CN105210837B - 使用植物无菌水培装置进行根瘤菌结瘤效果评价的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物无菌水培装置，包括玻璃杯(1)和固定在其内部的底部的至少一个滤网(2)，在所述滤网(2)内设置有培养基质(3)，所述玻璃杯(1)的顶部开口采用封口膜(4)封口，在所述玻璃杯(1)内设置有水培液(5)，所述水培液(5)的液面高度低于所述培养基质(3)的上表面。本发明植物无菌水培装置可以通过高温灭菌处理后对多种植物进行快速高效的无菌水培。本发明还公开了采用该装置进行水培苜蓿的根瘤菌接菌及结瘤效果的评价方法，所述方法具有操作简便、苜蓿生长速度快、水培液更换容易、根瘤菌接菌后结瘤效果观察方便等优点。

Description

使用植物无菌水培装置进行根瘤菌结瘤效果评价的方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及一种植物无菌水培装置及采用该装置进行水培苜蓿的根瘤菌接菌及结瘤效果的评价方法。

背景技术

常见的植物无菌苗种植方法是配制琼脂或植物凝胶等固体培养基，将植物种子消毒后种于固体培养基上。在固体培养基上培养无菌植物苗的方法存在一些缺陷，如苜蓿等植物在固体培养基上存在根发育缓慢，幼苗生长速度较慢。另外长时间培养后由于培养基中营养元素消耗和有毒代谢产物的积累，无菌苗生长受到抑制甚至死亡。此时更换新的固体培养基是一种解决办法，通常需要将无菌苗从旧的固体培养基中拔出移入新的固体培养基中，此操作容易对植物根造成伤害且操作不方便。

根瘤菌通过豆科植物根毛、侧根杈口或其他部位侵入，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤具有固氮功能，将空气中氮气还原成NH₃，分泌至根瘤细胞内，并合成酰胺类或酰尿类化合物，输出根瘤，由根的传导组织运输至宿主地上部分供利用。宿主为根瘤菌提供良好的居住环境、碳源和能源以及其他必需营养，而根瘤菌则为宿主提供氮素营养，形成共生关系。

自然界土壤中存在多种根瘤菌，不同种类根瘤菌在不同豆科植物根部的结瘤固氮效果不同。为了筛选与苜蓿相匹配的最佳固氮根瘤菌株，通常在大田中进行接菌试验，但此法存在受土壤中本身存在的根瘤菌及其它自然因素影响的影响。另外，还有方法将苜蓿种于高温灭菌土壤中，然后接入根瘤菌。此方法存在土壤灭菌不彻底，观察根瘤时需要将苗从土壤中拔出清洗等操作，存在对根造成较大伤害且操作不方便等缺陷。因此，需要一种便于接菌处理，不受其它细菌、霉菌等因素影响，观察方便的根瘤菌接菌及结瘤效果评价的装置和方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可以实现多种适合水培植物的快速简单无菌苗培养的植物无菌水培装置。本发明还提供了采用本发明所述的植物无菌水培装置进行水培苜蓿的根瘤菌接菌及结瘤效果的评价方法。

一种植物无菌水培装置，包括玻璃杯和固定在其内部的底部的至少一个滤网，在所述滤网内设置有培养基质，所述玻璃杯的顶部开口采用封口膜封口，在所述玻璃杯内设置有水培液，所述水培液的液面高度低于所述培养基质的上表面。

本发明所述的植物无菌水培装置，其中，所述玻璃杯的内部的底部中心位置设置有固定柱，所述滤网的底部设置有与所述固定柱相匹配的固定孔，所述固定孔穿过所述固定柱固定在所述玻璃杯的底部，所述滤网为不锈钢筒状滤网，所述滤网的顶部直径大于底部直径。

本发明所述的植物无菌水培装置，其中，所述滤网采用厚度为0.5mm、孔密度为10目的不锈钢滤网制作而成，所述滤网的底部外径为40mm，顶部外径为43mm，高度为50mm；所述固定孔的直径为10mm。

本发明所述的植物无菌水培装置，其中，所述滤网为一个或多个，当所述滤网为多个时，多个所述滤网上下叠加到设计高度，最底部的所述滤网固定在所述玻璃杯的底部，在最上端的所述滤网中设置有所述培养基质，相邻两个所述滤网之间的叠加部分的高度为30mm。

本发明所述的植物无菌水培装置，其中，所述玻璃杯的侧壁的下部设置有换液口，所述换液口采用锥形橡胶塞密封；所述换液口为圆柱形管体，长度为5mm，内径为8mm、外径为10mm，其一端与所述玻璃杯的下部相连，另一端采用所述锥形橡胶塞密封，所述锥形橡胶塞的长度为10mm，一端直径为5mm，另一端直径为10mm；所述培养基质为粒径3～5mm的石英砂。

本发明所述的植物无菌水培装置，其中，所述玻璃杯为圆桶形，侧壁和底部的厚度为3mm，内径为94mm，外径为100mm，高度为200～300mm，所述固定柱为圆柱形玻璃柱，直径为8mm，高度为30mm。

采用本发明所述的植物无菌水培装置进行水培苜蓿的根瘤菌接菌及结瘤效果的评价方法，包括如下步骤：

(A)、准备工作：将装有培养基质的滤网与玻璃杯组合，用封口膜将玻璃杯上口密封，使用锥形橡胶塞将底部换液口密封，形成植物无菌水培装置，将其在121℃下湿热灭菌30min后放入超净台备用；配制水培液，121℃下湿热灭菌30min放入超净台备用；

(B)、播种：筛选籽粒饱满的苜蓿种子，使用75％酒精消毒15min，然后用灭菌蒸馏水冲洗三遍，每遍1min，将灭菌苜蓿种子分别在不同根瘤菌株液中浸泡2～5小时，打开所述植物无菌水培装置的封口膜，将1～2粒接菌后的苜蓿种子放入滤网中的培养基质的表面，沿所述玻璃杯的内侧壁加入经高温灭菌的所述水培液，液面高度低于所述培养基质的表面高度，然后用封口膜将所述玻璃杯上口密封，播种操作均在超净工作台内完成；将播种后的植物无菌水培装置置于人工气候箱中培养；

(C)、更换水培液：每6～10天在超净台中更换一次所述水培液，更换所述水培液时将玻璃杯的底部锥形橡胶塞取出使所述水培液经换液口流出，待所述水培液全部流出后重新使用所述锥形橡胶塞密封换液口，打开所述封口膜后沿内侧壁加入新的所述水培液，每更换一次所述水培液，其液面高度比前一次更换时的水培液的高度降低5～10mm；最终液面低于水培液液面30～50mm；

(D)、观察评价：将水培30天以上的苜蓿幼苗取出，并观察评价不同根瘤菌的结瘤效果；

其中，所述水培液为无氮MS水培液。

采用本发明所述的植物无菌水培装置进行水培苜蓿的根瘤菌接菌及结瘤效果的评价方法，包括如下步骤：

(a)、准备工作：将装有培养基质的滤网与玻璃杯组合，配制Hogland水培液和无氮MS水培液；将所述Hogland水培液沿所述玻璃杯的内侧壁加入到所述玻璃杯内，液面高度低于培养基质表面高度，用封口膜将所述玻璃杯的上口密封，形成植物无菌水培装置，在121℃下湿热灭菌30min后放入超净台备用；

(b)、打开所述植物无菌水培装置的所述封口膜，选取发芽5天生长健壮的无菌苜蓿幼苗，将无菌苜蓿幼苗放入所述滤网中的培养基质表面，然后用所述封口膜将所述玻璃杯口密封，上述操作均在超净工作台内完成；将移栽无菌苗的所述植物无菌水培装置置于人工气候箱中培养；

(c)、每6～10天在超净台中更换一次水培液，更换Hogland水培液时将所述玻璃杯的底部锥形橡胶塞取出，使水培液经换液口流出，待Hogland水培液全部流出后重新使用所述锥形橡胶塞密封换液口，打开上部封口膜，沿所述玻璃杯的内侧壁加入新的Hogland水培液，每次更换新Hogland水培液的液面高度逐渐降低，最终液面高度低于所述培养基质3的表面高度30～50mm；

(d)、经无菌水培15天，苜蓿幼苗长出较多侧根，取2种苜蓿根瘤菌保存液0.1mL分别接种于10mL液体YEB培养基中，在摇床中200r/min，28℃振荡培养10～20小时，根瘤菌培养至浓度达到OD₆₀₀＝0.5～0.8时备用，分别取0.2mL刚摇好的根瘤菌菌液加入苜蓿幼苗根部，将Hogland水培液更换为无氮MS水培液，每6～10天更换一次水培液，经根瘤菌接菌水培30天的苜蓿苗用于结瘤效果的观察评价，取出苜蓿根，记录根瘤数量、大小和颜色，评价不同根瘤菌株的结瘤效果。

本发明植物无菌水培装置及采用该装置进行水培苜蓿的根瘤菌接菌及结瘤效果的评价方法与现有技术不同之处在于：

本发明植物无菌水培装置可以通过高温灭菌处理后进行无菌水培；以不锈钢滤网盛放石英砂作为培养基质便于植物幼苗的固定和根的生长；杯体下部有换液孔，在长时间培养时便于水培液更换且不易造成污染；该水培系统可以对多种豆科植物进行快速高效的无菌水培及根瘤菌接菌及结瘤效果观察评价。

使用本发明植物无菌水培装置进行植物无菌水培的方法具有如下优点：

选择灭菌处理的植物种子或无菌植物幼苗于本装置中进行培养，与常规开放式水培方法相比，采用本发明装置能够进行植物幼苗的无菌培养，可以为苜蓿等豆科植物根瘤菌接菌及结瘤效果观察评价提供无菌密闭环境；水培营养液能够为植物提供良好生长所需的各种营养元素，根瘤菌接菌方便；在此装置提供的无菌环境下植物幼苗生长速度快，不受其它根瘤菌和外界细菌、病毒、真菌影响。

选择的颗粒较大的石英砂培养基质和不锈钢滤网对植物根的生长具有很好的适应性。常规水培方法通常使用较细的石英砂、海绵等作为固定基质，在这些基质中植物根系生长受限，且观察、收集植物根系不便，与此相比，该发明装置能够使植物根系在较粗的石英砂孔隙中生长良好，便于植物根系的收集，植物根系还能通过金属滤网网孔伸出，便于根系观察。

本发明装置适合高度低于30cm的植物及幼苗的无菌水培，本发明装置操作简单，将适合的植物无菌幼苗或消毒后的植物种子在超净台中放入该水培装置内部的石英砂表面，用带滤片的封口膜将玻璃杯口密封，然后置于人工气候箱中进行水培。如需进行长期培养，可打开杯体底部开孔将旧水培液的放出，然后用橡胶塞密封后从杯口加入新的水培液，从而进行水培液的更换。此水培液的更换操作简便。

与常规固体琼脂培养基中进行无菌培养相比，采用本装置进行无菌水培的植物幼苗根系发育良好，根系发达，幼苗健壮，茎叶粗壮，刈割再生性好，解决了常规固体琼脂培养基中植物苗生长缓慢、根系短小、侧根稀少、刈割后再生缓慢以及培养基不易更换等问题。

下面结合附图对本发明的植物无菌水培装置及采用该装置进行水培苜蓿的根瘤菌接菌及结瘤效果的评价方法作进一步说明。

附图说明

图1为本发明植物无菌水培装置的玻璃杯的结构示意图；

图2为本发明植物无菌水培装置的滤网的结构示意图；

图3为本发明实施例1中植物无菌水培装置的结构示意图；

图4为图3的剖面结构示意图；

图5为本发明实施例2中植物无菌水培装置的结构示意图；

图6为图5的剖面结构示意图；

图7为苜蓿根瘤菌结瘤效果评价图；其中，A为所接根瘤菌菌株为苜蓿中华根瘤菌17576，B为所接根瘤菌为苜蓿中华根瘤菌17581，C为未接菌对照。

具体实施方式

实施例1

如图1～图4所示，一种植物无菌水培装置，包括玻璃杯1和固定在其内部的底部的至少一个滤网2，在滤网2内设置有培养基质3，玻璃杯1的顶部开口采用封口膜4封口，在玻璃杯1内设置有水培液5，水培液5的液面高度低于培养基质3的上表面。

玻璃杯1的内部的底部中心位置设置有固定柱6，滤网2的底部设置有与固定柱6相匹配的固定孔7，固定孔7穿过固定柱6固定在玻璃杯1的底部，滤网2为不锈钢筒状滤网，滤网2的顶部直径大于底部直径。

滤网2采用厚度为0.5mm、孔密度为10目的不锈钢滤网制作而成，滤网2的底部外径为40mm，顶部外径为43mm，高度为50mm；固定孔6的直径为10mm。

滤网2为一个，玻璃杯1的侧壁的下部设置有换液口8，换液口8采用锥形橡胶塞9密封，换液口8为圆柱形管体，长度为5mm，内径为8mm、外径为10mm，其一端与玻璃杯1的下部相连，另一端采用锥形橡胶塞8密封，锥形橡胶塞8的长度为10mm，一端直径为5mm，另一端直径为10mm。培养基质3为粒径3～5mm的石英砂，水培液5为Hogland营养液或无氮MS营养液。

玻璃杯1为圆桶形，侧壁和底部的厚度为3mm，内径为94mm，外径为100mm，高度为200～300mm，固定柱6为圆柱形玻璃柱，直径为8mm，高度为30mm。

实施例2

如图1、图2、图5和图6所示，一种植物无菌水培装置，包括玻璃杯1和固定在其内部的底部的至少两个滤网2，在滤网2内设置有培养基质3，玻璃杯1的顶部开口采用封口膜4封口，在玻璃杯1内设置有水培液5，水培液5的液面高度低于培养基质3的上表面。

玻璃杯1的内部的底部中心位置设置有固定柱6，滤网2的底部设置有与固定柱6相匹配的固定孔7，固定孔7穿过固定柱6固定在玻璃杯1的底部，滤网2为不锈钢筒状滤网，滤网2的顶部直径大于底部直径。滤网2采用厚度为0.5mm、孔密度为10目的不锈钢滤网制作而成，滤网2的底部外径为40mm，顶部外径为43mm，高度为50mm；固定孔6的直径为10mm。滤网2为多个，多个滤网2上下叠加到设计高度，最底部的滤网2固定在玻璃杯1的底部，在最上端的滤网2中设置有培养基质3，相邻两个滤网2之间的叠加部分的高度为30mm。

玻璃杯1的侧壁的下部设置有换液口8，换液口8采用锥形橡胶塞9密封。换液口8为圆柱形管体，长度为5mm，内径为8mm、外径为10mm，其一端与玻璃杯1的下部相连，另一端采用锥形橡胶塞8密封，锥形橡胶塞8的长度为10mm，一端直径为5mm，另一端直径为10mm。培养基质3为粒径3～5mm的石英砂，水培液5为Hogland营养液或无氮MS营养液。玻璃杯1为圆桶形，侧壁和底部的厚度为3mm，内径为94mm，外径为100mm，高度为200～300mm，固定柱6为圆柱形玻璃柱，直径为8mm，高度为30mm。

实施例3

采用本发明实施例1或实施例2所述的植物无菌水培装置进行水培苜蓿的根瘤菌接菌及结瘤效果的评价方法，包括如下步骤：

(A)、将盛放满石英砂的滤网2与玻璃杯1组合，用封口膜4将杯口密封，使用锥形橡胶塞9将底部开孔密封，组合后在121℃下湿热灭菌30min后放入超净台备用；配制无氮MS水培液，121℃下湿热灭菌30min放入超净台备用。

(B)、将0.1mL根瘤菌保存液接种于10mL液体YEB培养基中，在摇床中200r/min，28℃振荡培养10～20小时，根瘤菌培养至浓度达到OD₆₀₀＝0.5～0.8时备用。筛选籽粒饱满的苜蓿种子，使用75％酒精消毒15min，然后用灭菌蒸馏水冲洗三遍，每遍1min。取1mL刚摇好的根瘤菌菌液浸泡灭菌后的苜蓿种子1～2h。打开上述植物无菌水培装置的封口膜4，将浸泡根瘤菌的苜蓿种子1～2粒放入滤网2中的石英砂表面，从玻璃杯1内侧壁加入经高温灭菌的无氮MS水培液，液面高度不高于石英砂表面高度，然后用封口膜4将玻璃杯1的上口密封，上述播种操作在超净工作台内完成。将播种后的无菌水培装置置于人工气候箱中培养。

(C)、每6～10天在超净台中更换一次水培液，更换无氮MS水培液时将玻璃杯1底部锥形橡胶塞9取出使水培液5经换液口流出，待无氮MS水培液全部流出后重新使用锥形橡胶塞9密封换液口，打开上部封口膜4沿内侧壁加入新的无氮MS水培液，新加入无氮MS水培液的液面高度随着苜蓿苗根的生长逐渐降低，最终液面高度低于培养基质3表面30～50mm。

(D)、经根瘤菌接菌水培30天以上的苜蓿苗可用于结瘤效果的观察评价。

实施例4

采用本发明实施例1或实施例2所述的植物无菌水培装置进行水培苜蓿的根瘤菌接菌及结瘤效果的评价方法，包括如下步骤：

(a)、准备工作：将装有培养基质3的滤网2与玻璃杯1组合，配制Hogland水培液和无氮MS水培液；将所述Hogland水培液沿所述玻璃杯1的内侧壁加入到所述玻璃杯1内，液面高度低于培养基质表面3高度，用封口膜4将所述玻璃杯1的上口密封，形成植物无菌水培装置，在121℃下湿热灭菌30min后放入超净台备用；

(b)、打开所述植物无菌水培装置的所述封口膜4，选取发芽5天生长健壮的无菌苜蓿幼苗，将无菌苜蓿幼苗放入所述滤网2中的培养基质表面3，然后用所述封口膜4将所述玻璃杯1口密封，上述操作均在超净工作台内完成；将移栽无菌苗的所述植物无菌水培装置置于人工气候箱中培养；

(c)、每6～10天在超净台中更换一次水培液5，更换Hogland水培液时将所述玻璃杯1的底部锥形橡胶塞9取出，使水培液经换液口8流出，待Hogland水培液全部流出后重新使用所述锥形橡胶塞9密封换液口，打开上部封口膜4，沿所述玻璃杯1的内侧壁加入新的Hogland水培液，每次更换新Hogland水培液的液面高度逐渐降低，最终液面高度低于所述培养基质3的表面高度30～50mm；

(d)、经无菌水培15天，苜蓿幼苗长出较多侧根，取2种苜蓿根瘤菌(苜蓿中华根瘤菌17576和17581)保存液0.1mL分别接种于10mL液体YEB培养基中，在摇床中200r/min，28℃振荡培养10～20小时，根瘤菌培养至浓度达到OD₆₀₀＝0.5～0.8时备用，分别取0.2mL刚摇好的根瘤菌菌液加入苜蓿幼苗根部，将Hogland水培液更换为无氮MS水培液，每6～10天更换一次水培液，经根瘤菌接菌水培30天的苜蓿苗用于结瘤效果的观察评价，取出苜蓿根，记录根瘤数量、大小和颜色，评价不同根瘤菌株的结瘤效果。图7为苜蓿中华根瘤菌17576和17581的结瘤效果比较图。结果表明中华根瘤菌17576结瘤数量多、体积大、颜色浅红；苜蓿中华根瘤菌17581结瘤较少、体积较小。因此表明在水培条件下苜蓿中华根瘤菌17576比苜蓿中华根瘤菌17581结瘤效果要好。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种植物无菌水培装置，其特征在于：包括玻璃杯(1)和固定在其内部的底部的至少一个滤网(2)，在所述滤网(2)内设置有培养基质(3)，所述玻璃杯(1)的顶部开口采用封口膜(4)封口，在所述玻璃杯(1)内设置有水培液(5)，所述水培液(5)的液面高度低于所述培养基质(3)的上表面；所述玻璃杯(1)的内部的底部中心位置设置有固定柱(6)，所述滤网(2)的底部设置有与所述固定柱(6)相匹配的固定孔(7)，所述固定孔(7)穿过所述固定柱(6)固定在所述玻璃杯(1)的底部；所述玻璃杯(1)的侧壁的下部设置有换液口(8)，所述换液口(8)采用锥形橡胶塞(9)密封；所述换液口(8)一端与所述玻璃杯(1)的下部相连，另一端采用所述锥形橡胶塞(9)密封。

2.根据权利要求1所述的植物无菌水培装置，其特征在于：所述滤网(2)为不锈钢筒状滤网，所述滤网(2)的顶部直径大于底部直径。

3.根据权利要求2所述的植物无菌水培装置，其特征在于：所述滤网(2)采用厚度为0.5mm、孔密度为10目的不锈钢滤网制作而成，所述滤网(2)的底部外径为40mm，顶部外径为43mm，高度为50mm；所述固定孔(7)的直径为10mm。

4.根据权利要求2所述的植物无菌水培装置，其特征在于：所述滤网(2)为一个或多个，当所述滤网(2)为多个时，多个所述滤网(2)上下叠加到设计高度，最底部的所述滤网(2)固定在所述玻璃杯(1)的底部，在最上端的所述滤网(2)中设置有所述培养基质(3)，相邻两个所述滤网(2)之间的叠加部分的高度为30mm。

5.根据权利要求1所述的植物无菌水培装置，其特征在于：所述换液口(8)为圆柱形管体，长度为5mm，内径为8mm、外径为10mm；所述锥形橡胶塞(9)的长度为10mm，一端直径为5mm，另一端直径为10mm；所述培养基质(3)为粒径3～5mm的石英砂。

6.根据权利要求2所述的植物无菌水培装置，其特征在于：所述玻璃杯(1)为圆桶形，侧壁和底部的厚度为3mm，内径为94mm，外径为100mm，高度为200～300mm，所述固定柱(6)为圆柱形玻璃柱，直径为8mm，高度为30mm。

7.使用权利要求1～6中任意一项权利要求所述的植物无菌水培装置进行根瘤菌结瘤效果评价的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(A)、准备工作：将装有培养基质的滤网与玻璃杯组合，用封口膜将玻璃杯上口密封，使用锥形橡胶塞将底部换液口密封，形成植物无菌水培装置，将其在121℃下湿热灭菌30min后放入超净台备用；配制水培液，121℃下湿热灭菌30min放入超净台备用；

(B)、播种：筛选籽粒饱满的苜蓿种子，使用75％酒精消毒15min，然后用灭菌蒸馏水冲洗三遍，每遍1min，将灭菌苜蓿种子分别在不同根瘤菌株液中浸泡2～5小时，打开所述植物无菌水培装置的封口膜，将1～2粒接菌后的苜蓿种子放入滤网中的培养基质表面，沿所述玻璃杯的内侧壁加入经高温灭菌的所述水培液，液面高度低于培养基质的表面高度2～5mm，然后用封口膜将所述玻璃杯上口密封，播种操作均在超净工作台内完成；将播种后的植物无菌水培装置置于人工气候箱中培养；

(C)、更换水培液：每6～10天更换一次所述水培液，更换所述水培液时将玻璃杯的底部锥形橡胶塞取出使所述水培液经换液口流出，待所述水培液全部流出后重新使用所述锥形橡胶塞密封换液口，打开所述封口膜后沿内侧壁加入新的所述水培液，每更换一次所述水培液，其液面高度比前一次更换时的水培液的高度降低5～10mm；最终液面低于水培液液面30～50mm；

(D)、观察评价：将水培30天以上的苜蓿幼苗取出，并观察评价不同根瘤菌的结瘤效果；

其中，所述水培液为无氮MS水培液。

8.使用权利要求1～6中任意一项权利要求所述的植物无菌水培装置进行根瘤菌结瘤效果评价的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(a)、准备工作：将装有培养基质的滤网与玻璃杯组合，配制Hogland水培液和无氮MS水培液；将所述Hogland水培液沿所述玻璃杯的内侧壁加入到所述玻璃杯内，液面高度低于培养基质表面高度2～5mm，用封口膜将所述玻璃杯的上口密封，形成植物无菌水培装置，在121℃下湿热灭菌30min后放入超净台备用；

(b)、打开所述植物无菌水培装置的所述封口膜，选取发芽5天生长健壮的无菌苜蓿幼苗，将无菌苜蓿幼苗放入所述滤网中的培养基质表面，然后用所述封口膜将所述玻璃杯口密封，上述操作均在超净工作台内完成；将移栽无菌苗的所述植物无菌水培装置置于人工气候箱中培养；

(c)、每6～10天更换一次水培液，更换Hogland水培液时将所述玻璃杯的底部锥形橡胶塞取出，使水培液经换液口流出，待Hogland水培液全部流出后重新使用所述锥形橡胶塞密封换液口，打开上部封口膜，沿所述玻璃杯的内侧壁加入新的Hogland水培液，每次更换新Hogland水培液的液面高度逐渐降低，最终液面高度低于所述培养基质3的表面高度30～50mm；

(d)、经无菌水培15天，苜蓿幼苗长出较多侧根，取2种苜蓿根瘤菌保存液0.1mL分别 接种于10mL液体YEB培养基中，在摇床中200r/min，28℃振荡培养10～20小时，根瘤菌培养至浓度达到OD₆₀₀＝0.5～0.8时备用，分别取0.2mL刚摇好的根瘤菌菌液加入苜蓿幼苗根部，将Hogland水培液更换为无氮MS水培液，每6～10天更换一次水培液，经根瘤菌接菌水培30天的苜蓿苗用于结瘤效果的观察评价，取出苜蓿根，记录根瘤数量、大小和颜色，评价不同根瘤菌株的结瘤效果。