CN105237614A - 一种从藻类中提取生物活性物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及藻类深加工领域，公开了一种从藻类中提取生物活性物质的方法，该方法包括：1)对藻类样品进行破壁提取以使藻胆蛋白溶出，固液分离后得到粗提液；2)将粗提液与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为15-25重量％，固液分离取液相；3)选择性地将步骤2)固液分离得到的液相与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为30-55重量％，固液分离并收集沉淀；4)将步骤2)或步骤3)固液分离得到的液相与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为58-65重量％，固液分离并收集沉淀。本发明的方法还可以包括提取多糖的步骤。本发明能够高效地从藻类中提取生物活性物质。

Description

一种从藻类中提取生物活性物质的方法

技术领域

本发明涉及一种从藻类中提取生物活性物质的方法，具体地，涉及一种从藻类中提取藻胆蛋白和/或多糖的方法。

背景技术

藻类不仅可以作为食品，还与医学和农业都有很密切的关系。以葛仙米(Nostocsphaeroidskütz)为例，葛仙米是生于水稻田中的一种可食性蓝藻，属于蓝藻门(Cyanophyta)蓝藻纲(Cyanophyceae)念珠藻科(Nostocaceae)中念珠藻属(Nostoc)植物，又称天仙菜、天仙米，也有称水木耳，是一种淡水蓝藻，是我国传统珍贵的野生食药两用的藻类。我国的主要分布地是湖北鹤峰县走马坪镇。葛仙米具有：明目益气、治夜盲症、久食延年、解热清膈、利肠胃、痰火能疗和消除疲劳等功效。葛仙米备受民间推崇，但是还缺乏现代的科学依据。迄今为止，人们对葛仙米的功效成分的化学本质、理化特性、功能性质还缺乏研究。

虽然，目前也偶见有关于单一提取某种生物活性成分的报道，但未见同时提取多种生物活性成分的报道，特别是对于葛仙米，由于世界上葛仙米的分布十分稀少，产量也有限，开发高效地从藻类中提取(多种)生物活性物质的方法以为生化本质研究提供基础具有很重要的意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够高效地从藻类中提取生物活性物质(藻胆蛋白和/或多糖)的方法。

本发明的发明人发现，采用不同浓度的无机盐溶液进行盐析，能够显著提高藻胆蛋白的纯度。因此，为了实现上述目的，本发明提供了一种从藻类中提取生物活性物质的方法，该方法包括以下步骤：

(1)对藻类样品进行破壁提取以使藻胆蛋白溶出，固液分离后分别得到粗提液和固体残渣；

(2)将粗提液与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为15-25重量％，固液分离取液相；

(3)选择性地将步骤(2)固液分离得到的液相与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为30-55重量％，固液分离并收集沉淀；

(4)将步骤(2)或步骤(3)固液分离得到的液相与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为58-65重量％，固液分离并收集沉淀。

本发明的发明人进一步发现，提取藻胆蛋白后的固体残渣中含有较高量的多糖，且通过使用蛋白酶和采用特定的水提方式能够在水和醇用量较低的前提下更有效地从固体残渣(和/或藻类样品)中提取多糖。因此，在本发明优选的实施方式中，所述从藻类中提取生物活性物质的方法还包括上述提取藻胆蛋白步骤以外的提取多糖的步骤：

(I)将藻类样品(和/或固体残渣)依次与碱液和蛋白酶进行混合，以使藻类样品中的多糖溶出且蛋白质发生水解；

(II)往体系中补加水进行水提，固液分离，其中，水的补加量使得藻类样品与水提体系的重量比为1：20-100；水提的方式为：补加水后在80-110℃的温度下提取1-3h，重复2-5次；

(III)将步骤(II)固液分离获得的液相浓缩后进行醇沉，醇沉所使用的乙醇在醇沉体系中的含量为28-60重量％。

通过上述技术方案，本发明能够高效地从藻类中提取生物活性物质(藻胆蛋白和/或多糖)，收率和纯度均较高。而且，在本发明的上述优选实施方式中，本发明能够在一批藻类原料中同时获得藻胆蛋白和多糖两种生物活性物质，在保证收率的前提下节省了原料。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明实施例1获得的藻胆蛋白产品的紫外可见扫描分析图；

图2是本发明实施例1获得的多糖样品的红外光谱图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，涉及的藻类样品和固体残渣等的重量均按干重(115℃下干燥至恒重时的重量)计；涉及的液体的体积均为在25℃下测得的体积。

本发明提供了一种从藻类中提取生物活性物质的方法，所述生物活性物质为藻胆蛋白和/或多糖，该方法包括以下步骤：

(1)对藻类样品进行破壁提取以使藻胆蛋白溶出，固液分离后分别得到粗提液和固体残渣；

(2)将粗提液与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为15-25重量％，固液分离取液相(弃固相)；

(3)选择性地将步骤(2)固液分离得到的液相与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为30-55重量％，固液分离并收集沉淀；

(4)将步骤(2)或步骤(3)固液分离得到的液相与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为58-65重量％，固液分离并收集沉淀。

本发明中，所述藻类可以为各种已知含有藻胆蛋白和/或多糖的藻类，例如，蓝藻(Cyanophyta)、红藻(Rhodophyta)、隐藻(Cryptophyta)和甲藻(Pyrrophyta)中的至少一种。优选情况下，所述藻类为选自色球藻属(Chroococcus)、微囊藻属(Microcystis)、颤藻属(Oscillatoria)、念珠藻属(Nostoc)和鱼腥藻属(Anabeana)组成的组中的蓝藻。更优选地，所述藻类为选自念珠藻属的藻类，最优选为葛仙米。

本发明中，所述藻类样品的粒径优选为100-300μm。可以通过干燥、破碎和过筛等步骤获得上述粒径的藻类样品。

本发明的步骤(1)中，可以采用常规的方式进行破壁提取，只要能够使藻胆蛋白从藻类的细胞内溶出即可。优选情况下，所述破壁提取包括依次进行缓冲液溶胀、冻融和在浸提缓冲液的存在下进行高速组织匀浆处理。

可以按照常规的方式进行缓冲液溶胀。所述缓冲液溶胀的方式可以为将藻类样品与pH5-8.5的磷酸缓冲液混合。相对于每克的藻类样品，所述磷酸缓冲液的用量可以为4-15mL。所述缓冲液溶胀的条件可以包括温度为4-15℃，直至充分膨胀为止。

可以按照常规的方式进行冻融。所述冻融的方式可以为：反复在-10℃至-80℃的条件下进行冷冻、解冻，反复的次数不少于两次(如2-4次)。

高速组织匀浆处理特别有利于藻类的细胞壁破裂，可以借助高速组织匀浆机进行。所述浸提缓冲液优选为0.04-0.1mol/L的pH5-8.5的缓冲液(如磷酸氢盐-有机酸缓冲液、磷酸氢盐-磷酸二氢盐缓冲液或磷酸二氢盐-氢氧化物缓冲液，其中，所述有机酸可以为柠檬酸；所述磷酸氢盐可以为磷酸氢二钠和/或磷酸氢二钾；所述磷酸二氢盐可以为磷酸二氢钠和/或磷酸二氢钾；所述氢氧化物可以为氢氧化钠和/或氢氧化钾)。相对于每克的藻类样品，所述浸提缓冲液的用量可以为20-50mL。所述高速组织匀浆处理的条件优选包括：温度为4-15℃，时间为3-5h。优选地，所述高速组织匀浆处理的方式为间歇式，以进一步防止藻胆蛋白活性不利地受到高温的影响。

本发明的步骤(1)可以重复进行，以更充分地使藻胆蛋白溶出。

本发明的步骤(2)-(4)中，对盐析的条件等没有特殊的限制，只要能够使粗提液中的蛋白质凝聚而从溶液中析出即可，例如，所述盐析的条件包括：温度为2-8℃，时间为6-15h(指每次盐析的时间)。对盐析使用的无机盐的种类没有特别的要求，可以为常规的用于盐析的无机盐，例如，可以为硫酸铵、硫酸钠和氯化钠中的至少一种。本领域技术人员能够理解的是：盐析时，所述无机盐可以以溶液的形式与待进行盐析的溶液混合。

本发明的步骤(3)中，收集沉淀的方式优选是反复多次进行盐析和固液分离，且无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度逐次加大5-15重量％。根据本发明更优选的实施方式，步骤(3)中反复进行盐析和固液分离的次数为2-5次(2、3、4或5次)。换句话说，在优选的实施方式中，盐析的方式为：将粗提液与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为15-25重量％，固液分离取液相；将得到的液相与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为30-65重量％，固液分离并收集沉淀，该操作(收集沉淀)反复多次(如3、4、5或6次)进行且无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度逐次加大5-15重量％且最后一次盐析时无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为58-65重量％。

本发明中，步骤(3)和/或步骤(4)中收集的沉淀即为含有藻胆蛋白的粗提取物。为了进一步纯化藻胆蛋白，根据本发明的优选实施方式，本发明的方法还包括：将步骤(3)和/或步骤(4)中收集的沉淀进行透析，得到藻胆蛋白透析液。透析可以使用透析袋(截留分子量约为3000-4000)进行。透析的条件可以为常规的藻胆蛋白透析条件。还可以进一步将获得的藻胆蛋白透析液进行干燥(如冷冻干燥)，从而获得藻胆蛋白产品。

本发明中，由于藻胆蛋白是光敏感性蛋白，为防止其分解，上述提取步骤优选在避光条件下实施。

藻类(特别是葛仙米)多糖具有较强的增强免疫力和抗肿瘤的作用。本发明中，为了获得另一种生物活性成分——多糖，本发明的方法优选还包括提取步骤(1)固液分离获得的固体残渣(和/或藻类样品)中的多糖。通过提取固体残渣(或者，固体残渣和藻类样品)中的多糖能够充分回收步骤(1)固液分离获得的固体残渣中的生物活性成分(即多糖)。提取多糖的方法优选包括以下步骤：

(a)将所述固体残渣(和/或藻类样品)依次与碱液和蛋白酶进行混合，以使固体残渣(和/或藻类样品)中的多糖溶出且蛋白质发生水解；

(b)往体系中补加水进行水提，固液分离；

(c)将步骤(b)固液分离获得的液相进行醇沉。

本发明的步骤(a)中，对所使用的碱液和蛋白酶的种类和用量没有特别的要求，例如，所述碱液可以为氢氧化钠和/或氢氧化钾的溶液。所述碱液的浓度可以为0.1-0.5mol/L。相对于每克的藻类样品，所述碱液的用量可以为20-40mL。所述蛋白酶可以为各种常规的能够水解蛋白质的酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶、米曲霉蛋白酶、黑曲霉蛋白酶、根霉蛋白酶或胃蛋白酶。优选地，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。相对于每克的藻类样品，所述蛋白酶的用量可以为10-4000酶活力单位(U)。其中，酶活力单位是指：25℃下，每分钟水解1μg蛋白质所需酶的量为1个酶活力单位。

本发明的步骤(a)中，与碱液混合的条件优选包括：温度为15-50℃，时间为1.5-10h。与蛋白酶混合的条件优选包括：pH值为1.5-8，温度为15-60℃(如35-55℃)，时间为2-15h(如4-15h)。

本发明的步骤(b)中，水提可以按照常规的方式进行。优选地，水提的条件包括：温度为80-110℃，时间为2-15h(总时间)。

根据本发明更优选的实施方式，水提的方式为：补加水后在80-110℃的温度下提取1-3h，重复2-5次(每次水提的时间为1-3h)。(每次补加水时)水的补加量使得固体残渣(和/或藻类样品)与水提体系的重量比优选为1：20-100(1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95或者上述任意两个数值之间的范围)。本发明的发明人发现，采用这种方式进行水提可以在减少水的补加量的前提下提高多糖的收率。

本发明的步骤(c)中，对醇沉的条件没有特别的限制。优选情况下，醇沉的条件包括：温度为4-20℃(如4-10℃)，时间为4-24h(如8-24h)。本发明的发明人发现本发明的方法中的醇沉可以在乙醇的量较低的情况下进行，因此，所使用的乙醇在醇沉体系中的含量优选为28-60重量％(如29重量％、33重量％、37重量％、41重量％、45重量％、49重量％、53重量％、57重量％、58重量％59重量％或者上述任意两个数值之间的范围)。醇沉前进行的浓缩可以采用常规的浓缩方式，例如，旋转浓缩。浓缩的温度可以为35-65℃。浓缩后的体积(醇沉前的体积)优选为浓缩前体积的1/5-1/3。

本发明中，对各个步骤涉及的固液分离的方式没有特别的要求，例如，可以为离心的方式，本领域技术人员能够进行选择，在此不再详述。

在本发明的优选实施方式中，从藻类中提取生物活性物质(藻胆蛋白和/或多糖)的方法包括以下步骤：

(1)使藻类样品依次进行缓冲液溶胀、冻融和在浸提缓冲液的存在下进行高速组织匀浆处理，以使藻胆蛋白溶出，固液分离后分别得到粗提液和固体残渣；

(2)将粗提液与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为15-25重量％，固液分离取液相(弃固相)；

(3)将步骤(2)固液分离得到的液相与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为30-65重量％，固液分离并收集沉淀，该操作反复多次进行且无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度逐次加大5-15重量％且最后一次盐析时无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为58-65重量％；

(4)将所述固体残渣(和/或藻类样品)依次与碱液和蛋白酶进行混合，以使固体残渣(和/或藻类样品)中的多糖溶出且蛋白质发生水解；

(5)往体系中补加水进行水提，固液分离，其中，水的补加量使得固体残渣(和/或藻类样品)与水提体系的重量比为1：20-100；水提的方式为：补加水后在80-110℃的温度下提取1-3h，重复2-5次；

(6)将步骤(5)固液分离获得的液相浓缩后进行醇沉，醇沉所使用的乙醇在醇沉体系中的含量为28-60重量％。

在该优选实施方式中，有些步骤的更优选实施方式如前所述，不再一一赘述。

如前所示，提取多糖的方法也适用于以不同批次的藻类样品作为原料，通过上述优选的提取条件，本发明的方法在提取藻类样品中的多糖时也能够提高提取效率。因此，本发明提供的从藻类中提取生物活性物质(多糖)的方法包括以下步骤(更优选的实施方式如前所述，不再逐一详述)：

(I)将藻类样品(如前所述)依次与碱液和蛋白酶进行混合，以使藻类样品中的多糖溶出且蛋白质发生水解，与碱液混合的条件优选包括：温度为15-50℃，时间为1.5-10h；与蛋白酶混合的条件优选包括：pH值为1.5-8，温度为15-60℃，时间为2-15h；

(II)往体系中补加水进行水提，固液分离，其中，水的补加量使得藻类样品与水提体系的重量比为1：20-100；水提的方式为：补加水后在80-110℃的温度下提取1-3h，重复2-5次；

(III)将步骤(II)固液分离获得的液相浓缩后进行醇沉，醇沉所使用的乙醇在醇沉体系中的含量为28-60重量％。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，葛仙米样品为新鲜葛仙米干燥、粉碎过100目筛获得，葛仙米取自湖北鹤峰的走马坪镇；浸提缓冲液为0.05mol/L的KH₂PO₄+0.05mol/L的K₂HPO₄的混合液；高速组织匀浆机购自瑞士，功率为500W；透析袋购自biosharp生物科技公司，截留分子量为3500；冷冻干燥的温度为-80℃；藻胆蛋白的收率＝藻胆蛋白产品的重量/葛仙米样品的重量×100％；木瓜蛋白酶购自武汉亚法生物技术有限公司，100U/mg；胃蛋白酶购自国药集团化学试剂有限公司，1200U/g；旋转浓缩的条件包括温度为55℃，浓缩至原体积的1/4；藻胆蛋白的纯度的测定方法为紫外可见光扫描法，计算公式为(葛仙米藻胆蛋白主要以藻蓝蛋白为主，因此以藻蓝蛋白纯度表征藻胆蛋白的纯度)；多糖的收率＝多糖的重量/葛仙米样品的重量×100％。

实施例1

(1)破壁提取：称取20g葛仙米样品，用pH7.3的磷酸缓冲液(0.02mol/L)200mL在4℃下溶胀，-20℃冷冻8h，25℃解冻，如此反复处理3次，加入400mL的浸提缓冲液，置于高速组织匀浆机中进行高速组织匀浆处理(转速为5000rpm，4℃处理4h)，4℃下10000r/min离心20min，取上清液。

(2)盐析：往上清液中添加硫酸铵(使得体系中硫酸铵的浓度为20重量％)，在4℃下沉淀8h，4℃下10000r/min离心20min，取上清液，弃沉淀，上清液继续用硫酸铵(控制体系中硫酸铵的浓度为30重量％)沉淀(4℃，8h)后，4℃下10000r/min离心20min，离心分别取上清液并收集沉淀，如此分别用硫酸铵(控制体系中硫酸铵的浓度依次为40重量％、50重量％和60重量％)反复沉淀上清液。

(3)透析：将步骤(2)中收集的沉淀加浸提缓冲液溶解后于0.05mol/L的pH7.3磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液中用透析袋进行透析，得藻胆蛋白透析液；透析液经冷冻干燥得藻胆蛋白产品1.5g(收率为7.5％)，在250-700nm下进行紫外可见扫描分析，结果见图1，由图1可以看出，在565nm和615nm分别具有藻蓝蛋白和藻红蛋白的特征吸收峰，说明得到藻胆蛋白产品中含有藻胆蛋白；进一步计算得到藻胆蛋白的纯度为71.5％。

(4)取步骤(1)离心后的固体残渣，以400mL的NaOH溶液(0.4mol/L)于40℃处理2h后，用盐酸中和至中性，再按1mg/100mg葛仙米的量加入木瓜蛋白酶，于40℃处理10h，接着补加蒸馏水(水的补加量使得固体残渣与水提体系的重量比为1：90)，于90℃水浴提取2小时，5000r/min离心20min，取上清液，沉淀进行二次提取，二次提取条件为：水的补加量使得固体残渣与水提体系的重量比为1：50，沸水提取1h，5000r/min离心20min，合并两次上清液，旋转浓缩，浓缩液用乙醇(乙醇在醇沉体系中的含量为60重量％)沉淀过夜(4℃，8h)，5000r/min离心20min，取沉淀，冷冻干燥得葛仙米粗多糖5g(收率为25％)。粗多糖产品采用溴化钾压片，用红外光谱仪(傅利叶变换红外光谱仪)在4000-500cm^-1区进行扫描，结果如图2所示，如图2所示，3421cm^-1的宽峰落在3200-3600，是糖类-OH的伸缩振动，存在分子间或者分子内氢键；2926cm^-1吸收峰落在2800-3000cm^-1区，是C-H伸缩振动，绝大多数有机化合物都有此吸收峰，葛仙米多糖在此处有吸收峰，说明符合糖类的一般结构特征；1616cm^-1和1419cm^-1吸收峰是羧酸盐离子中的羰基的伸缩振动，说明有羧酸的存在；1060cm^-1是吡喃环的醚键(C-O-C)伸缩振动。

实施例2

(1)破壁提取：称取20g葛仙米样品，用pH5的磷酸缓冲液(0.02mol/L)80mL在15℃下溶胀，-20℃冷冻8h，25℃解冻，如此反复处理3次，加入400mL的浸提缓冲液，置于高速组织匀浆机中进行高速组织匀浆处理(转速为5000rpm，15℃处理4h)，4℃下10000r/min离心20min，取上清液。

(2)盐析：往上清液中添加硫酸铵(使得体系中硫酸铵的浓度为15重量％)，在4℃下沉淀8h，4℃下10000r/min离心20min，取上清液，弃沉淀，上清液继续用硫酸铵(控制体系中硫酸铵的浓度为35重量％)沉淀(4℃，8h)后，4℃下10000r/min离心20min，离心分别取上清液并收集沉淀，如此分别用硫酸铵(控制体系中硫酸铵的浓度依次为40重量％、45重量％、55重量％和58重量％)反复沉淀上清液。

(3)透析：将步骤(2)中收集的沉淀加浸提缓冲液溶解后于0.05mol/L的pH7.3磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液中用透析袋进行透析，得藻胆蛋白透析液；透析液经冷冻干燥得藻胆蛋白产品1.51g(收率为7.55％)，在250-700nm下进行紫外可见扫描分析，结果显示，在565nm和615nm分别具有藻蓝蛋白和藻红蛋白的特征吸收峰，说明得到藻胆蛋白产品中含有藻胆蛋白；进一步计算得到藻胆蛋白的纯度为63.9％。

(4)取步骤(1)离心后的固体残渣，以400mL的NaOH溶液(0.5mol/L)于15℃处理10h后，用盐酸中和至pH2，再按1mg/100mg葛仙米的量加入胃蛋白酶，于37℃处理15h，接着补加蒸馏水(水的补加量使得固体残渣与水提体系的重量比为1：90)，于80℃水浴提取1.5小时，5000r/min离心20min，取上清液，沉淀进行二次提取，二次提取条件为：水的补加量使得固体残渣与水提体系的重量比为1：50，沸水提取2h，5000r/min离心20min，合并两次上清液，旋转浓缩，浓缩液用乙醇(乙醇在醇沉体系中的含量为28重量％)沉淀过夜(10℃，24h)，5000r/min离心20min，取沉淀，冷冻干燥得葛仙米粗多糖4.5g(收率为22.5％)。粗多糖产品采用溴化钾压片，用红外光谱仪(傅利叶变换红外光谱仪)在4000-500cm^-1区进行扫描，结果与实施例1相同。

实施例3

(1)破壁提取：称取20g葛仙米样品，用pH8.5的磷酸缓冲液(0.02mol/L)300mL在10℃下溶胀，-20℃冷冻8h，25℃解冻，如此反复处理3次，加入400mL的浸提缓冲液，置于高速组织匀浆机中进行高速组织匀浆处理(转速为5000rpm，10℃处理4h)，4℃下10000r/min离心20min，取上清液。

(2)盐析：往上清液中添加硫酸铵(使得体系中硫酸铵的浓度为25重量％)，在4℃下沉淀8h，4℃下10000r/min离心20min，取上清液，弃沉淀，上清液继续用硫酸铵(控制体系中硫酸铵的浓度为50重量％)沉淀(4℃，8h)后，4℃下10000r/min离心20min，离心分别取上清液并收集沉淀，如此分别用硫酸铵(控制体系中硫酸铵的浓度依次为55重量％和63重量％)反复沉淀上清液。

(3)透析：将步骤(2)中收集的沉淀加浸提缓冲液溶解后于0.05mol/L的pH7.3磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液中用透析袋进行透析，得藻胆蛋白透析液；透析液经冷冻干燥得藻胆蛋白产品1.48g(收率为7.4％)，在250-700nm下进行紫外可见扫描分析，结果显示，在565nm和615nm分别具有藻蓝蛋白和藻红蛋白的特征吸收峰，说明得到藻胆蛋白产品中含有藻胆蛋白；进一步计算得到藻胆蛋白的纯度为70％。

(4)取步骤(1)离心后的固体残渣，以400mL的NaOH溶液(0.1mol/L)于50℃处理1.5h后，用盐酸中和至中性，再按1mg/100mg葛仙米的量加入木瓜蛋白酶，于55℃处理5h，接着补加蒸馏水(水的补加量使得固体残渣与水提体系的重量比为1：80)，于110℃水浴提取3小时，5000r/min离心20min，取上清液，沉淀进行二次提取，二次提取条件为：水的补加量使得固体残渣与水提体系的重量比为1：50，沸水提取4h，5000r/min离心20min，合并两次上清液，旋转浓缩，浓缩液用乙醇(乙醇在醇沉体系中的含量为35重量％)沉淀过夜(4℃，16h)，5000r/min离心20min，取沉淀，冷冻干燥得葛仙米粗多糖4.9g(收率为24.5％)。粗多糖产品采用溴化钾压片，用红外光谱仪(傅利叶变换红外光谱仪)在4000-500cm^-1区进行扫描，结果与实施例1相同。

实施例4

按照实施例1的方法提取生物活性物质，不同的是，藻胆蛋白的浸提缓冲液采用0.02mol/L的pH8.1的Tris-HCl缓冲液；固体残渣用NaOH溶液浸泡的时间为1h，木瓜蛋白酶酶解的时间为1h。结果得到藻胆蛋白产品1.44g(收率为7.2％)，且计算得到藻胆蛋白的纯度为66％；得到葛仙米粗多糖3.1g(收率为15.5％)。

实施例5

按照实施例1步骤(4)记载的方法提取多糖，不同的是，步骤(4)中的固体残渣用20g葛仙米样品代替，结果得到葛仙米粗多糖5.3g(收率为26.5％)。

对比例1

按照实施例1的方法提取生物活性物质，不同的是，葛仙米样品不经破壁提取，固体残渣不经碱液和酶处理。结果得到藻胆蛋白产品0.6g(收率为3％)，且计算得到藻胆蛋白的纯度为48％；得到葛仙米粗多糖2.3g(收率为11.5％)。

对比例2

按照实施例1的方法提取生物活性物质，不同的是，只进行一次盐析且控制体系中硫酸铵的浓度为60重量％，盐析的时间为40h。结果得到藻胆蛋白产品1.56g(收率为7.8％)，且计算得到藻胆蛋白的纯度为38.6％。

对比例3

按照实施例1的方法提取生物活性物质，不同的是，固体残渣不经酶处理且水的补加量使得固体残渣与水提体系的重量比为1：120。结果得到葛仙米粗多糖5.05g(收率为25.25％)。

对比例4

按照实施例1的方法提取生物活性物质，不同的是，固体残渣不经酶处理且控制乙醇在醇沉体系中的含量为75重量％。结果得到葛仙米粗多糖4.95g(收率为24.75％)。

从以上结果可以看出，本发明的方法能够高效地从藻类中提取生物活性物质。另外，比较实施例1与对比例2可以看出，按照本发明记载的方式进行盐析能够极大地提高藻胆蛋白的纯度；比较实施例1与对比例3可以看出，本发明的多糖提取方式特别有利于降低用水量；比较实施例1与对比例4可以看出，本发明的多糖提取方式特别有利于降低乙醇用量。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种从藻类中提取生物活性物质的方法，所述生物活性物质为藻胆蛋白和/或多糖，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)对藻类样品进行破壁提取以使藻胆蛋白溶出，固液分离后分别得到粗提液和固体残渣，优选地，所述藻类样品的粒径为100-300μm；

(2)将粗提液与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为15-25重量％，固液分离取液相；

(3)选择性地将步骤(2)固液分离得到的液相与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为30-55重量％，固液分离并收集沉淀；

(4)将步骤(2)或步骤(3)固液分离得到的液相与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为58-65重量％，固液分离并收集沉淀。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述破壁提取包括依次进行缓冲液溶胀、冻融和在浸提缓冲液的存在下进行高速组织匀浆处理，所述浸提缓冲液为0.04-0.1mol/L的pH5-8.5的缓冲液，所述高速组织匀浆处理的条件包括：温度为4-15℃，时间为3-5h，优选地，所述高速组织匀浆处理的方式为间歇式。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)-(4)中，所述盐析的条件包括：温度为2-8℃，时间为6-15h。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中收集沉淀的方式是反复多次进行盐析和固液分离，且无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度逐次加大5-15重量％。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，所述方法还包括：提取步骤(1)固液分离获得的固体残渣和/或藻类样品中的多糖，提取多糖的方法包括以下步骤：

(a)将所述固体残渣和/或藻类样品依次与碱液和蛋白酶进行混合，以使固体残渣和/或藻类样品中的多糖溶出且蛋白质发生水解；

(b)往体系中补加水进行水提，固液分离；

(c)将步骤(b)固液分离获得的液相进行醇沉。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，与碱液混合的条件包括：温度为15-50℃，时间为1.5-10h；与蛋白酶混合的条件包括：pH值为1.5-8，温度为15-60℃，时间为2-15h。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，水提的条件包括：温度为80-110℃，时间为2-15h，水的补加量使得固体残渣和/或藻类样品与水提体系的重量比为1：20-100；优选地，水提的方式为：补加水后在80-110℃的温度下提取1-3h，重复2-5次。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，醇沉的条件包括：温度为4-20℃，时间为4-24h，所使用的乙醇在醇沉体系中的含量为28-60重量％。

9.一种从藻类中提取生物活性物质的方法，所述生物活性物质为藻胆蛋白和/或多糖，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)使藻类样品依次进行缓冲液溶胀、冻融和在浸提缓冲液的存在下进行高速组织匀浆处理，以使藻胆蛋白溶出，固液分离后分别得到粗提液和固体残渣；

(2)将粗提液与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为15-25重量％，固液分离取液相；

(3)将步骤(2)固液分离得到的液相与无机盐混合进行盐析，无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为30-65重量％，固液分离并收集沉淀，该操作反复多次进行且无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度逐次加大5-15重量％且最后一次盐析时无机盐的用量使得混合体系中无机盐的浓度为58-65重量％；

(4)将所述固体残渣和/或藻类样品依次与碱液和蛋白酶进行混合，以使固体残渣和/或藻类样品中的多糖溶出且蛋白质发生水解；

(5)往体系中补加水进行水提，固液分离，其中，水的补加量使得固体残渣和/或藻类样品与水提体系的重量比为1：20-100；水提的方式为：补加水后在80-110℃的温度下提取1-3h，重复2-5次；

(6)将步骤(5)固液分离获得的液相浓缩后进行醇沉，醇沉所使用的乙醇在醇沉体系中的含量为28-60重量％。

10.一种从藻类中提取生物活性物质的方法，所述生物活性物质为多糖，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(I)将藻类样品依次与碱液和蛋白酶进行混合，以使藻类样品中的多糖溶出且蛋白质发生水解，与碱液混合的条件优选包括：温度为15-50℃，时间为1.5-10h；与蛋白酶混合的条件优选包括：pH值为1.5-8，温度为15-60℃，时间为2-15h；

(II)往体系中补加水进行水提，固液分离，其中，水的补加量使得藻类样品与水提体系的重量比为1：20-100；水提的方式为：补加水后在80-110℃的温度下提取1-3h，重复2-5次；

(III)将步骤(II)固液分离获得的液相浓缩后进行醇沉，醇沉所使用的乙醇在醇沉体系中的含量为28-60重量％。