CN105228617A - 抗耐药性细菌的抗菌化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗耐药性细菌的利福霉素类似物的生产。本发明也涉及抗耐药性分枝杆菌的抗菌化合物。本发明也提供包含抗耐药性细菌、特别是分枝杆菌的抗菌化合物的药物组合物。本发明也提供抗菌化合物用于治疗细菌、且特别是分枝杆菌引起的疾病的用途。

Description

抗耐药性细菌的抗菌化合物
技术领域
本发明涉及抗耐药性细菌的利福霉素(rifamycin)类似物的生产。本发明也进一步涉及抗耐药性分枝杆菌的抗菌化合物。本发明也提供包含抗耐药性细菌特别是分枝杆菌的抗菌化合物的药物组合物。本发明也提供抗菌化合物在治疗细菌、特别是分枝杆菌引起的疾病中的应用。
背景技术
地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsismediterranei)S699(ATCC13685)是产生重要的抗生素即利福霉素B的放线菌(actinobacterium)(图1)。半合成的利福霉素B衍生物用于对抗分别为结核病(tuberculosis,TB)和麻风病的病原体的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)。这些衍生物也用于对抗各种其它生物体，包括艾滋病相关的分枝杆菌。利福霉素B和利福霉素类通常属于袢霉素(ansamycin)类抗生素，并且其特征在于由脂肪链像篮子的提手一样跨越的萘部位(图1)。此芳香核将红棕色赋予利福霉素分子。地中海拟无枝酸菌(A.mediterranei)S699的利福霉素B中的碳骨架由2个乙酸酯和8个丙酸酯单元和起始单元3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)构成。利福霉素B是天然和稳定的分子，并充当用于合成包括(临床使用中的)利福霉素S、利福霉素SV、利福平(rifampicin)、利福布丁(rifabutin)、利福喷丁(rifapentine)和利福昔明(rifaximin)在内的半合成衍生物的起始材料。此外，从1960年起，对菌株S699实施传统的菌株改进程序，并且此菌株的后继用于利福霉素B的生产。目前，改进的工业菌株产生约15g/l至24g/l的利福霉素B。
如此前所述，开发了利福霉素B的半合成衍生物，以改善分子的药代动力学(图2)。利福平(3-[4-甲基哌嗪基亚氨基-甲基]利福霉素SV)于1968年在意大利首次被批准用于临床使用。它于1971年在美国获得食品与药物管理局的批准[Sensi.,P.等人(1983).Farmac.Ed.Sc.Vol.14,p.146-147]。它是首个利福霉素B的半合成衍生物，并已广泛用于结核病的治疗。它结合至结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的RNA聚合酶，并阻断RNA链的延伸。
利福霉素B的另一衍生物是利福布丁(4-N-异丁基螺哌啶基利福霉素S)。它以Mycobutin的名称上市。它的特点在于对一些耐利福平的菌株有效，并且具有抗艾滋病相关的鸟型分支杆菌复合体(Mycobacteriumaviumcomplex)的高活性。
利福霉素B的衍生物利福昔明(4-脱氧-3’-溴吡啶并-[1’,2’-1,2]咪唑并[5,4-c]-利福霉素SV)经口给药后在肠中实质上不吸收。此性质使之有利于用来治疗胃肠道内病原体局部病况。
利福喷丁(3{[(4-环戊基-1-哌嗪基)亚氨基]甲基}利福霉素SV)具有抗分枝杆菌活性和允许长效作用的药代动力学特性。它由SanofiAventis以Prifith的名称上市。它于1998年被食品与药物管理局批准用于结核病的治疗。
利福霉素的产生者地中海拟无枝酸菌具有有趣的历史。它是从距法国圣拉斐尔海滨约50m、海拔200m的松树园的土壤样品中分离出来的。由于形态和生物化学上的相似性，此分离物被分类为地中海链霉菌(Streptomycesmediterranei)[Margalith,P.和Beretta,G.(1960).Mycopathol.Mycol.Appl.Vol.13,p.321-330]。后来又重新分类为地中海拟无枝酸菌[Lechevalier等人(1986).Int.J.Sys.Bacteriol.Vol.36,p.29-37](需要参考文献)。Lal和同事开发了可用于地中海拟无枝酸菌多种菌株的转化和克隆的一系列克隆载体(pRL系列)[Lal,R.,US5985560A(1999)；Lal,R.等人(1991).Appl.Environ.Microbiol.Vol.57,p.665-671；Dhingra,G.等人(2003).Ind.Microbiol.Biotecnol.Vol.30,p.195-204]。
恰当地提到，红霉素(ery)、雷帕霉素(rap)和利福霉素(rif)的合成是通过由乙酸酯和丙酸酯单元的缩合而构建这些大环聚酮的模块化聚酮合酶(modularpolyketidesynthase)(多酶复合体，亦称为I型PKS)介导的。I型PKS具有共线性结构，并由模块(module)组成，各自具有决定基本链装配用的底物选择和随后的β-酮酯(聚酮)修饰的顺序的催化结构域。I型PKS模块通常包括形成最低限度PKS的酮基合酶(ketosynthase,KS)、酰基转移酶(acyltransferase,AT)和酰基载体蛋白(acylcarrierprotein,ACP)结构域。任选地可存在酮基还原酶(ketoreductase,KR)、脱水酶(dehydratase,DH)或烯酰还原酶(enoylreductase,ER)结构域(也称为还原性结构域)，以在酮酸酯链中引起修饰。起始单元(乙酰辅酶A)加载在由起始模块的AT结构域催化的ACP上。延伸链从先前模块的ACP交给当前模块的KS，并由KS结构域催化。AT结构域选择将要加至生长中的聚酮链的延伸单元的类型，KS催化缩合反应，以及ACP在连续的缩合之间拴住生长中的聚酮链，并接受来自AT的延伸单元，从而为下一次缩合反应作准备。生长中的聚酮由还原性环(reductiveloop)修饰。KR结构域将β-酮基还原成羟基。DH结构域消去水分子，产生α-β双键，并且ER结构域将α-β双键转化成饱和键。然后通过TE结构域的水解作用使碳骨架从PKS释放(图3)。虽然ACP、AT和KS的存在是模块中必需的，其它结构域例如KR、DH、ER是任选的，并且在模块中可以或者不必存在。
发现eryPKS和rapPKS基因簇之后，从地中海拟无枝酸菌S699克隆负责利福霉素B生物合成的全部90kbprifPKS基因簇[August,P.R.等人(1998).ChemBiol.Vol.5,p.69-71.]。生物合成基因簇分为4个区域。区域II(52kb)是最大的区域，并编码模块PKS。此区域分为5个开放读码框(ORF)-rifA、rifB、rifC、rifD和rifE。ORF包含按照在生物合成中的功能而共线性排列的10个模块，并催化连续的10轮聚酮链延伸以构建十一聚酮(图4)。基因rifA由模块1-3组成，rifB由模块4-6组成，rifC由模块7组成，rifD由模块8组成，rifE由模块9-10组成。模块内的结构域顺序为KS-酮基合酶、AT-酰基转移酶(任选的还原性结构域-DH-脱水酶和KR-酮基还原酶)和ACP-酰基载体蛋白(图5)。rifPKS中结构域ER不存在。在rifA基因之前是由激活起始单元而启动聚酮链形成的加载单元。rifPKS中有两类AT结构域。模块2和9中发现的AT结构域催化乙酸酯延伸单元的并入。其它8个模块具有催化丙酸酯延伸单元并入生长中的聚酮链的AT结构域。另一基因RifF紧接着位于rifE下游，与之翻译偶联。rifF的角色是环化聚酮链并同时将之从模块10的ACP结构域释放[Stratmann,A.等人(1999).Microbiol.Vol.145,p.3356-3375]。
萘部位的形成发生在第三和第四链延伸步骤之间，并且不是后PKS修饰。此步骤在本发明下文的交换策略的设计中是关键的。
临床中利福霉素衍生物特别是利福平的使用导致TB所致的死亡率明显降低。然而不良的依从性和不良的医药监管的结合已导致结核分枝杆菌的多重耐药(multipledrugresistance,MDR)株的产生。根据2011年WHO报告，东南亚区域、印度的结核病控制中心在新报告的TB病例中记录到2.3％的MDR-TB病例。如前所述，利福霉素B结构的复杂性使得化学工具的使用仅限于分子的C-3和C-4。这降低了可通过化学合成而产生的变化分子的排列组合的数目。对用于有效经济的MDR-TB治疗的利福霉素类似物的生产有强烈需求。
利福霉素B的半合成衍生物，例如利福平和利福布丁，已广泛用于结核病(结核分枝杆菌)、麻风病(麻风分枝杆菌)和艾滋病相关的分枝杆菌感染的治疗。利福平于1968年首次引入市场。此后利福平广泛地用于治疗结核病。然而不良的依从性和不良的医药监管的结合已导致结核分枝杆菌的多重耐药(MDR)株的产生。药物公司和医药界在寻找可有效对抗MDR-TB的经济的药物。利福霉素B化学结构的复杂性仅允许通过已完全使用的化学修饰在芳香核的C-3和C-4处进行如上所述的化学改变。
另一选择是组合生物合成，其涉及在产生利福霉素的生物体中向已有的PKS基因簇交换/删除/添加模块/结构域，以创造可产生目标分子的非自然的基因集合。具有共线性排列的聚酮合酶基因簇可按此方式改组，并已被证实来产生红霉素类似物。虽然在红霉素分子的方向上已进行了广泛工作(前面章节引用的文献)，但还没得到用于rifPKS操纵的报道。因此本领域需要开发在治疗TB中有更好、更高程度效果的目标分子，并且也需要开发TB细菌不耐受的此类新分子。
发明内容
因此，本发明的主要实施方案涉及具有下列化学结构及其盐的抗菌化合物和/或其盐：
本发明的另一实施方案涉及本发明的抗菌化合物，其对细菌引起的感染或疾病有用。
本发明的另一实施方案涉及本发明的抗菌化合物，其对分枝杆菌属物种引起的感染或疾病有用。
本发明的另一实施方案涉及本发明的抗菌化合物，其对分枝杆菌属物种引起的感染或疾病有用，其中选择的分枝杆菌属物种为结核分枝杆菌和结核分枝杆菌的MDR株。
本发明的另一实施方案还涉及药物组合物，其包含具有下列化学结构的抗菌化合物和/或其盐和它们药学上可接受的载体：
本发明的另一实施方案还涉及一种治疗方法，其包括向患者给予具有下列结构的抗菌化合物和/或其盐：
本发明的另一实施方案还涉及用于治疗疾病或感染的具有下列化学结构的抗菌化合物和/或其盐用于制备药物的用途：
本发明的另一实施方案涉及包含本发明的抗菌化合物的药物用于治疗疾病或感染的用途。
本发明的另一实施方案还涉及包含本发明的抗菌化合物的药物用于治疗细菌引起的疾病或感染的用途。
本发明的另一实施方案涉及地中海拟无枝酸菌S699的新菌株#34，其包含基因rapAT2区域。
本发明的另一实施方案还涉及地中海拟无枝酸菌S699的新菌株#34，其中rifAT6区域与rapAT2区域交换。
本发明的另一实施方案涉及地中海拟无枝酸菌S699的新菌株#34，其能够产生包括下列化学结构的利福霉素B的类似物和衍生物：
本发明的另一实施方案涉及包含rifPKS中的rapAT2区域的地中海拟无枝酸菌S699的新菌株的制备方法，所述方法包括下列步骤：
(a)分离来自地中海拟无枝酸菌S699的rifPKS的rifAT6区域，以及吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)(Acc.No.DSM-41524)的rapAT2区域；
(b)通过将rifPKS的rifAT6区域与吸水链霉菌(Acc.No.DSM-41524)的rapAT2区域交换，制备载体构建体；
(c)将步骤(b)的载体构建体插入地中海拟无枝酸菌S699；和
(d)获得包含rifPKS的rapAT2区域的地中海拟无枝酸菌S699的新菌株#34。
本发明的另一实施方案涉及新型抗菌化合物的制备方法，所述方法包括下列步骤：
(a)培养包含rifPKS区域中的rapAT2区域的地中海拟无枝酸菌S699#34的细胞；和
(b)收获地中海拟无枝酸菌S699#34的细胞，从而获得产物的粗级分；
(c)通过HPLC纯化粗产物；
(d)获得抗菌化合物24-脱甲基利福霉素B和24-脱甲基利福霉素SV。
本发明的另一实施方案涉及一种制备24-脱甲基利福霉素B的衍生物24-脱甲基利福霉素S的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)在选自氯化铜的试剂的存在下使24-脱甲基利福霉素B反应；
(b)在室温下使步骤(a)的反应过夜进行；
(c)获得24-脱甲基利福霉素S。
一种制备24-脱甲基利福霉素B的衍生物24-脱甲基利福平的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)在二甲基甲酰胺(DMF)和乙酸的存在下使24-脱甲基利福霉素B反应；
(b)向步骤(a)的混合物添加多聚甲醛和1,3,5-三甲基-六氢-1,3,5-三嗪；
(c)获得3-甲基-1,3-噁嗪并(oxazino)(5,6-c)-24-脱甲基利福霉素；
(d)使步骤(c)的化合物与1-氨基-4-甲基-哌嗪反应；和
(e)获得24-脱甲基利福平。
本发明的另一实施方案涉及重组核苷酸SEQIDNo.1。
本发明的另一实施方案涉及含有核苷酸SEQIDNO.1的细菌菌株。
本发明的另一实施方案涉及如本发明所记载的含有核苷酸SEQIDNO.1的细菌菌株。
本发明的另一实施方案涉及如本发明所记载的细菌菌株，其中所述细菌菌株能够产生利福霉素类似物。
本发明的另一实施方案涉及含有重组核苷酸序列IDNo.1的载体构建体。
本发明的另一实施方案还涉及载体构建体，其中所述载体构建体为pAT6E和pAT6F。
附图说明
当参考附图阅读下面的详细说明时，将更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优点，在附图中相同文字始终表示相同部分，其中：
图1：利福霉素B的化学结构。
图2：利福霉素B的半合成衍生物。
图3：1型PKS进行性机理(processivemechanism)的图示。
图4：通过区域II的利福霉素PKS的假定中间体的合成。
图5：rifPKS基因簇中酶结构域的组织。
图6：通过rifAT6与rapAT2交换而构建功能性盒的策略。
图7：示出rifAT6与rapAT2交换的策略的图示。
图8：示出单交换型(SingleCrossover)克隆的培养物的表观。
图9：单交换型克隆的凝胶电泳图谱。
图10：示出双交换型克隆的培养物的表观。
图11：双交换型克隆的凝胶电泳图谱。
图12：从DCO提取的类似物脱甲基利福霉素B的LC-ESI-MS图谱。
图13：利福霉素B及其类似物的NMR。
图14：24-脱甲基利福霉素B、24-脱甲基利福霉素S和24-脱甲基利福霉素SV的结构。
图15：24-脱甲基利福霉素S的晶体结构和与RNA聚合酶A的药物相互作用。
图16：(a)利福霉素S；(b)24-脱甲基利福霉素S；(c)利福平；(d)24-脱甲基利福平的ESI-MS谱。
图17：(a)24-脱甲基利福平；(b)化学合成的利福平和(c)商购可得的利福平的NMR谱。
图18：(a)24-脱甲基利福平和(b)利福平的比较MS/MS分析。
图19：ESI阴离子模式中利福平和24-脱甲基利福平特征性MS碎片。
图20：新型利福霉素类似物抗各种细菌物种的抗菌试验。
图21：利福平、利福霉素S、24-脱甲基利福平、24-脱甲基利福霉素S的活性的抗菌试验。
图22：核苷酸序列IDNo.1。
具体实施方式
虽然本发明可以进行各种修改和/或替代的方法和/或组成，其具体的实施方案已通过绘图/图和表举例说明的方式示出，并将在下文中详细描述。但是应理解，不意图将本发明限制于公开的特定方法和/或组成，相反，本发明将覆盖落入由所附权利要求限定的本发明的精神和范围以内的所有变形、等同和替代。
已通过图中常规的陈述适当示出图、表、式和方案，仅示出与理解本发明实施方案有关的具体细节，以便不会将本公开与对于从本文的记载获益的本领域的普通技术人员而言显而易见的细节相混淆。
下列记载仅是示例性的实施方案，并且不意图以任何方式限制本发明的范围、适用性或配置。相反，下列记载提供对实施本发明的示例性实施方案的方便的解释。只要不偏离本发明的范围，对记载的实施方案，在记载的要件的功能和排列上可进行各种变化。
术语“包括”、“包含”或其任何其它变形意在覆盖非排除性的包含，因而由“包含…”开头的一种或多种方法或组成或系统或方法没有更多限制，不排除其它的方法、子方法、组成、子组成、次要或主要组成或其它元素或其它结构或另外的方法或组成或另外的元素或另外的特征或另外的特点或另外的属性的存在。
定义：
为了本发明的目标，下列术语将具有如本文所述的含义：
如本文中使用，当在本发明的语境中使用时，术语“组合途径或组合生物合成”是指通过将地中海拟无枝酸菌S699的rifPKS基因簇的rifAT6结构域与吸水链霉菌的rapPKS基因簇的rapAT2结构域交换而进行的rifPKS基因簇的基因操作。
如本文中使用，当在本发明的语境中使用时，术语“载体/克隆载体”是指载体系列pAT6A、pAT6B、pAT6C、pAT6D、pAT6E和pAT6F的建立。pAT6F是转化入地中海拟无枝酸菌S699的非复制性质粒。
如本文中使用，当在本发明的语境中使用时，术语“衍生物”是指从24-脱甲基利福平B获得或制备的衍生物。一些示例性的衍生物为24-脱甲基利福平、24-脱甲基利福霉素S和24-脱甲基利福霉素SV。
如本文中使用，当在本发明的语境中使用时，术语“类似物”是指利福霉素B的类似物，其通过用rapAT2结构域来交换rifAT6结构域而制备，或者含有由rapAT2结构域替换的rifAT6结构域。一种此类示例性类似物为24-脱甲基利福霉素B。
如本文中使用，当在本发明的语境中使用时，术语“突变体或突变株”是指rifAT6结构域被PKS-1系统的rapAT2结构域替换，并且能够产生利福霉素B的类似物和衍生物的地中海拟无枝酸菌株。例如：产生例如24-脱甲基利福霉素B等类似物的地中海拟无枝酸菌#34。
如本文中使用，当在本发明的语境中使用时，术语“抗菌化合物”是指能抑制细菌生长、或细菌引起的感染、或细菌引起的疾病、或属于放线菌类的细菌或任何格兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌引起的病况的化合物。特别地，本发明的语境中使用的抗菌化合物是指有效抑制属于分枝杆菌属物种的细菌的生长的抗菌化合物。此外，本发明的语境中使用的抗菌化合物是指有效抑制由属于分枝杆菌属物种的细菌引起的任何疾病或任何感染或病况的抗菌化合物。
如本文中使用，当在本发明的语境中使用时，术语“多重耐药/MDR”是指使得引起疾病的细菌能够耐受确切的抗微生物剂或抗菌化合物，即目标在于消灭细菌的广泛结构和功能的化学品的情况。特别地，本发明的语境中使用的MDR是指使得引起疾病的分枝杆菌属物种能够耐受确切的抗微生物剂或抗菌化合物的情况，其中此类抗微生物剂或抗菌化合物是通常使用的抗生素药或商购可得的抗微生物剂或抗菌化合物。
如本文中使用，当在本发明的语境中使用时，术语“其盐”是指24-脱甲基利福霉素B、24-脱甲基利福霉素S、24-脱甲基利福霉素SV和24-脱甲基利福平的任何盐、酯、多晶型物、纯形式、异构体、异构体混合物、复合物和任何其它衍生物或类似物。更特别地，其盐例如盐、酯、多晶型物、纯形式、异构体、异构体混合物、复合物和任何其它衍生物应至少含有24-脱甲基-形式或结构，即，在24-脱甲基利福霉素B、24-脱甲基利福霉素S、24-脱甲基利福霉素SV和24-脱甲基利福平的类似物、衍生物、盐、酯、多晶型物、纯形式、异构体、异构体混合物、复合物中，在24位失去甲基。
本发明涉及可有效对抗细菌性疾病或感染的抗菌化合物。更特别地，本发明涉及可有效对抗由落入放线菌类的革兰氏阳性菌的细菌群体引起的感染或疾病的抗菌化合物的用途。本发明的抗菌化合物对多重耐药性细菌有用。本发明的抗菌化合物对例如分枝杆菌属物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种或菌株、杆菌属(Bacillus)物种或菌株、假单胞菌属(Pseudomonas)物种或菌株和大肠杆菌(E.coli)菌株有用。
此外，本发明涉及对分枝杆菌属物种引起的感染或疾病有用的抗菌化合物。特别地，这些抗菌化合物在抗结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌和耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)中有效。本发明的另一方面提供对分枝杆菌属物种的多重耐药株有用的抗菌化合物。
利福霉素分离为利福霉素复合物的同类物(congeners)[SensiP.等人(1983).Farmac.Ed.Sc.Vol.14,p.146-147]，并且rifPKS在1998年被完整测序[August,P.R.等人(1998)Chem.Biol.Vol.5,p.69-79]。此后已进行了很多研究来阐明基因簇的功能和利福霉素B的结构和作用。然而，rifPKS在利福霉素B生产中的独特性质长久阻碍了利福霉素B类似物的生产进程。在这之前，难以基因操作地中海拟无枝酸菌的rifPKS，因为对于地中海拟无枝酸菌还不能得到有效的基因技术和克隆载体。由于本发明的发明人之一已开发出了可用于转化和克隆地中海拟无枝酸菌一些菌株的一系列克隆载体(pRL系列)[Lal,R.,US5985560A(1999)；Lal,R.等人(1991).Appl.Environ.Microbiol.Vol.57,p.665-671；Dhingra,G.等人(2003).Ind.Microbiol.Biotecnol.Vol.30,p.195-204]，并且这样开发的电转化方法已用来操作产生利福霉素类似物用的rifPKS基因簇。rifPKS的操作也基于如下事实：过去红霉素(eryPKS)和雷帕霉素(rapPKS)的聚酮合酶的模块化性质在新型生物工程化聚酮的生产中已产生了相当大兴趣。由于早期克隆了eryPKS和rapPKS，在1998年，利福霉素生物合成基因簇或rifPKS的克隆和表征[August,P.R.等人(1998).Chem.Biol.Vol.5,p.69-79]为通过使用已用于eryPKS的类似途径来操作用于产生利福霉素类似物的rifPKS基因簇打开了可能性。在本发明中，使用了组合途径，其中地中海拟无枝酸菌S699的利福霉素聚酮合酶(rifPKS)簇已被基因操作来生产利福霉素B的类似物。
虽然在过去的40年中已通过化学方法来合成利福霉素的多种衍生物，但现在仅有屈指可数的利福霉素衍生物用于治疗结核病。多数利福霉素衍生物，包括临床上使用的，是在萘部位的C-3和/或C-4位被化学修饰。由于分子的复杂性，化合物其它部分的化学修饰出现困难。此外，与利福平复合的水生栖热菌RNAP的X-射线晶体学研究揭示，分子中的四个游离羟基对于RNAP结合是重要的[Campbell,E.A.等人(2001).Cell.Vol.104,p.901-912])。因此，对这些羟基的修饰是不希望的。从前述角度，本发明是独特的，因为本发明设计了一种策略，来开发聚酮骨架中发生修饰的新型类似物和衍生物。
在本发明中，开发了地中海拟无枝酸菌S699的突变体，用于生产利福霉素B的类似物，24-脱甲基利福霉素B，这也是对通过使用这种途径来生产利福霉素B的多种类似物而开启的组合生物合成的概念的证明。此类似物的衍生物有效对抗结核分枝杆菌的MDR株。更重要地，本发明首次提供了对于可通过生产利福霉素B类似物用的组合途径在模块4之外操作rifPKS基因簇的概念的证明。现在可改进突变株供商业应用。
因此本发明提供用于操作地中海拟无枝酸菌S699的rifPKS的组合生物合成策略。因而在本发明中，设计的策略允许将(募集丙酸酯的)rifPKS的第六模块(AT6)的酰基转移酶结构域与(将乙酸酯募集到生长链上的)rapPKS的第二模块(rapAT2，来自吸水链霉菌(有登录号：X86780.1和DSM培养物保藏-DSM41524))的酰基转移酶结构域交换。这些区域的交换导致产生的利福霉素B的新的类似物，即24-脱甲基利福霉素B的开发和生产。此外本发明也设计策略来开发24-脱甲基利福霉素B的衍生物。由此发现开发的新的类似物和衍生物有效对抗多种细菌物种(图20-21)。更具体地，发现这些新的类似物和衍生物有效对抗结核分枝杆菌的MDR菌株。
尽管有已知事实，即已知如rifPKS的复杂聚酮系统对于通路工程而言本质上较难改变，是由于下游的酶对于接受经修饰的底物的刚性，或由于经修饰的PKS系统的结构模块性的不兼容[Khosla,C.等人(2009).Curr.Opin,Chem..Biol.Vol.13,p.135-143]。本发明不仅鉴别出途径来阐明和解出rifPKS系统目前的缺点，还达成对分枝杆菌的已知和/或耐药菌株高度有效的类似物和衍生物。由此解决了在利福霉素聚酮骨架，特别是作为rifPKS基因的rifAT6区域的目标的萘醌环的合成的步骤中设计的rifPKS系统的性质不可改变的现有问题。用结构域替换策略，将此rifPKS基因簇的rifAT6区域与rapAT2交换。这导致新的利福霉素类似物，即24-脱甲基利福霉素B，和进一步的其衍生物，即24-脱甲基利福霉素S、24-脱甲基利福霉素SV和24-脱甲基利福平。
24-脱甲基利福霉素B及其衍生物的这些类似物；24-脱甲基利福霉素SV、24-脱甲基利福霉素S和24-脱甲基利福平，不仅是以可比的量产生，还表现更强的抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、耻垢分枝杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、大肠杆菌(Escherichiacoli)的抗菌活性。
本发明也提供能够产生利福霉素B的类似物即24-脱甲基利福霉素B的地中海拟无枝酸菌S699的突变菌株。本发明也提供开发地中海拟无枝酸菌S699的突变菌株的方法。在本发明中已发现，地中海拟无枝酸菌S699的菌株在增殖中、并且也在利福霉素B类似物的表达中相当稳定。从这些突变体中生产类似物已以实验室规模进行。产量为约50mg/L的类似物24-脱甲基利福霉素B。
从地中海拟无枝酸菌S699的突变菌株产生的类似物的NMR研究表明，利福霉素B和24-脱甲基利福霉素B的NMR谱图有显著差异(图13)。NMR谱图显示，24-脱甲基利福霉素B有m/z740的准分子离子，而24-脱甲基利福霉素SV的准分子离子为m/z682，这比利福霉素B和利福霉素SV少14个原子质量单位。
利福霉素耐受性与编码DNA-依赖性的RNAPβ-亚基的rpoB基因的81-bp区域中的基因改变有关(Williams等人.1998.Mycobacteriumtuberculosis.Antimicrob.Agents.Chemother.,Vol.42,1853-1857页)。本发明使用耐利福平结核分枝杆菌菌株，即在其RNAPβ-亚基中含S531L突变的OSDD321和OSDD206，和含H526T突变的OSDD55。突变在OSDD菌株中确认。基于序列数据，本发明发现耐药突变破坏了聚酮的柄(ansa)链中的氢键和可能的盐桥(图15b)。然而24-脱甲基利福平中甲基的失去可能导致柄链中的构象变化，使得化合物具有更多的柔性而结合突变的RNAP。因此相信除了有利的分配系数以外，从柄链的旁式(gauche)、顺戊烷和重叠相互作用的差异产生的柔性，以及与构象变化相关的氢键网络中的变化(图15c)，导致野生型和耐药菌株中的结合亲和性都增加。这种可能的构象柔性可能也与24-脱甲基利福平不稳定的1H和13CNMR谱联系。从前文的角度，本发明中提供的最意想不到和独特的发现是，24-脱甲基利福平抗结核分枝杆菌的利福平敏感和利福平耐药菌株的活性。24-脱甲基利福平表现出更强的抗结核分枝杆菌的利福平耐药菌株的活性。因此本发明的此发现向罹患分枝杆菌已对现有利福平药物或相关药物变得耐受的结核病的患者打开了完全的希望。这些结果与计算的自由能扰动(freeenergyperturbation,FEP)研究相映证，FEP研究显示，相比于利福霉素B，RNAP以1.2kcal/mol优先选择24-脱甲基利福霉素B(表1)。这是意义重大的，因为现在可开发此化合物作为治疗MDR-TB的具前景的导向。
表1.24-脱甲基利福霉素B和野生型RNAP的计算自由能扰动(FEP)研究
*所有能量的单位为kcal/mol。
由此，本发明通过首次显示rifPKS对结构域替换修饰是可变化的，而展示出利福霉素B的新型类似物和衍生物的产生，导致新型利福霉素类似物的形成。
本发明提供独特的能够产生利福霉素类似物的重组序列IDNo.1(图22)。本发明也提供包含重组序列IDNo.1的载体构建体。
本发明提供携带核苷酸序列IDNo.1的地中海拟无枝酸菌S699的新菌株#34。更具体地，此新菌株的参考号为地中海拟无枝酸菌S699#34，携带重组子SEQIDNo.1(图22)，该重组子向菌株提供独特的特性，并且此独特特性允许新菌株表达或产生利福霉素类似物，例如24-脱甲基利福霉素B和24-脱甲基利福霉素S。
本发明也提供有效对抗细菌物种特别是分枝杆菌的本发明中记载的抗菌化合物及其盐的药物组合物。本发明的药物组合物意在用于肠胃外和口服给药。优选地，本发明如此处记载的药物组合物可肠胃外地给药，例如静脉、皮下、皮内或肌内给药。本发明也提供作为“药学上可接受的辅料”功能的物质，其中术语“药学上可接受的辅料”意指用来实现如本文记载的抗菌化合物的传递、溶解或悬浮的药学上可接受的制剂载体、溶液或添加剂。本发明的药物组合物按需也可含有药学上可接受的辅助物质，从而近似生理状态，例如pH调节和缓冲剂、渗透压调节剂和湿润剂等。本发明的药物组合物也可含有药学上可接受的载体，例如佐剂等。此发明的药物组合物也可按任何方便的形式给药，例如片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂或粉末形式，例如在小袋中的。
将参照发明的非限制性实施方案进一步解释本发明。
因此，本发明的主要实施方案涉及具有下列化学结构及其盐的抗菌化合物：
本发明的另一实施方案涉及本发明的抗菌化合物，其对细菌引起的感染或疾病有用。
本发明的另一实施方案涉及本发明的抗菌化合物，其对分枝杆菌属物种引起的感染或疾病有用。
本发明的另一实施方案涉及本发明的抗菌化合物，其对分枝杆菌属物种引起的感染或疾病有用，其中选择的分枝杆菌属物种为结核分枝杆菌和结核分枝杆菌的MDR株。
本发明的另一实施方案还涉及药物组合物，其包含具有下列化学结构的抗菌化合物和/或其盐和它们药学上可接受的载体：
本发明的另一实施方案涉及药物组合物，其包含对细菌引起的感染或疾病有用的本发明的抗菌化合物。
本发明的另一实施方案涉及药物组合物，其包含对分枝杆菌属物种引起的感染或疾病有用的本发明的抗菌化合物。
本发明的另一实施方案还涉及药物组合物，其包含对结核分枝杆菌和结核分枝杆菌的MDR菌株引起的感染或疾病有用的本发明的抗菌化合物。
本发明的另一实施方案还涉及一种治疗方法，其包括，向患者给予具有下列结构的抗菌化合物或其盐：
本发明的另一实施方案还涉及用于治疗疾病或感染的、具有下列化学结构的抗菌化合物或其盐用于制备药物的用途：
本发明的另一实施方案还涉及具有下列化学结构的抗菌化合物或其盐用于制备药物的用途：
本发明的另一实施方案涉及含有本发明的抗菌化合物的药物用于治疗疾病或感染的用途。
本发明的另一实施方案还涉及含有本发明的抗菌化合物的药物用于治疗细菌引起的疾病或感染的用途。
本发明的另一实施方案还涉及含有本发明的抗菌化合物的药物用于治疗分枝杆菌属物种引起的疾病或感染的用途。
本发明的另一实施方案涉及含有如权利要求10或13中所要求的本发明的抗菌化合物的药物用于治疗分枝杆菌属物种、结核分枝杆菌和结核分枝杆菌的MDR菌株引起的疾病或感染的用途。
本发明的另一实施方案涉及含有本发明的抗菌化合物和药学上可接受的载体的药物组合物的制备方法。
本发明的另一实施方案涉及地中海拟无枝酸菌S699的新菌株#34，其包含基因rapAT2区域。
本发明的另一实施方案还涉及地中海拟无枝酸菌S699的新菌株#34，其中rifAT6区域与rapAT2区域交换。
本发明的另一实施方案涉及地中海拟无枝酸菌S699的新菌株#34，其能够产生如本文所记载的利福霉素B的类似物和衍生物。
本发明的另一实施方案涉及地中海拟无枝酸菌S699的新菌株#34，其能够产生包含下列化学结构的利福霉素B的类似物和衍生物：
本发明的另一实施方案涉及包含rifPKS中的rapAT2区域的地中海拟无枝酸菌S699的新菌株#34的制备方法，所述方法包括下列步骤：
(a)分离来自地中海拟无枝酸菌S699的rifPKS的rapAT6区域，以及吸水链霉菌(登录号DSM-41524)的rapAT2区域；
(b)通过将rifPKS的rapAT6区域与吸水链霉菌(登录号DSM-41524)的rapAT2区域交换，制备载体构建体；
(c)将步骤(b)的载体构建体插入地中海拟无枝酸菌S699；和
(d)获得包含rifPKS的rapAT2区域的地中海拟无枝酸菌S699的新菌株#34。
本发明的另一实施方案涉及制备新型抗菌化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)培养包含rifPKS区域中的rapAT2区域的地中海拟无枝酸菌S699#34的细胞；和
(b)收获地中海拟无枝酸菌S699#34的细胞，从而获得产物的粗级分；
(c)通过HPLC纯化粗产物；
(d)获得抗菌化合物24-脱甲基利福霉素B和24-脱甲基利福霉素SV。
本发明的另一实施方案涉及一种制备24-脱甲基利福霉素B的衍生物24-脱甲基利福霉素S的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)在选自氯化铜的试剂的存在下使24-脱甲基利福霉素B反应；
(b)在室温下使步骤(a)的反应过夜进行；
(c)获得24-脱甲基利福霉素S。
一种制备24-脱甲基利福霉素B的衍生物24-脱甲基利福平的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)在二甲基甲酰胺(DMF)和乙酸的存在下使24-脱甲基利福霉素B反应；
(b)向步骤(a)的混合物添加多聚甲醛和1,3,5-三甲基-六氢-1,3,5-三嗪；
(c)获得3-甲基-1,3-噁嗪并(5,6-c)-24-脱甲基利福霉素；
(d)使步骤(c)的化合物与1-氨基-4-甲基-哌嗪反应；和
(e)获得24-脱甲基利福平。
本发明的另一实施方案涉及重组核苷酸SEQIDNo.1。
本发明的另一实施方案涉及含有核苷酸SEQIDNO.1的细菌菌株。
本发明的另一实施方案涉及含有核苷酸SEQIDNO.1的地中海拟无枝酸菌S699#34菌株。
本发明的另一实施方案涉及本发明的细菌菌株，其中细菌菌株能够产生利福霉素类似物。
本发明的另一实施方案涉及地中海拟无枝酸菌S699#34菌株，其中细菌菌株能够产生利福霉素类似物。
本发明的另一实施方案涉及重组核苷酸SEQIDNo.1，其能表达利福霉素的新型类似物。
本发明的另一实施方案涉及本发明的重组核苷酸序列，其中所述类似物为24-脱甲基利福霉素B和24-脱甲基利福霉素S。
本发明的另一实施方案涉及包含重组核苷酸序列IDNo.1的载体构建体。
本发明的另一实施方案还涉及载体构建体，其中所述载体构建体为pAT6E和pAT6F。
本发明的另一实施方案涉及包含如本发明记载的载体构建体的细菌菌株。
本发明的另一实施方案涉及包含如本发明记载的载体构建体的地中海拟无枝酸菌S699#34菌株。
本发明的另一实施方案涉及携带pAT6F载体的地中海拟无枝酸菌S699#34菌株，其中所述pAT6F载体包含核苷酸序列No.1。
本发明的另一实施方案涉及能携带pAT6F载体的细菌菌株，其中所述pAT6F载体包含核苷酸序列No.1。
本发明的另一实施方案涉及能携带pAT6F载体的微生物菌株，其中所述pAT6F载体包含核苷酸序列No.1。
本发明的另一实施方案涉及能表达核苷酸序列No.1和/或其产物的微生物菌株。
虽然还没有关于通过组合生物合成来操作利福霉素B的骨架的报道，但有在其它聚酮合酶基因上尝试组合生物合成的报道。如本发明的记载而明白的，在通过使用组合途径而改变利福霉素B分子中取得了值得注意的成功。
下列记载仅是示例性的实施方案，并且不意图对本发明的范围、适用或配置以任何方式进行限制，相反，下列记载提供了对本发明的示例性事实方案的方便的阐释。对于记载的实施方案，可在不偏离本发明范围的前提下对要件的功能和排列进行各种变化。
实施例
实施例1
地中海拟无枝酸菌S699的基因操作。
常规的基因方法，例如基因组DNA分离(根据CTAB-溴化十六烷基三甲基铵法)、质粒分离(PromegaDNA纯化试剂盒)和限制性内切酶消化按标准技术进行。构建质粒pAT6F，用此前记载的方法[Dhingra,G.等人(2003).J.Ind.Microbiol.Biotechnol.Vol.13,p.195-204]向地中海拟无枝酸菌S699中转化(用BioRadGenePulser)，并且电穿孔混合物涂在每升含有4g酵母提取物、10g麦芽提取物和4g葡萄糖的YMG琼脂板(pH7.2)上。上铺有含500μg/mL红霉素的软琼脂(5g/L，DifcoTM琼脂，颗粒状)，以便在温育12-16h后赋予抗性。5-7天后获得的转化物在含50μg/mL红霉素(SigmaAldrich)的YMG培养基中生长来确认抗性。这些单交换型(SCO)克隆中pAT6F的整合通过DNA印迹杂交确认。为影响rifAT6由rapAT2的替换，这些SCO在没有红霉素的YMG培养基中培养3-4轮。细胞涂在有和没有红霉素压力的YMG琼脂板上，并选择抗生素敏感的克隆。双杂交(DCO)克隆进一步通过DNA印迹杂交确认。对于DNA杂交，基因组DNA固定在HybondN+膜(AmershamBiosciences)上。用[α-32P]标记的DNA探针，在65℃下进行杂交12h。对于非放射性方法，杂交用DIG-标记的DNA探针在65℃下进行。严格洗涤在65℃下用5×SSC、2×SSC、1×SSC和0.1×SSC进行。获得的DCO克隆含有重组核苷酸序列IDNo.1(图22)。如记载和描述的含有重组核苷酸序列IDNo.1的地中海拟无枝酸菌S699克隆被予以(内部)参考号地中海拟无枝酸菌S699#34。
PCRI和PCRII用引物的构建
用寡聚引物，即引物I和II(表1)分别作为正向和反向引物，扩增位于rifAT6上游的AT6侧翼区域，也称为PCRI(41862-43533bp)。为了帮助将PCRI克隆入pUC18的SmaI位点，限制性位点XbaI和BalI分别引入引物I和II的5’端。这些位点随后用于克隆。
类似地，用引物对引物III和引物IV(表2)扩增位于rifAT6下游的PCRII(44488-45989bp)。在5’端，向引物III中引入AvrII位点，并向引物IV引入XbaI，用于后续的pUC18中的克隆。
表2：用于扩增PCRI和PCRII的引物的序列
在所有引物中为产生限制性位点而插入的另外核苷酸用红色标出。PCRI和PCRII的正向引物中产生的限制性酶切位点的核苷酸序列用浅蓝色标出，而在反向引物中用黄色标出。
实施例2
pAT6A、pAT6B和pAT6C的构建
PCRI和PCRII产物从黏粒克隆no.13上的rifPKS产生。然后在线性化并去磷酸化的pUC18的SmaI位点进行多核苷酸激酶处理的PCRI或PCRII片段的连接。接下来，连接混合物转入大肠杆菌JM101。pUC18中含有PCRI和PCRII的质粒分别命名为pAT6A和pAT6B。在质粒‘pAT6A’中，PCRI逆向连接至后续克隆所需的质粒。根据所需的方向，PCRI的XbaI位点应与质粒的NdeI位点相邻，然而获得的克隆有远离质粒的NdeI位点的XbaI位点。为了使方向反转，用EcoRI/HindIII双酶切切下PCRI，并引入pUC19，最终得到质粒pAT6C。
实施例3
pAT6D的构建
质粒pMO2[Olinyk,M.等人(1996).Chem.Biol.Vol.3,p.833-839])，其中克隆有来自吸水链霉菌的雷帕霉素生物合成的基因簇的模块2(AT2)的酰基转移酶，用AvrII/HindIII消化，以释放rapAT2结构域。质粒pAT6B也用AvrII/HindIII消化，并将rapAT2与线性化的pAT6B连接，并将连接混合物转入大肠杆菌JM101，并选择含有正确插入的克隆。这些构建体命名为pAT6D。
实施例4
pAT6E的构建
通过用BalI/NdeI消化pAT6C而切下PCRI，同时用BalI/NdeI消化pAT6D。将来自pAT6C的插入物和线性化pAT6D连接，连接混合物转入大肠杆菌JM101。这样获得的构建体命名为pAT6E。
实施例5
[发展用于交换的功能性盒(pAT6F-8.3kb)的策略(图6)]:
最终盒pAT6F的构建
质粒pAT6E用XbaI消化，以释放PCRI-rapAT2-PCRII片段(约4kb)，并克隆入XbaI消化的含红霉素抗性基因的载体pIJ4026。pIJ4026(由M.J.Bibb,JohnInnesInstitute,Norwich提供)(图6)是大肠杆菌质粒，但含有赋予对红霉素抗性的ermE基因，并仅在地中海拟无枝酸菌中表达，而不在大肠杆菌中表达。包含由pIJ4026中的PCRI、rapAT2和PCRII片段组成的3.85片段的最终的构建体命名为pAT6F。3.85kb片段命名为SEQIDNO.1(图22)。
此质粒pAT6F通过电穿孔(7.5KV/Cm,1000Ω,25μF)转化入地中海拟无枝酸菌S699。在GYM琼脂培养基(葡萄糖4g/l；麦芽提取物10g/l；酵母提取物4g/l)中、红霉素压力下选择单交换型克隆。选择没有表现出棕色着色的单交换(SCO)克隆(这是由于通过同源重组，pAT6F整合入染色体，生物合成通路被阻断因而利福霉素的产生缺失)(图7和8)。如本发明所述的含核苷酸序列IDNo.1的质粒pTA6F示于图22。
为确认基因型，来自这些单交换(S.C.O.)型克隆的DNA与质粒(pIJ4026)杂交。4个SCO克隆(1-5,2-2,6-1,6-2)显示阳性杂交信号(图9)。为了选择双交换(D.C.O.)，阳性SCO型克隆2-2在没有红霉素压力的条件下进一步培养3-4代。选择有能力产生利福霉素(恢复棕色着色)的红霉素敏感双交换(D.C.O.)型克隆。这些克隆具有与rapAT2交换的rifAT6(图7)。通过过DNA杂交和DNA测序，以基因水平再次对获得的D.C.O.(图10)进行AT2结构域而不是AT6存在的检查。四个克隆表现出有rapAT2基因的阳性信号(图11)。含有重组序列IDNo.1的D.C.O克隆命名为地中海拟无枝酸菌S699#34。
由这些DCO克隆产生的期望的利福霉素类似物用LCESI-MS分析。这些阳性克隆仅有3个(#3、#34和#36)产生期望的类似物(图12)。结果通过1HNMR确认(图13)。发现类似物的分子量为741，这比天然的利福霉素B的分子量(755)少14amu(原子质量单位(atomicmassunit))。
突变菌株的孢子最初在30℃、200rpm下、YMG培养基中，在摇床上生长3天。然后用种子培养物接种(10％,v/v)500mL烧瓶中的YMG培养基(10×100mL)。在相同条件下温育10天后，将培养物离心，用1NHCl将采集的上清酸化至pH3，并用乙酸乙酯(2×1L)提取代谢产物。对利福霉素相关化合物的粗提取物进行硅胶色谱，用CHCl3-MeOH/5％NH4OH(10:1，然后8:1)作为流动相。汇集含产物的级分，并用旋转蒸发仪干燥。获得的产物进一步用HPLC[YMC-ODS-A,250×10mm,CH3CN-HCOONH4(0.05M)(60:40),流速2mL/min,254nm]纯化。然后用SephadexLH-20柱，以MeOH作为洗脱剂，将产物脱盐，以给出24-脱甲基利福霉素B(20mg)和24-脱甲基利福霉素SV(8mg)。
24-脱甲基利福霉素B：1HNMR(700MHz,D2O,CryoProbe):δ6.69(s,1H,H-3),6.34(d,1H,J＝12Hz,H-29),5.98(d,J＝11Hz,1H,H-17),5.75(dd,J＝15Hz,11Hz,1H,H-18),5.21(dd,J＝15Hz,10Hz,1H,H-19),5.05(m,2H,H-25,H-28),4.50(d,J＝17Hz,1H,-CH2-COOH),4.42(d,J＝17Hz,1H,-CH2-COOH),3.38(bd,J＝10Hz,1H,H-23),3.22(m,2H,H-21和H-27),3.22(s,3H,H-37),2.11(s,3H,H-36),2.08(s,3H,H-14),1.98(m,2H,H-20和H-26),1.70(s,3H,H-13),1.53(m,2H,H-22和H-24),1.28(t,J＝12Hz,1H,H-24),0.92(d,J＝6.5Hz,3H,H-31),0.85(d,J＝7Hz,3H,H-32),0.72(d,J＝6.5Hz,3H,H-34).13CNMR(175MHz,CD3OD,CryoProbe):δC191.7,176.7,174.7,168.1,144.7,142,1,141.5,131.5,126.5,126.4,119.4,117.8,113.7,112.8,112.1,109.6,104.4,101.1,80.5,73.9,72.4,71.5,68.8,54.9,48.8,41.4,39.9,35.9,32.2,21.8,20.6,20.5,15.4,9.5,9.5,6.9.(-)-HR-ESI-TOF-MSm/z740.2939(C38H46NO14[M-H]-计算值：740.2918)。
24-脱甲基利福霉素SV：1HNMR(700MHz,CD3OD,CryoProbe):1HNMR(700MHz,CD3OD):δ6.42(s,1H),6.31(bd,J＝12Hz,1H),5.95-5.89(m,2H),5.51(s,1H),5.20(bt,J＝12Hz,1H),5.14(bd,J＝9Hz,1H),3.22(s,3H),3.17(t,J＝10Hz,1H),2.13(s,3H),2.12-2.11(m,2H),2.01(s,3H),1.96(s,3H),1.67(s,3H),1.54-1.49(m,4H),0.93(d,6H),0.78(d,J＝5Hz,3H).HRMS(ESI-TOF)m/z(C36H42NO12[M-H]-计算值：682.2707)。
实施例6
24-脱甲基利福霉素B向24-脱甲基利福霉素S的转换
24-脱甲基利福霉素B(8mg,0.0107mmol)溶解在含CuCl2(0.1mM)的MeOH-H2O(10:1,5mL)中。反应混合物在室温下搅拌过夜，以使24-脱甲基利福霉素B转换为24-脱甲基利福霉素S。混合物酸化至pH3，且产物用乙酸乙酯提取(3×5mL)。提取物送至硅胶柱，用CHCl3-MeOH(10:1)作为洗脱剂，从而给出24-脱甲基利福霉素S(6mg)。
产物用(-)-ESI-MS和1HNMR谱分析(680的m/z[M-H]-，表明分子中没有乙醇酸部分，存在萘醌单元)。有趣的是，在CDCl3中-20℃下储存，形成透明红棕色正交晶体，揭示出通过C-1、C-8、C-21和C-23氧原子与Ca2+配位的24-脱甲基利福霉素S的二聚形式(图15a)。
1HNMR(300MHz,CD3OD):7.85(s,1H),7.04(m,1H),6.88(bd,J＝11Hz,1H),6.59(m,1H),5.23(dd,J＝12.6Hz,9.7Hz),4.53(bt,J＝8Hz,1H),4.22(bd,J＝10Hz,1H),3.80(bd,J＝10Hz,1H),3.48(s,3H),2.50(s,3H),2.35(s,3H),2.33(s,3H),2.00(s,3H),1.62(m,3H),1.41(d,J＝7Hz,3H),1,29(d,J＝6.8Hz,3H),0.67(d,J＝7Hz,3H).HRMS(ESI-TOF)m/z680.2730(C36H42NO12[M-H]-计算值：680.2707)。
24-脱甲基利福霉素S的X-射线晶体学。在BrukerApexCCD衍射仪上，用在173(2)K下采集衍射强度。基于系统性的缺失确定空间组。通过SADABS[Sheldrick,G.M.(1998).Bruker/SiemensAreaDetectorAbsorptionCorrectionProgram(BrukerAXS,Madison.WI)]实施吸收校正。通过直接法和傅立叶技术解析出结构，并用全矩阵最小二乘法对F2精确化。所有非-H原子用各向异性热参数精确化(图16)。H原子在刚性基团模型中以计算的位置处理。发现溶剂水以0.25的占位因子在分子之间的位置部分占位。该溶剂水分子中的H原子没有加以考虑。Flack参数为0.00(10)。相对高的Rint值0.1271与高角度处的衍射非常弱并且高角度处的强度统计不良这一事实相关。所有计算通过BrukerSHELXTL(v.6.10)包[Sheldrick,G.M.(1998).Bruker/SiemensAreaDetectorAbsorptionCorrectionProgram(BrukerAXS,Madison.WI)]进行。
实施例7
24-脱甲基利福平的合成
24-脱甲基利福霉素S(5mg,0.0073mmol)溶解在DMF(200μL)和乙酸(50μL)中。在50℃下搅拌混合物后，添加多聚甲醛(3mg)和1,3,5-三甲基-六氢-1,3,5-三嗪(8μL)。反应物在50℃下搅拌2h直至所有起始原料转换为3-甲基-1,3-噁嗪并(5,6-c)-24-脱甲基利福霉素，由TLC上的蓝色点指示。接着，向混合物添加1-氨基-4-甲基-哌嗪(8μL)。搅拌反应物，通过TLC监测，直至蓝色点消失，24-脱甲基利福平形成。混合物用冷却的2％乙酸(1.5mL)稀释，并用CHCl3(2mL)提取3次。合并有机级分，并浓缩至1mL，并进一步用盐水溶液洗涤3次。合并有机级分，并在无水硫酸钠上干燥，然后在旋转蒸发仪下干燥。粗级分送至硅胶色谱，用CHCl3–MeOH以10:1和8:1的比作为洗脱剂。含产物的级分汇集出，并进一步通过HPLC[CH3CN-0.05MHCOONH4(60:40)]，以(YMC-ODS-A,250×10mmID,5微米粒径)柱和2mL/min流速在254nm下纯化。干燥含24-脱甲基利福平的级分，从而提供产物为微红橙色粉末的标题化合物(2.5mg，0.0031mmol)。
1HNMR(500MHz,CD3OD):(图17)HRMS(ESI-TOF)m/z807.3829(C42H55N4O12[M-H]-计算值：807.3816)。
为确认24-脱甲基利福平的特性，进行比较MS/MS分析(图18)。结果显示24-脱甲基利福平(m/z807→676→616→490→420)和利福平(m/z821→690→630→490→420)具有相同的碎片图谱，虽然24-脱甲基利福平的多数碎片比利福平的相应碎片少14原子质量单位(图19)。这些碎片图谱也与此前对利福平的报道一致(Prasad,B.和Singh,S.J.(2009)Pharm.Biomed.Anal.Vol.50,pages475-490)。
实施例8
抗菌试验
利福平及其类似物和衍生物即24-脱甲基利福霉素B、24-脱甲基利福霉素S、24-脱甲基利福霉素SV和24-脱甲基利福平的抗菌活性也通过琼脂扩散试验测定。
将耻垢分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在营养琼脂上划线并在37℃下温育过夜。菌落转移至营养肉汤，并在37℃下温育24h。测定培养物的生长至合适的600nm处的密度(BioRad,SmartSpec300)。接种物(1mL)与温热的营养琼脂(24mL)彻底混合，并倒入培养皿。试验前，使琼脂板固化并干燥30min。无菌Whatman盘用利福平及其类似物(20μL)以1mg/mL的浓度饱和并在室温下干燥。盘放置在接种的琼脂板上，并在37℃下温育24h。为产生抑制区的对比背景，0.25％MTT显影染料(2mL)添加在盘上。
用24-脱甲基利福霉素S和24-脱甲基利福霉素SV进行对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，例如耻垢分枝杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌试验(图20)。结果表明衍生自新类似物24-脱甲基利福霉素B的新化合物(24-脱甲基利福霉素S和24-脱甲基利福霉素SV)对抗耻垢分枝杆菌比利福霉素B更有活性。进行了模拟研究，表明24-脱甲基利福平向结核分枝杆菌的耐利福霉素RNA聚合酶的结合比利福平更好。
类似地，用24-脱甲基利福平、24-脱甲基利福霉素S以及商购可得的利福平和利福霉素S进行对耻垢分枝杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌试验。结果显示24-脱甲基利福霉素S和24-脱甲基利福平具有抗耻垢分枝杆菌和金黄色葡萄球菌的活性，分别与利福霉素S和利福平相当(图21)。
基于上述结果，对本发明的类似物和衍生物的效果进行进一步研究，以研究结核分枝杆菌的多重耐药菌株。对此，MDR菌株从开源药物发现(OpenSourceDrugDiscovery,OSDD；www.osdd.net)获得，并根据WHO指南在印度PremasBiotech,Haryana进行药物试验。分别对两种利福平-敏感菌株和结核分枝杆菌三重抗性菌株：OSDD209&H37Rv和OSDD55,OSDD206&OSDD321进行药物敏感试验(表3)。
表3：在各种结核分枝杆菌(耐受和敏感)菌株(从OSDD获得)对商购可得的利福平和新型化合物24-脱甲基利福霉素S&24-脱甲基利福平的药物敏感性试验的比较数据
*norpoB突变
试验利福平(可从HiMedia购得)、24-脱甲基利福平和24-脱甲基利福霉S抗上述病原性菌株。用BacT/ALERTMB系统[Crump,J.A.等人(2011).J.Clin.Microbiol.Vol.49,p.3054-3057]，在不同的药物浓度(0.01-50μg/mL)下进行试验。结果表明24-脱甲基利福霉素S和24-脱甲基利福平表现出具有对结核分枝杆菌的利福霉素-敏感和-抗性菌株的强烈抗菌活性。
由印度PremasBiotech,Haryana用不同药物浓度(0.01-1μg/ml)进行药物敏感试验。药物试验使用MBBacT/ALERT系统[Crump,J.A.等人(2011).J.Clin.Microbiol.Vol.49,p.3054-3057]来完成，该系统是使用比色传感器和反射检测器来确定瓶中的二氧化碳水平的分枝杆菌检测系统。随着微生物的生长，有CO2产生，导致传感器的颜色变化(在瓶的底部)。由于CO2浓度上升，颜色从绿色变为黄色。瓶含有促进分枝杆菌生长的培养基和MB/BacT重构液。样品接种入MPBacT/ALERT瓶。试验以两种对照进行：直接生长对照(DGC)和比例生长对照(PGC)。DGC包含0.1mL种子培养物，与0.5ml重构液一起接种入MPBacT/ALERT瓶。PGC包含0.5mL的DGC，与0.5ml重构液一起接种入MPBacT/ALERT瓶。试验瓶包含0.5mL种子培养物，与0.5ml重构液和抗生素一起接种入MPBacT/ALERT瓶。当PGC瓶标示阳性时认为试验完成。
自由能扰动研究
鉴于24-脱甲基利福霉素类似物对利福平-敏感和-耐受结核分枝杆菌表现出比利福平可比或更佳的活性，我们决定用野生型RNAPv[Postma,J.P.M.等人(1982).FaradaySymp.Chem.Soc.Vol.17,p.55-67；Singh,U.C.等人(1987).J.Am.Chem.Soc.Vol.109,p.1607-1614]进行自由能扰动(FEP)研究(表4)。然而用利福平-耐受RNAP计算FEP是更可取的，不幸的是，突变的holo-RNAP的晶体结构还有待阐明。本发明中选择利福霉素B和24-脱甲基利福霉素B，基于的是其潜在的更低的计算费用，因此利福平衍生物稍微更大。此外，通常接受的是，C-3或C-4侧链并不显著改变药物的结合，但明显改变转运性质。
表4.用野生型RNAP的24-脱甲基利福霉素B的计算自由能扰动(FEP)研究
*所有能量的单位为kcal/mol。
FEP计算用Gromacs4.5[Pronk,S.等人(2013).Bioinformatics.Vol.29,p.845-854]，以21个平行窗口，从此前产生的结构来运行，并使用Bennet接受比来列表显示自由结合能。FEP结果显示24-脱甲基利福霉素B对野生型RNAP具有与利福霉素B相似的亲和性，但对水具有比后面的化合物更低的亲和性。24-脱甲基利福霉素B溶剂化亲和性中显著的降低引起比利福霉素B更高的对蛋白质的分配系数，导致24-脱甲基利福霉素B对RNAP的相对结合亲和性以1.2kcal/mol更好(表4)。

Claims (32)

1.具有下列化学结构的抗菌化合物和/或其盐：
2.根据权利要求1所述的抗菌化合物，其中所述抗菌化合物对细菌引起的感染或疾病有用。
3.根据权利要求1至2任一项所述的抗菌化合物，其中所述抗菌化合物对分枝杆菌属物种引起的感染或疾病有用。
4.根据权利要求1至3任一项所述的抗菌化合物，其中选择的所述分枝杆菌属物种为结核分枝杆菌和结核分枝杆菌的MDR菌株。
5.一种药物组合物，其包含具有下列化学结构的抗菌化合物和/或其盐、和它们药学上可接受的载体：
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述抗菌化合物对细菌引起的感染或疾病有用。
7.根据权利要求5至6任一项所述的药物组合物，其中所述抗菌化合物对分枝杆菌属物种引起的感染或疾病有用。
8.根据权利要求5至6任一项所述的药物组合物，其中所述抗菌化合物对结核分枝杆菌和结核分枝杆菌的MDR菌株引起的感染或疾病有用。
9.一种治疗方法，其包括向患者给予具有下列结构的抗菌化合物和/或其盐：
10.用于治疗疾病或感染的具有下列化学结构和/或其盐的抗菌化合物或其盐用于制备药物的用途：
11.具有下列化学结构的抗菌化合物和/或其盐用于制备药物的用途：
12.根据权利要求10所述的药物的用途，其用于治疗疾病或感染。
13.根据权利要求10所述的药物的用途，其用于治疗细菌引起的疾病或感染。
14.根据权利要求10所述的药物的用途，其用于治疗分枝杆菌属物种引起的疾病或感染。
15.根据权利要求10或13所述的药物的用途，其用于治疗分支杆菌属物种、结核分枝杆菌、结核分枝杆菌的MDR菌株引起的疾病或感染。
16.根据权利要求5所述的药物组合物的制备方法，所述方法包括根据权利要求1所述的抗菌化合物和药学上可接受的载体。
17.地中海拟无枝酸菌S699的新菌株#34，其包含基因rapAT2区域。
18.地中海拟无枝酸菌S699的新菌株#34，其中rifAT6区域与rapAT2区域交换。
19.地中海拟无枝酸菌S699的新菌株#34，其能够产生新型的利福霉素B的类似物和衍生物。
20.根据权利要求19所述的地中海拟无枝酸菌S699的新菌株#34，其中所述利福霉素B的类似物和衍生物包含具有下列化学结构的化合物：
21.包含rifPKS中的rapAT2区域的地中海拟无枝酸菌S699的新菌株的制备方法，所述方法包括下列步骤：
(a)分离来自地中海拟无枝酸菌S699的rifPKS的rifAT6区域，以及吸水链霉菌(Acc.No.DSM-41524)的rapAT2区域；
(b)通过将rifPKS的rifAT6区域与吸水链霉菌(Acc.No.DSM-41524)的rapAT2区域交换，制备载体构建体；
(c)将步骤(b)的载体构建体插入地中海拟无枝酸菌S699；和
(d)获得包含rifPKS的rapAT2区域的地中海拟无枝酸菌S699的新菌株#34。
22.一种新型抗菌化合物的制备方法，所述方法包括下列步骤：
(a)培养包含rifPKS区域中的rapAT2区域的地中海拟无枝酸菌S699#34的细胞；和
(b)收获地中海拟无枝酸菌S699#34的细胞，从而获得产物的粗级分；
(c)通过HPLC纯化粗产物；
(d)获得抗菌化合物24-脱甲基利福霉素B和24-脱甲基利福霉素SV。
23.一种制备24-脱甲基利福霉素B的衍生物24-脱甲基利福霉素S的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)在选自氯化铜的试剂的存在下使24-脱甲基利福霉素B反应；
(b)在室温下使步骤(a)的反应过夜进行；和
(c)获得24-脱甲基利福霉素S。
24.一种制备24-脱甲基利福霉素B的衍生物24-脱甲基利福平的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)在二甲基甲酰胺(DMF)和乙酸的存在下使24-脱甲基利福霉素B反应；
(b)向步骤(a)的混合物添加多聚甲醛和1,3,5-三甲基-六氢-1,3,5-三嗪；
(c)获得3-甲基-1,3-噁嗪并(5,6-c)-24-脱甲基利福霉素；
(d)使步骤(c)的化合物与1-氨基-4-甲基-哌嗪反应；和
(e)获得24-脱甲基利福平。
25.一种重组核苷酸SEQIDNo.1。
26.一种细菌菌株，其含有核苷酸SEQIDNO.1。
27.根据权利要求26所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株能够产生利福霉素类似物。
28.根据权利要求26至27任一项所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株为地中海拟无枝酸菌S699#34。
29.一种重组核苷酸SEQIDNo.1，其能够表达利福霉素的新型类似物。
30.根据权利要求1所述的重组核苷酸序列，其中所述类似物为24-脱甲基利福霉素B和24-脱甲基利福霉素S。
31.一种载体构建体，其含有重组核苷酸序列IDNo.1。
32.根据权利要求29所述的载体构建体，其中所述载体构建体为pAT6E和pAT6F。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101395259A (zh) * 2005-12-14 2009-03-25 活跃生物药物学有限公司 利福霉素类似物及其应用
CN102357249A (zh) * 2011-10-26 2012-02-22 广州赫尔氏药物开发有限公司 能够抑制耐药性结核杆菌的药物

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0877087A1 (en) 1997-05-08 1998-11-11 The Secretary, Department of Biotechnology Cloning vectors for Amycolatopsis sp. and a process for the preparation thereof
IL149030A0 (en) * 2000-08-09 2002-11-10 Panacea Biotec Ltd Pharmaceutical compositions containing rifampicin, isoniazid or combinations thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101395259A (zh) * 2005-12-14 2009-03-25 活跃生物药物学有限公司 利福霉素类似物及其应用
CN102357249A (zh) * 2011-10-26 2012-02-22 广州赫尔氏药物开发有限公司 能够抑制耐药性结核杆菌的药物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RUP LAL: "Swapping Acyl Transferase Domain of Module six within Rifamycin Polyketide Synthase gene cluster of Amycolatopsis mediterranei S699 with Acyl Transferase domain of Module two of Streptomyces hygroscopicus to produce rifamycin B analog: 24-desmethylrifamyci", 《99TH INDIAN SCIENCE CONGRESS》 *

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