CN105254597B - 红豆杉中10-dab iii和/或紫杉醇的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红豆杉中10‑DAB III和/或紫杉醇的提取方法。该提取方法为：1)用水溶液提取新鲜或干燥的红豆杉枝叶，得提取液；水溶液中包括10～500ppm的5‑ALA；新鲜的红豆杉枝叶中10‑DAB III含量≥1500ppm，紫杉醇含量≥200ppm；干燥的红豆杉枝叶中10‑DAB III含量≥5000ppm，紫杉醇含量≥300ppm；2)陶瓷膜过滤提取液，再用纳滤膜过滤；3)反相大孔吸附树脂吸附，梯度洗脱得10‑DAB III层析液段和/或紫杉醇层析液段，后处理，得10‑DAB III粗品和/或紫杉醇粗品。所提供的提取方法特别适用于10‑DAB III和紫杉醇含量高的红豆杉的提取。
Description
技术领域
本发明涉及一种红豆杉中10-DAB III和/或紫杉醇的提取方法。
背景技术
10-DAB III(全称是10-去乙酰基巴卡丁三)是半合成紫杉醇(Paclitaxel)、多西他赛(Docetaxel)和卡巴他赛(Cabazitaxel)的前体原料。国内外有很多专利公开了从各种红豆杉中提取10-DAB III和紫杉醇的方法，例如CN200710178672.1，CN1903849，EP629701，EP1053345，US4876399， US5019504，US5628906，US5850032，US5969165，US2002155177，WO0078741，WO0512507，WO01051476等。即用5～10倍的甲醇或乙醇水溶液提取红豆杉，然后萃取，减压浓缩制备成浸膏，然后再经正相或反相层析分离，结晶和重结晶等得到高含量的10-DAB III和紫杉醇精品，各专利保护的红豆杉品种主要为欧洲浆果红豆杉、蔓地亚红豆杉、加拿大红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉、喜马拉雅红豆杉、云南红豆杉和中国南方红豆杉。特别指出，CN200710178672.1专利中公开的方法，即用0.1％～0.5％柠檬酸水溶液超声逆流提取欧洲浆果红豆杉，用大孔树脂富集后再洗脱，然后减压浓缩，结晶和重结晶获得高含量10-DAB III。US5736366介绍用软化水提取红豆杉枝叶，用聚苯乙烯树脂吸附，再用甲醇洗脱，并进一步处理，收率得到75.4％。CN1660827报道用70～80％乙醇提取红豆杉枝叶，得到水溶性浓缩液，静置后，不溶于水的紫杉醇及低极性杂质沉淀析出，溶液再上S8、 AB6等大孔树脂进行富集提取10-DAB III的方法。
上述专利中涉及到的红豆杉品种中的10-DAB III含量都属于常规范畴，其中10-DAB III含量最高的红豆杉品种为欧洲浆果红豆杉，新鲜的红豆杉枝叶中10-DAB III含量大约在500～800ppm，干燥的红豆杉枝叶的含量大约在 1200～2000ppm之间。而根据专利CN201110190376.X公开的种植方法生产的红豆杉新品种，其10-DAB III的含量特别高，具体地，红豆杉枝叶中 10-DAB III含量≥1500ppm，干燥的红豆杉枝叶中10-DAB III含量≥5000ppm。针对各红豆杉品种中的10-DAB III含量，作如下比较，具体如表1所示：
表1 各红豆杉品种中10-DAB III的含量比较
但是，上述各专利公开的提取方法仅适用于提取10-DAB III含量不高的红豆杉原料；如果说，红豆杉原料中10-DAB III的含量被大大提升，例如专利CN201110190376.X公开的种植方法生产的红豆杉，若仍然采用上述各专利公开的提取方法提取10-DAB III，由于10-DAB III的含量太高，反而会发生严重降解的现象，如此一来，提取过程得到的10-DABIII的收率就会大大降低。那么，针对10-DAB III含量高的红豆杉，亟待提出一种10-DABIII 的收率高、产品稳定的提取方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于现有技术提供的10-DAB III提取方法应用于提取10-DAB III含量高的红豆杉品种时，得到的10-DAB III不稳定而且收率低的缺陷，而提供了一种红豆杉中10-DAB III和/或紫杉醇的提取方法。所提供的提取方法特别适用于10-DAB III和紫杉醇含量高的红豆杉的提取，该提取方法不仅提高了产品得率、减少了产品内的降解杂质、还大大节省了有机溶剂用量和水电汽费用，对环境影响小；该提取方法可以连续大规模地进行10-DAB III和/或紫杉醇的提取、纯化等操作。
本发明提供了一种红豆杉中10-DAB III和/或紫杉醇的提取方法；所述的提取方法包括如下步骤：
(1)用水溶液提取新鲜的或干燥的红豆杉枝叶原料，得提取液；所述水溶液中包括浓度为10～500ppm的5-ALA(全称是5-氨基酮戊酸)；新鲜的红豆杉枝叶原料中10-DAB III含量≥1500ppm，紫杉醇含量≥200ppm；干燥的红豆杉枝叶中10-DAB III含量≥5000ppm，紫杉醇含量≥300ppm；
(2)采用陶瓷膜过滤所述提取液，以滤除分子量大于50万道尔顿的杂质，再用纳滤膜过滤，以滤除分子量小于200道尔顿的小分子；
(3)采用反相大孔吸附树脂吸附，并梯度洗脱，得到10-DAB III层析液段和/或紫杉醇层析液段，再经后处理，得到10-DAB III粗品和/或紫杉醇粗品。
步骤(1)中，所述的水溶液中较佳地包括浓度为50～500ppm的5-ALA，更佳地包括浓度为100～200ppm的5-ALA。
步骤(1)中，所述的水溶液中较佳地还含有甲醇和/或乙醇，更佳地，进一步还含有柠檬酸和/或冰醋酸。其中，所述的甲醇和/或乙醇的含量较佳地为占所述水溶液的0.1％～95％，更佳地为占所述水溶液的20％～70％，所述百分比为质量百分比。所述的柠檬酸和/或冰醋酸的含量较佳地为占所述水溶液的0.1％～2％，所述百分比为质量百分比。
步骤(1)中，所述的提取为本领域常规操作，较佳地为超声逆流提取或抽提。所述的超声逆流提取较佳地在超声提取机中进行。所述的提取时，所述的新鲜的或干燥的红豆杉枝叶原料与所述水溶液的质量比较佳地为(1： 5)～(1：10)。所述的提取的次数较佳地一般为2次，每次提取的时间较佳地为2～3小时。一般来说，经过一次提取后，10-DAB III的得率较佳地为 85％～90％；经过两次提取后，10-DAB III的总得率较佳地为98％以上；所述的百分比为质量百分比。
步骤(1)中，所述的新鲜的或干燥的红豆杉枝叶原料较佳地由新鲜的或干燥的红豆杉枝叶经过预处理得到。其中，所述的预处理较佳地为：将新鲜的或干燥的红豆杉枝叶粉碎为长度≤1cm的小段，更佳地为粉碎为长度≤0.1cm的粉末。所述的粉碎的设备较佳地为豆浆机或粉碎机。
步骤(1)中，10-DAB III含量和紫杉醇含量满足步骤(1)的要求的红豆杉品种较佳地由下述种植方法获得：将红豆杉按本领域常规人工种植方法种植和施肥，其中，所述的施肥的肥料中含有0.1～10％的5-ALA，所述百分比为5-ALA占肥料总量的质量百分比。
其中，所述的红豆杉的本领域常规人工种植方法包括如下步骤：先将农田整理，然后将红豆杉种植，进行施肥即可。
其中，农田整理：将农田在秋季深翻20～40cm，翌春浅翻细耙，在整理同时施入腐熟的基肥30t/hm2～45t/hm2，同时将防治病虫害药剂均匀翻耕入土；农田平整后作苗床，床面宽1.0～1.2m，高20～25cm，要求中沟深度10～20cm，边沟深度20～40cm；
种植：取红豆杉的苗，在1～4月份期间，按照每亩800～1000株的密度种植，在栽植当年的4～9月，每月锄草抚育1～2次，1年抚育5～7次；其中，当红豆杉种植≥2年，第2年抚育4～5次，第3年抚育3～4次；锄草中不锄伤幼树的树根，锄草时结合清沟和培土，雨季田间排水，使雨水通畅排出；
施肥管理：当红豆杉种植≥2年，在栽植的第2年开始，每年的3月和/ 或8月施1～2次肥，每株沟施30～50g的肥料。
其中，所述的红豆杉的种类为本领域常规，一般有中国南方红豆杉(TaxusChinensis var.Mairei)，中国红豆杉(Taxus Chinensis)，东北红豆杉(TaxusCuspidata)，云南红豆杉(Taxus Yunnanensis)，西藏红豆杉(Taxus Wallichiana)，欧洲浆果红豆杉(Taxus Baccata)，短叶红豆杉(Taxus Brevifolia)，加拿大红豆杉(TaxusCanadensis)，佛罗里达红豆杉(Taxus Floridana)，曼地亚红豆杉(Taxus Media,T.speciosa,T.fastigiata)，矮紫杉(Taxus Cuspidata var. nana)，或者欧洲黄叶红豆杉(Taxus Baccata cv stricta)(或又名Taxus baccata var.fructu)，较佳地为中国南方红豆杉(Taxus Chinensis var.Mairei)、中国红豆杉(Taxus Chinensis)、东北红豆杉(TaxusCuspidata)、云南红豆杉(Taxus Yunnanensis)和西藏红豆杉(Taxus wallichiana)，更佳地为中国南方红豆杉 (Taxus Chinensis var.Mairei)。
步骤(2)中，所述的陶瓷膜的膜芯平均孔径较佳地为小于100nm，更佳地为50nm。
步骤(2)中，所述的陶瓷膜的浓缩倍率较佳地为5～20倍，更佳地为10 倍。
步骤(2)中，所述的纳滤膜的平均孔径较佳地为不大于2nm。
步骤(2)中，所述的纳滤膜的浓缩倍率较佳地为1～10倍，更佳地为5 倍。
上述步骤(2)中涉及的陶瓷膜和纳滤膜的具体工作条件如工作管道压力、温度等均随具体厂家的设备型号设置决定，只要满足前述条件即能滤除分子量大于50万道尔顿的杂质，以及滤除分子量小于200道尔顿的小分子的设备均可使用。
步骤(3)中，所述的反相大孔吸附树脂较佳地为D101大孔吸附树脂、 D101-1大孔吸附树脂、YPR-II大孔吸附树脂、CAD-40大孔吸附树脂、CAD-45 大孔吸附树脂、D1300大孔吸附树脂、X-5大孔吸附树脂、AB-8大孔吸附树脂、H103大孔吸附树脂、D204大孔吸附树脂和DM11大孔吸附树脂中的一种或多种，更佳地为D101大孔吸附树脂。
其中，所述的D101大孔吸附树脂的处理能力较佳地为：每千克D101 大孔吸附树脂吸附2～3倍柱体积的待处理液。
步骤(3)中，所述的梯度洗脱的流动相较佳地为浓度为20％～95％的甲醇水溶液或乙醇水溶液，更佳地为浓度依次为30％、40％、50％、60％和90％的甲醇水溶液或乙醇水溶液；所述百分比为质量百分比。其中，所述的浓度为30％的甲醇水溶液或乙醇水溶液的淋洗用量较佳地为2倍柱体积。所述的浓度为40％的甲醇水溶液或乙醇水溶液的淋洗用量较佳地为3倍柱体积。所述的浓度为50％的甲醇水溶液或乙醇水溶液的淋洗用量较佳地为3倍柱体积。所述的浓度为60％的甲醇水溶液或乙醇水溶液的淋洗用量较佳地为3倍柱体积。所述的浓度为90％的甲醇水溶液或乙醇水溶液的淋洗用量较佳地为3倍柱体积。
其中，所述的浓度为20％～95％的甲醇水溶液或乙醇水溶液中较佳地还包括5-ALA。其中，所述的5-ALA占所述的浓度为20％～95％的甲醇水溶液或乙醇水溶液的浓度较佳地为10～500ppm，更佳地为50～500ppm，进一步更佳地为100ppm。
步骤(3)中，所述的梯度洗脱后，较佳地，还用浓度为30％的甲醇水溶液或乙醇水溶液进行平衡；平衡溶剂的用量较佳地为2倍柱体积。
步骤(3)中，所述的10-DAB III层析液段和所述紫杉醇层析液段较佳地通过薄层色谱法确定。
步骤(3)中，所述的10-DAB III层析液段的后处理较佳地包括如下步骤：浓缩，调节溶剂配比，冷却结晶，抽滤，洗涤，烘干，即可。
其中，所述的浓缩较佳地在平均孔径不大于2nm的纳滤膜中进行，以截留分子量高于200道尔顿的化合物；所述纳滤膜的面积较佳地为200m2。所述的浓缩的浓缩倍率较佳地为5～20倍，更佳地为10倍。10-DAB III层析液段经过浓缩后，得到的10-DAB III浓缩液中甲醇或乙醇的浓度一般为50％，所述百分比为质量百分比。
其中，所述的调节溶剂配比较佳地包括如下步骤：向所述10-DAB III 浓缩液中加入纯化水，将其中的甲醇或乙醇浓度由50％调节为20％～35％，更佳地为调节至30％，所述百分比为质量百分比。
其中，所述的冷却结晶较佳地为冷却至-5℃～5℃；所述的冷却结晶的时间较佳地为12～48小时，更佳地为12小时。
其中，所述的洗涤的溶剂较佳地为浓度为30％的甲醇水溶液或乙醇水溶液；所述的洗涤的次数较佳地为2次。
步骤(3)中，所述的10-DAB III粗品的纯度较佳地一般为70％以上，所述百分比为质量百分比。
步骤(3)中，得到所述的10-DAB III粗品后，较佳地还按照本领域常规对所述10-DAB III粗品进行重结晶提纯，一般经过常规重结晶操作后，可得到纯度为99％以上的10-DAB III精品，所述百分比为质量百分比。。所述重结晶的溶剂较佳地为丙酮；所述的重结晶的次数较佳地为2～3次。
步骤(3)中，所述的紫杉醇层析液段的后处理较佳地包括如下步骤：浓缩，调节溶剂配比，冷却结晶，抽滤，烘干，即可。
其中，所述的浓缩较佳地在平均孔径不大于2nm的纳滤膜中进行，以截留分子量高于200道尔顿的化合物；所述纳滤膜的面积较佳地为100m2。所述的浓缩的浓缩倍率较佳地为5～20倍，更佳地为10倍。紫杉醇层析液段经过浓缩后，得到的紫杉醇浓缩液中甲醇或乙醇的浓度一般为60％，所述百分比为质量百分比。
其中，所述的调节溶剂配比较佳地为：向所述紫杉醇浓缩液中加入纯化水，将其中的甲醇或乙醇浓度由60％调节为30～45％，更佳地为调节至40％，所述百分比为质量百分比。
其中，所述的冷却结晶较佳地为冷却至-5℃～5℃；所述的冷却结晶的时间较佳地为12～48小时，更佳地为12小时。
步骤(3)中，所述的紫杉醇粗品的纯度一般较佳地为20％～25％，所述百分比为质量百分比。
步骤(3)中，得到所述的紫杉醇粗品后，较佳地还按照本领域常规对所述紫杉醇粗品进行层析分离提纯，可得到纯度为99.5％以上的紫杉醇精品，所述百分比为质量百分比。
本发明中，所述的浓缩倍率为原液的体积与残留液的体积之比。
本发明中，所述的ppm是指百万分之一，均是针对物质的质量而言的。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明所提供的提取方法特别适用于分离 10-DABIII含量高的红豆杉新品种，不仅提高了产品得率、减少了产品内的降解杂质、还大大节省了有机溶剂用量和水电汽费用，对环境影响小；该提取方法可以连续大规模地进行10-DABIII的提取、纯化等操作。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，涉及的原料的获取方法如下：
实施例1～8和对比实施例1中用到的红豆杉枝叶原料为新鲜的红豆杉枝叶经过预处理得到。其中，所述的预处理为：将新鲜的红豆杉枝叶经豆浆机粉碎为长度≤0.1cm的粉末；实施例8为用粉碎机粉碎为长度≤0.5cm的粉末。
其中，所述的新鲜的红豆杉枝叶中10-DAB III含量为3200ppm，紫杉醇含量为250ppm。满足该要求的红豆杉由下述种植方法获得：先将农田整理，然后将中国南方红豆杉(Taxus Chinensis var.Mairei)种植，进行施肥即可，其中，所述的施肥的肥料中含有0.1～10％的5-ALA，百分比为5-ALA占肥料总量的质量百分比。
其中，农田整理：将农田在秋季深翻20～40cm，翌春浅翻细耙，在整理同时施入腐熟的基肥30t/hm2～45t/hm2，同时将防治病虫害药剂均匀翻耕入土；农田平整后作苗床，床面宽1.0～1.2m，高20～25cm，要求中沟深度10～20cm，边沟深度20～40cm；
种植：取红豆杉的苗，在1～4月份期间，按照每亩800～1000株的密度种植，在栽植当年的4～9月，每月锄草抚育1～2次，1年抚育5～7次；其中，当红豆杉种植≥2年，第2年抚育4～5次，第3年抚育3～4次；锄草中不锄伤幼树的树根，锄草时结合清沟和培土，雨季田间排水，使雨水通畅排出；
施肥管理：当红豆杉种植≥2年，在栽植的第2年开始，每年的3月和/ 或8月施1～2次肥，每株沟施30～50g的肥料。
下述实施例中，涉及的设备的购买厂家、型号和具体参数如下：
除实施例8之外，其余实施例或对比实施例所用的超声提取机：购自山东济宁金百特生物机械有限公司，型号：实验型，容积10L。实施例8的超声提取机：型号TDCLSH-7/6400/14000，设备制造厂家为山东济宁金百特生物机械有限公司。
除实施例8之外，其余实施例或对比实施例所用的陶瓷膜：购自江苏久吾高科技股份有限公司，型号为陶瓷实验型，浓缩管道压力0.36～0.4Mpa，工作温度15～40℃，浓缩时间2小时。
实施例8中陶瓷膜的设备型号为JWCMF-52，设备厂家为江苏久吾高科技股份有限公司，膜芯平均孔径为50nm，陶瓷膜的有效工作面积为50m2，陶瓷膜浓缩时间为8～12小时，工作温度为30～45℃，工作管道内压力 0.36～0.4Mpa。
除实施例8之外，其余实施例或对比实施例所用的纳滤膜：购自江苏久吾高科技股份有限公司，设备型号为纳滤实验型，浓缩管道压力1～2MPa，工作温度15～40℃，浓缩时间2小时。
实施例8使用的纳滤膜分别为：①设备型号JWNF-300，设备厂家为江苏久吾高科技股份有限公司，纳滤膜的平均孔径为2nm，有效纳滤膜工作面积为300m2，纳滤膜的浓缩时间为6～8小时，工作温度为30～45℃，工作管道内压力1.0～1.2Mpa；②设备型号JWNF-200，设备厂家为江苏久吾高科技股份有限公司，纳滤膜的平均孔径为2nm，有效纳滤膜工作面积为200m2，纳滤膜的浓缩时间为6～8小时，工作温度为30～45℃，工作管道内压力 1.0～1.2Mpa；③设备型号JWNF-100，设备厂家为江苏久吾高科技股份有限公司，纳滤膜的平均孔径为2nm，有效纳滤膜工作面积为100m2，纳滤膜的浓缩时间为6～8小时，工作温度为30～45℃，工作管道内压力1.0～1.2Mpa。
除实施例8之外，其余实施例或对比实施例所用的D101大孔吸附树脂柱：柱子内径10cm，柱高1.2m，内填装2Kg的D101大孔吸附树脂。
实施例8的D101大孔吸附树脂柱的柱子内径1m，高度3m，内装经活化的D101大孔树脂1吨。
下述实施例中，如无特殊说明，所述百分比均为质量百分比。
实施例1 采用含10ppm的5-ALA的水溶液提取新鲜的红豆杉枝叶的实施例
本实施例中10-DAB III和紫杉醇的提取方法包括如下步骤：
(1)取1Kg新鲜的红豆杉枝叶原料，将该原料投入到超声提取机中，取0.05g5-ALA，溶解于5Kg30％甲醇水溶液中，搅拌均匀获得含10ppm的 5-ALA水溶液，加入至超声提取机；开启搅拌电机和超声板，超声提取2个小时后，放出提取液，砂芯漏斗抽滤后得到4.5Kg提取液，经HPLC检测， 4.5Kg提取液中10-DAB III含量为0.58mg/mL，紫杉醇含量为0.03mg/mL，10-DAB III一次提取得率为81.56％，紫杉醇一次提取得率为54％；
再取0.05g5-ALA，溶解于5Kg30％甲醇水溶液中，同样方法再提取一次，获得5Kg的提取液，HPLC检测后，10-DAB III含量为0.06mg/mL，紫杉醇含量为0.01mg/mL，10-DAB III第二次提取得率为9.375％，10-DAB III 合计总得率为90.94％；紫杉醇第二次提取得率为20％，紫杉醇合计总得率 74％。
(2)合并两次红豆杉提取液，共计9.5Kg，经实验型陶瓷膜浓缩后，30％甲醇水溶液1Kg/次膜洗3次后得到11.5Kg清液和1Kg的母液，1Kg母液丢弃。将11.5Kg的陶瓷膜清液经实验型纳滤膜浓缩，得到3Kg的纳滤膜浓缩液和8.5Kg的清液。HPLC检测3Kg的浓缩液，10-DABIII含量为0.92mg/mL，浓缩得率为94.84％，紫杉醇含量为0.06mg/mL，得率为97.30％。
实施例2 采用含100ppm的5-ALA的水溶液提取新鲜的红豆杉枝叶的实施例
本实施例中10-DAB III和紫杉醇的提取方法包括如下步骤：
(1)取1Kg新鲜的红豆杉枝叶原料，将该原料投入到超声提取机中，取0.5g5-ALA，溶解于5Kg30％甲醇水溶液中，搅拌均匀获得含100ppm的 5-ALA水溶液，加入至超声提取机；开启搅拌电机和超声板，超声提取2个小时后，放出提取液，砂芯漏斗抽滤后得到4.5Kg提取液，经HPLC检测， 4.5Kg提取液中10-DAB III含量为0.62mg/mL，紫杉醇含量为0.03mg/mL， 10-DAB III一次提取得率为87.19％，紫杉醇一次提取得率为54％；
再取0.5g5-ALA，溶解于5Kg30％甲醇水溶液中，同样方法再提取一次，获得5Kg的提取液，HPLC检测后，10-DAB III含量为0.07mg/mL，紫杉醇含量为0.01mg/mL，10-DAB III第二次提取得率为10.93％，10-DAB III合计总得率为98.12％；紫杉醇第二次提取得率为20％，紫杉醇合计总得率74％。
(2)合并两次红豆杉提取液，共计9.5Kg，经陶瓷膜浓缩后，30％甲醇水溶液1Kg/次膜洗3次后得到11.5Kg清液和1Kg的母液，1Kg母液丢弃。将11.5Kg的陶瓷膜清液经实验型纳滤膜浓缩，得到3Kg的纳滤膜浓缩液和 8.5Kg的清液；HPLC检测3Kg的浓缩液，10-DAB III含量为1.04mg/mL，浓缩得率为99.36％，紫杉醇含量为0.06mg/mL，得率为97.30％。
实施例3 采用含200ppm的5-ALA的水溶液提取新鲜的红豆杉枝叶的实施例
本实施例中10-DAB III和紫杉醇的提取方法包括如下步骤：
(1)取1Kg新鲜的红豆杉枝叶原料，将该原料投入到超声提取机中，取1g5-ALA，溶解于5Kg30％甲醇水溶液中，搅拌均匀获得含200ppm的 5-ALA水溶液，加入至超声提取机；开启搅拌电机和超声板，超声提取2个小时后，放出提取液，砂芯漏斗抽滤后得到4.5Kg提取液，经HPLC检测，4.5Kg提取液中10-DAB III含量为0.61mg/mL，紫杉醇含量为0.03mg/mL，10-DAB III一次提取得率为85.78％，紫杉醇一次提取得率为54％；
再取1g5-ALA，溶解于5Kg30％甲醇水溶液中，同样方法再提取一次，获得5Kg的提取液，HPLC检测后，10-DAB III含量为0.06mg/mL，紫杉醇含量为0.01mg/mL，10-DAB III第二次提取得率为9.38％，10-DAB III合计总得率为95.16％；紫杉醇第二次提取得率为20％，紫杉醇合计总得率74％。
(2)合并两次红豆杉提取液，共计9.5Kg，经陶瓷膜浓缩后，30％甲醇水溶液1Kg/次膜洗3次后得到11.5Kg清液和1Kg的母液，1Kg母液丢弃。将11.5Kg的陶瓷膜清液经实验型纳滤膜浓缩，得到3Kg的纳滤膜浓缩液和 8.5Kg的清液；HPLC检测3Kg的浓缩液，10-DAB III含量为0.98mg/mL，浓缩得率为96.55％，紫杉醇含量为0.06mg/mL，得率为97.30％。
实施例4 不添加5-ALA对提取液进行层析分离的实施例
本实施例中10-DAB III和紫杉醇的提取方法包括如下步骤：
取3Kg纳滤膜浓缩液(10-DAB III浓度为0.82mg/mL，紫杉醇浓度为 0.02mg/mL)，缓慢吸附在预先活化的D101大孔树脂柱中，吸附完成后，TLC 点板确认上柱液吸附完全，没有泄漏；分别调配30％甲醇水溶液20L，40％甲醇水溶液30L，50％甲醇水溶液30L，60％甲醇水溶液30L，90％甲醇水溶液30L，分别按顺序淋洗洗脱液，流速为100mL/min。TLC点板分段(展开剂＝乙酸乙酯：正己烷＝2：1，浓硫酸碳化法显色)，分别收集得到10-DAB III 层析液段35L，紫杉醇层析液段8L。纳滤膜浓缩后，分别得到0.5L的10-DAB III浓缩液(50％甲醇)和100mL紫杉醇浓缩液(60％甲醇)。HPLC检测后， 10-DAB III含量为3.93mg/mL，紫杉醇含量为0.48mg/mL，10-DAB III层析分离得率为79.88％，紫杉醇分离层析得率为80％。
将500mL含甲醇50％的10-DAB III浓缩液加入333mL纯化水，配成含 30％甲醇的水溶液。冰箱中冷冻12小时，抽滤，少量30％甲醇水溶液淋洗3 次，烘干，得到固体2.05g，HPLC检测含量69.92％，结晶得率为72.94％。
将100mL含甲醇60％的紫杉醇浓缩液加入50mL纯化水，配成含40％甲醇的水溶液。冰箱中冷冻12小时，抽滤，少量40％甲醇水溶液淋洗3次，烘干，得到固体0.12g，HPLC检测含量23.33％，结晶得率为58.33％。
实施例5 添加10ppm的5-ALA对提取液进行层析分离的实施例
本实施例中10-DAB III和紫杉醇的提取方法包括如下步骤：
取3Kg的纳滤膜浓缩液(10-DAB III浓度为0.82mg/mL，紫杉醇浓度为 0.02mg/mL)，缓慢吸附在预先活化的D101大孔树脂柱中，吸附完成后，TLC 点板确认上柱液吸附完全，没有泄漏。分别调配30％甲醇水溶液20L(加入 0.2g5-ALA)，40％甲醇水溶液30L(加入0.3g5-ALA)，50％甲醇水溶液30L(加入0.3g5-ALA)，60％甲醇水溶液30L(加入0.3g5-ALA)，90％甲醇水溶液30 升(冲柱液，不需要5-ALA)，分别按顺序淋洗洗脱液，流速为100mL/min。TLC点板分段(展开剂＝乙酸乙酯：正己烷＝2：1，浓硫酸碳化法显色)，分别收集得到10-DABIII层析液段36L，紫杉醇层析液段8L。纳滤膜浓缩后，分别得到0.5L的10-DAB III浓缩液(50％甲醇)和100mL紫杉醇浓缩液(60％甲醇)。HPLC检测后，10-DAB III含量为4.15mg/mL，紫杉醇含量为 0.50mg/mL，10-DAB III层析分离得率为84.35％，紫杉醇分离层析得率为83.33％。
将500mL含甲醇50％的10-DAB III浓缩液加入333mL纯化水，配成含 30％甲醇的水溶液。冰箱中冷冻12小时，抽滤，少量30％甲醇水溶液淋洗3 次，烘干，得到固体2.23g，HPLC检测含量70.38％，结晶得率为75.64％。
将100mL含甲醇60％的紫杉醇浓缩液加入50mL纯化水，配成含40％甲醇的水溶液。冰箱中冷冻12小时，抽滤，少量40％甲醇水溶液淋洗3次，烘干，得到固体0.14g，HPLC检测含量22.17％，结晶得率为62.08％。
实施例6 添加100ppm的5-ALA对提取液进行层析分离的实施例
本实施例中10-DAB III和紫杉醇的提取方法包括如下步骤：
取3Kg的纳滤膜浓缩液(10-DAB III浓度为0.82mg/mL，紫杉醇浓度为 0.02mg/mL)，缓慢吸附在预先活化的D101大孔树脂柱中(柱子内劲10cm，柱高1.2m，内填装2Kg的D101大孔树脂)，吸附完成后，TLC点板确认上柱液吸附完全，没有泄漏。分别调配30％甲醇水溶液20L(加入2g5-ALA)， 40％甲醇水溶液30L(加入3g5-ALA)，50％甲醇水溶液30L(加入3g5-ALA)， 60％甲醇水溶液30L(加入3g5-ALA)，90％甲醇水溶液30L(冲柱液，不需要 5-ALA)，分别按顺序淋洗洗脱液，流速为100mL/min。TLC点板分段(展开剂＝乙酸乙酯：正己烷＝2：1，浓硫酸碳化法显色)，分别收集得到10-DAB III 层析液段34L，紫杉醇层析液段8L。纳滤膜浓缩后，分别得到0.5L的10-DAB III浓缩液(50％甲醇)和100mL紫杉醇浓缩液(60％甲醇)。HPLC检测后， 10-DAB III含量为4.68mg/mL，紫杉醇含量为0.48mg/mL，10-DAB III层析分离得率为95.12％，紫杉醇分离层析得率为80％。
将500mL含甲醇50％的10-DAB III浓缩液加入333mL纯化水，配成含 30％甲醇的水溶液。冰箱中冷冻12小时，抽滤，少量30％甲醇水溶液淋洗3 次，烘干，得到固体2.67g，HPLC检测含量72.40％，结晶得率为82.61％。
将100mL含甲醇60％的紫杉醇浓缩液加入50mL纯化水，配成含40％甲醇的水溶液。冰箱中冷冻12小时，抽滤，少量40％甲醇水溶液淋洗3次，烘干，得到固体0.14g，HPLC检测含量21.35％，结晶得率为62.27％。
实施例7 添加200ppm的5-ALA对提取液进行层析分离的实施例
本实施例中10-DAB III和紫杉醇的提取方法包括如下步骤：
取3Kg的纳滤膜浓缩液(10-DAB III浓度为0.82mg/mL，紫杉醇浓度为 0.02mg/mL)，缓慢吸附在预先活化的D101大孔树脂柱中(柱子内劲10cm，柱高1.2m，内填装2Kg的D101大孔树脂)，吸附完成后，TLC点板确认上柱液吸附完全，没有泄漏。分别调配30％甲醇水溶液20L(加入4g5-ALA)， 40％甲醇水溶液30L(加入6g5-ALA)，50％甲醇水溶液30L(加入6g5-ALA)， 60％甲醇水溶液30L(加入6g5-ALA)，90％甲醇水溶液30L(冲柱液，不需要5-ALA)，分别按顺序淋洗洗脱液，流速为100mL/min。TLC点板分段(展开剂＝乙酸乙酯：正己烷＝2：1，浓硫酸碳化法显色)，分别收集得到10-DAB III层析液段35L，紫杉醇层析液段8L。纳滤膜浓缩后，分别得到0.5L的 10-DAB III浓缩液(50％甲醇)和100mL紫杉醇浓缩液(60％甲醇)。HPLC检测后，10-DAB III含量为4.40mg/mL，紫杉醇含量为0.49mg/mL，10-DAB III层析分离得率为89.43％，紫杉醇分离层析得率为81.67％。
将500mL含甲醇50％的10-DAB III浓缩液加入333mL纯化水，配成含 30％甲醇的水溶液。冰箱中冷冻12小时，抽滤，少量30％甲醇水溶液淋洗3 次，烘干，得到固体2.35g，即为10-DAB III粗品，HPLC检测10-DAB III 的含量70.89％，结晶得率为75.72％。继续用丙酮对该10-DAB III粗品进行两次重结晶，得到纯度为99％的10-DAB III精品。
将100mL含甲醇60％的紫杉醇浓缩液加入50mL纯化水，配成含40％甲醇的水溶液。冰箱中冷冻12小时，抽滤，少量40％甲醇水溶液淋洗3次，烘干，得到固体0.15g，即为紫杉醇粗品，HPLC检测其中的紫杉醇含量为 24.40％，结晶得率为74.69％。继续对该紫杉醇粗品进行层析分离，得到纯度为99.5％的紫杉醇精品。
实施例8 工业化生产实施例
取5吨新鲜的红豆杉枝叶原料，粉碎机粉碎后，枝叶粒度为小于等于0.5cm的粉末。
按10吨/罐30％甲醇水溶液调配罐中，每次每罐加入1Kg的5-ALA，形成含5-ALA为100ppm浓度的30％甲醇水溶液。
超声提取机中，红豆杉投料速度设置为150Kg/小时，提取液流速设置为 1.8吨/小时，提取温度为30～40℃，提取工作压力为常压。开启机器，经超声逆流提取33.33小时后，第一次提取结束，获得55吨第一次红豆杉提取液 (第一次提取，红豆杉会吸附甲醇水溶液)。按相同方法进行第二次超声逆流提取，获得60吨第二次红豆杉提取液。经HPLC检测，第一次提取液10-DAB III含量为0.27mg/mL，第一次提取得率为84.86％，第一次提取液紫杉醇含量为0.016mg/mL，第一次提取得率为70.4％，第二次提取液10-DAB III含量为0.04mg/mL，第二次提取得率为13.71％，第二次提取液紫杉醇含量为 0.002mg/mL，第二次提取率为9.6％，10-DAB III的总提取得率为98.57％，紫杉醇的总提取得率为80％。
将第一次提取液55吨经陶瓷膜浓缩，经16小时浓缩，将55吨浓缩成2 吨母液和53吨清液，2吨母液分别3次加入2吨30％的甲醇水膜洗3次，合计获得59吨陶瓷膜清液和2吨陶瓷膜母液，2吨陶瓷膜母液泵入耙式干燥机回收甲醇，其他废水排入污水站处理。
将第二次提取液60吨经陶瓷膜浓缩，经16小时浓缩，将60吨浓缩成2 吨母液和58吨清液，2吨母液分别3次加入2吨30％的甲醇水膜洗3次，合计获得64吨陶瓷膜清液和2吨陶瓷膜母液，2吨陶瓷膜母液泵入耙式干燥机回收甲醇，其他废水排入污水站处理。
将以上第一次的59吨清液和第二次的64吨清液合并成123吨陶瓷膜清液，开启300m2的纳滤膜，经24小时浓缩，将123吨陶瓷膜清液浓缩成30 吨纳滤膜料液和93吨清液，其中93吨清液返回超声提取工段作为套用溶剂。经HPLC检测后，30吨纳滤膜料液的10-DABIII含量为0.569mg/mL，紫杉醇含量为0.033mg/mL，10-DAB III浓缩得率为99.00％，紫杉醇浓缩得率为 99.00％。
将以上30吨纳滤膜料液吸附于3根D101大孔树脂柱中，TLC检测确认上样液已完全吸附，没有泄漏。
分别调配30％甲醇水溶液12吨(加入1.2Kg5-ALA)，40％甲醇水溶液18 吨(加入1.8Kg5-ALA)，50％甲醇水溶液18吨(加入1.8Kg5-ALA)，60％甲醇水溶液18吨(加入1.8Kg5-ALA)，90％甲醇水溶液18吨(冲柱液，不需要 5-ALA)，分别按顺序淋洗洗脱液，流速为1L/min。TLC点板分段(展开剂＝乙酸乙酯：正己烷＝2：1，浓硫酸碳化法显色)，分别收集得到10-DAB III层析液段18吨，紫杉醇层析液段8吨。
将18吨的10-DAB III层析液段经200m2纳滤膜浓缩，得到1.5吨浓缩液和16.5吨清液，16.5吨清液直接回用作为层析洗脱液。经HPLC检测， 1.5吨浓缩液的10-DAB III含量为10.26mg/mL，层析分离得率为90.10％。
将8吨的紫杉醇层析液段经100m2纳滤膜浓缩，得到0.5吨浓缩液和7.5 吨清液，7.5吨清液直接回用作为层析洗脱液。经HPLC检测，0.5吨浓缩液的紫杉醇含量为1.72mg/mL，层析分离得率为86.87％。
分别用纳滤膜设备，将其他段的层析液浓缩，分别回收流动相。没用的纳滤膜母液经常用浓缩锅浓缩后回收甲醇，废水排入污水站。
将1.5吨的10-DAB III浓缩液(含50％甲醇)泵入3000L搪瓷反应釜中，加入1吨纯化水，配成30％甲醇水溶液合计2.5吨，夹套通入-5℃冷冻盐水 12小时后，抽滤，再分别用30L的30％甲醇水洗涤3次，烘干得到18.25Kg 黄白色固体，HPLC检测10-DAB III含量为71.35％，结晶得率为84.61％。
将0.5吨的紫杉醇浓缩液(含60％甲醇)泵入1000L搪瓷反应釜中，加入 250Kg纯化水，配成40％甲醇水溶液合计750Kg，夹套通入-5℃冷冻盐水12 小时后，抽滤，再分别用5L的40％甲醇水洗涤3次，烘干得到3.31Kg的黄色固体，HPLC检测紫杉醇含量为21.61％，结晶得率为83.17％。
实施例9
本实施例的提取方法中涉及的溶剂、步骤和工艺条件均同实施例1，不同之处在于：原料为新鲜的红豆杉枝叶原料，其10-DAB III含量为1500ppm，紫杉醇含量为200ppm；步骤(1)中所述水溶液中5-ALA的浓度为500ppm；步骤(3)中，所述的反相大孔吸附树脂为YPR-II大孔吸附树脂。
实施例10
本实施例的提取方法中涉及的溶剂、步骤和工艺条件均同实施例1，不同之处在于：原料为干燥的红豆杉枝叶原料，其10-DAB III含量为5000ppm，紫杉醇含量为300ppm；步骤(1)中所述水溶液中5-ALA的浓度为50ppm；步骤(3)中，所述的反相大孔吸附树脂为AB-8大孔吸附树脂。
对比实施例1
本对比实施例的原料、提取步骤同实施例1，不同之处在于，提取过程时不添加5-ALA。
本对比实施例中10-DAB III和紫杉醇的分离方法包括如下步骤：
(1)取1Kg新鲜的红豆杉枝叶原料，将该原料投入到超声提取机中，取5Kg30％甲醇水溶液(不加5-ALA)，加入至超声提取机；开启搅拌电机和超声板，超声提取2小时后，放出提取液；用砂芯漏斗抽滤后得到4.5Kg提取液，经HPLC检测，4.5Kg提取液中10-DAB III含量为0.54mg/mL，紫杉醇含量为0.03mg/mL，10-DAB III一次提取得率为75.94％，紫杉醇一次提取得率为54％；
再加入5Kg30％甲醇水溶液中，同样方法再提取一次，获得5Kg的提取液，HPLC检测后，10-DAB III含量为0.05mg/mL，紫杉醇含量为0.01mg/mL， 10-DAB III第二次提取得率为7.81％，10-DAB III合计总得率为83.75％；紫杉醇第二次提取得率为20％，紫杉醇合计总得率74％；提取后的废渣经纯甲醇提取后HPLC检测，残留10-DAB III含量为8ppm，残留紫杉醇含量为 60ppm。
(2)合并两次红豆杉提取液，共计9.5Kg，经陶瓷膜设备浓缩后，30％甲醇水溶液1Kg/次膜洗3次后得到11.5Kg清液和1Kg的母液，1Kg母液丢弃；将11.5Kg的陶瓷膜清液经纳滤膜设备浓缩，得到3Kg的纳滤膜浓缩液和8.5Kg的清液。HPLC检测3Kg的浓缩液，10-DABIII含量为0.78mg/mL，浓缩得率为87.31％，紫杉醇含量为0.06mg/mL，得率为97.30％。
比较对比实施例1和实施例1～3的数据，可以看出，由于对比实施例1 的提取过程中未加入5-ALA，即使仍然使用陶瓷膜和纳滤膜来过滤浓缩，得到的浓缩液中10-DAB III的得率仅为87.31％。而实施例1～3、实施例8中，采用陶瓷膜和纳滤膜过滤后，浓缩液中10-DAB III的得率分别为94.84％、 99.36％、96.55％和99.0％。按照本领域常规要求，一般来说，只有当10-DAB III的提取得率在95％以上，才表明提取过程比较成功，10-DAB III的降解现象微弱；进一步地，如果10-DAB III的提取得率超过98％，则说明10-DAB III基本上无降解。反之，如果10-DAB III的提取得率低于90％，则说明 10-DAB III降解严重，提取过程非常失败；可见，对比实施例1的提取结果属于非常失败的范畴。
发明人进一步采用CN200710178672.1公开的提取方法来提取10-DAB III含量为3200ppm，紫杉醇含量为250ppm的新鲜的红豆杉枝叶原料，发现提取得率仅为92％，也就是说10-DAB III在提取过程中会发生一定程度的降解。
Claims (52)
1.一种红豆杉中10-DAB III和/或紫杉醇的提取方法；所述的提取方法包括如下步骤：
(1)用30％甲醇水溶液超声提取新鲜的或干燥的红豆杉枝叶原料，得提取液；所述水溶液中包括浓度为10～200ppm的5-ALA；新鲜的红豆杉枝叶原料中10-DAB III含量≥1500ppm，紫杉醇含量≥200ppm；干燥的红豆杉枝叶中10-DAB III含量≥5000ppm，紫杉醇含量≥300ppm；所述百分比为质量百分比；
(2)采用膜芯平均孔径为50nm的陶瓷膜过滤所述提取液，以滤除分子量大于50万道尔顿的杂质，再用平均孔径为2nm的纳滤膜过滤，以滤除分子量小于200道尔顿的小分子；
(3)采用D101大孔吸附树脂、YPR-II大孔吸附树脂和AB-8大孔吸附树脂中的一种吸附，并梯度洗脱，得到10-DAB III层析液段和/或紫杉醇层析液段，再经后处理，得到10-DABIII粗品和/或紫杉醇粗品；所述的梯度洗脱的流动相为浓度依次为30％、40％、50％、60％和90％的甲醇水溶液，所述百分比为质量百分比。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的水溶液中包括浓度为50～200ppm的5-ALA。
3.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的水溶液中包括浓度为100～200ppm的5-ALA。
4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的水溶液中还含有柠檬酸和/或冰醋酸。
5.如权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述的柠檬酸和/或冰醋酸占所述水溶液的0.1％～2％，所述百分比为质量百分比。
6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的提取为超声逆流提取或超声抽提；和/或，所述的提取时，所述的新鲜的或干燥的红豆杉枝叶原料与所述水溶液的质量比为(1：5)～(1：10)；和/或，所述的提取的次数为2次，每次提取的时间为2～3小时。
7.如权利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述的超声逆流提取在超声提取机中进行。
8.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的新鲜的或干燥的红豆杉枝叶原料由新鲜的或干燥的红豆杉枝叶经过预处理得到；
和/或，步骤(1)中，10-DAB III含量和紫杉醇含量满足步骤(1)的要求的红豆杉品种由下述种植方法获得：先将农田整理，然后将红豆杉种植，进行施肥即可；其中，所述的施肥的肥料中含有0.1～10％的5-ALA，所述百分比为5-ALA占肥料总量的质量百分比。
9.如权利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述的预处理为：将新鲜的或干燥的红豆杉枝叶粉碎为长度≤1cm的小段。
10.如权利要求9所述的提取方法，其特征在于，所述的预处理为：将新鲜的或干燥的红豆杉枝叶粉碎为长度≤0.1cm的粉末。
11.如权利要求9或10所述的提取方法，其特征在于，所述的粉碎的设备为豆浆机或粉碎机。
12.如权利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述的农田整理为：将农田在秋季深翻20～40cm，翌春浅翻细耙，在整理同时施入腐熟的基肥30t/hm2～45t/hm2，同时将防治病虫害药剂均匀翻耕入土；农田平整后作苗床，床面宽1.0～1.2m，高20～25cm，要求中沟深度10～20cm，边沟深度20～40cm；
所述的种植为：取红豆杉的苗，在1～4月份期间，按照每亩800～1000株的密度种植，在栽植当年的4～9月，每月锄草抚育1～2次，1年抚育5～7次；其中，当红豆杉种植≥2年，第2年抚育4～5次，第3年抚育3～4次；锄草中不锄伤幼树的树根，锄草时结合清沟和培土，雨季田间排水，使雨水通畅排出；
所述的施肥为：当红豆杉种植≥2年，在栽植的第2年开始，每年的3月和/或8月施1～2次肥，每株沟施30～50g的肥料；
所述的红豆杉的种类为中国南方红豆杉(Taxus Chinensis var.Mairei)。
13.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的陶瓷膜的浓缩倍率为5～20倍；和/或，所述的纳滤膜的浓缩倍率为1～10倍。
14.如权利要求13所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的陶瓷膜的浓缩倍率为10倍。
15.如权利要求13所述的提取方法，其特征在于，所述的纳滤膜的浓缩倍率为5倍。
16.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的梯度洗脱后，还用浓度为30％的甲醇水溶液进行平衡；
和/或，步骤(3)中，所述的10-DAB III层析液段和所述紫杉醇层析液段通过薄层色谱法确定。
17.如权利要求16所述的提取方法，其特征在于，所述的D101大孔吸附树脂的处理能力为：每千克D101大孔吸附树脂吸附2～3倍柱体积的待处理液。
18.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的浓度为30％的甲醇水溶液的淋洗用量为2倍柱体积。
19.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的浓度为40％的甲醇水溶液的淋洗用量为3倍柱体积。
20.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的浓度为50％的甲醇水溶液的淋洗用量为3倍柱体积。
21.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的浓度为60％的甲醇水溶液的淋洗用量为3倍柱体积。
22.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的浓度为90％的甲醇水溶液的淋洗用量为3倍柱体积。
23.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的甲醇水溶液中还包括5-ALA。
24.如权利要求23所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的5-ALA占所述的甲醇水溶液的浓度为10～200ppm。
25.如权利要求23所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的5-ALA占所述的甲醇水溶液的浓度为50～200ppm。
26.如权利要求23所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的5-ALA占所述的甲醇水溶液的浓度为100ppm。
27.如权利要求16所述的提取方法，其特征在于，所述的梯度洗脱后，还用浓度为30％的甲醇水溶液进行平衡，平衡溶剂的用量为2倍柱体积。
28.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的10-DAB III层析液段的后处理包括如下步骤：浓缩，调节溶剂配比，冷却结晶，抽滤，洗涤，烘干，即可；
步骤(3)中，得到所述的10-DAB III粗品后，还对所述10-DAB III粗品进行重结晶。
29.如权利要求28所述的提取方法，其特征在于，所述的浓缩在平均孔径为2nm的纳滤膜中进行，以截留分子量高于200道尔顿的化合物。
30.如权利要求29所述的提取方法，其特征在于，所述纳滤膜的面积为200m2。
31.如权利要求28所述的提取方法，其特征在于，所述的浓缩的浓缩倍率为5～20倍。
32.如权利要求28所述的提取方法，其特征在于，所述的浓缩的浓缩倍率为10倍。
33.如权利要求28所述的提取方法，其特征在于，所述的调节溶剂配比包括如下步骤：向所述10-DAB III浓缩液中加入纯化水，将其中的甲醇浓度调节为20％～35％，所述百分比为质量百分比。
34.如权利要求28所述的提取方法，其特征在于，所述的调节溶剂配比包括如下步骤：向所述10-DAB III浓缩液中加入纯化水，将其中的甲醇浓度调节为30％，所述百分比为质量百分比。
35.如权利要求28所述的提取方法，其特征在于，所述的冷却结晶为冷却至-5℃°～5℃。
36.如权利要求28所述的提取方法，其特征在于，所述的冷却结晶的时间为12～48小时。
37.如权利要求28所述的提取方法，其特征在于，所述的冷却结晶的时间为12小时。
38.如权利要求28所述的提取方法，其特征在于，所述的洗涤的溶剂为浓度为30％的甲醇水溶液或乙醇水溶液，所述百分比为质量百分比。
39.如权利要求28所述的提取方法，其特征在于，所述的洗涤的次数为2次。
40.如权利要求28所述的提取方法，其特征在于，所述重结晶的溶剂为丙酮。
41.如权利要求28所述的提取方法，其特征在于，所述的重结晶的次数为2～3次。
42.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的紫杉醇层析液段的后处理包括如下步骤：浓缩，调节溶剂配比，冷却结晶，抽滤，烘干，即可。
43.如权利要求42所述的提取方法，其特征在于，所述的浓缩在平均孔径为2nm的纳滤膜中进行，以截留分子量高于200道尔顿的化合物。
44.如权利要求43所述的提取方法，其特征在于，所述纳滤膜的面积为100m2。
45.如权利要求42所述的提取方法，其特征在于，所述的浓缩的浓缩倍率为5～20倍。
46.如权利要求42所述的提取方法，其特征在于，所述的浓缩的浓缩倍率为10倍。
47.如权利要求42所述的提取方法，其特征在于，所述的调节溶剂配比为：向所述紫杉醇浓缩液中加入纯化水，将其中的甲醇浓度调节为30～45％，所述百分比为质量百分比。
48.如权利要求42所述的提取方法，其特征在于，所述的调节溶剂配比为：向所述紫杉醇浓缩液中加入纯化水，将其中的甲醇浓度调节为40％，所述百分比为质量百分比。
49.如权利要求42所述的提取方法，其特征在于，所述的冷却结晶为冷却至-5℃～5℃。
50.如权利要求42所述的提取方法，其特征在于，所述的冷却结晶的时间为12～48小时。
51.如权利要求42所述的提取方法，其特征在于，所述的冷却结晶的时间为12小时。
52.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，得到所述的紫杉醇粗品后，还对所述紫杉醇粗品进行层析分离提纯。
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