的方法和一种脱色浓缩分离对苯二酚的方法,但这两种方法都存在会损失大量熊果苷的问题而不适合用于本申请中α-熊果苷转化液的除杂。此外,CN103483401B公开了一种萃取分离对苯二酚的方法,虽然该方法能以较低的成本,高效提取α-熊果苷发酵液中的对苯二酚,然而,该方法步骤繁琐,并且存在溶剂残留问题,不适宜于大体系分离,难以应用于工业化生产。由此可见,目前已有的从发酵液中分离出对苯二酚的方法在不同程度上都存在成本高、污染大、效率低下等缺点,有待改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能彻底去除α-熊果苷转化液中氢醌的方法,具有成本低、无污染、效率高等优势。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:一种α-熊果苷转化液中氢醌的去除方法,蔗糖、氢醌、表面活性剂和菌体经反应后获得α-熊果苷转化液,过滤,采用树脂对滤液进行吸附处理,之后收集树脂透过液,得到完全除去氢醌的α-熊果苷溶液。
上述技术方案的有益效果在于:从HPLC检测结果来看,利用树脂吸附可以彻底除去α-熊果苷转化液中的氢醌。与常规的浓缩、脱色以及萃取分离氢醌的方法相比较,本发明采用树脂吸附去除氢醌,具有操作简单,能耗低,不存在溶剂残留、效率高等优势,此外,该方法容易放大,从而应用在工业生产中。
作为优选,所述树脂的使用方法为:在常温和自然pH下,滤液以0.2BV/h~5BV/h的流速通过树脂柱,树脂与滤液的体积比例为1:(1~10)。在实际应用过程中,具体的流速以流出液中检测不出氢醌为准。
需要说明的是,BV是树脂柱的基本单位,在行业内,树脂柱工作时的各种物料量都以BV为单位。例如溶液通过树脂柱的流量速度为2~4BV/h,即表明每小时通过溶液的体积为树脂床容积的2~4倍。
事实上,所述步骤(4)中的树脂为大孔吸附树脂或者离子交换树脂。
作为优选方案,所述树脂为HZ806型大孔中等极性吸附树脂、HZ-816型大孔非极性吸附树脂、ZGA-351型阴离子交换树脂中的任意一种,其均能对氢醌产生良好吸附,而几乎不吸附α-熊果苷,避免造成处理过程中α-熊果苷的损失。
为保证吸附效果,上述树脂在第一次使用前需要进行预处理,其预处理方法为:将树脂清洗干净,先用1~5倍树脂体积的1~10wt%氢氧化钠浸泡2~10h,再用1~5倍树脂体积的1~10vt%盐酸浸泡2~10h,然后用蒸馏水水洗树脂至中性,之后用50~95vt%的乙醇溶液浸泡3~9h,最后用蒸馏水水洗树脂至无乙醇味,滤去水,即得进行使用。
此外,树脂在循环吸附后会发生堵塞现象,因此需要通过再生处理,提高使用次数,再生方法为:用1~5倍树脂体积的1~10wt%氢氧化钠以0.1~2BV/h的流速流过树脂柱,然后用1~5倍树脂体积的1~10wt%盐酸以0.1~2BV/h的流速流过树脂柱,之后用蒸馏水水洗树脂至中性,再用70~95wt%的乙醇溶液浸泡3~9h,最后用蒸馏水水洗至吸树脂无乙醇味,滤去水,即得进行再次使用。
具体的方案为,所述菌种为大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,野油菜黄单胞菌,米曲霉中的任意一种。需要说明的是,所述菌种是指能催化氢醌和淀粉类物质反应生成α-熊果苷的菌株,包括但不限于上述指出的菌种。
更具体的方案为,上述α-熊果苷转化液中氢醌的去除方法,具体包括如下步骤:
(1)菌种经种子培养和发酵培养结束后,收集菌体;
(2)蔗糖、氢醌、表面活性剂和菌体按照如下投加量混合:蔗糖180~300g/L,氢醌5~20g/L,表面活性剂0.01~0.06%,菌体细胞5~20OD,反应至产物中氢醌的浓度<5g/L;
(3)产物在50-80℃下保温0.5-2h,之后通过膜过滤除去杂质;
(4)膜过滤后的滤液经过树脂吸附处理,之后收集树脂透过液,得到完全除去氢醌的α-熊果苷溶液。
在上述技术方案中,菌种的种子培养和发酵培养采用本领域常规培养方法即可,目的是获得高浓度菌液。
所述步骤(3)中的膜过滤包括依次进行的微滤和超滤,微滤所用膜元件的孔径为20-200nm,超滤所用膜元件的截留分子量为1000-10000。在该孔径和截留分子量下,可以将混合液中的酶以及细胞碎片等杂质过滤掉。
附图说明
图1-6分别为实施例1-6中树脂透过液的色谱检测图。
具体实施方式
以下通过6个实施例来进一步公开本发明,以下实施例中所用树脂在第一次使用前需要进行预处理,其预处理方法为:将树脂清洗干净,先用1~5倍树脂体积的1~10wt%氢氧化钠浸泡2~10h,再用1~5倍树脂体积的1~10vt%盐酸浸泡2~10h,然后用蒸馏水水洗树脂至中性,之后用50~95vt%的乙醇溶液浸泡3~9h,最后用蒸馏水水洗树脂至无乙醇味,滤去水,即得进行使用。
此外,树脂在堵塞后需要通过再生处理,再生方法为:用1~5倍树脂体积的1~10wt%氢氧化钠以0.1~2BV/h的流速流过树脂柱,然后用1~5倍树脂体积的1~10wt%盐酸以0.1~2BV/h的流速流过树脂柱,之后用蒸馏水水洗树脂至中性,再用70~95wt%的乙醇溶液浸泡3~9h,最后用蒸馏水水洗至树脂无乙醇味,滤去水,即得进行再次使用。
实施例1:α-熊果苷转化液中氢醌的去除
(1)大肠杆菌经种子培养和发酵培养后,收集菌体;
(2)向2m3的转化罐中注入0.7m3水,然后加入340kg的蔗糖,13.2kg氢醌,溶解完全后,定容至1m3,之后向转化罐中加入0.1m3菌体,再加入5L的表面活性剂,30℃下反应3h,转化结束,产物中氢醌残留0.56g/L,α-熊果苷含量30.5g/L,氢醌摩尔转化率93.4%;
(3)产物在60℃下保温1h,通过孔径为100nm的陶瓷膜微滤处理后,透过液再通过截留分子量为2000的超滤膜超滤处理,收集超滤透过液;
(4)在常温和自然pH下,收集超滤透过液以3BV/h的流速通过HZ806大孔中等极性吸附树脂柱,树脂与超滤透过液的体积比例为1:3,收集树脂透过液,得到完全除去氢醌的α-熊果苷溶液。
采用HPLC检测树脂透过液,如附图1所示,透过液中氢醌含量为零。
HPLC检测条件为:柱子:WondaSil C18反相柱,4.6*150mm。进样量:10uL。柱温:35℃。流动相:5%甲醇水溶液。流速:1.0mL/min。检测波长:280nm。α-Arbutin出峰时间:4.8min;Hydroquinone出峰时间:6.0min。
实施例2:α-熊果苷转化液中氢醌的去除
(1)枯草芽孢杆菌经种子培养和发酵培养后,收集菌体;
(2)向2m3的转化罐中注入0.7m3水,然后加入340kg的蔗糖,13.2kg氢醌,溶解完全后,定容至1m3,之后向转化罐中加入0.1m3菌体,再加入5L的表面活性剂,30℃下反应3h,转化结束,产物中氢醌残留0.56g/L,α-熊果苷含量30.5g/L,氢醌摩尔转化率93.4%;
(3)产物在65℃下保温1h,通过孔径为100nm的陶瓷膜微滤处理后,透过液再通过截留分子量为2000的超滤膜超滤处理,收集超滤透过液;
(4)在常温和自然pH下,收集超滤透过液以2BV/h的流速通过HZ-816大孔非极性吸附树脂柱,树脂与超滤透过液的体积比例为1:5,收集树脂透过液,得到完全除去氢醌的α-熊果苷溶液。
采用HPLC检测树脂透过液,如附图2所示,透过液中氢醌含量为零。
实施例3:α-熊果苷转化液中氢醌的去除
(1)野油菜黄单胞菌经种子培养和发酵培养后,收集菌体;
(2)向2m3的转化罐中注入0.7m3水,然后加入340kg的蔗糖,13.2kg氢醌,溶解完全后,定容至1m3,之后向转化罐中加入0.1m3菌体,再加入5L的表面活性剂,30℃下反应3h,转化结束,产物中氢醌残留0.56g/L,α-熊果苷含量30.5g/L,氢醌摩尔转化率93.4%;
(3)产物在70℃下保温1h,通过孔径为100nm的陶瓷膜微滤处理后,透过液再通过截留分子量为2000的超滤膜超滤处理,收集超滤透过液;
(4)在常温和自然pH下,收集超滤透过液以2.5BV/h的流速通过ZGA-351阴离子交换树脂柱,树脂与超滤透过液的体积比例为1:3,收集树脂透过液,得到完全除去氢醌的α-熊果苷溶液。
采用HPLC检测树脂透过液,如附图3所示,透过液中氢醌含量为零。
实施例4:α-熊果苷转化液中氢醌的去除
(1)米曲霉经种子培养和发酵培养后,收集菌体;
(2)向2m3的转化罐中注入0.7m3水,然后加入240kg的蔗糖,13.2kg氢醌,溶解完全后,定容至1m3,之后向转化罐中加入0.1m3菌体,再加入5L的表面活性剂,30℃下反应3h,转化结束,产物中氢醌残留1.87g/L,α-熊果苷含量27.12g/L,氢醌摩尔转化率83.2%;
(3)产物在60℃下保温1h,通过孔径为100nm的陶瓷膜微滤处理后,透过液再通过截留分子量为5000的超滤膜超滤处理,收集超滤透过液;
(4)在常温和自然pH下,收集超滤透过液以3BV/h的流速通过HZ806大孔中等极性吸附树脂柱,树脂与超滤透过液的体积比例为1:6,收集树脂透过液,得到完全除去氢醌的α-熊果苷溶液。
采用HPLC检测树脂透过液,如附图4所示,透过液中氢醌含量为零。
实施例5:α-熊果苷转化液中氢醌的去除
(1)枯草芽孢杆菌经种子培养和发酵培养后,收集菌体;
(2)向2m3的转化罐中注入0.7m3水,然后加入240kg的蔗糖,13.2kg氢醌,溶解完全后,定容至1m3,之后向转化罐中加入0.1m3菌体,再加入5L的表面活性剂,30℃下反应3h,转化结束,产物中氢醌残留1.87g/L,α-熊果苷含量27.12g/L,氢醌摩尔转化率83.2%;
(3)产物在65℃下保温1h,通过孔径为100nm的陶瓷膜微滤处理后,透过液再通过截留分子量为5000的超滤膜超滤处理,收集超滤透过液;
(4)在常温和自然pH下,收集超滤透过液以2BV/h的流速通过HZ-816大孔非极性吸附树脂柱,树脂与超滤透过液的体积比例为1:3,收集树脂透过液,得到完全除去氢醌的α-熊果苷溶液。
采用HPLC检测树脂透过液,如附图5所示,透过液中氢醌含量为零。
实施例6:α-熊果苷转化液中氢醌的去除
(1)野油菜黄单胞菌经种子培养和发酵培养后,收集菌体;
(2)向2m3的转化罐中注入0.7m3水,然后加入240kg的蔗糖,13.2kg氢醌,溶解完全后,定容至1m3,之后向转化罐中加入0.1m3菌体,再加入5L的表面活性剂,30℃下反应3h,转化结束,产物中氢醌残留1.87g/L,α-熊果苷含量27.12g/L,氢醌摩尔转化率83.2%;
(3)产物在70℃下保温1h,通过孔径为100nm的陶瓷膜微滤处理后,透过液再通过截留分子量为5000的超滤膜超滤处理,收集超滤透过液;
(4)在常温和自然pH下,收集超滤透过液以3BV/h的流速通过ZGA-351阴离子交换树脂柱,树脂与超滤透过液的体积比例为1:4,收集树脂透过液,得到完全除去氢醌的α-熊果苷溶液。
采用HPLC检测树脂透过液,如附图6所示,透过液中氢醌含量为零。