CN105219802A - 胰岛组织特异性表达GIPRdn慢病毒载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子遗传学技术领域，尤其涉及一种胰岛组织特异性表达GIPR^dn慢病毒载体及其应用。一种胰岛组织特异性表达GIPR^dn慢病毒载体，其具有SEQ？ID？No.1所示的序列。本发明构建的胰岛组织特异性表达GIPR^dn慢病毒载体，包装成病毒颗粒后可以利用绿色荧光蛋白实现目的基因在体内外表达的示踪定位，大大方便了研究人员进行观察研究；慢病毒成功包装并测定病毒滴度。本发明构建的胰岛组织特异性表达GIPR^dn慢病毒载体为下一步生产Ⅱ型糖尿病转基因猪打下基础。

Description

胰岛组织特异性表达GIPRdn慢病毒载体及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学技术领域，尤其涉及一种胰岛组织特异性表达GIPR^dn慢病毒载体及其应用。

背景技术

葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(Glucose-dependentInsulinotropicpolypeptide，GIP)，具有进食后刺激胰岛素合成分泌，抑制胰高血糖素合成分泌等生理功能，在维持血糖稳态上发挥了重要作用。GIP具有促进胰岛素分泌并改善其敏感性，上调β细胞相关基因的表达，促进胰岛β细胞的增殖，延迟胰岛素清除，促进神经修复。GIP的促胰岛素功能受损是2型糖尿病发病机制的一个重要因素。GIP的促胰岛素功能是通过G蛋白耦联受体激活腺苷酸环化酶，产生的cAMP激活下游信号通路作用于胰岛β细胞。GIP需要与其受体GIPR结合才能发挥其生物学功能。

GIPR(Glucose-dependentinsulinotropicpolypeptidereceptor)属于G蛋白偶联受体超家族，具有7次跨膜结构，作用对象是腺苷酸环化酶。GIP激素从小肠上段分泌进入血液后，与β细胞表面的特异性的受体(GIPR)结合，使G蛋白的构象改变，激活腺苷酸环化酶AC，使细胞内的cAMP浓度升高，并活化cAMP依赖的蛋白激酶PKA，并使控制胰岛素基因表达转录和分泌的关键蛋白质(如CREB)的磷酸化，同时参与胰岛素分泌的调控、配体分离以及受体敏感性的恢复等过程，从而促进葡萄糖刺激后胰岛素的分泌。

GIPR基因存在缺陷或者功能受损，GIP/GIPR/PKA信号转导通路受到抑制，GIP激素的分泌量保持不变，但其促胰岛素分泌作用降低，机体血糖浓度升高，诱发2型糖尿病(T2DM)的发生。制备表达缺陷型GIPR基因(GIPR^dn)的转基因T2DM动物模型有助于研究T2DM的发病机理。

胰岛素由胰岛组织特异性分泌，胰岛素基因启动子能诱导外源基因在胰岛β细胞中特异性表达。构建携带猪胰岛素基因启动子(PIP2)和显性抑制型GIPR^dn基因的慢病毒，保证目的基因在细胞内的高效整合和特异性稳定表达，为后续建立转基因猪提供基础。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明借鉴近年来研究结果加以改进，构建了一种胰岛组织特异性表达GIPR^dn慢病毒载体，本发明的最终目的是在胰腺细胞中特异性表达功能缺陷型GIPR^dn，抑制胰岛素分析，为后续构建转基因Ⅱ型糖尿病模型打下基础。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种胰岛组织特异性表达GIPR^dn慢病毒载体，所述的胰岛组织特异性表达GIPR^dn慢病毒载体具有SEQIDNo.1所示的序列。

本发明还提供了所述的胰岛组织特异性表达GIPR^dn慢病毒载体在真核细胞中调控胰岛组织分泌的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明构建的胰岛组织特异性表达GIPR^dn慢病毒载体，包装成病毒颗粒后不仅能够在真核细胞中，还可以利用绿色荧光蛋白实现目的基因在体内外表达的示踪定位，大大方便了研究人员进行观察研究。慢病毒成功包装并测定病毒滴度。本发明构建的胰岛组织特异性表达GIPR^dn慢病毒载体为下一步生产Ⅱ型糖尿病转基因猪打下基础。

2.本发明的胰岛组织特异性表达GIPR^dn慢病毒载体，应用第3代慢病毒系统包装293FT细胞生成病毒颗粒，通过脂质体进行转染，转染率达90％以上。

3.本发明选择构建以慢病毒为载体的表达系统，能显著提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的概率明显增加，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

附图说明

图1为GIPR^dnPCR电泳结果；

其中：泳道1-2为GIPR^dn的PCR结果；M为Marker5000。

图2为GIPR^dn和pLV的双酶切电泳结果；

其中：泳道1-2为pMD18-T-GIPR^dn双酶切；泳道3-4为pLV双酶切；M为Marker1kb。

图3为pLV-GIPR^dn的菌液Cracking电泳结果；

其中：泳道1-3为pLV-GIPR^dn质粒；M为superMarker。

图4为pLV-GIPR^dn菌液PCR电泳结果；

其中：泳道1-3为GIPR^dn的PCR产物；泳道4为对照；M为Marker。

图5为GIPR^dn的测序比对结果。

图6为pLV-GIPR^dn质粒的双酶切鉴定；

其中：泳道1-2为pLV-GIPR^dn的酶切产物；M为Marker1Kb。

图7为PIP2和pLV-GIPR^dn质粒的双酶切结果；

其中：泳道1-4为pMD18-T-PIP2酶切产物；泳道5为pLV-GIPR^dn酶切产物；M为Marker1Kb。

图8为pLV-PIP2-GIPR^dn菌液PCR电泳结果；

其中：泳道1为GIPR^dn的PCR产物；泳道2为空白对照；M为Marke2000。

图9为pLV-PIP2-GIPR^dn质粒的双酶切鉴定；

其中：泳道1为pLV-PIP2-GIPRdn的酶切产物；M为Marker1Kb。

图10为pLV-PIP2-GIPR^dn转染βTC-6细胞48h后细胞形态以及荧光表达情况；

其中A为pLV-PIP2-GIPR^dn；B为pLVpositivecontrol；C为pLVnegativecontrol；A’、B’、C’为thewhitelightofthecorresponding。

图11为GIPR^dn慢病毒包装24、48、72h荧光观察图；

其中：A为病毒包装24h；B为病毒包装48h；C为病毒包装72h；A’、B’、C’分别为A、B、C对应的白光图。

图12为病毒滴度测定结果图；

其中：A为pLV-PIP2-GIPR^dn；A’为白光对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：

1.1试验材料

1.1.1主要试剂及来源

LAMixTap、T4连接酶和EcoRI、BamHI限制性内切酶购自TaKaRa公司；

DNA胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自杭州博日生物有限公司；

氨苄霉素、氯化钠、氯化钾购自上海华舜生物技术有限公司；

胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、氯化钠购自德国OXOID；

DNAMarker购自广州东盛生物科技有限公司；

细胞转染试剂、细胞培养基和FBS购自Gibco公司。

1.2试验方法

1.2.1人GIPR^dn基因序列的合成

人显性抑制的葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体基因(GIPR^dn)序列是由上海英潍生物工程有限公司合成，GIPR^dn序列大小分别为1377bp。GIPR^dn序列比GIPR序列少出24个碱基(955-978位点/氨基酸位点319-326)，在序列1019-1020位点(氨基酸340位点)CT碱基突变为AG碱基，编码的丙氨酸突变为谷氨酸。

1.2.2引物设计合成

以人工合成的GIPR^dn基因序列为参考序列，利用Oligo6.0软件设计特异性引物Primer–F：5’-AAGCTTGATCCCCCAACCACTCCAA-3’；Primer–R：5’-GGATCCTTAGGGCTGGGGGTTACTGA-3’。上下游引物的5’端分别添加EcoRI和BamHI酶切位点。

GIPR^dn部分序列引物(902-1243bp，扩增片段366bp/342bp)Primer-F：5’-TCCCTGGGTGATCGTCAGGT-3’；Primer-R：5’-AGCAGTAGAGGACGCTGACC-3’，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.3人GIPR^dn基因扩增

GIPR^dn序列需要更换酶切位点，以质粒为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为15.0μL：质粒DNA0.5μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μL，PCRTaq酶7.5μL(3mMMg²⁺)，ddH₂O6.0μL。反应程序：94℃5min；94℃30s；65℃30s；72℃1min40s，共34个循环，72℃10min。PCR产物用1％凝胶电泳后观察结果。

1.2.4PCR产物的回收纯化

GIPR^dn的PCR产物条带回收纯化，操作方法按BioFlux胶回收试剂盒说明书进行。

1.2.5目的片段与T载体的连接

GIPR^dn的纯化产物连接到pMD18-T载体上。连接体系：SolutionI5.0μL，pMD18-TVector1μL，PCR纯化产物4μL，总体积为10μL。连接反应液混匀封口，于16℃连接10h以上。

1.2.6重组质粒转化细菌及阳性克隆的筛选

pMD18-T-GIPR^dn转化大肠杆菌DH5α。操作步骤如下：

(1)从-80℃冰箱内取出DH_5α感受态细菌握融。

(2)将连接液注入50μL感受态细胞中混匀，在冰上静置30min。

(3)42℃的水浴中热激活1min，避免晃动。

(4)快速将EP管置于冰上冷却5min。

(5)加入500μL无抗生素的普通LB液体培养基，37℃，200rpm摇床培养1小时。

(6)用无菌弯头玻璃棒将100μL菌液铺于含氨苄青霉素(AMP)的琼脂平板，37℃正面放置15～30min后，倒置培养过夜。

(7)观察培养的平板是否有菌落生长。16h后从平板上分别挑取单个菌落于1mL含有氨苄青霉素(AMP)的LB培养液中，37℃，200rpm振荡培养5小时。

16h后分别挑取少量单菌落于1mL含Amp⁺(1000:1)的LB液体培养液中，37℃，200rpm继续振荡培养4-5小时。以培养的菌液为模板进行PCR扩增，反应体系和反应程序如下：

PCR反应体系为15.0μL：质粒DNA0.5μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μL，PCRTaq酶7.5μL(3mMMg2⁺)，ddH2O6.0μL。

反应程序：94℃5min；94℃30s；65℃30s；72℃1min40s，共34个循环，72℃10min。

1.2.7重组质粒的测序鉴定

将PCR鉴定为阳性的菌液送交深圳华大生物科技公司和上海英潍生物工程公司测序。测序结果与参考序列比对，确定是否成功插入GIPR^dn基因的序列。

1.2.8pMD18-T-GIPR^dn和pLV载体的双酶切

提取pMD18-T-GIPR^dn、pMD18-T-GIPR质粒，用EcoRI和BamHI内切酶将这2个重组质粒和pLV质粒双酶切，酶切体系：pMD18-T-GIPR^dn和pLV各8.0μL，EcoRI0.5μL，BamHI0.5μL，10×KBuffer1.0μL。将反应液混匀，37℃酶切2h，最后1％凝胶电泳进行检测。

1.2.9双酶切产物的纯化

将GIPR^dn和pLV的双酶切产物电泳条带进行回收纯化，操作方法同上述1.2.6。

1.2.10胶回收产物的T4连接

将纯化后的酶切产物进行T4连接，连接体系：pLV纯化产物1.0μL，GIPR^dn纯化产物7.0μL，10×T4LigaseBuffer1.0μL，T4ligase1.0μL。将混合液混匀，16℃水浴过夜。

1.2.11重组质粒的转化、细菌转化子的筛选

连接产物转化DH5α大肠杆菌，并进行阳性克隆筛选，操作方法同上述1.2.6。取菌液PCR鉴定为阳性的菌液分别送至深圳华大生物公司和上海英潍生物公司测序。

1.2.12pLV-PIP2-GIPRdn重组载体的构建

将pLV慢病毒载体的CMV启动子替换为PIP2特异性启动子。操作步骤为：

(1)用SnaBI和XbaI限制性内切酶双酶切pMD18-T-PIP2和pLV-GIPR^dn载体，电泳检测双酶切结果，胶回收纯化目的片段；

(2)PIP2回收片段和pLV-GIPR^dn载体片段按7:1的比例进行T4连接，16℃连接过夜；

(3)转化及菌液验证步骤同上述1.2.6，以培养的菌液为模板，PCR扩增体系、程序同上述1.2.6。然后将PCR鉴定为阳性的菌液分别送上海英骏和深圳华大公司测序。

(4)取菌液PCR和测序验证为阳性的菌液进行质粒提取，获得pLV-PIP2-GIPR^dn重组质粒，并用SnaBI和XbaI酶进行双酶切验证。

1.2.13去内毒素质粒提取

将酶切验证和测序验证正确的pLV-GIPR^dn和pLV-PIP2-GIPR^dn的菌液进行扩大培养，提取去内毒素质粒。操作过程按照OMEGA公司去内毒素试剂盒的说明书进行。

1.2.14重组质粒转染βTC-6细胞

将构建好的pLV-PIP2-GIPR^dnpLV-GIPR^dn载体和pLV载体分别转染βTC-6细胞，转染时细胞需处在60-70％融合的对数生长期，以保证转染效率。具体方法如下：

(1)转染前24h以合适的细胞密度接种到6孔板上。转染时，细胞要达到60-70％的融合；

(2)溶液1：250μLOpti-MEM无血清培养基+5μLLipofectamine^TMLTXReagent，混匀；

(3)溶液2：250μLOpti-MEM无血清培养基+约含有2.5μg质粒+2.5μL的Plus^TMReagent，混匀。

(4)溶液1与溶液2混合，37℃，5％CO₂培养箱中温育5min。

(5)将6孔板中的细胞用PBS缓冲液冲洗细胞两遍，加入1.5mL15％FBS+85％DMEM培养液。

(6)将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入培养板中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO₂培养箱中继续培养24-72h，检测转染水平。

1.2.15荧光显微镜观察

利用日本NIKON公司的80i正置荧光显微镜分别在pLV-GIPR^dn载体转染后的48h观察各组细胞的荧光强度。

1.2.16慢病毒的包装

1.2.16.1293T细胞培养

(1)解冻293T细胞，24h传代到60mm的培养皿中，直到细胞汇合度达到60-70％；

(2)细胞接种：消化100mm培养皿中的细胞并用枪头吹打混匀。将细胞传代到用L-多聚赖氨酸处理后的含有9mL含血清的DMEM培养基的培养皿中，放置于37℃、5％CO₂饱和适度的培养箱中培养；

(3)换液：待细胞汇合度达到60-70％时，培养基更换为无血清无双抗的DMEM培养基放置培养箱1h。

1.2.16.2质粒转染293T细胞

将目的质粒pLV-PIP2-GIPR^dn分别与包装包膜质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G按一定的比例混合，按LTX的转染方法混合opti-MEM无血清培养基、8μg混合质粒、2.5μLPlus^TMReagent、5μLLipofectamine^TMLTXReagent，将混合液逐滴缓慢加至待转染细胞中，上下左右轻柔轻轻混匀，于37℃、5％CO₂培养箱中培养4h，培养过夜后，更换新鲜的DMEM完全培养液继续培养。

1.2.17慢病毒的收集和浓缩

细胞转染24h后，观察绿色荧光表达情况，将培养皿中的培养液弃去，加入新鲜的体细胞培养液4mL。分别收集48h和72h的细胞培养液(其中含有慢病毒)，1500rpm10min低速离心除去死细胞，0.45μm无菌滤器过滤。收集的病毒液20000rpm，4℃，离心2.5h，弃去上清，用PBS缓冲液洗脱病毒液，4℃溶解2-4h，分装小管放置-80℃冰箱保存，预留1μL测浓缩后的病毒滴度。

1.2.18慢病毒滴度测定

取一个24孔板，消化293T细胞，24孔板每孔接入1.5×105细胞，新鲜培养基加至每孔500μl，并加入1/1000polybrene(终浓度为10ug/mL)，取1μl的浓缩病毒液稀释100倍，按1μl、2μl、4μl三个病毒量滴加至每个孔，摇匀后放入37℃，5％CO₂培养箱培养。分别各取1个孔进行滴度测定。细胞汇合度达到一定汇合度时，用PBS缓冲液洗2次，置于荧光显微镜下。每个孔随机抽取5个视野，记录每个视野中荧光细胞数占细胞总数的比值，计算平均数。最后按公式计算出病毒滴度。病毒滴度(IU/mL)＝荧光细胞数占总细胞数的百分比÷加入的病毒上清体积(mL)×接入细胞的总数×稀释倍数。

1.2.19病毒感染βTC-6细胞

慢病毒感染前一天将βTC-6细胞(2×10⁵)接种于6孔板。第二天换上新的1ml培养基，分别取5ul慢病毒液体均匀地滴加入6孔板中并加入1/1000凝聚胺(polybrene，终浓度为10μg/mL)，轻轻混匀，放入CO₂培养箱中培养。24h后换新的培养基培养2ml，48h和72h分别拍照观察。72h后收集βTC-6细胞提取RNA。

1.3结果与分析

1.3.1GIPR^dn的PCR扩增结果

PCR扩增GIPR^dn基因序列。终产物在1％琼脂糖凝胶中电泳并进行观察。

结果如图1所示，GIPR^dn的片段大小在1000-1500bp之间，与预期的结果一致。

1.3.2pMD18-T-GIPR^dn和pLV双酶切结果

EcoRI和BamHI内切酶双酶切pMD18-T-GIPR^dn和慢病毒载体(pLV)，双酶切产物电泳结果如图2所示，泳道1-2为pMD18-T-GIPR^dn的双酶切结果，泳道3-4为pLV载体的双酶切结果。

1.3.3pLV-GIPR^dn重组质粒鉴定结果

GIPR^dn和pLV目的片段回收纯化后进行T4连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆进行培养。培养的菌液进行如下鉴定：

1.3.3.1菌液Cracking鉴定结果

取100μL菌液10000rpm离心1min，弃去上清，10μLddH₂O重悬菌液，加入10μLCracking液反应10min，再加入2μL6×LoadingBuffer混匀，上样。

电泳结果如图3所示，图片显示pLV-GIPR^dn的片段大小均比pLV的大，初步说明GIPR^dn/GIPR目的片段已插入pLV载体中。

1.3.3.2菌液PCR鉴定结果

以培养的菌液为模板，PCR分别扩增GIPR^dn的部分序列片段，菌液PCR电泳结果如图4所示，PCR扩增所获得的片段大小与预期的一样，说明GIPR^dn已成功插入pLV载体中。

1.3.3.3测序鉴定结果

测序的结果与参考序列进行比对，比对结果如图5所示，GIPR^dn与合成的参考序列比对同源性为100％。

1.3.3.4双酶切鉴定结果

PCR和测序鉴定为阳性的菌液提取质粒，用EcoRI和BamHI双酶切重组质粒进行验证。

结果如图6所示，各序列片段的大小与预期结果一致，说明重组载体载体构建成功。

1.3.4PIP2、pLV-GIPR^dn的双酶切

pMD18-T-PIP2、pLV-GIPR^dn质粒用SnaBI和XbaI内切酶进行双酶切，将pLV原有的CMV启动子去除，双酶切结果如图7所示，pMD18-T-PIP2的双酶切结果为2个条带，pLV-GIPR^dn的为一个条带，片段大小与预期结果一致。

1.3.5pLV-PIP2-GIPR^dn的菌液PCR验证

以克隆培养的菌液为模板，PCR扩增PIP2序列片段，PCR电泳结果如图8所示。PCR扩增所获得的片段大小与预期的一样，初步说明PIP2已分别插入pLV-GIPR^dn重组载体中。

1.3.6pLV-PIP2-GIPR^dn双酶切鉴定

菌液PCR和测序鉴定均为阳性的菌液提取质粒，用SnaBI和XBaI双酶切重组质粒，产物电泳结果如图9所示，泳道1为pLV-PIP2-GIPR^dn的双酶切结果，与预期的结果一致，说明PIP2序列已插入pLV-PIP2-GIPR^dn载体中。

1.3.7pLV-PIP2-GIPR^dn转染βTC-6细胞结果

利用日本NIKON公司的80i正置荧光显微镜在转染后48h观察各组细胞的荧光强度，结果如图10所示，由图可见pLV-PIP2-GIPR^dn和pLV转染的细胞均发荧光，细胞形态清晰，而水空白对照组未见有荧光，表明pLV-PIP2-GIPR^dn能够表达绿色荧光。

1.3.8病毒包装及病毒滴度检测

pLV-PIP2-GIPR^dn与包装包膜质粒共转染293T细胞后24、48、72小时荧光显微镜下观察(图11)，可以看到大量的荧光表达。

对收集的病毒液进行滴度测定，按病毒滴度计算公式(病毒滴度IU/mL＝视野中荧光细胞占视野中总细胞数的百分比÷加入的病毒上清体积(mL)×铺放细胞总数×稀释倍数)进行滴度的计算。

结果如图12所示，经过滴度测定，采用本试验方法进行包装得到的病毒滴度为10⁸TU/mL。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (2)

1.一种胰岛组织特异性表达GIPR^dn慢病毒载体，其特征在于：所述的胰岛组织特异性表达GIPR^dn慢病毒载体具有SEQIDNo.1所示的序列。

2.根据权利要求1所述的胰岛组织特异性表达GIPR^dn慢病毒载体在真核细胞中调控胰岛素分泌的用途。