CN115894580B - 一种用于全细胞催化生产α-熊果苷的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于全细胞催化生产α‑熊果苷的分离纯化方法，所述方法采用树脂吸附和树脂、活性炭脱色的方法，从全细胞催化生产α‑熊果苷的催化液中提取得到高纯度的α‑熊果苷。本发明的方法得到的α‑熊果苷产品回收率高，纯度高，尤其是完全检测不到具有毒性的对苯二酚，该方法原料成本低，设备可重复利用，可实现α‑熊果苷的大批量生产。
Description
技术领域
本发明属于天然物质提取分离领域，具体涉及一种全细胞催化生产熊果苷的分离纯化方法。
背景技术
熊果苷（Arbutin）是对苯二酚（Hydroquinone，HQ）的糖基化产物，由葡萄糖和对苯二酚通过糖苷键连接而成，因在预防黑色素生成方面的卓越功效而在美白类化妆品中具有广泛的应用。由于葡萄糖和HQ可形成α和β两种糖苷键，因此熊果苷也存在α-熊果苷和β-熊果苷两种构型。α-熊果苷呈粉末状或针状晶体，易溶于水和乙醇，溶液为无色透明状，遇酸容易分解。与β-熊果苷相比，α-熊果苷更具pH稳定性及热稳定性，能够更好地应用到各种形式的美白化妆品中。
全细胞催化法可以实现α-熊果苷的高效合成，极具工业化应用价值。目前生产α-熊果苷有酶法和全细胞生物催化法及植物提取法等。全细胞生物催化反应不需要先提纯酶，整个细胞可以直接用于酶促反应，生物转化过程相比传统酶催化反应更加容易，且产量较大。但是对苯二酚作为全细胞催化生产α-熊果苷的底物，在催化液中有加大残留，而对苯二酚毒性较大，有致癌和致诱变性。目前要求产品中对苯二酚的检测浓度低于2ppm，对产品纯度要求较高。
CN114044797A公开了一种α-熊果苷连续色谱法提纯的方法，其采用了6根弱酸性阳离子交换树脂D001。该方法利用多根色谱柱串联纯化，成本高操作繁琐，更重要的是，其选用的树脂型号不能满足产品要求，根据其实施例记载的方法，完全观察不到熊果苷挂柱，无法有效成功分离纯化出α-熊果苷。另外对于洗脱液的收集等目前采用的方法均用洗脱体积计量，对于不同初始条件的纯化而言，洗脱体积会发生变化，因此该方法不利于工业化生成，较为复杂。
发明内容
为克服现有技术中的问题，本发明提供一种全细胞催化生产α-熊果苷的提取纯化方法， 包括以下步骤：
（1）预处理
催化液固液分离，将分离后的清液调节pH低于5，出现絮状沉淀后固液分离，将液体冷却于10℃以下；
（2）多树脂串联吸附
将步骤（1）得到的低温液体注入吸附氢醌的树脂后，再注入清水，该树脂流出液进入吸附熊果苷的树脂，当吸附熊果苷的色谱柱出料后开始收集含蔗糖的废水；
（3）收集洗脱液
以洗脱液分别洗脱树脂，实时监测流出液，分别收集α-熊果苷洗脱液和氢醌洗脱液；
（4）脱色除杂
将α-熊果苷洗脱液注入阳离子大孔交换树脂，实时监测流出液，收集α-熊果苷脱色液，浓缩得到的脱色液，并加入活性炭吸附脱色；
（5）后处理
除去活性炭后，冷冻脱色液，得冻干α-熊果苷产品。
根据本发明的实施方案，步骤（1）中的固液分离采用离心机分离。
根据本发明的实施方案，步骤（1）中采用5%的盐酸调节pH值≤4，并室温下静置10min以上，例如30min，50min。
根据本发明的实施方案，步骤（1）中，絮状沉淀后滤膜分离，所述滤膜包括滤纸、水膜、陶瓷膜等。
根据本发明的实施方案，步骤（1）中，所述冷却是将液体置于冰浴中。
根据本发明的实施方案，步骤（2）中，吸附氢醌的树脂为LX-289B，吸附熊果苷的树脂为XDA-8G或者XR-18B。
根据本发明的实施方案，步骤（2）中，低温液体注入吸附氢醌的树脂的流速设定为1ml/min ~3ml/min，例如2ml/min。
根据本发明的实施方案，步骤（3）中，使用15-50%的乙醇洗脱吸附熊果苷的色谱柱，例如20%，30%。
根据本发明的实施方案，步骤（3）中，使用0.1-0.3M的热氢氧化钠溶液洗脱吸附氢醌的色谱柱，所述热氢氧化钠溶液温度为40℃-80℃。
根据本发明的实施方案，步骤（3）中，使用紫外检测实时监测流出液，以便收集熊果酸或者氢醌洗脱液。
根据本发明的实施方案，步骤（4）中，阳离子大孔交换树脂为LX-160。
根据本发明的实施方案，步骤（4）中，使用紫外检测实时监测流出液，以便收集熊果酸脱色液。
根据本发明的实施方案，步骤（4）中，所述浓缩是将α-熊果苷脱色液浓缩至原来体积的一半。
根据本发明的实施方案，步骤（4）中，活性炭的加入量为熊果苷脱色液的1‰-10‰，例如5‰。
根据本发明的实施方案，步骤（4）中，加入活性炭并将脱色液加热至50-70℃，吸附至少1小时以上。例如，加热至60℃吸附2小时。
根据本发明的实施方案，预先将所述吸附氢醌的树脂、吸附熊果苷的树脂和阳离子大孔交换树脂依次串联设置，在步骤（3）时，断开吸附氢醌的树脂与吸附熊果苷的树脂。
有益效果：本发明提供了一种工艺步骤简单、可操作性强的全细胞催化生产α-熊果苷的提取纯化方法，本发明的方法得到的α-熊果苷产品回收率高，纯度高，尤其是完全检测不到具有毒性的对苯二酚，本发明的方法原料成本低，设备可重复利用，可实现α-熊果苷的大批量生产。
附图说明
图1为α-熊果苷全波长扫描图。
图2为α-熊果苷微量紫外分光光度计浓度-吸光值标准曲线图。
图3为α-熊果苷催化液的成分组成。
图4为α-熊果苷催化液经过多树脂串联纯化后的成分组成。
图5为多树脂串联色谱柱连接示意图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的交联聚合物胶束和载药交联聚合物胶束做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例 1 称取1mg的α-熊果苷及1mg的对苯二酚分别溶于50ml水中配成α-熊果苷标准液及对苯二酚标准液。分别取200μL α-熊果苷标准品、对苯二酚标准液和纯水于96孔板中，每个样品安排3组平行实验。设置扫描模式为ABS扫描，扫描步长设置为1nm；设置扫描范围为200nm至500nm；放置96孔板进行扫描，得到最佳吸收波长为280nm（如图1）。随后配置不同浓度梯度的α-熊果苷标准液（其浓度梯度设置为：0.625 g/L；1.25 g/L；2.5 g/L；5 g/L；10 g/L），并分别称取20μL置于微量紫外检测仪中测量对应的紫外吸收值，将浓度和相对应的吸光值进行线性拟合绘制标准曲线图，其中5g/L以内符合线性关系，R2 = 0.999（如图2）。
实施例 2 取50 ml经全细胞催化后的α-熊果苷催化液，25℃12000 rpm离心20min、留取上清液并使用5 %盐酸溶液调节pH值至4.0，于25℃静置30 min以上，溶液中出现絮状不溶物，膜过滤得到待纯化α-熊果苷混合液。HPLC检测其成分构成结果如图3所示。其中所用高效液相色谱仪（HPLC）的型号为1260 Infinity Ⅱ Prime，选用依利特牌色谱柱，柱号为E3212207。
实施例 3 将待纯化α-熊果苷混合液置于冰浴中，使用恒流泵将混合液恒流泵入色谱柱中进行分离，进料流速为1ml/min，催化液上样完毕后，泵入去离子水至色谱柱中，对苯二酚（即氢醌）会吸附在氢醌树脂柱LX-289B中，而蔗糖与熊果苷会直接流入熊果苷树脂柱XDA-8G中。熊果苷树脂柱将α-熊果苷吸附到树脂上，而蔗糖会直接流出，使用阿贝折光仪分析是否已除去蔗糖。从蔗糖开始流出时收集蔗糖废液，大约收集3个柱体积可结束。
将熊果苷树脂和氢醌树脂断开连接，分别向氢醌树脂色谱柱中加入0.1M的热氢氧化钠溶液（50℃左右，）对氢醌树脂进行再生，并收集氢醌废液，当紫外吸收信号平稳时洗脱结束。向熊果苷树脂色谱柱中通入20%乙醇溶液洗脱α-熊果苷。当紫外吸收信号上涨时收集α-熊果苷。
上述α-熊果苷收集液经HPLC检测（所述检测仪同实施例2），纯度达到100%，此收集液中已检测不到对苯二酚信号。经多树脂串联纯化后的回收率达到95 %左右（串联洗脱液熊果苷浓度（69.78g/l）×体积（50ml）÷进料液的熊果苷浓度（125.63g/l）×体积（30ml），所述浓度经HPLC检测得到），其检测结果如图4所示。
将上述α-熊果苷收集液按照设定流速2ml/min继续泵入阳离子交换色谱柱（LX-160）中，精制熊果苷，吸附生物碱类色素。
将上述经阳离子交换色谱柱精制的α-熊果苷收集液用真空旋转蒸发仪浓缩2倍（温度设置为80 ℃，压力为-0.1Mpa）后称重，量取浓缩液质量0.5%的活性炭加入到α-熊果苷浓缩液中，置于60℃的水浴锅中搅拌脱色2 h。
通过抽滤装置脱除掉活性炭得到α-熊果苷脱色液，其中使用的滤膜为津腾微孔水系过滤膜（孔径0.2μm），置于-80℃冰箱中冷冻过夜，随后置于冻干机（设置条件为-70℃，1.7 pa）中冻干得到α-熊果苷成品。
本实施例中，还研究了活性炭用量在上述温度条件下对脱色效果的影响。发明人意外发现，活性炭的用量明显影响了脱色效果，而且相较而言，并非较高用量更有效果，在0.1%至1%，甚至更高用量，例如5%的范围内，其中0.5%用量的活性炭，脱色效果最好。
以上对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种全细胞催化生产α-熊果苷的提取纯化方法， 其特征在于，包括以下步骤：
（1）预处理
催化液固液分离，将分离后的清液采用5%的盐酸调节pH值≤4，并室温下静置10min以上，出现絮状沉淀后采用滤膜固液分离，将液体置于冰浴中冷却；
（2）多树脂串联吸附
将步骤（1）得到的低温液体注入吸附氢醌的树脂LX-289B后，再注入清水，该树脂流出液进入吸附α-熊果苷的树脂XDA-8G，当吸附熊果苷的树脂柱出料后开始收集含蔗糖的废水；
（3）收集洗脱液
使用15-50%的乙醇洗脱吸附α-熊果苷的树脂，使用0.1-0.3M的热氢氧化钠溶液洗脱吸附氢醌的树脂，分别收集α-熊果苷洗脱液和氢醌洗脱液；
（4）脱色除杂
将α-熊果苷洗脱液注入阳离子大孔交换树脂LX-160，收集α-熊果苷脱色液，浓缩所述脱色液，并加入活性炭吸附脱色；
（5）后处理
除去活性炭后，冷冻脱色液，得冻干α-熊果苷产品；
其中，预先将所述吸附氢醌的树脂、吸附α-熊果苷的树脂串联设置，在步骤（3）时，断开吸附氢醌的树脂与吸附熊果苷的树脂。
2.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，
步骤（1）中，所述滤膜选自滤纸、水膜和陶瓷膜中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，
步骤（2）中，低温液体注入吸附氢醌的树脂的流速设定为1ml/min ~3ml/min。
4.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，
步骤（3）中，使用紫外检测实时监测流出液，以便收集熊果苷或者氢醌洗脱液。
5.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，
步骤（4）中，使用紫外检测实时监测流出液，以便收集熊果苷脱色液；
步骤（4）中，所述浓缩是将α-熊果苷脱色液浓缩至原来体积的一半。
6.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，
步骤（4）中，活性炭的加入量为熊果苷脱色液的1‰-10‰。
7.根据权利要求6所述的提取纯化方法，其特征在于，
步骤（4）中，活性炭的加入量为熊果苷脱色液的5‰。
8.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，
步骤（4）中，加入活性炭并将脱色液加热至50-70℃，吸附至少1小时以上。
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