JP2001029072A - 核酸の新規合成を検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 核酸合成系において、核酸の新規合成を検出
する方法を提供する。 【解決手段】 核酸合成系に、ドナー蛍光色素で標識さ
れた蛍光標識核酸モノマーと、アクセプター蛍光色素で
標識された蛍光標識核酸モノマーとを添加し、両核酸モ
ノマーを基質として、核酸合成系に取り込ませ、そして
核酸分子内に取り込まれることにより近接した前記ドナ
ー蛍光色素から前記アクセプター蛍光色素へのＦＲＥＴ
を誘起させ、かつＦＲＥＴに基づく蛍光を検出し、前記
核酸合成系で、核酸の新規合成を検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸（ＲＮＡ、或
いはＤＮＡ)の新規合成（ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ）を検出する方法に関する。さらに詳しくは、
本発明は、核酸合成系内での蛍光共鳴エネルギー移動
（ＦＲＥＴ）に由来する蛍光を検出することに基づき、
核酸合成系における核酸の新規合成の有無を検出する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、または
細胞内（ｉｎ ｖｉｖｏ）における、核酸合成を検出す
るためには、一般に該核酸を特異的に染色する色素、核
酸プローブ等を用いる必要があった。これらの検出用試
薬は、未反応の試薬に起因するバツクグランドを生じる
ので、核酸の検出、定量に際して、核酸／検出試薬複合
体を、予め分離、精製していた。そのため、これらの手
法を用いる連続的かつ簡便な検定には、困難が伴った。

【０００３】一方、核酸と結合（インターカレーショ
ン）すると、蛍光波長が変化する色素（例えば、Ｈｏｅ
ｃｈｓｔ３３２５８、３３３４２）も知られている。こ
のような色素を用いると、合成された核酸の全量を定量
することは、可能であるが、ある単位時間に合成された
核酸の量を定量することは不可能であった。後者は、ｉ
ｎ ｖｉｖｏでのある単位時間における、核酸の合成速
度の評価、或いはｉｎｖｉｔｒｏで既に存在する核酸に
対して、新たに合成される核酸の検定等を含む。さら
に、色素が核酸と相互作用するので、合成反応そのもの
を阻害する可能性もあり、核酸合成系に対する悪影響が
無視できない。また、ＤＮＡとＲＮＡを明確に区別する
のも困難である。

【０００４】また、生物の細胞において、核酸の新規合
成を検出できれば、生体内における各種の現象を解析す
る方法として有用である。このような試みとして従来、
免疫抗体法、ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ法をはじめ、様々な手法が開発されてきた。しかし
ながら、生きた（ｖｉａｂｌｅ）細胞における核酸合成
を固定、包埋処理等の操作を施さずに、細胞が「生きた
まま」の状態で検出する方法は、存在しなかった。従来
技術において、最もこの目的に近い手法がＪａｃｋｓｏ
ｎらによって報告されている。即ち、臭素化された核酸
モノマーのアナログ（Ｂｒ−ＵＴＰ）を基質として生き
た細胞の中でＲＮＡ合成を行い、この細胞を固定後に蛍
光抗体を用いて検出する方法である。Ｊａｃｋｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯＪ．１２，１０５９−１０６５。
この方法でも、細胞に固定処理を施しており、従って、
生きたままでの検出には至っていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、核酸合成系
における核酸の新規合成を比較的簡単に検出する方法を
提供することを目的とする。また、本発明は、核酸合成
系における核酸の新規合成を連続的に（リアルタイム
で）検出する方法を提供することを目的とする。さら
に、本発明は、上記のように従来技術では、達成できな
かった生きた細胞中での核酸の新規合成を検出可能にす
る方法を提供することも目的とする。加えて、本発明
は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでも適用可能な前記一連の検出方
法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来技術
における核酸合成の検出方法に内在する問題点に鑑み、
鋭意研究を重ねた結果、核酸合成系において標識された
核酸モノマー（特に、蛍光標識された核酸モノマー）を
基質として用い、核酸合成が可能な条件下、該標識核酸
モノマーの前記核酸合成系に対する取り込まれを検出す
ることで、核酸の新規合成がなされたか、否かを判定で
きることを見出し、本発明を完成した。具体的には、ド
ナー型及びアクセプター型の２種類の蛍光標識された核
酸モノマーを核酸合成系に導入し、該核酸合成系で誘起
されうる蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)を解析する
ことに基づき、核酸合成を検出する方法により本発明が
達成される。

【０００７】即ち、本発明は、最も広義には以下の工程
を含む、核酸の新規合成を検出する方法（以下、本発明
の検出方法ともいう）を提供する。

【０００８】（１）核酸合成系に、標識核酸モノマーを
添加する工程と、（２）前記標識核酸モノマーを、基質
として前記核酸合成系に取り込ませる工程と、（３）遊
離標識核酸モノマー以外の標識の存在を検出する工程
と、を含むことを特徴とする、核酸合成系における核酸
の新規合成を検出する方法。

【０００９】好ましくは、前記標識核酸モノマーに使用
される「標識」は蛍光性分子である。

【００１０】さらに、本発明は、以下の工程を含む、核
酸の新規合成を検出する方法を提供する。

【００１１】（Ａ）核酸合成系に、ドナー蛍光色素で標
識された蛍光標識核酸モノマーと、アクセプター蛍光色
素で標識された蛍光標識核酸モノマーとを添加する工程
と、（Ｂ）前記ドナー蛍光色素で標識された蛍光標識核
酸モノマーと、前記アクセプター蛍光色素で標識された
蛍光標識核酸モノマーとを基質として、前記核酸合成系
に取り込ませる工程と、（Ｃ）核酸分子内に取り込まれ
ることにより近接した前記ドナー蛍光色素から前記アク
セプター蛍光色素へのＦＲＥＴを誘起させ、前記ＦＲＥ
Ｔに基づく蛍光を検出する工程とを含むことを特徴とす
る、核酸合成系における核酸の新規合成を検出する方
法。

【００１２】また、本発明は、上記核酸の新規合成を検
出する方法において、前記核酸合成系がｉｎ ｖｉｖｏ
である方法を提供する。

【００１３】さらに、本発明は、上記核酸の新規合成を
検出する方法において、前記核酸合成系がｉｎ ｖｉｔ
ｒｏである方法を提供する。

【００１４】加えて、本発明は、上記核酸の新規合成を
検出する方法において、工程（Ｂ）がｉｎ ｖｉｔｒｏ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによって実施される方法
を提供する。

【００１５】さらに加えて、本発明は、上記核酸の新規
合成を検出する方法において、工程（Ｂ）がｒｅｖｅｒ
ｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによって実施される
方法を提供する。

【００１６】また、本発明は、上記前記核酸の新規合成
を検出する方法において、前記工程（Ｂ）と、前記工程
（Ｃ）との間に、さらに前記核酸合成系に存在する低分
子量成分を分離、除去する工程を含む方法を提供する。

【００１７】以下、本発明を実施の形態に即して詳細に
説明する。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明の検出方法は、核酸合成系
に、蛍光標識核酸モノマー類を添加し、該蛍光標識核酸
モノマー類を基質として、前記核酸合成系に取り込ま
せ、該核酸合成系内で、ＦＲＥＴを誘起させ、それに基
づく蛍光を検出することを要旨とする。

【００１９】本明細書で用いられる「核酸合成系」と
は、核酸合成が自然発生的、或いは人為的に行われるい
かなる環境をも包含し、大別して、ｉｎ ｖｉｖｏおよ
びｉｎｖｉｔｒｏがある。ｉｎ ｖｉｖｏの場合、前記
核酸合成系は、生きた細胞を含み、本発明において、特
に重要である。また、「核酸」とは、通常用いられる意
味での各種の核酸を指し、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍ
ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ）、並びにウィルスのＤＮ
ＡおよびＲＮＡである。

【００２０】本発明の検出方法を構成する第１の工程
（工程（Ａ））は、核酸合成系に、蛍光標識核酸モノマ
ー類を添加することからなる。核酸モノマーは、検出す
べき核酸がＤＮＡの場合、各種のモノデオキシリボヌク
レオチドであり、それらの種類に関して特に制限はな
い。それらの１種のみ、または２種以上の混合物を使用
してよいが、蛍光標識が容易で、かつ入手が容易な１種
のモノデオキシリボヌクレオチドを使用することが好ま
しい。実用的には、既に蛍光標識されたモノデオキシリ
ボヌクレオチドを使用すればよい。検出すべき核酸がＲ
ＮＡの場合、各種のモノリボヌクレオチドが使用可能で
あり、それらの１種のみ、または２種以上の混合物を使
用してよい。ＤＮＡの場合と同様に、好適には、蛍光標
識が容易で、かつ入手が容易な１種のモノリボヌクレオ
チドを使用する。さらに、好適には、既に蛍光標識され
たモノリボヌクレオチドを使用すればよい。

【００２１】前記蛍光標識核酸モノマー類は、このよう
な核酸モノマーが蛍光標識された複数の（即ち、一対
の）ものである。蛍光標識に使用される、蛍光性分子は
蛍光色素であることが好ましく、特に後述のＦＲＥＴを
誘起させる目的から、ドナー蛍光色素と、アクセプター
蛍光色素の一対の組み合わせが使用される。この組み合
わせについては、特に制限はなく、従来から公知の種々
の色素、およびそれらの誘導体の組み合わせであってよ
い。換言すれば、好ましいドナー蛍光色素と、アクセプ
ター蛍光色素との組み合わせは、公知の色素類の中か
ら、ＦＲＥＴの効率が最適化されるように、適宜選択す
る。これは当業者にとって容易である。従って、本発明
では選択されたドナー蛍光色素と、アクセプター蛍光色
素とのそれぞれで標識された２種類の型の核酸モノマー
一対を使用する。

【００２２】上記第１の工程中、このような一対の蛍光
標識核酸モノマーを核酸合成系に添加する。これは核酸
合成系がｉｎ ｖｉｔｒｏであれば、単に核酸モノマー
を系に通常の手段を用いて、加えることにより達成され
る。この場合、核酸合成系は、細胞懸濁液または酵素反
応液等の形態である。核酸合成系がｉｎ ｖｉｖｏであ
っても、核酸モノマーが系を構成する細胞に対して、浸
透性を有することがある。このような場合、同様に、単
に核酸モノマーを系に添加すればよい。核酸モノマーが
細胞内に、自然浸透しない時、例えば、マイクロインジ
ェクションによりこれを達成することができる。マイク
ロインジェクション法は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他蛋白
質等を細胞に、直接注入する手法として公知であり、本
発明においても、前記ｉｎ ｖｉｖｏ核酸合成系が生き
た植物細胞、および動物細胞である場合ともに、有用な
手法として使用可能である。

【００２３】本発明の検出方法を構成する第２の工程
（工程（Ｂ））は、前記一対の蛍光標識核酸モノマーを
基質として、核酸合成系に取り込ませることからなる。
ｉｎｖｉｖｏ核酸合成系の場合、核酸合成が可能な条件
下、適当な細胞内でこの取り込みが行われ、究極的に
は、核酸が合成される。一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸合
成系の場合、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔｉｏｎ、ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔｉｏｎ等の手法を用いて、取り込みを行わせることが
できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ
ｎは、目的とするＲＮＡ（ｍＲＮＡまたはウィルスＲＮ
Ａなど）をその鋳型ＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏで合成
（転写）するものであり、当業者にとって公知の標準的
操作からなる。詳しくは、「新細胞工学実験プロトコー
ル」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社１９
９５年）２８０頁等に記載されている。ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎは、ＲＮＡを鋳型とし
て、これに相補的なＤＮＡを、逆転写酵素を用いて合成
するものである。これは遺伝子操作の基本的手法とし
て、周知であり、詳しくは、「新細胞工学実験プロトコ
ール」（同上）５３頁等に記載されている。これら両手
法から、それぞれＲＮＡおよびＤＮＡが合成可能であ
り、従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸合成系でも、検出の
対象となる核酸合成はＲＮＡおよびＤＮＡ合成の両者を
包含する。ｉｎ ｖｉｖｏ核酸合成系がこれら両者を含
むことは、言うまでもない。

【００２４】ｉｎ ｖｉｖｏでは、環境条件下、多種多
様な核酸が同時に生合成される。本発明では、必要に応
じて、ｉｎ ｖｉｖｏ系に予め、不要核酸の合成を阻害
する核酸合成阻害剤を添加してから、本発明の検出方法
を実施することもできる。ＲＮＡウィルスの検出を目的
とした場合、このような阻害剤の１例として、アクチノ
マイシンＤを使用することができる。この抗生物質は、
細胞内、ＲＮＡ依存性のＲＮＡ合成を選択的に阻害する
ことが知られている。そこで、アクチノマイシンＤの存
在下、本発明の検出方法を実施すると、細胞ＲＮＡの合
成が阻害されて該合成は検出されない。しかしながら、
ＲＮＡ依存性ＲＮＡ（即ち、ＲＮＡウィルス）の合成
は、阻害されないので該ＲＮＡのみが合成され、本発明
の検出方法に従えば、その選択的検出が可能となる。

【００２５】本発明の検出方法を構成する第３の工程
（工程（Ｃ））は、核酸合成系内で、近接する前記ドナ
ー蛍光色素から前記アクセプター蛍光色素へのＦＲＥＴ
を誘起させ、前記ＦＲＥＴに基づく蛍光を検出すること
からなる。上記第２の工程で、核酸合成系に前記一対の
蛍光標識された核酸モノマーが取り込まれた核酸分子が
得られる。図１は、このような核酸分子の例を模式的に
示したものである。図中、Ｄは、ドナー蛍光色素を、Ａ
は、アクセプター蛍光色素を表わす。ここで核酸分子の
１本鎖に、ドナー蛍光色素で標識された蛍光標識核酸モ
ノマーと、アクセプター蛍光色素で標識された蛍光標識
核酸モノマーとが取り込まれている。核酸分子は、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡのいずれであってもよい。

【００２６】図１に示されるように、ドナー蛍光色素
と、アクセプター蛍光色素とが空間的に近接する配置を
とりうると、両蛍光分子間で蛍光共鳴エネルギー移動が
起こり得る。これは前記２種類の蛍光分子の距離が、あ
る一定値以内であると、分子間の相互作用が生じること
に起因する。本明細書中、この現象を「ＦＲＥＴ」と略
する。ＦＲＥＴが誘起される条件は、（１）まず、ドナ
ー蛍光色素と、アクセプター蛍光色素とが前記の距離条
件を満たし、（２）さらに、ドナー蛍光色素が光エネル
ギー的に励起されることである。前者は、蛍光標識核酸
モノマーが取り込まれた核酸において、一定数の分子が
既にこの条件を満たしている。後者は、ドナー蛍光色素
にその励起波長に対応する、適当な波長の光を照射すれ
ばよい。このようにして光励起されたドナー蛍光色素か
らアクセプター蛍光色素にエネルギー移動が起こり、そ
の場合アクセプター蛍光色素の蛍光が観測される。前述
のように、本発明において、好適に使用されるドナー蛍
光色素と、アクセプター蛍光色素との組み合わせは、当
業者にとって容易に選択が可能であるが、ひとつの選択
基準として、ドナー蛍光色素の蛍光スペクトルに対し
て、アクセプター蛍光色素の吸収スペクトルが重なりう
るように選択を行うことができる。具体的に、好ましい
個別のドナー蛍光色素と、アクセプター蛍光色素との組
み合わせについては、実施例に、例示されている。

【００２７】本発明の検出方法を構成する第３の工程
は、さらにＦＲＥＴに基づく蛍光を検出することを含
む。ここで、蛍光の検出、および測定は、標準的な蛍光
測定装置を用いて行う。前記核酸合成系がｉｎ ｖｉｔ
ｒｏであれば、通常の方法に従い、低分子量成分を分
離、除去した上で、高分子量成分を単離、精製し、試料
を調製する。好ましい分離、精製手段として、本発明で
は電気泳動を用いる。別の分離、精製手段として、ゲル
ろ過が使用でき、この手法も好ましい。これらの分離、
精製手段によって、低分子量成分である未反応の蛍光標
識核酸モノマー、およびその他の反応生成物を除去でき
る。分離、精製過程を省くことが好ましい場合、予め、
基質である蛍光標識核酸モノマーの添加量を調整する。
これにより、過剰な未反応の基質が検出前の核酸合成系
に存在することを防止できる。このようにして得られる
試料を、例えば、蛍光分光光度計での蛍光測定に供す
る。一方、前記核酸合成系がｉｎ ｖｉｖｏであれば、
ｉｎ ｖｉｔｒｏの場合のように、分離、精製を行って
もよいが、該核酸合成系をそのまま試料として用いるこ
とが好ましい。適切な処理後、これを蛍光顕微鏡で可視
化する。特に、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用する
と、前述したように過剰な基質の影響を低減することが
可能となる。

【００２８】既に、説明したように、本発明に係わる、
核酸合成系において、核酸が新規合成されておれば、上
記ＦＲＥＴが生じる。従って、それに基づく蛍光（即
ち、アクセプター蛍光色素の蛍光）が誘起され、さらに
検出されることとなる。核酸合成系内に既に、存在する
核酸は、ＦＲＥＴを起こさないため、本発明の検出方法
で検出されることはない。このように、本発明の検出方
法で採用される、特定の条件を考慮して、蛍光測定環境
を設定すれば、核酸合成系内で、直接的に核酸の新規合
成を検出することが可能となる。

【００２９】本発明において、ウィルス（例えば、植物
病原体）の混在する可能性のある核酸合成系（即ち、生
きた細胞である植物細胞）を用いると、該合成系内で、
該ウィルスのＲＮＡが新規合成される場合がある。本発
明の検出方法に従えば、このようなウィルス由来のＲＮ
Ａも検出できるので、生きた細胞中、ウィルスの混在
（存在）の有無を識別することも可能である。即ち、ウ
ィルス感染細胞の識別も可能となる。これはウィルス感
染細胞に、基質として、本発明に係わる蛍光標識核酸モ
ノマーが取り込まれ、合成されるウィルス由来のＲＮＡ
でＦＲＥＴが観測され得るからである。このようなウィ
ルスの検定方法も、本発明において、一つの好適な実施
の形態を構成する。さらに、前述した蛍光顕微鏡でＦＲ
ＥＴを観測できれば、ウィルス感染細胞内でのウィルス
の局在化についての知見も得られることとなる。

【００３０】さらに、別の実施の形態によれば、核酸合
成系において、核酸が新規合成される時間経過を連続的
にモニターすることもできる。これは核酸合成系がｉｎ
ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏに関わらず可能である。

【００３１】以下、本発明を実施例に基づいて説明す
る。

【００３２】

【実施例】（実施例1）ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔｉｏｎ反応におけるＲＮＡ合成の検出（１） 市販のＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによるｉｎ
ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ用キット
(ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ、Ａｍｂｉｏｎ社製)を用いた。
また、市販の蛍光標識された核酸モノマー(モノリボヌ
クレオチド)を基質として用いた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応の条件は、下記の通り
であった。

【００３３】反応は２０μｌの系で行い、反応容器に、
１０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰの溶液（各１μ
l）、０．７５μlの１０ｍＭ ＵＴＰ、５００ｎｇの鋳
型ＤＮＡ(トマトモザイクウイルス-ＬのｃＤＮＡをコー
ドするプラスミドを酵素処理により直鎖状にしたも
の)、1μlの１０ｍＭ ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ａｎａｌｏｇ(Ｂｉｏ-ｌａｂｓ社製)、2μlの１０ｘｒ
ｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ(ＭＥＧＡｓｃｒｉｐ
ｔ、Ａｍｂｉｏｎ社製)、2μlのＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅを含むＥｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ(ＭＥＧＡｓｃｒ
ｉｐｔ、Ａｍｂｉｏｎ社製)、2.5μlの１ｍＭ蛍光標識
核酸モノマー類を添加し、３７℃で２時間反応させた。

【００３４】蛍光標識核酸モノマーとして、ドナー蛍光
色素で標識されたモノリボヌクレオチドであるＦｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
社製）を使用した。アクセプター蛍光色素で標識された
モノリボヌクレオチド、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ−１４−
ＵＴＰ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ−１４−ＵＴＰ、Ｔｅｘａ
ｓ Ｒｅｄ−５−ＵＴＰ（すべてＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅ社製）をそれぞれ、前記のドナー蛍光色素で
標識されたモノリボヌクレオチドと、組み合わせて使用
した。対照として、ドナー蛍光色素或いはアクセプター
蛍光色素で標識されたモノリボヌクレオチドを1種類の
み、単独で使用して同様に反応させた。

【００３５】反応後のそれぞれの反応液について、アガ
ロースゲル電気泳動を行った。得られたゲルをエチジウ
ムブロマイドで染色し、ＵＶ励起下観察した。この結
果、いずれのレーンでも、転写反応産物に対応するバン
ドが認められた。これらのバンドから目的物を分取する
ために、各フラグメントをゲルごと切り出し、ＲＮＡｉ
ｄＫｉｔ(ＢＩＯ１０１社製)に含まれるＲＮＡ ｂｉｎ
ｄｉｎｇ ｓａｌｔ溶液を添加し、４５℃で加温溶解し
た。以上の一連の操作によって、未反応の蛍光標識モノ
リボヌクレオチドおよびその他の低分子量不純物が除か
れた転写産物溶液が得られた。

【００３６】それぞれの抽出溶液について、蛍光分光光
度計を用い、４８０ｎｍ励起における蛍光スペクトルを
測定、解析した。これらの結果を図２〜４に示す。図２
は、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ＵＴＰと、Ｂｏｄ
ｉｐｙ ＴＭＲ−１４−ＵＴＰとの組み合わせを用いた
時の結果を示す。図３は、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１
２−ＵＴＰと、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ−１４−ＵＴＰとの
組み合わせを用いた時の結果を示す。図４は、Ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ＵＴＰと、ＴｅｘａｓＲｅｄ−
５−ＵＴＰとの組み合わせを用いた時の結果を示す。

【００３７】図２〜４に示されたように、各図に於い
て、対照スペクトルとの比較を行うにあたり、酵素反応
によってＲＮＡ分子中に取り込まれる蛍光標識分子（蛍
光色素）の数が同じになる様にスペクトルを補正する必
要がある。

【００３８】具体的に、この補正について説明を加える
と、下記の通りである。ドナー蛍光色素或いはアクセプ
ター蛍光色素で標識された蛍光標識モノリボヌクレオチ
ドを1種類のみ、単独で使用した場合、得られた産物の
スペクトルを、上記それぞれの蛍光色素の組み合わせに
ついて、測定し、各図中に表示してある。これらのスペ
クトルは、比較されるべき、ドナー蛍光色素およびアク
セプター蛍光色素の特定の組み合わせを使用した場合の
産物のスペクトル（各図中、ＦＲＥＴと表示する）を基
準にして、各蛍光色素の直接励起蛍光の強度が取り込ま
れている分子数に比例すると見なして、各色素の分子数
が互いにほぼ等しくなるように補正されたものである。
即ち、例えば、アクセプター蛍光色素のスペクトルに於
ける、同分子数と、ＦＲＥＴと表示されたスペクトルに
於けるアクセプター蛍光色素の分子数がほぼ等しいこと
を意味する。さらに、このように補正された一つのドナ
ー蛍光色素のみ、或いは一つのアクセプター蛍光色素の
みのスペクトルを加算し、合成スペクトルを作成した。
各図中、この合成スペクトルをＦＲＥＴが起きていない
場合の理論スペクトル（ＴＨＥＯＲ）として表示してあ
る。従って、図２を例にとると、ＦＲＥＴと表示され
た、実際のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ＵＴＰと、
Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ−１４−ＵＴＰとを組み合わせた
時の産物の蛍光スペクトルと、ＴＨＥＯＲと表示された
理論スペクトルに於いて、ドナー蛍光色素（Ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｉｎ）と、アクセプター蛍光色素（Ｂｏｄｉｐ
ｙ ＴＭＲ）とに関して、含有されている（或いは、考
慮されている）それぞれの分子数は、ほぼ等しいという
前提において比較が行われる。尚、各図中すべてのスペ
クトルの蛍光強度は、５１５ｎｍで規格化したＦＲＥＴ
のスペクトルを基準として、プロットしてある。

【００３９】例えば、図２から明らかなように、Ｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ＵＴＰと、Ｂｏｄｉｐｙ Ｔ
ＭＲ−１４−ＵＴＰとの組み合わせを用いて得られた蛍
光スペクトルには、前記理論スペクトルと比較して、有
意なＦＲＥＴピークが観測された。これはＦＲＥＴピー
クに着目することによって、核酸（ＲＮＡ）の合成を検
出することが可能であることを示している。図３、４で
も同様のスペクトルパターンが見られることから、上記
で用いたすべてのドナー蛍光色素或いはアクセプター蛍
光色素で標識されたモノリボヌクレオチドの組み合わせ
について、本発明の検出方法が有用であったことが分か
る。

【００４０】（実施例２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応におけるＲＮＡ合成の検出
（２） 実施例1と同様の方法で、蛍光標識された核酸モノマー
（モノリボヌクレオチド）を基質として用いて、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応を行っ
た。ここで用いた蛍光標識核酸モノリボヌクレオチド
は、ドナー蛍光色素で標識されたＢｏｄｉｐｙ ＦＬ−
１４−ＵＴＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）
と、アクセプター蛍光色素で標識されたＢｏｄｉｐｙ
ＴＲ−１４−ＵＴＰおよびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ−５−Ｕ
ＴＰ（ともにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）で
あった。

【００４１】反応後、実施例１で行った補正計算を行わ
ずに直接的な比較を行うために、反応産物を、Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘＧ５０スピンカラム（Ｐａｎ Ｖｅｒａ社製）
を用いて、ゲルろ過した。これによって、未反応の蛍光
標識モノリボヌクレオチドおよびその他の低分子量不純
物が除かれた転写産物溶液が得られた。

【００４２】それぞれの溶出溶液について、実施例１と
同様に、蛍光スペクトルを測定した。これらの結果を図
５、図６に示す。図５は、Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ−１４−
ＵＴＰと、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ−１４−ＵＴＰとの組み
合わせを用いた時の結果を示す。図６は、Ｂｏｄｉｐｙ
ＦＬ−１４−ＵＴＰと、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−５−Ｕ
ＴＰとの組み合わせを用いた時の結果を示す。いずれの
場合もドナー蛍光色素或いはアクセプター蛍光色素で標
識された蛍光標識モノリボヌクレオチド2種類を、基質
として取り込ませた時にのみ、ＦＲＥＴシグナルが観測
された。これはＦＲＥＴピークに着目することによっ
て、核酸（ＲＮＡ）の合成を検出することが可能である
ことを示している。

【００４３】（実施例3）逆転写反応におけるＤＮＡ合
成の検出 市販のｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅに
よる逆転写反応キット(ＡＭＶＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃ
ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ社製)を用いた。また、市販の蛍光標識され
た核酸モノマー(モノデオキシリボヌクレオチド)を基質
として用いた。

【００４４】逆転写反応の条件は、下記の通りであっ
た。５μlの水、２０μｇのＲＮＡ、１μlのｐｒｉｍｅ
ｒを混合し、７０℃で１０分間反応させた。その後、反
応溶液を急冷し、ｐｒｉｍｅｒをアニーリングさせた。
ここでｐｒｉｍｅｒとして、トマトモザイクウイルス-
Ｌの１８０Ｋタンパク質遺伝子の３’末端付近（４８３
６−４８５３位）ＲＮＡに対して相補的な配列を持つ、
オリゴヌクレオチド（塩基配列：ｃｔｔａｔａａａｃａ
ａａｃｇａａｃｃ）を使用した。ＲＮＡは、トマトモザ
イクウイルス-Ｌのｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒ
ｉｐｔｉｏｎ産物を使用した。さらに、１μlのＤＤ
Ｔ、１μlのＲＮＡｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５μlの
５ｘＲｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、１μlのＡＭＶＲｅｖ
ｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（以上すべて前
記キットに含まれる）、そして1μlの１ｍＭ蛍光標識モ
ノマーを添加し、２５μlの系で４６℃、２時間反応さ
せた。蛍光標識核酸モノマーとして、ドナー蛍光色素で
標識されたモノデオキシリボヌクレオチドであるＦｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｉｎ−１１−ｄＵＴＰ（ＡｍａｓｈａｍＰ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を使用した。
また、アクセプター蛍光色素で標識されたモノデオキシ
リボヌクレオチド、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（Ａｍａｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）も使用し
た。

【００４５】反応後、実施例２と同様に、反応産物を、
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０スピンカラム（Ｐａｎ Ｖｅｒ
ａ社製）を用いて、ゲルろ過した。これによって、未反
応の蛍光標識モノデオキシリボヌクレオチドおよびその
他低分子量の不純物が除かれた反応産物溶液を得た。次
に、この溶液について、実施例１と同様に、蛍光スペク
トルを測定した。結果を図７に示すが、ここでもＦＲＥ
Ｔシグナルが観測された。これはＦＲＥＴピークに着目
することによって、核酸（ＤＮＡ）の合成を検出するこ
とが可能であることを示している。

【００４６】

【発明の効果】本発明に係わる核酸の新規合成を検出す
る方法は、核酸合成系に、ドナー蛍光色素で標識された
蛍光標識核酸モノマーと、アクセプター蛍光色素で標識
された蛍光標識核酸モノマーとを添加し、両核酸モノマ
ーを基質として、核酸合成系に取り込ませ、そして近接
するドナー蛍光色素から前記アクセプター蛍光色素への
ＦＲＥＴを誘起させ、かつＦＲＥＴに基づく蛍光を検出
するので、合成された核酸分子を分離、或いは単離する
ことなく、直接的に核酸の新規合成を検出することがで
きる。従って、核酸合成系を破壊せずに、そのなかでの
核酸合成の検出を可能にする方法である。しかも、所望
ならば、経時的な検出（モニター）も可能となる。

【００４７】また、本発明の検出方法は、核酸合成系の
破壊を回避することができるので、生きた細胞で、生き
たままの状態での検出に適用できる。

【００４８】また、本発明の検出方法に従えば、新規に
合成された核酸のみが検出されるので、核酸合成系に既
に存在する核酸に影響されず、選択的、高感度の検出が
可能となる。

【００４９】さらに、本発明の検出方法に従えば、基質
である蛍光標識核酸モノマーとして、モノリボヌクレオ
チドと、モノデオキシリボヌクレオチドとのいずれも使
用可能であり、ＤＮＡ或いは、ＲＮＡの検出が可能とな
る。しかも、同一の（即ち、単一の）蛍光検出手段で、
両核酸の合成の検出ができる。

【００５０】加えて、本発明の検出方法は、ＦＲＥＴに
基づく蛍光を検出するので、蛍光色素本来の蛍光に基づ
く従来の検出方法よりも、高精度である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の検出方法の原理であるＦＲＥＴが起こ
り得る例を用いて、検出方法を模式的に説明する図であ
る。

【図２】本発明の検出方法に係わる、ＦＲＥＴの第１の
例を示す蛍光スペクトルであり、ここでは、Ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｉｎ−１２−ＵＴＰと、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ
−１４−ＵＴＰとの組み合わせを用いた時のものであ
り、さらに対照として、各色素で標識された、核酸モノ
マーのみを使用したもの等を含む。

【図３】本発明の検出方法に係わる、ＦＲＥＴの第２の
例を示す蛍光スペクトルであり、ここでは、Ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｉｎ−１２−ＵＴＰと、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ−
１４−ＵＴＰとの組み合わせを用いた時のものであり、
さらに対照として、各色素で標識された、核酸モノマー
のみを使用したもの等を含む。

【図４】本発明の検出方法に係わる、ＦＲＥＴの第３の
例を示す蛍光スペクトルであり、ここでは、Ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｉｎ−１２−ＵＴＰと、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−
５−ＵＴＰとの組み合わせを用いた時のものでり、さら
に対照として、各色素で標識された、核酸モノマーのみ
を使用したもの等を含む。

【図５】本発明の検出方法に係わる、ＦＲＥＴの第４の
例を示す蛍光スペクトルであり、ここでは、Ｂｏｄｉｐ
ｙ ＦＬ−１４−ＵＴＰと、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ−１４
−ＵＴＰとの組み合わせを用いた時のものであり、さら
に対照として、各色素で標識された、核酸モノマーのみ
を使用したものを含む。

【図６】本発明の検出方法に係わる、ＦＲＥＴの第５の
例を示す蛍光スペクトルであり、ここでは、Ｂｏｄｉｐ
ｙ ＦＬ−１４−ＵＴＰと、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−５−
ＵＴＰとの組み合わせを用いた時のものであり、さらに
対照として、各色素で標識された、核酸モノマーのみを
使用したものを含む。

【図７】本発明の検出方法に係わる、ＦＲＥＴの第６の
例を示す蛍光スペクトルであり、ここでは、Ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｉｎ−１１−ｄＵＴＰと、Ｃｙ５−ｄＵＴＰと
の組み合わせを用いた時のものであり、さらに対照とし
て、Ｃｙ５色素で標識された、核酸モノマーのみを使用
したものを含む。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 菅 隆之 静岡県浜北市平口5000番地 株式会社分子 バイオホトニクス研究所内 (72)発明者 古澤 巌 京都府京都市左京区高野東開町１−20−３ −36−303 (72)発明者 三瀬 和之 京都府京都市左京区東白川東瀬ノ内町50− １ ハイジ北白川201 (72)発明者 渡辺 雄一郎 東京都品川区小山台２−５ 小山台住宅６ −303 (72)発明者 川上 茂樹 東京都八王子市寺田町432−112−２ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA01 BB03 DA12 DA13 DA14 FB07 FB12 GC15 2G054 AB07 BA01 BB02 CA22 CE02 EA03 FB01 GA04 GB02 4B024 AA11 AA20 CA01 CA11 CA20 HA11 4B063 QA01 QQ05 QQ41 QR08 QR32 QR35 QR38 QR42 QR58 QR62 QS13 QS16 QX02

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （Ａ）核酸合成系に、ドナー蛍光色素で
   標識された蛍光標識核酸モノマーと、アクセプター蛍光
   色素で標識された蛍光標識核酸モノマーとを添加する工
   程と、 （Ｂ）前記ドナー蛍光色素で標識された蛍光標識核酸モ
   ノマーと、前記アクセプター蛍光色素で標識された蛍光
   標識核酸モノマーとを基質として、前記核酸合成系に取
   り込ませる工程と、 （Ｃ）核酸分子内に取り込まれることにより近接した前
   記ドナー蛍光色素から前記アクセプター蛍光色素への蛍
   光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を誘起させ、前記Ｆ
   ＲＥＴに基づく蛍光を検出する工程とを含むことを特徴
   とする、核酸合成系における核酸の新規合成を検出する
   方法。
2. 【請求項２】 前記核酸合成系がｉｎ ｖｉｖｏである
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記核酸合成系がｉｎ ｖｉｔｒｏであ
   ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記工程（Ｂ）がｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔ
   ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによって実施されることを特
   徴とする請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記工程（Ｂ）がｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒ
   ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによって実施されることを特徴
   とする請求項３に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記工程（Ｂ）と、前記工程（Ｃ）との
   間に、さらに前記核酸合成系に存在する低分子量成分を
   分離、除去する工程を含むことを特徴とする請求項３に
   記載の方法。