CN105218367A - 一种高纯度二十碳五烯酸乙酯浓缩物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种EPA乙酯浓缩物，该浓缩物包含按油的重量百分含量计至少96.5%的EPA乙酯并且反式EPA和氧化产物含量控制在尽可能低的水平，具体为浓缩物中反-5,顺-8,11,14,17-二十碳五烯酸乙酯、反-11,顺-5,8,14,17-二十碳五烯酸乙酯、反-14,顺-5,8,11,17-二十碳五烯酸乙酯、反-17,顺-5,8,11,14-二十碳五烯酸乙酯、反-8,17,顺-5,11,14-二十碳五烯酸乙酯的含量均低于0.3%，同时浓缩物的过氧化值低于2，茴香胺值低于5，该产品的氧化稳定性更好，安全性更高。
Description
技术领域
本发明涉及一种鱼油浓缩物，其包含ω-3 型长链多不饱和脂肪酸—二十碳五烯酸（EPA），更具体地，涉及EPA乙酯浓缩物，其包含按油的重量百分含量计至少96.5%的EPA乙酯并且反-5,顺-8,11,14,17-二十碳五烯酸乙酯、反-11,顺-5,8,14,17 -二十碳五烯酸乙酯、反-14,顺-5,8,11,17-二十碳五烯酸乙酯、反-17,顺-5,8,11,14-二十碳五烯酸乙酯、反-8,17,顺-5,11,14-二十碳五烯酸乙酯的含量均低于0.3%，同时浓缩物的过氧化值低于2，茴香胺值低于5。
背景技术
二十碳五烯酸（顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸；EPA）是一种人类不能自身合成的必需脂肪酸，属ω-3 型长链多不饱和脂肪酸，具有调节内分泌、提高免疫功能、舒张血管、降低血清胆固醇和低密度血脂蛋白水平、减少血小板凝聚、抗炎、抗癌等作用，高纯度的EPA可用于防治动脉粥样硬化、冠心病、高血压、炎性病症、肿瘤、老年痴呆等疾病，在医药制药领域极有发展前景。
然而，由于EPA的结构中具有多个不饱和的双键，均以顺式构象存在，在分离纯化的过程中，如除臭、蒸馏等工艺环节，受光热、催化等的影响，常会从顺式构象转化为反式构象，即产生大量的反式EPA。较容易产生的反式EPA有反-5,顺-8,11,14,17-二十碳五烯酸、反-11,顺-5,8,14,17 -二十碳五烯酸、反-14,顺-5,8,11,17-二十碳五烯酸、反-17,顺-5,8,11,14-二十碳五烯酸、反-8,17,顺-5,11,14-二十碳五烯酸（下文简述为5种反式EPA）等，其含量相对较高，且由于与EPA具有非常类似的物理特性（如类似的蒸气压、溶解度和吸附特征），去除较为困难，这不仅影响了EPA产品的纯度，也增加了危害人体健康的风险，目前已知文献报道的反式脂肪酸对人体的危害包括降低记忆力、导致发胖、引发冠心病、诱发肿瘤、哮喘、糖尿病及过敏等病症、影响婴幼儿的生长发育、影响男性生育能力等，因此，尽可能控制和减少EPA浓缩物中上述反式脂肪酸的含量，能够提高EPA产品的质量，减少其所含杂质和副产物对人体健康带来的潜在影响和危害。
由EPA的结构特点带来的另一个问题是分离纯化过程中其不饱和键极易发生氧化反应，形成氢过氧化物（一级氧化产物，以过氧化值为评价指标），并进一步分解形成烃、醇、醛、酸等化合物（二级氧化产物，以茴香胺值为评价指标），这些氧化产物有些是形成鱼油腥臭味的关键性物质（如小分子醛、酮挥发产生腥臭），引起消费者反胃、恶心呕吐；有些则对人体健康有害（如过氧化物和自由基加速人体衰老）。美国药典（USP34-NF29版）对鱼油ω-3 型多不饱和脂肪酸的过氧化值的标准限度为低于5.0，茴香胺值的标准限度为低于20.0，但为了保证产品储存期内的氧化稳定性，并尽可能降低氧化产物潜在的破坏人体正常生理功能，促使疾病发生和发展的风险，将新鲜加工的鱼油的过氧化值和茴香胺值控制在尽可能低的范围，是衡量鱼油质量的关键之一。
CN101253952A公开了一种不产生反式脂肪酸和聚合生成的醛、酮等有害物质的鱼油低温除腥工艺：将乙酯型鱼油、甘油、脂肪酶混合，在进行酶促酯交换反应过程中加入鱼油重量的0.1%~0.2%的香基除腥剂除腥。上述方法虽然避免了鱼油在高温条件下除腥时对内在结构的破坏，使得除腥工艺过程中反式脂肪酸及氧化产物的量不会增加，但并不能降低鱼油中反式脂肪酸及氧化产物的量；并且，制备高纯度EPA浓缩物的过程十分复杂，随着进一步的深加工处理，其反式脂肪酸及氧化产物的量仍会升高。
刘芳等人通过研究发现，鼠尾草酸能够有效抑制鱼油中反式脂肪酸、醛类等有害成分的含量 [刘芳《迷迭香鼠尾草酸的分离纯化及抗氧化作用研究》东北林业大学 硕士学位论文 2010，编号Y2050407] 。本发明申请人按照其所述方法，在鱼油中加入0.3mg/g鼠尾草酸作为抗氧化剂，然后采用银离子络合法和超临界流体萃取法分离纯化至EPA乙酯的重量百分含量达到96.5%，检测发现其5种反式EPA的含量为0.37%~0.98%，浓缩物过氧化值为5.3，茴香胺值为12.5。
CN101538508A公开了一种降低植物油反式脂肪酸含量的脱色方法：在中和植物油中加入活性白土于一定温度和真空度下搅拌脱色，活性白土Bronsted酸中心18 mmol/g~22mmol/g、Levis酸中心2.7 mmol/g~3.3mmol/g，活性白土添加量为油重的1%，于100℃~120℃脱色30~50分钟后，冷却水中冷却至60℃，过滤即得。本发明申请人对经分离纯化至EPA乙酯重量百分含量达96.5%的浓缩物，按照上述方法进行脱色，结果检测脱色后浓缩物中5种反式EPA的含量为0.48%~1.23%，浓缩物过氧化值为6.1，茴香胺值为13.6，由于鱼油和植物油脂肪酸成分构成的差异，上述方法无法应用于EPA乙酯浓缩物的制备。
鉴于高纯度EPA广泛的医疗保健作用以及人们对产品质量要求的不断提高，开发一种EPA乙酯含量高于96.5%，同时反式EPA和氧化产物含量控制在尽可能低的水平的EPA浓缩物，对于提高产品的氧化稳定性，延长产品保存期限，降低潜在的引发疾病的风险，保障公众健康具有重要的现实意义。
发明内容
为了克服现有技术无法提供一种EPA含量高，同时反式EPA及氧化产物含量低的EPA乙酯浓缩物，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种高纯度的EPA乙酯浓缩物，其包含按油的重量百分含量计至少96.5%的EPA乙酯，并且反-5,顺-8,11,14,17-二十碳五烯酸乙酯、反-11,顺-5,8,14,17 -二十碳五烯酸乙酯、反-14,顺-5,8,11,17-二十碳五烯酸乙酯、反-17,顺-5,8,11,14-二十碳五烯酸乙酯、反-8,17,顺-5,11,14-二十碳五烯酸乙酯的含量均低于0.3%，同时浓缩物的过氧化值低于2，茴香胺值低于5。
本发明还提供了上述高纯度的EPA乙酯浓缩物的制备方法：
（1）将EPA乙酯重量百分含量大于等于70%的原料鱼油，加到尿素的乙醇溶液中，在45℃~78℃，优选60℃~75℃下搅拌溶解至澄清，反应0.5~24h后，在10℃~15℃结晶1~3h，然后在0℃~5℃结晶3~6h，最后在-10℃~-5℃结晶1~3h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在惰性气体保护下，减压浓缩、洗涤，得到浓缩物；
（2）对步骤1制得的浓缩物采用高效液相色谱法进行分离纯化，流动相为甲醇-异丙醇-水，其中甲醇与异丙醇的体积比为80︰10~85︰5 ml:ml，异丙醇与水的体积比为5︰15~10︰5 ml:ml，得到的洗脱液合并后减压浓缩，然后经薄膜蒸发，得到浓缩物；
（3）对步骤2所制得的浓缩物进行二级分子蒸馏，其中一级蒸馏是在80℃~100℃、压力小于10Pa条件下进行，二级蒸馏是在120℃~140℃、压力小于10Pa条件下进行，得到高纯度EPA乙酯浓缩物。
所述步骤1使用的乙醇是95%乙醇。
所述步骤1的反应时间为0.5~2h。
所述步骤1中尿素与原料鱼油的重量比（下文简称为尿酯比）是1︰1~2.5︰1 g:g，乙醇与原料鱼油的重量比（下文简称为醇酯比）是4︰1~10︰1 g:g；优选为尿酯比是1.2︰1 g:g，醇酯比是8︰1 g:g。
所述步骤1优选将鱼油加到尿素的乙醇溶液中，在45℃~78℃下搅拌溶解至澄清，反应0.5~24h后，先在10℃结晶1h，然后在0℃结晶3h，最后在-5℃结晶2h。
所述步骤2使用的色谱柱为DAC色谱柱，填料为Kromasil C18。
所述步骤2使用的流动相甲醇-异丙醇-水优选按如下方法进行梯度洗脱：
。
所述步骤3优选为一级分子蒸馏是在90℃、压力小于等于5Pa条件下进行，二级分子蒸馏在130℃、压力小于等于5Pa条件下进行。
为了得到反式EPA及氧化产物含量较低的高纯度EPA乙酯浓缩物，本发明申请人参考了众多文献方法，如CN102391112A实施例提供的工业化生产EPA乙酯的方法，包括：（1）将EPA乙酯重量百分含量为68%~72%的原料鱼油在温度106℃，压力0.05mbr下进行二级分子蒸馏，收集馏分；（2）将分子蒸馏后的样品溶于乙醇，氮气保护下分批加入氢氧化钠，25℃下搅拌20h至反应完成，缓慢搅拌降温至-20℃并放置24h，析出固体，抽滤，冰乙醇洗涤滤饼，抽干后固体用1N稀盐酸调节PH=5，正庚烷萃取两次，合并有机层，饱和食盐水洗涤，旋干。（3）将经过盐沉淀法得到的样品注入液相制备系统，色谱柱为DAC-HB800，填料YMC-Pack
ODS-AQ，流动相甲醇-水（体积比88︰12 ml:ml，并加入流动相总体积0.1%的TFA）等度洗脱，收集洗脱液浓缩即得。本发明申请人按照上述方法制备得到重量百分含量为97%的EPA乙酯浓缩物，经检测其5种反式EPA的含量为0.24%~0.92%，浓缩物过氧化值为3.6，茴香胺值为8.9。
本发明申请人又参考文献方法（Grima, E. M., Medina, A. R. et al., 1996. Gram-scale
purification of eicosapentaenoic acid (EPA, 20∶5n−3)
from wet Phaeodactylum tricornutum UTEX640 biomass.J. Appl. Phycol. 8:
359–367），为了减少色谱分离时使用的有机溶剂的量并降低对色谱填料的损耗，以含重量百分含量为70%的EPA乙酯的鱼油为起始原料，按上述文献方法先使用尿素-甲醇溶液进行包合，尿酯比为4︰1 g:g，包合温度65℃~70℃，于28℃过夜结晶，滤液浓缩后注入液相制备系统，色谱柱为C18柱，流动相为甲醇-水（体积比80︰20 ml:ml，并加入流动相总体积1%的醋酸），制备得到重量百分含量为93.4%的EPA浓缩物，经检测其5种反式EPA的含量为0.32%~0.84%，浓缩物过氧化值为4.2，茴香胺值为12.4。
在《鱼油多不饱和脂肪酸高纯度分离技术及山药抗性淀粉制备技术研究》（江苏大学 硕士学位论文 江莉莉 分类号TS225.24，UDC665.2，编号1029980509051）一文中，公开了一种利用分子蒸馏技术降低鱼油茴香胺值的工艺，本发明申请人按照其所述方法，将经过常规的尿素包合方法和色谱柱分离纯化方法制备得到的EPA重量百分含量为93.4%的浓缩物，在温度135℃，压力0.1Pa下经过分子蒸馏，或者将EPA重量百分含量为70%的原料鱼油经过常规的尿素包合后，在温度135℃，压力0.1Pa下经过分子蒸馏，然后再进行色谱柱分离，上述方法得到的浓缩物其EPA乙酯的重量百分含量分别为93.7%和97.4%，其5种反式EPA的含量分别为0.43%~1.32%和0.29%~0.82%，浓缩物过氧化值分别为6.8和5.2，茴香胺值分别为9.4和9.7。
本发明申请人又采用其他鱼油的分离纯化方法相结合，例如尿素包合结合超临界流体萃取、分子蒸馏结合硝酸银硅胶柱、银离子络合法结合模拟移动床分离法等，或者尝试调整各分离纯化方法的具体参数，如尿素包合时使用不同的尿酯比和醇酯比、分子蒸馏时采用不同的温度和压力分别进行二级、三级甚至四级分子蒸馏、液相色谱制备时使用其他流动相如甲醇/四氢呋喃/水、甲醇/丙腈/水等，仍然无法得到反式EPA及氧化产物含量较低的高纯度EPA乙酯浓缩物。
本发明申请人在进行大量的分离纯化实验时，令人惊异地发现，当以EPA乙酯重量百分含量大于等于70%的原料鱼油经过尿素包合、色谱柱分离及分子蒸馏，并且，尿素包合时反应液先在10℃~15℃结晶1~3h，然后在0℃~5℃结晶3~6h，最后在-10℃~-5℃结晶1~3h，色谱柱分离时使用甲醇-异丙醇-水为流动相，同时满足甲醇与异丙醇的体积比为80︰10~85︰5 ml:ml，异丙醇与水的体积比为5︰15~10︰5 ml:ml，此时得到的浓缩物，其EPA乙酯的重量百分含量至少为96.5%，并且5种反式EPA的含量均低于0.3%；当尿素包合和色谱柱分离所得油脂在80℃~100℃、压力小于10Pa条件下进行一级分子蒸馏，然后在120℃~140℃、压力小于10Pa条件下进行二级分子蒸馏，浓缩物氧化产物含量也可以得到很好的控制，其过氧化值低于2，茴香胺值低于5。
本发明所述的尿素包合纯化方法，是以乙醇作为溶解尿素的溶剂，可以是无水乙醇或95%乙醇，优选使用95%乙醇以降低成本；尿酯比为1︰1~2.5︰1 g:g，醇酯比可以是4︰1~10︰1 g:g，优选为尿酯比1.2︰1 g:g，醇酯比8︰1 g:g，此时使用少量的尿素和乙醇即能够达到最佳的包合效果，获得较高纯度的EPA乙酯浓缩物；尿素包合的反应温度通常设定在60℃~75℃以达到较好的分离目的，同时避免成分被破坏；包合时间为0.5~2h可以使反应达到平衡，增加时间可使产品收率增加，但从经济效益考虑，0.5~2h是较为合适的。
本发明申请人研究发现，尿素包合过程中，将鱼油加到尿素的乙醇溶液中反应后，采取本发明所述的阶段性结晶方法，即在10℃~15℃结晶1~3h，然后在0℃~5℃结晶3~6h，最后在-10℃~-5℃结晶1~3h，是控制EPA乙酯浓缩物成品中5种反式EPA含量的关键步骤之一；然而，经过大量的实验研究，本发明申请人还意外地发现，如果先在10℃结晶1h，然后在0℃结晶3h，最后在-5℃结晶2h，此时得到的浓缩物在进行色谱柱分离时，出人意料的，其上样率可由2%提高至5%，使得单位时间内色谱分离纯化鱼油的量大大提高，从而最大限度地提高EPA浓缩物的产率，降低生产成本，增加了生产效益。
本发明所述的高效液相色谱法，使用的色谱柱可以是传统填装法填装的色谱柱，如干法、匀浆法，优选使用动态轴向压缩制备的色谱柱，即DAC色谱柱，以提高其柱效，并且样品重复性好；填料是C18柱，选自YMC-Pack ODS-AQ反相填料、Waters
u-Bondapak C18填料、Kromasil C18填料等，优选Kromasil C18填料分离效果最好。
本发明所述的高效液相色谱法，优选使用如下方法进行梯度洗脱：
。
上述流动相梯度洗脱后获得EPA乙酯浓缩物其5种反式EPA的含量均能控制在0.15%以下。
本发明所述的减压蒸馏，是借助真空泵降低系统内压力，从而降低液体的沸点，达到蒸发的目的，尤其适用于对热不稳定的物质。对鱼油进行减压蒸馏其蒸馏温度通常与溶剂在不同压力下的沸点有关，本发明所述的减压蒸馏蒸发的溶剂主要为水和醇类，温度一般设定在40℃~60℃即可以达到分离目的。
本发明所述的薄膜蒸发技术，是一种新型高效蒸发方法，通过旋转刮膜器强制成膜并高速流动达到蒸发溶剂的目的，其热传递效率高，操作温度低，受热时间短，特别适用于鱼油产品的工业生产，使用的压力通常低于120Pa，温度为70℃~90℃能达到较好的蒸发效果。
本发明所述的分子蒸馏，优选为90℃、压力小于等于5Pa条件下进行一级分子蒸馏，130℃、压力小于等于5Pa条件下进行二级分子蒸馏，与其他温度和压力范围下分子蒸馏制备得到EPA浓缩物相比，其去除氧化杂质的效果更好，产品过氧化值和茴香胺值更低。
对比例
对比例
1
按照专利CN102285880A实施例1所述方法，将EPA乙酯及DHA乙酯总重量百分含量为80%的鱼油粗品，配制成每毫升含200mg粗品的待分离制备液，注入制备型高效液相色谱—质谱联用仪器系统，色谱柱为C18柱（250mm×20mm）；流动相为甲醇水溶液（体积比90︰10 ml:ml），获得的EPA乙酯纯化液在20℃减压浓缩，然后用乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩后得到EPA乙酯浓缩物。
对比例
2
（1）取EPA乙酯重量百分含量为70%的鱼油，加到尿素的95%乙醇溶液中，尿酯比2∶1 g:g，醇酯比10∶1 g:g，在70℃下搅拌溶解至澄清，反应1h后，在10℃结晶5h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在氮气保护下，50℃减压浓缩，20%-25%氯化钠洗涤2次，得到浓缩物；
（2）步骤1所得的浓缩物注入高效液相色谱系统，使用DAC色谱柱，填料YMC-Pack
ODS-AQ，流动相为甲醇-水（体积比85∶15 ml:ml），得到的洗脱液合并后于50℃减压浓缩，然后80℃薄膜蒸发，得到EPA乙酯浓缩物。
对比例
3
（1）取EPA乙酯重量百分含量为70%的鱼油，加到尿素的95%乙醇溶液中，尿酯比2∶1 g:g，醇酯比10∶1 g:g，在70℃下搅拌溶解至澄清，反应1h后，在10℃结晶5h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在氮气保护下，50℃减压浓缩，20%-25%氯化钠洗涤2次，得到浓缩物；
（2）步骤1所得的浓缩物进行二级分子蒸馏，温度和压力分别为一级蒸馏90℃、0.1Pa，二级蒸馏125℃、0.1Pa，得到EPA乙酯浓缩物。
对比例
4
（1）取EPA乙酯重量百分含量为70%的鱼油，加到尿素的95%乙醇溶液中，尿酯比2∶1 g:g，醇酯比10∶1 g:g，在70℃下搅拌溶解至澄清，反应1h后，在-10℃结晶5h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在氮气保护下，50℃减压浓缩，20%-25%氯化钠洗涤2次，得到浓缩物；
（2）对步骤1所得的浓缩物进行二级分子蒸馏，温度和压力分别为一级蒸馏90℃、3Pa，二级蒸馏125℃、2Pa，得到浓缩物；
（3）步骤2所得的浓缩物注入高效液相色谱系统，使用DAC色谱柱，填料YMC-Pack
ODS-AQ，流动相为甲醇-水（体积比85∶15 ml:ml），得到的洗脱液合并后于50℃减压浓缩，然后80℃薄膜蒸发，得到EPA乙酯浓缩物。
对比例
5
（1）取EPA乙酯重量百分含量为70%的鱼油，加到尿素的95%乙醇溶液中，尿酯比2∶1 g:g，醇酯比10∶1 g:g，在70℃下搅拌溶解至澄清，反应1h后，在-5℃结晶5h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在氮气保护下，50℃减压浓缩，20%-25%氯化钠洗涤2次，得到浓缩物；
（2）步骤1所得的浓缩物注入高效液相色谱系统，使用DAC色谱柱，填料YMC-Pack
ODS-AQ，流动相为甲醇-水（体积比85∶15 ml:ml），得到的洗脱液合并后于50℃减压浓缩，然后80℃薄膜蒸发，得到浓缩物；
（3）对步骤2所得的浓缩物进行二级分子蒸馏，温度和压力分别为一级蒸馏90℃、3Pa，二级蒸馏125℃、2Pa，得到EPA乙酯浓缩物。
对比例
6
（1）取EPA乙酯重量百分含量为70%的鱼油，加到尿素的95%乙醇溶液中，尿酯比2∶1 g:g，醇酯比10∶1 g:g，在70℃下搅拌溶解至澄清，反应1h后，在10℃结晶1h，然后在0℃结晶3h，最后在-5℃结晶2h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在氮气保护下，50℃减压浓缩，20%-25%氯化钠洗涤2次，得到浓缩物；
（2）步骤1所得的浓缩物注入高效液相色谱系统，使用DAC色谱柱，填料YMC-Pack
ODS-AQ，流动相为甲醇-水（体积比85∶15 ml:ml），得到的洗脱液合并后于50℃减压浓缩，然后80℃薄膜蒸发，得到浓缩物；
（3）对步骤2所得的浓缩物进行二级分子蒸馏，温度和压力分别为一级蒸馏90℃、2Pa，二级蒸馏125℃、2Pa，得到EPA乙酯浓缩物。
对比例
7
（1）取EPA乙酯重量百分含量为70%的鱼油，加到尿素的95%乙醇溶液中，尿酯比2∶1 g:g，醇酯比10∶1 g:g，在70℃下搅拌溶解至澄清，反应1h后，在10℃结晶1h，然后在0℃结晶3h，最后在-5℃结晶2h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在氮气保护下，50℃减压浓缩，20%-25%氯化钠洗涤2次，得到浓缩物；
（2）步骤1所得的浓缩物注入高效液相色谱系统，使用DAC色谱柱，填料YMC-Pack
ODS-AQ，流动相为甲醇-四氢呋喃-水（体积比45∶30∶25 ml:ml:ml），得到的洗脱液合并后于50℃减压浓缩，然后80℃薄膜蒸发，得到浓缩物；
（3）对步骤2所得的浓缩物进行二级分子蒸馏，温度和压力分别为一级蒸馏90℃、1Pa，二级蒸馏125℃、1Pa，得到EPA乙酯浓缩物。
对比例
8
（1）取EPA乙酯重量百分含量为70%的鱼油，加到尿素的95%乙醇溶液中，尿酯比2∶1 g:g，醇酯比10∶1 g:g，在70℃下搅拌溶解至澄清，反应1h后，在0℃结晶5h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在氮气保护下，50℃减压浓缩，20%-25%氯化钠洗涤2次，得到浓缩物；
（2）步骤1所得的浓缩物注入高效液相色谱系统，使用DAC色谱柱，填料YMC-Pack
ODS-AQ，流动相为甲醇-异丙醇-水（体积比85∶5∶10 ml:ml:ml），得到的洗脱液合并后于50℃减压浓缩，然后80℃薄膜蒸发，得到浓缩物；
（3）对步骤2所得的浓缩物进行二级分子蒸馏，温度和压力分别为一级蒸馏90℃、1Pa，二级蒸馏125℃、1Pa，得到EPA乙酯浓缩物。
对比例
9
（1）取EPA乙酯重量百分含量为70%的鱼油，加到尿素的95%乙醇溶液中，尿酯比2∶1 g:g，醇酯比10∶1 g:g，在70℃下搅拌溶解至澄清，反应1h后，在10℃结晶1h，然后在0℃结晶3h，最后在-5℃结晶2h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在氮气保护下，50℃减压浓缩，20%-25%氯化钠洗涤2次，得到浓缩物；
（2）步骤1所得的浓缩物注入高效液相色谱系统，使用DAC色谱柱，填料YMC-Pack
ODS-AQ，流动相为甲醇-异丙醇-水（体积比85∶5∶10 ml:ml:ml），得到的洗脱液合并后于50℃减压浓缩，然后80℃薄膜蒸发，得到EPA乙酯浓缩物。
对比例
10
（1）取EPA乙酯重量百分含量为70%的鱼油，加到尿素的95%乙醇溶液中，尿酯比2∶1 g:g，醇酯比10∶1 g:g，在70℃下搅拌溶解至澄清，反应1h后，在10℃结晶1h，然后在0℃结晶3h，最后在-5℃结晶2h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在氮气保护下，50℃减压浓缩，20%-25%氯化钠洗涤2次，得到浓缩物；
（2）步骤1所得的浓缩物注入高效液相色谱系统，使用DAC色谱柱，填料YMC-Pack
ODS-AQ，流动相为甲醇-异丙醇-水（体积比85∶5∶10 ml:ml:ml），得到的洗脱液合并后于50℃减压浓缩，然后80℃薄膜蒸发，得到浓缩物；
（3）对步骤2所得的浓缩物进行二级分子蒸馏，温度和压力分别为一级蒸馏90℃、2Pa，二级蒸馏125℃、3Pa，得到EPA乙酯浓缩物。
按照下述方法，分别对对比例1~10所述方法制备得到的EPA乙酯浓缩物进行EPA乙酯的重量百分含量、5种反式EPA的含量及浓缩物的过氧化值和茴香胺值的检测。（本发明所述的EPA乙酯的重量百分含量、反式EPA的含量、过氧化值及茴香胺值均按照下述方法检测所得）
EPA
乙酯及反式
EPA
的含量测定
依据美国油脂检测标准AOCS Ce 1b-89所述，采用毛细管气相色谱法测定。
色谱条件
色谱柱Omegawax 320（30m×0.32mm×0.25um），柱温采用程序升温，载气为氢气，FID检测器，进样口温度250℃，检测器温度270℃，初始柱温170℃，1.0℃/min升温至225℃。
检测方法
精密称量约25mg C23:0乙酯作内标物置于25mL容量瓶，异辛烷定容，吸取1.0mL置于培养管中，蒸发溶剂；精密称量不超过15mgEPA乙酯浓缩物置于上述培养管中，加入1mL异辛烷，充氮，盖上盖子混匀，注入1uL于毛细管气相色谱检测系统，按下式计算EPA的重量百分含量：
EPA%=(AX)(WIS)(CFX)×100/[(AIS)(WS)×1.08]
式中：AX—EPA峰面积；
AIS—内标物峰面积；
CFX—理论校正因子，此为0.99；
WIS—内标物重量，mg；
WS—样品重量，mg。
按面积归一化法计算反式EPA的百分含量：
反式EPA%=(AT)×100/(ΣA-AIS)
式中：AT—反式EPA峰面积；
ΣA—所有峰的峰面积之和；
AIS—内标物峰面积。
过氧化值测定
依据国家标准GBT 5538-2005所述过氧化值的检测方法测定其过氧化值，具体方法为：
溶液配制
乙酸与异辛烷混合液（体积比60:40 ml:ml）：将3份冰乙酸与2份异辛烷混合，冰乙酸和异辛烷均用纯净、干净的惰性气体（二氧化碳或氮气）气流清除氧。
碘化钾饱和溶液：新配制且不得含有游离碘和碘酸盐。
硫代硫酸钠溶液：c（Na2S2O3）=0.1mol/L，临用前标定。将24.9g五水硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O）溶解于蒸馏水中，稀释至1L。
硫代硫酸钠溶液：c（Na2S2O3）=0.01mol/L，临用前标定。由0.1mol/L硫代硫酸钠溶液稀释而成。
淀粉溶液：5g/L。将1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混合，在搅拌的情况下溶于200mL沸水中，添加250mg水杨酸作为防腐剂并煮沸3min，立即从热源上取下并冷却。
测定
用纯净干燥的二氧化碳或氮气冲洗锥形瓶，称样2.0~5.0g，装入250ml具塞锥形瓶中，将50ml乙酸-异辛烷溶液加入锥形瓶中，盖上塞子摇动至样品溶解。加入0.5mL饱和碘化钾溶液，盖上塞子使其反应，时间为1min±1s，在此期间摇动锥形瓶至少3次，然后立即加入30mL蒸馏水。0.01mo/L硫代硫酸钠溶液滴定上述溶液。逐渐地、不间断地添加滴定液，同时伴随有力的搅动，直到黄色几乎消失。添加约0.5mL淀粉溶液，继续滴定，临近终点时，不断摇动使所有的碘从溶剂层释放出来，逐滴添加滴定液，至蓝色消失，即为终点。
空白实验
测定须进行空白实验，当空白实验消耗0.01mol/L硫代硫酸钠溶液超过0.1mL，应更换试剂，重新对样品进行测定。
过氧化值P按下式计算：
P=1000（V-V0）c/m
式中：V—用于测定的硫代硫酸钠溶液的体积，ml；
V0—用于空白的硫代硫酸钠溶液的体积，ml；
c—硫代硫酸钠溶液的浓度，mol/L;
m—试样的质量，g。
茴香胺值测定
依据国家标准GBT 24304-2009所述茴香胺值的检测方法测定其茴香胺值，具体方法为：
测试溶液的制备：称取适量制备好的EPA浓缩物，精确到1mg，直接装入25mL容量瓶中，用5mL～10mL异辛烷溶解，并用相同的溶剂稀释至刻度。
未反应溶液的测定：用移液管吸收5mL测试溶液于具塞试管中，用移液管加1mL冰醋酸溶液，盖上塞子并充分摇动。在23℃±3℃下放置暗处8min。在2min内将溶液转移到干净、干燥的分光光度计的比色皿中。从添加冰醋酸溶液计时，反应时间总计10min±1min，随即测定吸光度。
反应溶液的测定：用移液管吸取5mL测试溶液于具塞试管中，用移液管加1mL茴香胺试剂，盖上塞子并充分摇动。在在23℃±3℃下放置暗处8min。在2min内将溶液转移到干净、干燥的分光光度计的比色皿中。从添加茴香胺试剂计时，反应时间总计10min±1min，随即测定吸光度。
空白溶液的测定：用移液管吸取5mL异辛烷于具塞试管中，用移液管加1mL茴香胺试剂，盖上塞子并充分摇动。在23℃±3℃下放置暗处8min。在2min内将溶液转移到干净、干燥的分光光度计的比色皿中。从添加茴香胺试剂计时，反应时间总计10min±1min，随即测定吸光度。
按下式计算p-茴香胺值（AV）:
AV=100QV[1.2×(A1-A2-A0)]/m
式中：V—溶解试样的体积，mL，V=25mL;
m—试样的质量，g；
Q—根据茴香胺值定义，Q为测定溶液中样品浓度，g/mL，Q=0.01 g/mL
A0—未反应溶液吸光度；
A1—反应溶液吸光度；
A2—空白溶剂吸光度。
对比例1～10制备的EPA乙酯浓缩物中EPA重量百分含量、反式EPA的含量、过氧化值、茴香胺值结果见下表：
。
在对比例1~3中，单独使用高效液相色谱法或者分子蒸馏法处理尿素包合后的浓缩物，其5种反式EPA的含量无法均达到0.5%以下，同时氧化产物的量也较高；对比例4~5中，将尿素包合、分子蒸馏、高效液相色谱三种分离方法相结合，并调整各分离方法的操作顺序，其5种反式EPA的含量仍无法均达到0.5%以下，产品的过氧化值无法控制在6以下，茴香胺值无法控制在5以下；对比例6~8中，单独在尿素包合时使用阶段性控温的结晶方法结合常规高效液相色谱及分子蒸馏法，或者高效液相分离时在甲醇-水流动相中加入一定量的四氢呋喃，或者常规尿素包合后，在高效液相分离时使用甲醇-异丙醇-水作为流动相然后再分子蒸馏，仍无法将5种反式EPA的含量均控制在0.5%以下，同时其过氧化值无法控制在4以下，茴香胺值无法控制在5以下；对比例9表明，当以EPA乙酯重量百分含量大于等于70%的鱼油经过尿素包合、色谱柱分离，且同时满足本发明所述的条件，即尿素包合时采用本发明所述的阶段性结晶方法，并且色谱分离时使用本发明所述体积比的甲醇-异丙醇-水为流动相进行等度洗脱，此时EPA乙酯的重量百分含量至少为96.5%，并且5种反式EPA的含量均低于0.3%，氧化产物与对比例1~8相比虽大幅降低，但仍然不能满足过氧化值小于2，茴香胺值小于5；对比例10表明当上述方法制备的浓缩物先在80℃~100℃、压力小于10Pa条件下进行一级分子蒸馏，然后在120℃~140℃、压力小于10Pa条件下进行二级分子蒸馏，可以将其氧化产物控制在更低的水平，其过氧化值可控制在2以下，茴香胺值可控制在5以下。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不是对本发明的保护范围的进一步限定。
实施例
1
（1）取EPA乙酯重量百分含量为70%的鱼油，加到尿素的无水乙醇溶液中，尿酯比1∶1 g:g，醇酯比10∶1 g:g，在60℃下搅拌溶解至澄清，反应0.5h后，在12℃结晶2h，然后在5℃结晶6h，最后在-10℃结晶1h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在氮气保护下，40℃减压浓缩，20%-25%氯化钠洗涤2次，得到浓缩物；
（2）步骤1所得的浓缩物注入高效液相色谱系统，使用DAC色谱柱，填料YMC-Pack
ODS-AQ，流动相为甲醇-异丙醇-水（体积比80∶5∶15 ml:ml:ml），得到的洗脱液合并后于60℃减压浓缩，然后70℃薄膜蒸发，得到浓缩物；
（3）对步骤2所得的浓缩物进行二级分子蒸馏，温度和压力分别为一级蒸馏80℃、8Pa，二级蒸馏120℃、9Pa，得到EPA乙酯浓缩物。
实施例
2
（1）取EPA乙酯重量百分含量为70%的鱼油，加到尿素的95%乙醇溶液中，尿酯比2.5∶1 g:g，醇酯比4∶1 g:g,在78℃下搅拌溶解至澄清，反应2h后，在15℃结晶3h，然后在3℃结晶4h，最后在-7℃结晶3h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在氮气保护下，60℃减压浓缩，20%-25%氯化钠洗涤2次，得到浓缩物；
（2）步骤1所得的浓缩物注入高效液相色谱系统，使用DAC色谱柱，填料YMC-Pack
ODS-AQ，流动相为甲醇-异丙醇-水（体积比85∶10∶5 ml:ml:ml），得到的洗脱液合并后于60℃减压浓缩，然后80℃薄膜蒸发，得到浓缩物；
（3）对步骤2所得的浓缩物进行二级分子蒸馏，温度和压力分别为一级蒸馏100℃、6Pa，二级蒸馏140℃、2Pa，得到EPA乙酯浓缩物。
实施例
3
（1）取EPA乙酯重量百分含量为70%的鱼油，加到尿素的95%乙醇溶液中，尿酯比2∶1 g:g，醇酯比8∶1 g:g，在45℃下搅拌溶解至澄清，反应1h后，在10℃结晶1h，然后在0℃结晶3h，最后在-5℃结晶2h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在氮气保护下，50℃减压浓缩，20%-25%氯化钠洗涤2次，得到浓缩物；
（2）步骤1所得的浓缩物注入高效液相色谱系统，使用DAC色谱柱，填料YMC-Pack
ODS-AQ，流动相为甲醇-异丙醇-水（体积比82∶9∶9 ml:ml:ml），得到的洗脱液合并后于60℃减压浓缩，然后90℃薄膜蒸发，得到浓缩物；
（3）对步骤2所得的浓缩物进行二级分子蒸馏，温度和压力分别为一级蒸馏90℃、4Pa，二级蒸馏135℃、6Pa，得到EPA乙酯浓缩物。
实施例
4
（1）取EPA乙酯重量百分含量为80%的鱼油，加到尿素的95%乙醇溶液中，尿酯比1.2∶1 g:g，醇酯比8∶1 g:g，在75℃下搅拌溶解至澄清，反应2h后，在10℃结晶1h，然后在0℃结晶4h，最后在-10℃结晶1h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在氮气保护下，50℃减压浓缩，20%-25%氯化钠洗涤2次，得到浓缩物；
（2）步骤1所得的浓缩物注入高效液相色谱系统，使用DAC色谱柱，填料Kromasil
C18，流动相为甲醇-异丙醇-水（体积比85∶5∶10 ml:ml:ml），得到的洗脱液合并后于50℃减压浓缩，然后80℃薄膜蒸发，得到浓缩物；
（3）对步骤2所得的浓缩物进行二级分子蒸馏，温度和压力分别为一级蒸馏90℃、4Pa，二级蒸馏140℃、7Pa，得到EPA乙酯浓缩物。
实施例
5
（1）取EPA乙酯重量百分含量为80%的鱼油，加到尿素的95%乙醇溶液中，尿酯比1.5∶1 g:g，醇酯比6∶1 g:g，在70℃下搅拌溶解至澄清，反应2h后，在10℃结晶1h，然后在0℃结晶4h，最后在-10℃结晶1h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在氮气保护下，50℃减压浓缩，20%-25%氯化钠洗涤2次，得到浓缩物；
（2）步骤1所得的浓缩物注入高效液相色谱系统，使用DAC色谱柱，填料YMC-Pack
ODS-AQ，流动相为甲醇-异丙醇-水（体积比85∶5∶10 ml:ml:ml），得到的洗脱液合并后于50℃减压浓缩，然后80℃薄膜蒸发，得到浓缩物；
（3）对步骤2所得的浓缩物进行二级分子蒸馏，温度和压力分别为一级蒸馏90℃、2Pa，二级蒸馏130℃、2Pa，得到EPA乙酯浓缩物。
实施例
6
（1）取EPA乙酯重量百分含量为80%的鱼油，加到尿素的95%乙醇溶液中，尿酯比2∶1 g:g，醇酯比7∶1 g:g，在70℃下搅拌溶解至澄清，反应,2h后，在10℃结晶1h，然后在0℃结晶3h，最后在-10℃结晶1h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在氮气保护下，50℃减压浓缩，20%-25%氯化钠洗涤2次，得到浓缩物；
（2）步骤1所得的浓缩物注入高效液相色谱系统，使用DAC色谱柱，填料YMC-Pack
ODS-AQ，流动相按以下方法进行梯度洗脱：
得到的洗脱液合并后于50℃减压浓缩，然后80℃薄膜蒸发，得到浓缩物；
（3）对步骤2所得的浓缩物进行二级分子蒸馏，温度和压力分别为一级蒸馏90℃、0.1Pa，二级蒸馏125℃、0.1Pa，得到EPA乙酯浓缩物。
分别对实施例1~3液相色谱分离纯化时，按照下式计算上样率：
上样率=W上样/W填料，W上样为色谱制备时上样的样品重量，W填料为色谱制备时色谱柱中的填料重量，结果见下表。
分别对实施例1~6最终制备得到的EPA乙酯浓缩物进行EPA乙酯的重量百分含量、5种反式EPA的含量及浓缩物的过氧化值和茴香胺值的检测，结果见下表。。
Claims (10)
1.一种高纯度的EPA乙酯浓缩物，其特征在于所述EPA乙酯浓缩物包含按油的重量百分含量计至少96.5%的EPA乙酯，并且反-5,顺-8,11,14,17-二十碳五烯酸乙酯、反-11,顺-5,8,14,17 -二十碳五烯酸乙酯、反-14,顺-5,8,11,17-二十碳五烯酸乙酯、反-17,顺-5,8,11,14-二十碳五烯酸乙酯及反-8,17,顺-5,11,14-二十碳五烯酸乙酯的含量均低于0.3%，浓缩物过氧化值低于2，茴香胺值低于5。
2.根据权利要求1所述的高纯度的EPA乙酯浓缩物，特征在于其制备方法是：
（1）将EPA乙酯重量百分含量大于等于70%的原料鱼油，加到尿素的乙醇溶液中，在45℃~78℃，优选60℃~75℃下搅拌溶解至澄清，反应0.5~24h后，在10℃~15℃结晶1~3h，然后在0℃~5℃结晶3~6h，最后在-10℃~-5℃结晶1~3h，过滤除去结晶所得的析出物，滤液在惰性气体保护下，减压浓缩、洗涤，得到浓缩物；
（2）对步骤1制得的浓缩物采用高效液相色谱法进行分离纯化，流动相为甲醇-异丙醇-水，其中甲醇与异丙醇的体积比为80︰10 ~85︰5 ml:ml，异丙醇与水的体积比为5︰15~10︰5 ml:ml，得到的洗脱液合并后减压浓缩，然后经薄膜蒸发，得到浓缩物；
（3）对步骤2所制得的浓缩物进行二级分子蒸馏，其中一级蒸馏是在80℃~100℃、压力小于10Pa条件下进行，二级蒸馏是在120℃~140℃、压力小于10Pa条件下进行，得到高纯度EPA乙酯浓缩物。
3.根据权利要求2所述的高纯度的EPA乙酯浓缩物的制备方法，其特征在于所述步骤1的乙醇是95%乙醇。
4.根据权利要求2所述的高纯度的EPA乙酯浓缩物的制备方法，其特征在于所述步骤1的反应时间为0.5~2h。
5.根据权利要求2所述的高纯度的EPA乙酯浓缩物的制备方法，其特征在于所述步骤1中尿素与原料鱼油的重量比是1︰1~2.5︰1 g:g，乙醇与原料鱼油的重量比是4︰1~10︰1 g:g；优选为尿素与原料鱼油的重量比是1.2︰1 g:g，乙醇与原料鱼油的重量比是8︰1 g:g。
6.根据权利要求2所述的高纯度的EPA乙酯浓缩物的制备方法，其特征在于所述步骤1是将鱼油加到尿素的乙醇溶液中，在45℃~78℃下搅拌溶解至澄清，反应0.5~24h后，先在10℃结晶1h，然后在0℃结晶3h，最后在-5℃结晶2h。
7.根据权利要求2所述的高纯度的EPA乙酯浓缩物的制备方法，其特征在于所述步骤2使用的色谱柱为DAC色谱柱，填料为Kromasil C18。
8.根据权利要求2所述的高纯度的EPA乙酯浓缩物的制备方法，其特征在于所述步骤2使用的流动相甲醇-异丙醇-水是按如下方法进行梯度洗脱：
。
9.根据权利要求2所述的高纯度的EPA乙酯浓缩物的制备方法，其特征在于所述步骤3优选为一级分子蒸馏是在90℃、压力小于等于5Pa条件下进行，二级分子蒸馏在130℃、压力小于等于5Pa条件下进行。
10.根据权利要求1所述的高纯度的EPA乙酯浓缩物，其特征在于所述的反-5,顺-8,11,14,17-二十碳五烯酸乙酯、反-11,顺-5,8,14,17 -二十碳五烯酸乙酯、反-14,顺-5,8,11,17-二十碳五烯酸乙酯、反-17,顺-5,8,11,14-二十碳五烯酸乙酯及反-8,17,顺-5,11,14-二十碳五烯酸乙酯的含量，是按照毛细管气相色谱法，色谱条件为色谱柱Omegawax
320（30m×0.32mm×0.25um），柱温采用程序升温，载气为氢气，FID检测器，进样口温度250℃，检测器温度270℃，初始柱温170℃，1.0℃/min升温至225℃，以C23:0乙酯作内标物，并对色谱图按面积归一化法计算得到的百分含量。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160106 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |