CN105237570A - 一类用于dna原位杂交荧光检测（fish）技术的生物试剂及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类癌症早期检测化合物及制备方法。该类化合物利用BODIPY类化合物高荧光量子效率的特点，有助于提高检测灵敏度和准确率。

Description

一类用于DNA原位杂交荧光检测（FISH）技术的生物试剂及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一类基于BODIPY化合物及FISH方法的癌症早期检测试剂及其制备方法和用途。该试剂可应用FISH方法在基因水平上对各类癌症进行准确判断，也可用于特定基因序列的识别。

背景技术

癌症是现在死亡率最高的疾病之一。癌症死亡率高的一个重要原因是早期诊断困难，如果能够实现癌症的早期诊断并及时手术摘除，癌症是可以治愈的；遗憾的是——约2/3的癌症患者发现时已经到了中晚期，肿瘤变大手术治疗困难，同时癌细胞可能已经发生转移。因此，癌症的早期筛检变得尤为重要。

荧光原位杂交法(Fluorescencein-situhybridization，FISH法)在生物医学领域得到了广泛应用。FISH方法利用了DNA分子链中核酸碱基序列的识别功能，并以荧光分子(基团)标记作为荧光探针，实现了DNA的高分辨和高灵敏检测。由于FISH方法基于基因序列(遗传密码)的识别，能够检测癌症基因的存在，为其早期诊断和预防提供依据。这一技术利用了DNA碱基的精确互补配对过程，因而对癌症基因的检出准确率较高。同时这项技术检出限低，1cc血液中只要有一颗癌细胞就能够检测出来。

二吡咯硼烷化合物BODIPY自1968年首次报道以来就受到广泛的关注。BODIPY与传统荧光化合物相比，具有吸收强，量子效率高，光谱窄，易于修饰，光谱范围可调等优点。正因为上述优点的存在，使得BODIPY类化合物能够广泛应用于环境和生物检测方面。基于这类染料的探针具有灵敏度高，检出限低，抗干扰强等优势。用BODIPY作为检测探针的信号输出端，利用BODIPY类染料高荧光量子效率的特点，可以大大提高检测极限；因其较窄的发射光谱，使得其荧光色纯度高，能够有效地降低干扰，提高准确度。

发明内容

本发明的目的在于提供一类用于癌症基因检测的FISH荧光化合物。

本发明的另一目的在于提供用于癌症基因检测的FISH荧光化合物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供一类能够用于DNA碱基标记的荧光化合物及其制备方法。

本发明的再一目的在于提供用于癌症基因检测的FISH荧光化合物的用途。

本发明提供了一种FISH荧光化合物，其具有如下通式II的结构。

其中，Fl为荧光分子部分，其结构为如下述通式III所示：

其中，X₁、X₂独立选自F、烷基、烷氧基；R₁、R₂、R₃、R₅、R₆、R₇独立的选自：H、烷基、-烷基-COO-烷基、-芳基-COO-烷基、-烷基-COO-芳基、-烷基-OCO-烷基、-芳基-OCO-烷基、-烷基-OCO-芳基、-CO-NH-烷基、-CO-NH-芳基、氨基、腈基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、杂环基、杂环烷基；

R独立选自亚烷基、-烷基-COO-烷基-、-芳基-COO-烷基-、-烷基-COO-芳基-、-烷基-CONH-烷基-、-烷基-CONH-芳基-、-芳基-CONH-烷基-、-芳基-CONH-芳基-、-烷基-CONH-芳烷基-、-芳烷基-CONH-烷基-、-芳烷基-CONH-芳烷基-、-芳基-、-芳烷基-、-杂芳基-、-杂芳烷基-、-杂环基-、-杂环烷基-。

上述X₁、X₂、R₁、R₂、R₃、R₅、R₆、R₇、R中定义的基团可以进一步被取代基取代，所述取代基可以为烷基、烷氧基、卤素、硝基等。

所述的烷基代表碳原子数为1-10，优选1-6的直链或支链烷基，例如，甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、叔丁基等。

所述的烯基代表碳原子数为2-10，优选2-6的直链或支链烯基，例如，乙烯、丙烯、丁烯等。

所述的炔基代表碳原子数为2-10，优选2-6的直链或支链炔基，例如，乙炔、丙炔、丁炔等。

所述的环烷基代表具有3-8个，优选3-6个环原子的碳环，例如环戊烷基、环己烷基或环庚烷基。

所述的芳基指具有6-20个碳原子的单环、多环芳族基团，代表性的芳基包括：苯基、萘基等。

所述的杂芳基指具有1-20个碳原子、至少1个，优选1-4个选自N、S、O杂原子的单环或多环杂芳族基团，代表性的杂芳基包括：吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噻唑基、吲哚基等。

所述的杂环基指具有1-20个碳原子、至少1个，优选1-4个选自N、S、O杂原子的饱和或不饱和的单环或多环杂环基团，如氮杂环基，氮、氧杂环基，代表性的杂环基包括：四氢吡咯基、四氢吡啶基、哌嗪基、吗啉基等。

所述氨基代表基团-NR¹ ₂，其中，R¹独立的选自H、烷基、芳基、杂芳基、杂环基。

根据本发明，优选的，R₁、R₂、R₃、R₅、R₆、R₇独立的选自：H、烷基、-烷基-COO-烷基、-芳基-COO-烷基、-烷基-OCO-烷基、-芳基-OCO-烷基、-CO-NH-烷基、-CO-NH-芳基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基。

根据本发明，优选的，R独立选自亚烷基、-烷基-COO-烷基-、-芳基-COO-烷基-、-烷基-COO-芳基-、-烷基-CONH-烷基-、-烷基-CONH-芳基-、-芳基-CONH-烷基-、-烷基-CONH-芳烷基-、-芳烷基-CONH-烷基-、-芳基-、-芳烷基-。

根据本发明，所述Fl优选为如下通式IIIa的结构。

本发明特别优选的式II化合物选自：

本发明还提供了一种通式II化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

其中，Fl、R如前面所述。

1)dUTP的汞化

将dUTP的水溶液与Hg(OAc)₂的水溶液混合，然后加热搅拌，之后冷却；将NaCl加入上述冷却后的溶液，生成白色沉淀，即得到产物dUTP-Hg；

2)由dUTP-Hg制备dUTPN

将步骤1)中得到的dUTP-Hg配成溶液；然后将所述dUTP-Hg溶液与烯丙胺溶液混合，得到dUTPN；

3)由dUTPN制备通式II化合物(即FISH试剂)

将通式I的荧光染料溶于有机溶剂，然后加入dUTPN的溶液，反应得到通式II化合物。

根据本发明，在步骤1)中，将混合溶液加热搅拌，之后停止加热继续搅拌，然后再倒入冰水中冷却。所述加热温度优选为50℃，加热搅拌的时间优选3小时。所述倒入冰水中冷却至0℃。

根据本发明，在步骤1)中，将最后得到的白色沉淀过滤收集，分别用NaCl溶液和水洗后，再用乙醇洗涤，然后真空干燥。

根据本发明，在步骤2)中，将步骤1)中得到的dUTP-Hg加入LiOAc/HOAc缓冲溶液中配成dUTP-Hg溶液，所述LiOAc/HOAc缓冲溶液的配制优选如下：将LiOAc·H₂O溶于水并加HOAc调节pH(优选的，调节pH＝5)，配成LiOAc/HOAc缓冲溶液体系；所述烯丙胺优选为重蒸后的烯丙胺(b.p.＝55℃)；所述烯丙胺溶液为烯丙胺的醋酸水溶液，烯丙胺的醋酸水溶液优选将重蒸后的烯丙胺与醋酸水溶液混合配成；所述反应温度优选为室温，反应时间优选16-24小时。

根据本发明，在步骤2)中，优选加入Li₂PdCl₄引发反应。

根据本发明，在步骤3)中，dUTPN溶液的配制是将dUTPN溶于NaB₂O₇缓冲溶液中，所述NaB₂O₇缓冲溶液优选pH＝8.5，浓度优选为0.1M，所述有机溶剂优选为DMF，所述反应时间优选为14-16小时。

根据本发明，在步骤3)中，将得到的通式II化合物用HPLC进行分离和纯化。优选的HPLC分离条件为——水：甲醇＝5：4，流速15mL/min。

本发明还提供一类用于DNA碱基标记的荧光化合物，其可以用于制备通式II化合物，该荧光化合物具有如下通式I的结构。

其中，Fl为荧光分子部分，其结构为如下述通式III所示：

其中，X₁、X₂独立选自F、烷基、烷氧基；R₁、R₂、R₃、R₅、R₆、R₇独立的选自：H、烷基、-烷基-COO-烷基、-芳基-COO-烷基、-烷基-COO-芳基、-烷基-OCO-烷基、-芳基-OCO-烷基、-烷基-OCO-芳基、-CO-NH-烷基、-CO-NH-芳基、氨基、腈基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、杂环基、杂环烷基；

R独立选自亚烷基、-烷基-COO-烷基-、-芳基-COO-烷基-、-烷基-COO-芳基-、-烷基-CONH-烷基-、-烷基-CONH-芳基-、-芳基-CONH-烷基-、-芳基-CONH-芳基-、-烷基-CONH-芳烷基-、-芳烷基-CONH-烷基-、-芳烷基-CONH-芳烷基-、-芳基-、-芳烷基-、-杂芳基-、-杂芳烷基-、-杂环基-、-杂环烷基-等。上述X₁、X₂、R中定义的基团可以进一步被取代基取代，所述取代基可以为烷基、烷氧基、卤素、硝基等。

根据本发明，优选的，R₁、R₂、R₃、R₅、R₆、R₇独立的选自：H、烷基、-烷基-COO-烷基、-芳基-COO-烷基、-烷基-OCO-烷基、-芳基-OCO-烷基、-CO-NH-烷基、-CO-NH-芳基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基。

根据本发明，优选的，R独立选自亚烷基、-烷基-COO-烷基-、-芳基-COO-烷基-、-烷基-COO-芳基-、-烷基-CONH-烷基-、-烷基-CONH-芳基-、-芳基-CONH-烷基-、-烷基-CONH-芳烷基-、-芳烷基-CONH-烷基-、-芳基-、-芳烷基-。

根据本发明，所述Fl优选为如下通式IIIa的结构。

本发明特别优选的式I化合物选自：

本发明还提供了一种通式I化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将式IV化合物溶于有机溶剂，加入脱水剂，在催化剂作用下与N-羟基琥珀酰亚胺进行脱水反应得到通式I化合物；

其中，Fl、R如上所述。

根据本发明，将上述方法中得到的通式I荧光染料通过色谱柱分离，得到纯化的通式I化合物。

根据本发明，在上述方法中，所述脱水剂优选为DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)，所述催化剂优选为DMAP(4-二甲氨基吡啶)，所述脱水反应优选在室温下进行，优选通氩气保护，优选反应时间为5小时。

本发明还提供了一种通式II化合物在DNA原位杂交方法中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

将通式II化合物(即荧光标记的dUTP)和dATP，dGTP，dCTP，dTTP的混合物用缓冲溶液配成一定浓度；将带有癌症基因编码(或目标基因片断)的模板DNA片断与上述溶液混合，并在DNA聚合酶的作用下发生聚合，得到含癌症基因(或目标基因)的DNA片断。通过凝胶过滤除去未反应的荧光标记dUTP(即式II化合物)和其它碱基。

将上述标记模板DNA片断与待检细胞中的DNA进行杂交，再分离除去游离DNA片断，若分离后除去游离DNA片断的DNA链中有荧光出现，则说明待检细胞有癌症基因或已经发生了癌变(或带有目标基因片断)。

附图说明

图1：本发明实施例3制备的FISH试剂在FISH实验中的实际效果图，两条带癌症基因的染色体被成功检出(球状和散列状分别对应不同的细胞周期中的染色体状态)。

具体实施方式

为了进一步说明本发明的指导思想，给出下列系列具体实施例，但本发明并不受这些具体实施例的限制，任何了解该领域的技术人员对本发明的些许改动将可以达到类似的结果，这些改动也包含在本发明之中。

实施例1

制备1,3,5,7-四甲基-8-(4-(4-正丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯-1酰胺基)-苯基)–BODIPY(Ia)，相关反应路线如下：

1)制备1,3,5,7-四甲基-8-(4-硝基苯基)-BODIPY(1)

[1,3,5,7-tetramethyl-8-(4-nitrophenyl)-4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diza-s-indacene]

将对硝基苯甲醛(7.92g,0.052mol)溶于1000mLCH₂Cl₂中，先通气30min，加入2,4-二甲基吡咯(12.8mL，9.92g,0.104mol)，在N₂气保护下滴加0.8mL三氟乙酸(TFA)，搅拌过夜。然后加入二氯二腈基苯醌(DDQ，2,3-Dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone,19.2g,0.085mol)，反应2h后，再加入40mL三乙胺，搅拌15min，在0℃下滴加40mLBF₃·OEt₂，搅拌2h后用2×100mL水洗干燥后分离。分离条件为CH₂CH₂：石油醚(4:1)Flash色谱柱分离。得到产物8.25g,产率43.0％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.39(d,J＝8.4Hz,2H),7.54(d,J＝8.5Hz,2H),6.02(s,2H),2.57(s,6H),1.37(s,6H).MS-EIm/z:369(M,C₁₉H₁₈BF₂N₃O₂,理论值369),323(M–NO₂,C₁₉H₁₈BF₂N₂,理论值323)。

2)制备1,3,5,7-四甲基-8-(4-胺基苯)-BODIPY(2)

[1,3,5,7-tetramethyl-8-(4-aminophenyl)-4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diza-s-indacene]

4.5g(1)溶于600mL乙醇中，加入100mL水合肼，再加入200mgPd/C，室温搅拌直到原料点完全消失(约6个小时)。滤去Pd/C和其它固体杂质，用100mL×2水洗后用乙酸乙酯萃取以除去肼等水溶性杂质，加入无水CaCl₂干燥后旋干。ESI-MSm/z:340.3(M+H,C₁₉H₂₁BF₂N₃,理论值340.2),320.3(M-F+H,C₁₉H₂₁BFN₃,理论值320.2)

3)制备1,3,5,7-四甲基-8-(4-(3-羧基丙酰胺基)苯基)-BODIPY(3)

[1,3,5,7-tetramethyl-8-(4-(3-carboxypropanamido)phenyl)-4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diza-s-indacene]

将步骤2)中旋干得到的混合物用1000mLCH₂Cl₂溶解，向上述溶液中加入琥珀酸酐(6.1g,5equ.)，搅拌过夜，并点板监测直到原料点完全消失。与原料点几乎不发光相比，产物点发光较亮。用CH₂Cl₂柱分除去其它杂质，再用丙酮冲出产物，得产物(3)43.2g，粗产率60％。¹HNMR(400MHz,DMSO)δ10.19(s,1H),7.79(d,J＝8.3Hz,2H),7.27(d,J＝8.3Hz,2H),6.17(s,2H),2.60(d,J＝5.7Hz,2H),2.56(d,J＝5.9Hz,2H),2.45(s,6H),1.40(s,6H).ESI-MSm/z:438.3(M-H,C₂₃H₂₄BF₂N₃O,理论值438.3),338.1(M-4-oxobutanoicacid，即脱掉4-羰基丁酸,理论值338.2).

4)制备1,3,5,7-四甲基-8-(4-(4-正丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯-1酰胺基)-苯基)–BODIPY(Ia)

[1,3,5,7-tetramethyl-8-(4-(4-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-4-oxobutanamido)phenyl)-4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diza-s-indacene]

将化合物(3)(180mg，0.4mmol)溶于60mL氯仿中，通Ar气体保护，加入N-羟基琥珀酰亚胺(70mg,0.61mmol,1.5equ.)后，加入DCC(100mg,0.48mmol,1.2equ.)作脱水剂，活化羧基，再加入DMAP(4-二甲氨基吡啶)(5mg,0.1equ.)作催化剂，室温搅拌进行反应，点板监测直到原料点基本消失(约5小时)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.51(d,J＝7.9Hz,1H),7.41(d,J＝7.8Hz,1H),6.00(s,1H),2.93(s,2H),2.56(s,3H),1.54(s,2H),1.43(s,3H)。

实施例2

制备(1,3,5,7-四甲基-8-(3-(3-N-羟基琥珀酰亚胺)-3-丙酸酯)-BODIPY(Ib)，其相关反应路线如下：

1)制备羧酸化染料(1,3,5,7-四甲基-8-(2-羧基乙基)-BODIPY(4)

[1,3,5,7-tetramethyl-8-(2-carboxyethyl)-BODIPY]

1L三口瓶中，先通N₂排气5min，再依次加入琥珀酸酐(6g,0.12mol)，1L干燥的CH₂Cl₂，2,4-二甲基吡咯(11.2g,0.12mol)，11gBF₃·OEt₂(或者在双排管中进行)。将上述混合体系加热回流，搅拌5h后冷却到室温，加入56gBF₃·OEt₂和30gEt₃N，在N₂保护下搅拌过夜。用4×500mL水洗后用无水MgSO₄干燥，抽干。再用正己烷：乙酸乙酯4：1过柱分离(6.9g,36％)。¹HNMR(400MHz,CD₃Cl)δ6.08(s,2H),3.41–3.27(m,2H),2.71–2.62(m,2H),2.52(s,6H),2.45(s,6H).ESI-MSm/z:319.1(M-H,C₁₆H₁₈BF₂N₂O₂,理论值319.1),275.1(M-CO₂-H,C₁₅H₁₈BF₂N₂,理论值275.1).

2)制备活化荧光染料Ib(1,3,5,7-四甲基-8-(3-(3-N-羟基琥珀酰亚胺)-3-丙酸酯)-BODIPY(Ib)

[1,3,5,7-tetramethyl-8-(3-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-3-oxopropyl)-BODIPY]

将化合物(4)(320mg，1mmol)溶于5mLTHF中，通Ar气体保护，0℃下加入N-羟基琥珀酰亚胺(138mg,1.2mmol)后，加入DCC(247mg,1.2mmol)作脱水剂，活化羧基，再加入DMAP(14.6mg,0.12mol)作催化剂，反应混合物升至室温搅拌36小时，冰冻过滤(低温下产物在THF中溶解性很低)。用丙酮：石油醚1：2色谱柱分离(TCL中，Rf＝0.3)，或者二氯甲烷：乙酸乙酯8：2柱分(30min)，279.4mg,产率67％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ6.09(s,2H),3.59–3.28(m,2H),2.90(d,J＝9.2Hz,2H),2.86(s,4H),2.53(s,6H),2.46(s,6H).¹³CNMR(400MHz,CDCl₃)δ168.99(s),167.31(s),155.49(s),141.49(s),140.65(s),131.32(s),122.49(s),32.47(s),25.81(s),23.45(s),16.61(s),14.75(s).ESI-MSm/z:417.1(C₂₀H₂₂BF₂N₃O₄,理论值417.2),398.1(C₂₀H₂₂BFN₃O₄,理论值398.2).

实施例3

制备化合物IIb

1)dUTP的修饰，包括如下步骤：

将dUTP(550mg，1mmol)溶解在5mL水中，同时将Hg(OAc)₂(375mg,1.18mmol)溶于5mL水中，将后者加入dUTP溶液中混合。将混合溶液加热到50℃，搅拌3小时，反应混合物变得混浊，并析出少量白色絮状物。随后停止加热搅拌至室温，倒入冰水中冷却至0℃。将160mgNaCl溶于1mL水中，加入上述冷却后的溶液后生成白色沉淀，过滤收集白色沉淀，分别用2mL0.1MNaCl溶液和1mL水洗后，再用2mL乙醇洗涤，然后真空干燥，得到dUTP-Hg(产率93％)。

将510mgLiOAc·H₂O溶于50mL水，加2滴HOAc调节pH＝5，配成0.1MLiOAc/HOAc缓冲溶液体系；取50mgdUTP-Hg，加入3mL上述溶液配成20mMdUTP-Hg溶液；烯丙胺重蒸(b.p.＝55℃)后用4M醋酸配成2M的烯丙胺醋酸溶液；取烯丙胺醋酸溶液3.75mL与dUTP-Hg溶液3mL混合后，加入16.5mgLi₂PdCl₄引发反应，并在室温下搅拌16-24小时，得到产物。¹HNMR(400MHz,D₂O)δ8.17(s,1H),6.60(d,J＝16.1Hz,1H),6.42(d,J＝8.0Hz,1H),6.39(d,J＝6.2Hz,1H),4.71(s,2H),4.30(s,2H,NH₂),4.21(s,1H),3.73(d,J＝6.5Hz,2H),2.43(d,J＝5.9Hz,2H).ESI-MSm/z:548.0558(C₁₂H₁₇Li₄N₃O₁₄P₃,理论值548.0564)。

2)制备化合物IIb

dUTPN(63mg,0.1mmol)溶于20mL0.1MNaB₂O₇溶液(pH＝8.5)；将实施例2中得到的化合物(Ib)(53.6mg,0.1mmol)溶于2mLDMF中后，加入上述溶液混合后搅拌14-16小时。ESI-MSm/z:303.1702(C16H18BF2N2O*，理论值303.15)；564.3093(C12H17Li3N3NaO14P3⁺，理论值564.3)。

实施例4

将实施例3中的化合物IIb和dATP，dGTP，dCTP，dTTP的混合物用缓冲溶液配成一定浓度；将带有癌症基因编码(或目标基因片断)的模板DNA片断与上述溶液混合，并在DNA聚合酶的作用下发生聚合，得到含癌症基因的DNA片断。通过凝胶过滤除去未反应的化合物IIb和其它碱基。

将上述标记模板DNA片断与待检细胞中的DNA进行杂交后分离出游离DNA片断。之后在荧光显微镜中观察其荧光现象(见图1)。

图1为在荧光显微镜中观察的实际效果图，两条带癌症基因的染色体被成功检出(球状和散列状分别对应不同的细胞周期中的染色体状态)；细胞中的两条对应染色体在荧光显微镜中出现了荧光，说明这两条染色体中带有癌症基因。图中不同状态的染色体，即散列状和球状部分分别代表细胞不同的分裂期。

Claims (10)

1.式II所示的化合物:

其中，Fl为荧光分子部分，其结构为如下通式III所示：

其中，X₁、X₂独立选自F、烷基、烷氧基；R₁、R₂、R₃、R₅、R₆、R₇独立的选自：H、烷基、-烷基-COO-烷基、-芳基-COO-烷基、-烷基-COO-芳基、-烷基-OCO-烷基、-芳基-OCO-烷基、-烷基-OCO-芳基、-CO-NH-烷基、-CO-NH-芳基、氨基、腈基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、杂环基、杂环烷基；

R独立选自亚烷基、-烷基-COO-烷基-、-芳基-COO-烷基-、-烷基-COO-芳基-、-烷基-CONH-烷基-、-烷基-CONH-芳基-、-芳基-CONH-烷基-、-芳基-CONH-芳基-、-烷基-CONH-芳烷基-、-芳烷基-CONH-烷基-、-芳烷基-CONH-芳烷基-、-芳基-、-芳烷基-、-杂芳基-、-杂芳烷基-、-杂环基-、-杂环烷基-；

上述X₁、X₂、R₁、R₂、R₃、R₅、R₆、R₇、R中定义的基团可以进一步被取代基取代，所述取代基可以为烷基、烷氧基、卤素、硝基等；

所述的烷基代表碳原子数为1-10的直链或支链烷基；

所述的烯基代表碳原子数为2-10直链或支链烯基；

所述的炔基代表碳原子数为2-10的直链或支链炔基；

所述的环烷基代表具有3-8个环原子的碳环；

所述的芳基指具有6-20个碳原子的单环、多环芳族基团；

所述的杂芳基指具有1-20个碳原子、至少1个选自N、S、O杂原子的单环或多环杂芳族基团；

所述的杂环基指具有1-20个碳原子、至少1个选自N、S、O杂原子的饱和或不饱和的单环或多环杂环基团；

所述氨基代表基团-NR¹ ₂，其中，R¹独立的选自H、烷基、芳基、杂芳基、杂环基。

2.根据权利要求1所述的化合物，所述Fl为如下通式IIIa的结构：

3.根据权利要求1所述的化合物，所述式II化合物选自：

4.一种权利要求1所述的式II化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

其中，Fl、R如权利要求1所述；

1)dUTP的汞化

将dUTP的水溶液与Hg(OAc)₂的水溶液混合，然后加热，再冷却；将NaCl加入上述冷却后的溶液，生成白色沉淀，即得到产物dUTP-Hg；

2)由dUTP-Hg制备dUTPN

将步骤1)中得到的dUTP-Hg配成溶液；然后将所述dUTP-Hg溶液与烯丙胺溶液混合，得到dUTPN；

3)由dUTPN制备通式II化合物

将通式I的荧光染料溶于有机溶剂，然后再加入dUTPN的溶液，反应得到通式II化合物。

5.通式I所示的化合物：

其中，Fl、R如权利要求1所述。

6.根据权利要求5所述的化合物，所述Fl为如下通式IIIa的结构。

7.根据权利要求5所述的化合物，所述式I化合物选自：

8.一种权利要求5所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将式IV化合物溶于有机溶剂，加入脱水剂，在催化剂作用下与N-羟基琥珀酰亚胺进行脱水反应得到通式I化合物：

其中Fl、R如权利要求1所定义。

9.权利要求1所述的式II化合物在DNA原位杂交方法中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求1中的式II化合物和dATP，dGTP，dCTP，dTTP的混合物用缓冲溶液配成一定浓度；将带有癌症基因编码(或目标基因片断)的模板DNA片断与上述溶液混合，并在DNA聚合酶的作用下发生聚合，得到含癌症基因(或目标基因)的DNA片断；通过凝胶过滤除去未反应的荧光标记dUTP(即式II化合物)和其它碱基；

将上述标记模板DNA片断与待检细胞中的DNA进行杂交，再分离除去游离DNA片断，若分离后除去游离DNA片断的DNA链中有荧光出现，则说明待检细胞有癌症基因或已经发生了癌变(或带有目标基因片断)。